CN104059928B - 提高大肠杆菌耐盐性的基因GhASS1及其制备以及利用其编码的蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明属于新基因的制备，特别是指一种提高大肠杆菌耐盐性的基因GhASS1及其制备以及利用其编码的蛋白。以5’-ACCATGGGCGAGCTCGGTACCATG？GCTCAGTTCAAAG-3’为上游引物5ZWASS，以5’-TTGCGGACTCTAGAGGATCCCAC？TTACATACCTTTGTTAAGCATTGC-3’为下游引物3ZWASS，以棉花植株根中的RNA反转录所合成的cDNA为模板，采用PCR扩增方法获得。本发明填补了现有技术存在的在植物中未见到精氨酸琥珀酸合成酶的相关分子生物学研究报道的空白。具有基因GhASS1在重组菌中的表达提高了重组菌在盐胁迫下的生长活力，增强了菌株的耐盐能力的优点。

Description

提高大肠杆菌耐盐性的基因GhASS1及其制备以及利用其编码的蛋白

技术领域

本发明属于新基因的制备，特别是指一种提高大肠杆菌耐盐性的基因GhASS1及其制备以及利用其编码的蛋白。

背景技术

尿素循环(UreaCycle)，又称为鸟氨酸循环，是第一个被发现的环式代谢途径。在哺乳动物中，2分子氨(1分子氨是游离的，1分子氨来自天冬氨酸)和1分子CO₂生成1分子尿素的环式代谢途径，是氮代谢最终产物--尿素的生成过程，因此具有除去氨毒害作用。此外，其不仅将氨和CO₂合成为尿素，而且生成一分子延胡索酸，使尿素循环与柠檬酸循环联系起来。肝脏是哺乳动物尿素合成的主要器官，在临床实践中，尿素循环的任何一个步骤出问题都有可能产生疾病。如果完全缺乏尿素循环中的某一个酶，婴儿在出生不久就昏迷或死亡；如果部分缺乏，会引起智力发育迟滞、嗜睡和经常呕吐。

尿素在植物体内是尿素循环的一种主要代谢产物，在体外又是作物生产中被广泛使用的氮肥，但尿素循环在植物体内的生理作用还不清楚。长期以来一般认为植物体内尿素循环的转运活性低，其意义在于合成精氨酸。个别植物也可产生尿素，在脲酶作用下分解产生氨，用以合成其他含氮化合物，包括核酸、激素、叶绿体、血红素、胺、生物碱等。

精氨酸琥珀酸合成酶(Argininosuccinatesynthetase，简称ASS)或称精氨酸琥珀基合成酶，是一种从瓜氨酸及天冬氨酸催化合成精氨酸琥珀酸的酶(EC6.3.4.5)。它负责尿素循环中的第3个步骤及瓜氨酸-一氧化氮循环(Citrulline-NitricOxideCycle)中的一个反应。一般认为ASS为尿素循环或瓜氨酸-一氧化氮循环的限速酶。目前在植物中还未见到相关分子生物学研究的报道。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种提高大肠杆菌耐盐性的基因GhASS1。

本发明的目的之二在于提供提高大肠杆菌耐盐性的基因GhASS1的制备方法。

本发明的目的之三在于提供利用提高大肠杆菌耐盐性的基因GhASS1编码的蛋白。

本发明的整体技术构思是：

提高大肠杆菌耐盐性的基因GhASS1，其序列如下：

提高大肠杆菌耐盐性的基因GhASS1的制备包括如下步骤：

以5’-ACCATGGGCGAGCTCGGTACCATGGCTCAGTTCAAAG-3’为上游引物5ZWASS，以5’-TTGCGGACTCTAGAGGATCCCACTTACATACCTTTGTTAAGCATTGC-3’为下游引物3ZWASS，以棉花植株根中的RNA反转录所合成的cDNA为模板，采用PCR扩增方法获得。

利用提高大肠杆菌耐盐性的基因GhASS1编码的蛋白，其序列如下：

本发明的具体技术内容还有：

提高大肠杆菌耐盐性的基因GhASS1的制备，其工艺步骤如下：

A、PCR反应模板的制备；

B、引物的制备；

C、基因GhASS1全序列的扩增和克隆。

所述的步骤A是选取新鲜棉花的根，在液氮中研磨成粉末状，置于预先冻存在冰上无RNase的离心管中，提取棉花的根组织中的RNA，提取的RNA经1％琼脂糖甲醛变性胶电泳检测，反转录合成cDNA用于PCR反应的模板。

所述的RNA提取采用Takara公司生产的总RNA提取试剂盒。

所述的反转录包括如下工艺步骤：

a、向RNase-free离心管中加入2μgRNA，浓度为0.5μg/μl的OligodT₁₈2μl，DEPC-H₂O7.75μl,在温度70℃的条件下反应5分钟后，迅速冰浴；

b、向步骤a的溶液中加入以下反应液后制成混合液

将上述混合液在转速为2000转/分钟的转速下离心30秒后，42℃的条件下于PCR仪中反应1小时；

c、混合液在72℃的条件下反应10分钟灭活反转录酶，混合液的体积为20μl，将反转录产物于-70℃冻存。

所述的步骤B是以名称为NM-118616的拟南芥ASScDNA序列为探针，在NCBI数据库中寻找棉花EST序列，获得注册号分别为DR461332，ES847521，HO104400的3条棉花EST序列信息，对获得的3条EST序列信息进行电子拼接，获得含有完整开放阅读框的较长的cDNA序列，以步骤A中获得的反转录合成cDNA为PCR反应的模板，设计两条PCR引物对获得的cDNA序列扩增，上、下游扩增引物中分别引入KpnI和BamHI识别序列，上游引物为5ZWASS:5’-ACCATGGGCGAGCTCGGTACCATGGCTCAGTTCAAAG-3’；下游引物为3ZWASS:5’-TTGCGGACTCTAGAGGATCCCACTTACATACCTTTGTTAAGCATTGC-3’。

所述的步骤C是利用步骤A中获得的cDNA作模板，使用步骤B中获得的上、下游引物进行PCR扩增；

20μlPCR反应体系如下：

反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性1分钟，50℃复性30秒，72℃延伸2分钟，循环30次；72℃继续延伸10分钟,PCR扩增产物经浓度为1.0％的琼脂糖凝胶电泳分离后，采用Takara公司胶回收试剂盒回收目的基因，回收产物与反应体系连接，将连接产物转化大肠杆菌后筛选阳性克隆提取质粒DNA，进行测序分析；

20μl连接体系有如下体积的组分组成：

将连接体系混合均匀后，16℃过夜。

申请人对本发明获得的基因进行了如下试验。

1、基因GhASS1cDNA的克隆

1-1、依据电子拼接所得到的序列信息，设计引物进行RT-PCR扩增。扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到一条大小为1500bp的片段，该片段大小与预期一致(图1)。

1-2、将得到的RT-PCR产物回收并与pGEM-T载体连接，连接产物转化入DH5，提取转化子的质粒DNA，分别用SpeⅠ单酶切，和用SphⅠ、SpeⅠ双酶切，0.8％琼脂糖电泳检测。如图，SpeⅠ单酶切产生1条含pGEM+GhASS1片段的长为4500bp的大片段，而用SphⅠ、SpeⅠ双酶切则产生1条pGEM骨干载体片段和1条GhASS1基因，片段大小约为3000bp和1500bp，电泳(图2)结果与预期相符，说明外源基因与T载体成功连接。北京三博远志生物技术有限公司测序。

2、基因GhASS1cDNA序列分析

2-1、将RT-PCR扩增产物测序结果与电子拼接所得相应序列进行比对，二者的同源性达99.1％，证明目标基因在棉花中真实存在，因此确定其cDNA序列如图3。

2-2、该cDNA序列长1584bp，5’非翻译区(5’-UTR)包含22bp，从第23bp至第1507bp为其开放阅读框(ORF)，共有1485bp，自第1508bp后为其3’端非翻译区(3’-UTR)。ORF区翻译的蛋白多肽序列如图4。

2-3、该多肽由494个氨基酸组成，推断产物的分子量(MW)为54kD，等电点(pI)5.03。序列中不存在跨膜螺旋和信号肽，可能定位于细胞质中。利用NPSA中的MLRC方法预测棉花GhASS1二级结构，结果显示无规则卷曲所占比例最大，为53.09％；而α-螺旋和β-折叠所占比例分别为31.67％和15.24％。利用网站Expasy中SwissModel程序进行同源建模，推测GhASS1蛋白的三维结构，结果(图5)显示该蛋白可能含有较多的无规卷曲，α螺旋比β折叠多，与二级结构预测结果一致。

3、基因GhASS1编码产物的同源对比与系统进化分析

3-1、将所得基因GhASS1编码的氨基酸序列与落叶松蕈(Agaricusbisporus)(Genbank注册号为CAI12846)和人类(Homosapiens)(Genbank注册号为P00966)进行序列比对，结果如图6，显示在GhASS1中有与ASS同源蛋白的高度保守序列，其中富含甘氨酸的A模序([A/S]-[F/Y]-S-G-G-[LV]-D-T-[S/T])为Mg²⁺-ATP酶共有序列，B模序(G-x-T-x-K-G-N-D-x(2)-R-F)为天冬氨酸结合位点，C模序(S-x-D-x-N-x(6)-E)和D模序(E-[N/D]-R-x(4)-K-x(4)-Y-E)通过形成β发卡结构参与与胍氨酸的结合。

3-2、序列相似性分析显示，GhASS1与拟南芥、水稻等植物同源蛋白的相似性在80％以上，与人等哺乳动物、酿酒酵母等真菌中同源蛋白的相似性在40-50％，与大肠杆菌同源蛋白的相似性在20-30％。系统进化分析显示(图7)，GhASS1的系统进化与参比各物种的进化地位基本一致。

美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI)推测开放阅读框架的ORFFinder，网址为：(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)。蛋白质基本性质分析数据库ExPASy在线服务器，分析GhASS1蛋白的分子量、等电点、疏水性等。蛋白质跨膜预测服务器HMMTOP(http://www.enzim.hu/hmmtop/index.html)，蛋白质信号肽预测工具SignalP4.0Sever(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，蛋白质亚细胞定位预测工具PSORTPredition(http://psort.hqc.jp/form.html)，蛋白质Domain分析工具SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)，蛋白质二级结构的预测工具NPSA-MLRC(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝/NPSA/npsa_htm.html)，并通过Pymol软件对GhASS1蛋白的三维结构进行显示。用ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)进行在线的同源序列比对，用DNAMAN软件进行系统发生树分析。

4、GhASS1原核表达与体外催化特征分析

4-1、pCold-GhASS1原核表达载体的构建

用XbaI和KpnI双酶切GhASS1测序载体，因在GhASS1ORF序列内部的1118bp处存在1个KpnI的识别序列，且ORF序列上游设计添加了1个KpnI的识别序列，因此KpnI和XbaI双酶切GhASS1测序载体时需严格控制反应条件，使该反应处于不完全酶切状态，此时电泳回收与GhASS1ORF序列大小相符的酶切片段，与同样酶切反应获得的pColdTF片段连接，经转化和转化子筛选，获得pCold-GhASS1重组质粒。同样，用XbaI和KpnI双酶切检测获得的pCold-GhASS1重组质粒，反应完全后，采用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，可观察到清晰的3个条带(图8)，其中最大的片段与pColdTF载体大小一致，另2条带大小分别约为1200bp和300bp，两带大小之和与GhASS1ORF大小一致，说明GhASS1ORF已成功构建入pColdTF。将此载体送送北京三博远志生物技术有限公司测序,测序结果与预期相符。

4-2、基因GhASS1在大肠杆菌中的表达

经IPTG诱导后，含有pColdTF空载体的对照菌在54KDa处表达较高水平的标签蛋白带，重组菌中因为GhASS1在pCold-TF质粒中的插入，产生特异的1条融合蛋白条带，大小约为标签蛋白与目标蛋白分子量之和，本研究中约为108KDa。电泳结果如图9所示，说明在含pCold-GhASS1质粒的Rosetta工程菌株中，GhASS1重组蛋白得到了有效表达。

4-3、棉花精氨酸琥珀酸合成酶GhASS1体外催化特征分析

精氨酸琥珀酸合成酶催化天冬氨酸和瓜氨酸合成精氨酸琥珀酸，同时消耗一份子的ATP，使其生成焦磷酸和AMP，在焦磷酸酶的作用下，焦磷酸水解成磷酸，在酸性条件下，磷酸与钼酸结合生成磷钼酸，磷钼酸与硫胺反应产生硫胺荧，并发出很强的荧光。依据荧光强度，可间接测定ASS活性。通过测定反应液中总蛋白含量计算酶比活力。

取菌体15℃诱导24h后的菌液裂解液作为催化粗酶液，以天冬氨酸，瓜氨酸和ATP为底物，进行体外酶催化特性的研究，以每分钟产生1μmolPO₄ ^3-的酶量为一个酶活力单位(U/L)，得到粗提取液的酶活性和比活力(图10A,图10B)。由图10A及图10B可知，含pCold-GhASS1质粒的重组菌表达蛋白GhASS1的酶活性和比活力都远远高于含pCold-TF质粒的对照菌。说明GhASS1成功的转移到了大肠杆菌Rosetta菌株中，并可表达有活性的蛋白。

GhASS1酶活测定采用如下方法：

ASS催化瓜氨酸与天冬氨酸缩合成精氨酸代琥珀酸，消耗一分子ATP，生成AMP和焦磷酸，焦磷酸在焦磷酸酶的作用下水解成磷酸，磷酸与钼酸在酸性条件下结合生成磷钼酸，其与非荧光的硫胺反应产生高荧光性的硫胺荧，荧光激发波长375nm，测定波长440nm。利用这一原理通过检测其荧光强度，来测定GhASS1的酶活性。

基质缓冲液：50mmol/LTris-HCl缓冲液(pH＝7.7)，去离子水配制。

基质液：10mL基质缓冲液内含0.005mmol天冬氨酸，0.004mmol瓜氨酸，0.01mmolATP，0.025mmolMgCl2，10U焦磷酸酶，临用前去离子水配制。

荧光混合液：1％H₂SO₄，1mmol/L钼酸铵，0.2mmol/L盐酸硫胺，按2：1：1比例去离子水配制。

标准液：0.1mmol/L硼砂，去离子水配制。

裂解缓冲液：50mMTris-HCl缓冲液(pH＝8.0)，2mMEDTA，0.5％TritonX-100，1mg/mL溶菌酶，去离子水配制。

(1)菌体15℃诱导24h后，各取1.4mL至1.5mL的EP管中，4000rpm低温(4℃)离心10min，倒掉上清液，用移液枪吸干培养基。

(2)各加入100μL裂解液，移液枪轻轻吹打使菌液悬浮。

(3)－20℃和室温反复冻融3-5次。

(4)4℃、4000rpm离心10min，所得上清即为粗酶液。

(5)37℃保温10min，各加入2mL荧光混合液，其中测定对照管加10μL待测酶液，37℃保温5min后，各管加入100mmol/L硼砂，混匀，测定荧光度。

表1荧光测定酶活力

酶活力公式：

F-荧光吸收值

酶的比活力测定

(1)考马斯亮蓝试剂

取0.1mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95％乙醇，加入85％H₃PO₄100ml，用蒸馏水定容至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01％(W/V)考马斯亮蓝G-250，4.7％(W/V)乙醇，8.5％(W/V)H₃PO₄。

(2)标准蛋白质溶液

用牛血清血蛋白配成含蛋白质1mg/mL的标准蛋白溶液。

(3)待测蛋白即粗酶液。

(4)标准曲线按照表2.2绘制。

表2总蛋白含量的测定

	1	2	3	4	5	6	测定管
								标准蛋白液(mL)	0	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0	0
蒸馏水(mL)	1.0	0.8	0.6	0.4	0.2	0	800μL
								待测蛋白液(μL)	0	0	0	0	0	0	200μL
蛋白质含量(μg)	0	200	400	600	800	1000	未知
								考马斯亮蓝溶液(mL)	5	5	5	5	5	5	5

酶的比活力＝酶活性/总蛋白质量

5、GhASS1超量表达对大肠杆菌的影响

5-1、对大肠杆菌生长速度的影响

大肠杆菌Rosetta菌株的最适生长温度是37℃，但是pCold-GhASS1重组质粒的启动表达最适温度是15℃，因此分别选择37℃和15℃培养条件下，在含有0.5mmol/LIPTG的培养基中进行诱导培养，发现无论是37℃，还是15℃条件下(图11A,图11B)，(1)含pCold-GhASS1质粒的重组菌均早于含有pCold-TF质粒的对照菌进入对数生长期；(2)在对数生长阶段，相同培养条件和培养时间时，重组菌的OD值均高于对照菌。以在15℃条件下为例，重组菌OD值达到0.8时所需生长时间为15h时，而对照菌需18h。说明GhASS1的表达，增强了重组菌株的适应能力和生长活力，表现出了一定的生理作用，促进了菌株对环境的适应能力，特别是在低温情况下，较快的进入了对数生长阶段。

5-1采用如下试验方法进行：

(1)50mL的LB液体培养基采用质量百分比为2％的接种量，抗生素成分：Amp50mg/L；Cm17mg/L。37℃，180rpm震荡培养至OD600在0.5-0.7之间。

(2)将培养瓶在15℃水浴30min，之后加入IPTG至其终浓度0.5mmol/L，15℃水浴震荡培养，每隔2h测一次OD600；其他条件相同，37℃水浴震荡培养，每隔1-2h测一次OD600。

(3)以时间为横坐标，OD600为纵坐标绘制曲线图。

5-2、对大肠杆菌耐盐能力的影响

重组菌和对照菌经0.5mmol/LIPTG，15℃诱导24h后，调整菌液浓度使其一致。分别取100uL菌液转入额外含有0mmol/L、300mmol/L、600mmol/LNaCl的50mL液体LB培养基中，并分别在37℃和15℃条件下进行培养，24h后测定菌液OD600值，分析盐胁迫对重组菌和对照菌生长的影响。如图12A,图12B所示，(1)在15℃条件下，LB培养基中没有额外添加NaCl(记为0mmol/LNaCl)，重组菌的OD600高于对照菌，再次验证了重组菌较对照菌具有较强的活力。(2)当LB培养基中添加额外的高浓度NaCl(300mmol/L、600mmol/LNaCl)后，重组菌和对照菌的生长均受到明显的抑制。但在相同盐浓度下，重组菌比对照菌表现了较高的OD600值，特别是NaCl浓度在600mmol/L的情况下，对照菌受到严重地抑制，几乎无法生长，而重组菌依然生长。说明GhASS1在重组菌中的表达提高了重组菌在盐胁迫下的生长活力，增强了菌株的耐盐能力。

5-2采用如下试验方法进行：

(1)LB液体培养基(设定三组不同盐浓度：0mmol/LNaCl，300mmol/LNaCl，600mmol/LNaCl)。

(2)不同温度条件下培养：15℃诱导24h后，2％转接到含有不同NaCl浓度的50mLLB培养基，一组以15℃培养24h后测定OD600。另一组以37℃培养至对数生长后期(参考生长曲线的时间)，测定OD600。

(3)以NaCl浓度为横坐标，OD600为纵坐标，绘制柱状图。

上述试验的结果如附图说明。

本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：

1、基因GhASS1的表达，增强了重组菌株的适应能力和生长活力，表现出了一定的生理作用，促进了菌株对环境的适应能力，特别是在低温情况下，较快的进入了对数生长阶段。

2、基因GhASS1在重组菌中的表达提高了重组菌在盐胁迫下的生长活力，增强了菌株的耐盐能力。

附图说明

本发明的附图有：

图1是本发明的中利用RT-PCR得到基因GhASS1的检测结果。

图1中1：MarkerDL5000；2:RT-PCR产物。

图2是酶切检测结果。

图2中M:MarkerDL5000；1，SpeⅠ单酶切结果；2，SphⅠ、SpeⅠ双酶切结果。

图3是基因GhASS1的cDNA序列。

图4是基因GhASS1推断的氨基酸序列。

图5是基因GhASS1编码产物的三级结构。

图6是基因GhASS1编码产物的同源比对结果。

图7是GhASS1的系统进化分析。

图8是采用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测pCold-GhASS1载体KpnI和XbaI双酶切反应产物的结果示意图。

图8中1,2泳道为质粒双酶切产物；M为DL15000marker。

图9是基因GhASS1原核表达产物的SDS-PAGE检测结果。

图9中1：ProteinMarker；2：含pCold-GhASS1质粒的表达菌；3：含pCold-TF质粒的对照菌。

图10重组菌体中GhASS1酶活性(图10A)和酶比活力(图10B)测定结果。

图10中pCold-TF为对照菌，pCold-GhASS1为重组菌。

图11是重组菌体生长曲线。

图11A中温度为15℃，图11B中温度为37℃，pCold-TF为对照菌，pCold-GhASS1为重组菌。

图12是重组菌耐盐能力检测结果示意图。

图12A中温度为15℃，图12B中温度为37℃，pCold-TF为对照菌，pCold-GhASS1为重组菌。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例作进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书作出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范畴。

本实施例的基因和利用其编码的氨基酸序列如前述，其基因的制备方法如下：

提高大肠杆菌耐盐性的基因GhASS1的制备方法，以5’-ACCATGGGCGAGCTCGGTACCATGGCTCAGTTCAAAG-3’为上游引物5ZWASS，以5’-TTGCGGACTCTAGAGGATCCCACTTACATACCTTTGTTAAGCATTGC-3’为下游引物3ZWASS，以棉花植株根中的RNA反转录所合成的cDNA为模板，采用PCR扩增方法获得。

制备方法的工艺步骤如下：

A、PCR反应模板的制备；

B、引物的制备；

C、基因GhASS1全序列的扩增和克隆。

所述的步骤A是选取新鲜棉花的根，在液氮中研磨成粉末状，置于预先冻存在冰上无RNase的离心管中，提取棉花的根组织中的RNA，提取的RNA经1％琼脂糖甲醛变性胶电泳检测，反转录合成cDNA用于PCR反应的模板。

所述的RNA提取采用Takara公司生产的总RNA提取试剂盒。

所述的反转录包括如下工艺步骤：

a、向RNase-free离心管中加入2μgRNA，浓度为0.5μg/μl的OligodT₁₈2μl，DEPC-H₂O7.75μl,在温度70℃的条件下反应5分钟后，迅速冰浴；

b、向步骤a的溶液中加入以下反应液后制成混合液

将上述混合液在转速为2000转/分钟的转速下离心30秒后，42℃的条件下于PCR仪中反应1小时；

c、混合液在72℃的条件下反应10分钟灭活RT，混合液的体积为20μl，将反转录产物于-70℃冻存。

所述的步骤B是以名称为NM-118616的拟南芥ASScDNA序列为探针，在NCBI数据库中寻找棉花EST序列，获得注册号分别为DR461332，ES847521，HO104400的3条棉花EST序列信息，对获得的3条EST序列信息进行电子拼接，获得含有完整开放阅读框的较长的cDNA序列，以步骤A中获得的反转录合成cDNA为PCR反应的模板，设计两条PCR引物对获得的cDNA序列扩增，上、下游扩增引物中分别引入KpnI和BamHI识别序列，上游引物为5ZWASS:5’-ACCATGGGCGAGCTCGGTACCATGGCTCAGTTCAAAG-3’；下游引物为3ZWASS:5’-TTGCGGACTCTAGAGGATCCCACTTACATACCTTTGTTAAGCATTGC-3’。

所述的步骤C是利用步骤A中获得的cDNA作模板，使用步骤B中获得的上、下游引物进行PCR扩增；

20μlPCR反应体系如下：

反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性1分钟，50℃复性30秒，72℃延伸2分钟，循环30次；72℃继续延伸10分钟,PCR扩增产物经浓度为1.0％的琼脂糖凝胶电泳分离后，采用Takara公司胶回收试剂盒回收目的基因，回收产物与反应体系连接，将连接产物转化大肠杆菌后筛选阳性克隆提取质粒DNA，进行测序分析；

20μl连接体系有如下体积的组分组成：

将连接体系混合均匀后，16℃过夜。

Claims (9)

1.提高大肠杆菌耐盐性的基因GhASS1，其特征在于其序列如下：

2.根据权利要求1所述的提高大肠杆菌耐盐性的基因GhASS1的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

以5’-ACCATGGGCGAGCTCGGTACCATGGCTCAGTTCAAAG-3’为上游引物，以5’-TTGCGGACTCTAGAGGATCCCACTTACATACCTTTGTTAAGCATTGC-3’为下游引物，以棉花植株根中的RNA反转录所合成的cDNA为模板，采用PCR扩增方法获得。

3.根据权利要求2所述的提高大肠杆菌耐盐性的基因GhASS1的制备方法，其特征在于，其工艺步骤如下：

A、PCR反应模板的制备；

B、引物的制备；

C、基因GhASS1全序列的扩增和克隆。

4.根据权利要求3所述的提高大肠杆菌耐盐性的基因GhASS1的制备方法，其特征在于所述的步骤A是选取新鲜棉花的根，在液氮中研磨成粉末状，置于预先冻存在冰上无RNase的离心管中，提取棉花的根组织中的RNA，提取的RNA经1％琼脂糖甲醛变性胶电泳检测，反转录合成cDNA用于PCR反应的模板。

5.根据权利要求4所述的提高大肠杆菌耐盐性的基因GhASS1的制备方法，其特征在于，所述的RNA提取采用Takara公司生产的总RNA提取试剂盒。

6.根据权利要求4所述的提高大肠杆菌耐盐性的基因GhASS1的制备方法，其特征在于，所述的反转录包括如下工艺步骤：

a、向RNase-free离心管中加入2μgRNA，浓度为0.5μg/μl的OligodT₁₈2μl，DEPC-H₂O7.75μl,在温度70℃的条件下反应5分钟后，迅速冰浴；

b、向步骤a的溶液中加入以下反应液后制成混合液

在转速为2000转/分钟的转速下离心30秒后，42℃的条件下于PCR仪中反应1小时；

c、混合液在72℃的条件下反应10分钟灭活反转录酶，混合液的体积为20μl，将反转录产物于-70℃冻存。

7.根据权利要求3所述的提高大肠杆菌耐盐性的基因GhASS1的制备方法，其特征在于，所述的步骤B是以名称为NM-118616的拟南芥ASScDNA序列为探针，在NCBI数据库中寻找棉花EST序列，获得注册号分别为DR461332，ES847521，HO104400的3条棉花EST序列信息，对获得的3条EST序列信息进行电子拼接，获得含有完整开放阅读框的较长的cDNA序列，以步骤A中获得的反转录合成cDNA为PCR反应的模板，设计两条PCR引物对获得的cDNA序列扩增，上、下游扩增引物中分别引入KpnI和BamHI识别序列，上游引物为5ZWASS:5’-ACCATGGGCGAGCTCGGTACCATGGCTCAGTTCAAAG-3’；下游引物为3ZWASS:5’-TTGCGGACTCTAGAGGATCCCACTTACATACCTTTGTTAAGCATTGC-3’。

8.根据权利要求3所述的提高大肠杆菌耐盐性的基因GhASS1的制备方法，其特征在于，所述的步骤C是利用步骤A中获得的cDNA作模板，使用步骤B中获得的上、下游引物进行PCR扩增；

20μlPCR反应体系如下：

反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性1分钟，50℃复性30秒，72℃延伸2分钟，循环30次；72℃继续延伸10分钟,PCR扩增产物经浓度为1.0％的琼脂糖凝胶电泳分离后，采用Takara公司胶回收试剂盒回收目的基因，回收产物与反应体系连接，将连接产物转化大肠杆菌后筛选阳性克隆提取质粒DNA，进行测序分析；

20μl连接体系有如下体积的组分组成：

将连接体系混合均匀后，16℃过夜。

9.利用如权利要求1所述的基因GhASS1编码的蛋白，其特征序列如下：