CN104053781A - 利用恶臭假单胞菌GPO1 AlkB单加氧酶氧化烯烃的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于氧化烯烃的方法，所述方法包括在氧的存在下使所述烯烃与AlkB型氧化还原酶接触，和涉及AlkB型氧化还原酶，优选为来自恶臭假单胞菌GPO1或其变体的AlkB，用于氧化烯烃成醇和/或酸的用途。

Description

利用恶臭假单胞菌GPO1 AlkB单加氧酶氧化烯烃的方法

本发明涉及用于氧化烯烃的方法，所述方法包括在氧的存在下使所述烯烃与单加氧酶，优选AlkB型氧化还原酶接触，和涉及单加氧酶，优选为AlkB型氧化还原酶，更优选为来自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）GPO1或其变体的AlkB，用于氧化烯烃成醇和/或酸的用途。

烯烃(Alkene)，在有机化学中也称为链烯(olefin)，是指包含至少一个碳-碳双键的烃。与它们的不饱和的特征一致，烯烃比烷烃更具反应性，尽管在许多物理性质方面相似。

烯烃通常通过在高温下裂化包含烷烃的矿物燃料，如天然气凝析油组分，并从产物目标脂族烯烃的混合物中分离获得。其它方法包括消除反应，例如醇的脱水和炔烃的氢化。

烯烃通常用作合成聚合物的结构单元。这些聚合物，例如聚乙烯和聚丙烯，具有高的工业价值。烯烃的聚合反应可以通过添加催化剂例如过氧化苯甲酰来引发，其包括或者被转化成反应性自由基并攻击单体，生成另一个在第二步中可以攻击另一单体以进行链延伸的自由基。这往下进行直到链的增长被终止，例如，通过与另一个延伸链反应，通过与自由基抑制剂如氧相互作用或自由基歧化，后者产生饱和的和不饱和的聚合物产物。除了依赖于矿物燃料之外，这些方法的缺点还涉及需要使用危险的和不稳定的化学品。

尽管任何烯烃，甚至乙烯，最简单的可能的烯烃，可以进行这样的聚合反应，通常希望产生包含更复杂的烯烃结构单元的更复杂的聚合物。因此，有必要在它们进行聚合之前将烯烃转化为取代的烯烃，例如通过通过氧化，以引入羟基或羧基。

本领域的状态教导了可用于氧化烯烃的各种反应，例如臭氧分解，烯烃的裂解，以形成有机化合物如羧酸和醛。但是，如果烯烃是出于产生聚合物结构单元的目的而被氧化，必须小心使双键完整，否则该产物不再能够用于基于自由基反应机理的聚合反应。换句话说，所述氧化反应必须是高度选择性的。

因此，本发明要解决的问题是提供一种用于将烯烃转化为氧化烯烃，如不饱和醇、醛和羧酸的方法，其中所述烯烃不必经受苛刻的反应条件如高氧化性物质，例如臭氧和过氧化氢，强酸如甲苯亚磺酸，或经受金属催化剂，例如基于锇的催化剂。

本发明要解决的另一个问题是提供一种用于在温和的条件下产生氧化烯烃，特别是异丁烯酸的方法，其中所述氧化是选择性的，在这个意义上，产生特定比例的醇、醛和羧酸，而双键基本上保持完整和/或生成较小比例的副产物。

在第一方面，本发明要解决的问题是通过用于氧化烯烃的方法解决，包括使所述烯烃在氧的存在下与单加氧酶接触。

在第一实施方案中，所述问题通过一种方法解决，其中所述单加氧酶是AlkB型氧化还原酶。

在第二实施方案中，其也是第一实施方案的实施方案，所述问题通过一种方法解决，其中所述单加氧酶是来自恶臭假单胞菌GPO1或其变体的AlkB。

在第三实施方案中，其也是第一至第二实施方案的实施方案，所述问题通过一种方法解决，其中所述烯烃由式（I）表示

其中R¹、R²、R³和R⁴每个和独立地选自包含H–(CH₂)_x–的组，其中x是0或更多，其中R¹、R²和R³的两个可以形成环烷基，优选烷基包含5或6元，并且其中优选R¹、R²和R³每个和独立地选自包含H–(CH₂)_x–的组并且x是1至24。

在第四实施方案中，其也是第一至第三实施方案的实施方案，R⁴是甲基。

在第五实施方案中，其也是第一至第四实施方案的实施方案，所述问题通过一种方法解决，其中R¹ = R² = 氢，或R¹ = R³ = 氢，并且优选 R¹ = R² = R³ = 氢。

在第六实施方案中，其也是第一至第五实施方案的实施方案，所述问题通过一种方法解决，其中R¹ = R² = 氢并且 R³是甲基。

在第七实施方案中，其也是第一至第六实施方案的实施方案，所述问题通过一种方法解决，其中R¹ = R² = 氢并且 R³是-CH=CH₂。

在第八实施方案中，其也是第一至第七实施方案的实施方案，所述问题通过一种方法解决，其中所述烯烃在室温和大气压力下是气态的。

本发明要解决的问题在第二方面通过单加氧酶用于氧化烯烃为醇和/或酸的用途来解决，所述单加氧酶优选是AlkB型氧化还原酶，更优选是来自恶臭假单胞菌GPO1或其变体的AlkB。

在第二方面的第一实施方案中，所述问题通过一种用途解决，其中所述烯烃由式（I）表示

其中R¹、R²和R³每个和独立地选自包含H–(CH₂)_x–的组，其中x是0或更多，其中R¹、R²和R³的两个可以形成环烷基，优选烷基包含5或6元，并且其中优选R¹、R²和R³每个和独立地选自包含H–(CH₂)_x–的组并且x是1至24。

在第二方面的第二实施方案中，其也是第一实施方案的实施方案，所述问题通过一种用途解决，其中R⁴是甲基。

在第二方面的第三实施方案中，其也是第一至第二实施方案的实施方案，所述问题通过一种用途解决，其中R¹ = R² = 氢，或R¹ = R³ = 氢，并且优选 R¹ = R² = R³ = 氢。

在第二方面的第四实施方案中，其也是第一至第三实施方案的实施方案，所述问题通过一种用途解决，其中R¹ = R² = 氢并且 R³是甲基。

在第二方面的第五实施方案中，其也是第一至第四实施方案的实施方案，所述问题通过一种用途解决，其中R¹ = R² = 氢并且 R³是-CH=CH₂。

在第二方面的第六实施方案中，其也是第一至第五实施方案的实施方案，所述问题通过一种用途解决，其中所述烯烃在室温和大气压力下是气态的。

在第二方面的第七实施方案中，其也是第一至第八实施方案的和第一方面和所有其实施方案的实施方案，所述问题通过一种用途或方法解决，其中，所述烯烃氧化成氧化产物的混合物，并且产生的酸的比例大于所产生的氧化产物整体的25%，优选大于所产生的氧化产物整体的40％。

在第二方面的第八实施方案中，其也是第一至第七实施方案的和第一方面和所有其实施方案的实施方案，所述问题通过一种用途或方法解决，其中所述单加氧酶作为表达所述单加氧酶的全细胞催化剂提供。

在第二方面的第十实施方案中，所述醇和/或酸由式（II）表示

其中R¹是HO–(CH₂)_x–或HOOC–(CH₂)_x–，且R²和R³每个和独立地选自包含H–(CH₂)_x–的组，其中x是0或更多，其中R²和R³可以形成环烷基，优选烷基包含5或6元，并且其中优选R²和R³每个和独立地选自包含H–(CH₂)_x–的组，并且x是1至24。

本发明基于令人惊讶的发现，即AlkB型氧化还原酶，先前已知仅能够氧化烷烃和饱和的烷基的一组酶，可以用于氧化烯烃，特别是气态烯烃。

本发明的方法和用途中心围绕使alkB型氧化还原酶与烯烃接触。这类氧化还原酶的原型，AlkB，是来自恶臭假单胞菌AlkBGT系统的氧化还原蛋白，依赖于两个辅助多肽，AlkG和AlkT。AlkT是FAD依赖的红素氧还蛋白，将电子从NADH转移到AlkG。AlkG是红素氧还蛋白，含铁的氧化还原蛋白，作为对AlkB的直接电子供体发挥作用。在优选实施方案中，如本文所用术语“alkB型氧化还原酶”指具有烃结合位点的红素氧还蛋白依赖性氧化还原酶。在另一个优选实施方案中，如本文所用术语“烃结合位点”指能够结合烃，优选烷烃和/或烯烃的一片蛋白表面,更优选在蛋白催化中心附近。在另一个优选实施方案中，如本文所用术语“红素氧还蛋白依赖性烷烃氧化酶”，指识别的烷烃作为其底物经由红素氧还蛋白接收电子的氧化还原酶，在一个更优选的实施方案中，所述红素氧还蛋白是具有α+β类折叠，并且2个α螺旋和2至3个β-股（β-strand）将电子转移至烷烃氧化酶。在最优选的实施方案中，所述alkB型氧化还原酶是来自恶臭假单胞菌Gpo1（登录号：CAB54050.1，本申请中使用的任何登录号均指来自NCBI运行的Genbank数据库的相应序列，其中提及的公开在2012年1月15日上线）或其变体的AlkB。

在优选的实施方案中，如本文所用术语“接触”指使烯烃和氧化还原酶之间直接接触，使得后者能够氧化前者。例如，所述细胞和烯烃不可以在不同区室中，所述区室由膜例如对于细胞和目标烯烃不渗透的无机膜分隔。如果所述烯烃是固体或可溶的，其可以简单地添加到氧化还原酶水溶液。如果所述烯烃是气态，可以用包含所述气态烯烃的空气对包含细胞的水溶液鼓泡。

在所述烯烃是固体的情况下，可以使用合适的有机溶剂溶解其并然后添加到水溶液。优选的有机溶剂是生物相容的溶剂，即允许所用细胞的活力的溶剂，和/或允许所选的alkB型氧化还原酶的活性的溶剂。在优选的实施方案中，所述有机溶剂是包含5或更多，更优选8或更多，最优选12或更多个碳原子的脂肪酸或其衍生物例如烷基酯。在优选的实施方案中，所述有机溶剂是月桂酸甲基酯。

所述alkB型氧化还原酶可以是重组氧化还原酶。在优选实施方案中，如本文所用术语“重组”alkB型氧化还原酶指编码alkB型氧化还原酶的核酸不是用于表达其的生物体（或者事实上任何野生型生物体）的内源核酸，而已使用遗传工程化改造制备。本领域技术人员熟悉合适的质粒、核酸元件，例如启动子序列和可以用于制造这些质粒的方法。标准的分子生物学方法描述于，例如Sambrook 等(Molecular cloning - A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press)。

虽然理论上可以使用表达alkB型氧化还原酶的野生型菌株，但优选所述alkB型氧化还原酶是过表达的。在优选的实施方案中，如本文所用术语“过表达”指所述多肽的浓度相比其在相应的野生型细胞中的浓度是升高的。本领域技术人员熟悉可以用于过表达alkB型氧化还原酶的技术，例如使用质粒的pET或pGEX系统。

所述alkB型氧化还原酶可以是纯化的或分离的多肽。在优选实施方案中，如本文所用术语“纯化的”指像这样提及的多肽比其在细胞中表达时更纯。可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳随后是所产生的凝胶的考马斯亮蓝染色来判断纯度。在优选实施方案中，所述多肽纯度高于50、60、70、80、90、95或99%，但是其理论上可以以任何程度的纯度使用，从粗细胞裂解物到100%纯的多肽。本领域技术人员熟悉蛋白纯化方法，例如亲和层析、硫酸铵沉淀和凝胶过滤层析。

所述烯烃在与alkB型氧化还原酶活性相容的环境中与alkB型氧化还原酶接触。本领域技术人员熟悉关于酶活性需要考虑的标准参数，例如离子强度、温度和合适的含水缓冲液的组成，并且能够在常规实验范围内确定合适的条件。用于维持alkB型氧化还原酶活性的合适的条件描述于，例如Grant C., Woodley, J. M, and Baganz, F (2011) Enzyme and Microbial Technology 48, 480-486。

关键是只要由alkB型氧化还原酶催化的烯烃氧化继续，就要存在氧。典型地，所述氧化还原酶在水溶液中，并且通过在有氧条件下，即在分子氧(O₂)的存在下搅拌反应容器来导入氧。可选地，优选除了惰性气体如氮气或氩气之外，所述溶液还可以用纯分子氧或包含分子氧的气体混合物鼓泡。如果要氧化的烯烃在所考虑的条件下是气态的，其可以是该混合物的一部分。在优选实施方案中，所述水溶液与空气接触以提供氧。

在优选实施方案中，分子氧可以在超过大气压的局部压力下存在，优选在室温（25 ℃）下测量的，优选以大于1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10巴。

本发明的教导不仅可以使用具有本申请中明确（例如通过名称或登录号）或暗示提及的准确的氨基酸或核酸序列的生物大分子，也可以使用这些序列的变体进行。在优选实施方案中，如本文所用术语“变体”分别包含氨基酸或核酸序列，其与参考氨基酸或核酸序列70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98或99%相同，其中优选除了那些对于功能（例如蛋白的催化活性）或分子的折叠或结构所必需的氨基酸之外的氨基酸被缺失，取代或通过插入替换或必需氨基酸以保守方式被替换。本领域状态包括可以用于比对两个给定核酸或氨基酸序列并计算同一性程度的算法，参见Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, 3^rd edition, Thompson 等, Nucleic Acids Research 22, 4637-4680, 1994, 和Katoh 等, Genome Information, 16(1), 22-33, 2005。术语“变体”与术语“同源物”同义或互换使用。可以通过在氨基酸或核酸序列中导入缺失、插入或取代，以及包含这些大分子或其变体的融合来制备这些变体。在优选实施方案中，关于氨基酸序列的术语“变体”，优选除了上述序列同一性之外，还包含这样的氨基酸序列，其对于相应参考或野生型序列包含一个或多个保守氨基酸改变或包含编码一个或多个保守氨基酸改变核酸序列。在优选实施方案中，术语氨基酸序列或核酸序列的“变体”优选除了上述程度的序列同一性之外，还分别包括氨基酸序列或核酸序列的任何活性部分和/或片段，或编码氨基酸序列的活性部分和/或片段的任何核酸序列。在优选的实施方案中，如本文所用术语“活性部分”指氨基酸序列或核酸序列，其分别少于全长氨基酸序列或编码少于全长氨基酸序列，其中所述氨基酸序列或编码的氨基酸序列分别至少保留其基本生物活性的一些。例如，蛋白酶的活性部分和/或片段能够水解多肽中的肽键。在优选实施方案中，如本文所用术语“至少保留其基本生物活性的一些”指所述氨基酸序列具有超过或不同于背景活性的生物学活性并且表征所述活性的动力学参数，更具体地k_cat和K_M，优选在对于特定底物参考分子所显示的值的3个，更优选2个，最优选1个量级内。在优选实施方案中，术语核酸的“变体”包含这样的核酸，其互补链与参考或野生型核酸优选在严格条件下杂交。本领域技术人员容易确定杂交反应的严格性，并且通常是依赖于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验性计算。通常，较长的探针需要更高的温度用于适当的退火，而更短的探针需要更低的温度。杂交通常取决于变性DNA再退火到存在于低于其熔解温度的环境中的互补链的能力。探针和可杂交的序列之间所需的同源性程度越高，可以使用的相对温度越高。因此其遵循更高的相对温度将倾向于使反应条件更严格，而更低的温度较不严格。对于杂交反应的严格性的额外细节和解释参见，F. M. Ausubel (1995), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc.。此外，本领域技术人员可以遵循手册“The DIG System Users Guide for Filter Hybridization”, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany, 1993中和Liebl 等 (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)中给出的关于如何借助杂交鉴定DNA序列的指导。在优选实施方案中，对于任一杂交均应用严格条件，即仅当探针与目标序列70%或更多相同时才发生杂交。关于目标序列具有较低同一性程度的探针可以杂交，但是这样的杂交体不稳定并且将在严格条件下的清洗步骤中被去除，例如降低盐浓度至2 x SSC或，任选地和随后，至0.5 x SSC，而温度以优选递增的顺序是约50℃–68℃，约52℃–68℃，约54℃–68℃，约56℃–68℃，约58℃–68℃，约60℃–68℃，约62℃–68℃，约64℃–68℃，约66℃–68℃。在具体优选的实施方案中，所述温度为约64℃–68℃或约66℃-68℃。可以将盐浓度调节到0.2 x SSC或甚至0.1 x SSC。可以分离关于参考或野生型序列具有至少70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的同一性程度的多核苷酸片段。在优选的实施方案中，如本文所用术语核酸序列的“同源物”指根据遗传密码的简并性，与参考核酸序列编码相同氨基酸序列的任何核酸序列。

可选地，所述alkB型氧化还原酶可以作为全细胞生物催化剂提供。在优选实施方案中，如本文所用术语“全细胞生物催化剂”指以允许alkB型氧化还原酶与烯烃接触的方式表达所述alkB型氧化还原酶的活细胞。在优选实施方案中，所述alkB型氧化还原酶位于外细胞膜并因此暴露于全细胞生物催化剂周围的水溶液。可选地，所述alkB型氧化还原酶在细胞内表达。

在优选的实施方案中，所述全细胞生物催化剂除了alkB型氧化还原酶之外还表达来自恶臭假单胞菌的alkL编码的多肽(登录号CAB69081.1)或其变体。

本发明的教导可以使用各种细胞进行。在优选的实施方案中，如本文所用术语“细胞”指包括细菌，古细菌，真菌，藻类等的任何永久性单细胞的细胞。在优选实施方案中，所述细胞是细菌细胞，更优选是来自于包含假单胞菌、棒杆菌（Corynebacterium）和大肠杆菌的组，最优选大肠杆菌的细胞。在另一个优选实施方案中，所述细胞是低等真核细胞，更优选来自于包含酵母属（Saccharomyces）、假丝酵母（Candida）、毕赤酵母（Picchia）、裂殖酵母（Schizosaccharomyces）和耶氏酵母（Yarrowia）的组的真菌，并且最优选是酿酒酵母（Saccharomyces cerivisiae）。在本申请中，术语“细胞”与术语“微生物”同义和互换使用。所述细胞可以是分离的细胞，换句话说是单株细胞的纯培养物，或可以包含至少两株的混合物。生物技术相关的细胞是可商购获得的，例如来自美国典型培养物保藏中心（ATCC）或德国微生物和细胞培养物保藏中心（DSMZ）。保持和修饰微生物的方法可从现有技术获得，例如Sambroke/Fridge/Maniadis (1989): Molecular cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Press, 2 ^nd  edition, Fuchs/Schlegel (2007), Allgemeine Mikrobiologie, 2008, Georg Thieme Verlag。

本发明的方法包括使烯烃与包含alkB型氧化还原酶的水溶液接触。此步骤不仅可以包括临时使烯烃与溶液接触，而且事实上在alkB型氧化还原酶的存在下孵育烯烃足够长时间，以允许氧化反应发生，例如至少1、2、4、5、10、或20小时。所选择的温度必需使得本发明的细胞保持能够催化和/或代谢活性，例如10至42℃，优选30至40℃，最优选32至38℃，在本发明的细胞是大肠杆菌细胞的情况下。

被氧化的烯烃可以是任何烯烃。在优选的实施方案中，如本文所用术语“烯烃”指式R_x-CH=CH-CR_yH₂表示的任何化合物，其中R_x是任何化学基团，并且R_y是氢或连同R_x或其部分形成亚烷基环。在另一个优选实施方案中，如本文所用术语“烯烃”指由式C_nH_2n表示的烃，其中n是或大于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30。在另一个优选实施方案中，所述烯烃是由式C_nH_2n-2表示的环烯，其中n是或大于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30。在优选实施方案中，所述烯烃在室温（25 ℃)和大气压下是气态烯烃，例如异丁烯。这样的烯烃的氧化反应产生醇或羧酸，其中至少一个伯碳原子分别带有羟基基团或羧酸基团。

气态烯烃优选在超过大气压的局部压力下存在，优选在室温（25 ℃）下测量的，例如以大于1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10巴。存在的所有气态化合物例如氧气、气态烯烃和氮气的总的合并的压力可以大于1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10巴。

术语“水溶液”包括任何包含水作为主要溶剂的溶液，其可以用以保持表达ALKB型氧化还原酶的全细胞生物催化剂（至少是暂时的）以代谢活性和/或有活力的状态或alkB型氧化还原酶有催化能力，并且包括（如果这样是必要的）任何额外的底物。本领域技术人员熟悉各种可用于生长和维持的细胞的水溶液，通常称为培养基，例如在大肠杆菌的情况下，LB培养基。在优选的实施方案中，所述水溶液保持在有氧条件下。由于相比基本培养基生长速率增加，使用完全培养基用于培养要用作全细胞生物催化剂的细胞是有利的。

作为水溶液用于进行本发明方法，或使用简单缓冲液或基本培养基是有利的，所述基本培养基是合理的简单组成的培养基，相比复杂培养基，其仅包含用于使细胞保持在代谢活性和/或有活力的状态不可缺少的最少的盐和营养物的集合。例如，M9培养基可以用作基本培养基。如果要被氧化的烷基在水中具有有限的溶解性，可以向水溶液中添加去垢剂，如吐温或曲拉通，或可以使用疏水溶剂来溶解要被氧化的烷基。本领域技术人员熟悉各种水和有机溶液的制备。

该反应可以以分批模式或连续模式运行。本领域技术人员熟悉适当的发酵罐和/或反应容器。

按照本发明的教导，可以氧化烯烃使得产生特定比例的氧化产物。在优选实施方案中，如本文所用术语“产生的酸的比例大于所产生的氧化产物的整体的X%”指X%的通过AlkB型氧化还原酶氧化的烯烃分子转化为相应的酸而非相应的醇或醛。例如，如果1mol异丁烯接触AlkB型氧化还原酶，0.5mol被该氧化还原酶氧化，并且0.25mol被氧化获得异丁烯酸，则所产生的酸的比例大于氧化产物的整体的50%。在优选实施方案中，所产生的酸的比例大于所产生的氧化产物的整体的10、20、30、40、50、60、70、80或90%。在优选的实施方案中，如果反应以分批反应模式运行，则所产生的酸的比例在反应已基本上达到平衡后确定，如果反应以连续模式运行，则所产生的酸的比例考虑离开运行的反应容器的分子来确定。

本发明进一步通过下列图和非限制性实施例进行阐释，从其中可以取得本发明的进一步的特征、实施方案、方面和有利之处。

图1显示如实施例1中观察的2-甲基-2-丙烯-1-醇随时间的浓度。

图2显示如实施例1中观察的异丁烯酸随时间的浓度。

实施例1：使用包含来自恶臭假单胞菌GPO1的单加氧酶（AlkBGT）的大肠杆菌W3110的异丁烯的氧化。

a）以10 l规模的生物量的产生

种子前培养物：制备1L LB培养基（5g/l酵母提取物、10g/l蛋白胨、0.5g/l NaCl，溶于1L水，在121℃高压灭菌20分钟）。

25ml每种此溶液转移到5个带有挡板的100ml摇瓶中，补充通过过滤灭菌的25μl卡那霉素溶液(50 g/l)，并使用200ml每种大肠杆菌 W 3110 pBT 10 (WO2009/677461)甘油冻存培养物（cryoculture）接种。这些培养物在37℃和200rpm（幅度2.5cm）下孵育18小时。

种子培养物：制备1 L 高密度细胞培养基 (HCD-培养基)，其包含1.76 g/l NH₄SO₄、19.08 g/l K₂HPO₄、12.5 g/l KH₂PO₄、6.66 g/l 酵母提取物、1.96 g/l 柠檬酸钠、17 ml 柠檬酸铁铵溶液(1 %)、5 ml 微量元素溶液 US3 (1 L 微量元素溶液 US 3 包含 36.5 g HCl 37 %、1.91 g MnCl₂ x 4H₂O、1.87 g ZnSO₄ x 7H₂O、0.8 g EDTA钠 x 2H₂O、0.3 g H₃BO₃、0.25 g Na₂MoO₄ x 2H₂O、4.7 g CaCl₂ x 2H₂O、17.8 g FeSO₄ x 7 H₂O、0.15 g CuCl₂，溶于1 L水。)、 30 ml 补料溶液 (葡萄糖 50 % w/v、MgSO₄ x 7 H₂O 0.5 % w/v、NH₄Cl 2.2 % w/v)、1 ml 卡那霉素溶液(50 g/l)。包含NH₄SO₄ 至柠檬酸钠的948 ml溶液进行高压灭菌，其它组分通过分开过滤灭菌并随后添加。pH为6.8。

将5 x 75 ml HCD培养基转移到带挡板的1000 ml摇瓶中，每个接种25 ml种子前培养物并在37 ℃和200 rpm(幅度 2.5 cm)孵育30小时。

无菌的10 L发酵罐使用7 L无菌培养基设置，所述培养基包含1.75 g/l (NH₄)₂SO₄、19 g/l K₂HPO₄ x 3 H₂O、12.5 g/l KH₂PO₄、6.6 g/l酵母提取物、2.24 g/l 柠檬酸钠 x 2H₂O、15 g/l 葡萄糖、0.49 g/l MgSO₄ x 7 H₂O、16.6 ml/L柠檬酸铁铵溶液(1 % w/v)、15 ml/l微量元素溶液(如种子培养物)、1 ml/L 卡那霉素溶液(50 mg/l)和2 ml消泡剂(Delamex)。作为补料，连接高压灭菌的葡萄糖溶液(50 % w/v)，所述溶液包含MgSO₄ x 7H₂O 10g/l，并且使用0.5 M H₂SO₄ 和25 % NH₄OH用于pH校正。

来自摇瓶的培养物以无菌方式混合并用于经由中转瓶接种发酵罐。发酵条件为：pO₂ 30 %，气流6 nlpm，搅拌400 – 1200 rpm，温度37 ℃，pH 7，补料开始8小时，补料速率150 – 250 g/h。经过19小时后，温度降低到30℃，并且使用0.4mM DCPK诱导培养物。经过23小时后，发酵罐中的OD₆₀₀为约100，以无菌方式移出培养液，并在1000ml离心瓶中（每个含500ml溶液）在8000rpm离心收集（spun down）。弃上清，并且10g沉淀等份分在离心管（falcon tube）中。沉淀可以立即用于生物转化或可以冷冻在–80 ℃供进一步的使用。

b）异丁烯的生物转化

三份如a）部分中所述制备的生物量沉淀每份重悬在pH7的50ml 70mM磷酸铵缓冲液（组成：8 g/L (NH₄)H₂PO₄、0.5 g/L NaCl、0.49g/L MgSO₄ x 7H₂O、1 ml微量元素溶液 US3和50 μg/l 卡那霉素)。使用5 % NH₄OH调节pH。

将包含约3滴高压灭菌的消泡剂（Delamex）的150ml磷酸铵缓冲液转移到三个灭菌的300ml发酵罐的每一个中。以6巴的初始压力的包含25%异丁烯和75%来自气瓶的合成空气的气体混合物经由具有0.2 μm孔径的金属interperlator以约15Nl/h的流速导入到发酵罐中。发酵罐的温度使用水浴维持在40℃，并且其内容物使用磁力搅拌器以900rpm进行搅拌。输出的气体通过各包含150ml水的洗瓶。

使用50ml重悬的生物量沉淀（各自经由取样管）接种发酵罐。分批（10g/L)或连续补料（1.8g/lh)添加葡萄糖。使用2.5%氨水分别维持pH在7.0或6.3。各自经过55、130、250和420分钟从发酵罐取出6ml样品。在室温以10000g将样品离心10分钟，并且过滤上清液。使用HPLC进行层析分析，作为Agilent techonologies 1200设备部分使用折光率检测器和二极管阵列检测HPLC。使用Aminex HPX-87H-柱 (300mmx 7.8 mm)。使用10 mM H₂SO₄作为洗脱液，以0.6 ml/min流速和40 ℃的柱温运行该设备。被分析的所有化合物的标准品制备在超纯水中，并在相同条件下测量。通过比较保留时间进行评价。2-甲基-2-丙烯-1-醇和异丁烯酸随时间的浓度描绘于图1和2。

Claims (10)

1.单加氧酶用于氧化烯烃为醇和/或酸的用途，所述单加氧酶优选是AlkB型氧化还原酶，更优选是来自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）GPO1或其变体的AlkB。

2.根据权利要求2的用途，其中所述烯烃由式（I）表示

其中R¹、R²和R³每个和独立地选自包含H–(CH₂)_x–的组，其中x是0或更多，其中R¹、R²和R³的两个可以形成环烷基，优选烷基包含5或6元，并且其中优选R¹、R²和R³每个和独立地选自包含H–(CH₂)_x–的组并且x是1至24。

3.根据权利要求2的用途，其中R⁴是甲基。

4.根据权利要求3的用途，其中 R¹ = R² = 氢或 R¹ = R³ = 氢，并且优选 R¹ = R² = R³ = 氢。

5.根据权利要求4的用途，其中R¹ = R² = 氢并且R³是甲基。

6.根据权利要求5的用途，其中R1 = R2 = 氢并且R³是-CH=CH₂。

7.根据权利要求1至6任一项的用途，其中所述烯烃在室温和大气压下是气态。

8.根据权利要求1至7任一项的用途，其中所述烯烃氧化成氧化产物的混合物，并且所产生的酸的比例大于所产生的氧化产物整体的25%，优选大于所产生的氧化产物整体的40%。

9.根据权利要求1至8任一项的用途，其中所述氧化还原酶作为表达所述氧化还原酶的全细胞催化剂提供。

10.根据权利要求1至9任一项的用途，其中所述醇和/或酸由式（II）表示

其中R¹是HO–(CH₂)_x–或HOOC–(CH₂)_x–，且R²和R³每个和独立地选自包含H–(CH₂)_x–的组，其中x是0或更多，其中R²和R³可以形成环烷基，优选烷基包含5或6元，并且其中优选R²和R³每个和独立地选自包含H–(CH₂)_x–的组，并且x是1至24。