CN104049091B - 一种检测乙醇脱氢酶的方法及试剂盒 - Google Patents

一种检测乙醇脱氢酶的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医学检测技术领域，公开了一种检测乙醇脱氢酶的方法及试剂盒。本发明所述检测乙醇脱氢酶的方法可有效除去样品中酮类物质的内源性干扰，提高乙醇脱氢酶催化乙醛的反应的特异性，保证乙醇脱氢酶检测结果的准确性。实验表明，本发明所述检测乙醇脱氢酶的方法检测结果准确性高、灵敏度好，精密度好，线性范围宽。本发明所述试剂盒稳定性好，保存期长，方便在全自动生化分析仪上检测，适用范围广，便于推广使用，可广泛应用于各级医院、卫生预防部门和医学生物科研单位测定血清中乙醇脱氢酶含量。

Description

一种检测乙醇脱氢酶的方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及医学检验测定技术领域，具体的说是涉及一种检测乙醇脱氢酶的方法及试剂盒。
背景技术
乙醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase，简称ADH)的系统名为：H乙醇H：辅酶I氧化还原酶(alcohol：NAD+oxidoreductase)，在乙醇代谢中起着中重要作用。主要存在于人体肝脏中，95％在肝中心小叶区，为诊断肝细胞坏死的特异性指标，其他组织含量甚微，而心、胰、骨骼肌、红细胞等不含此酶，因此有良好的器官特异性。由于有器官特异性，在肝病定位上可弥补谷丙转氨酶(ALT)轻度增高非特异性反应的不足，可作为鉴别诊断定位依据。
乙醇脱氢酶偏高的原因可以分为中毒性肝细胞损伤和病毒性肝炎。中毒性肝细胞损伤，如肿瘤化疗药物等，引起ADH增高。另外大量饮酒造成的急性肝损伤，血清ADH也会呈不同程度增高。而病毒性肝炎，特别是重症肝炎、肝坏死，血清ADH会显著增高。除与常规ALT、谷草转氨酶(AST)、γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)有一定相关性外，ADH增高幅度与病情相关，是判定疗效和预后的指标。
目前，血清乙醇脱氢酶的测定方法主要有比色法和分光光度法。比色法是以对亚硝基二甲苯胺为底物，经ADH催化还原成有色染料，根据颜色深浅测定其活性。而分光光度法是根据ADH催化乙醇脱氢，使NADP+P还原生成NADH，通过在340nm下测定吸光度的增加来测定血清中乙醇脱氢酶的含量。但比色法和分光光度法费时且精确度及灵敏度较差，不适合临床使用。而且乙醇脱氢酶对底物的特异性不高，对其他的醛类物质亦能起反应，所以上述检测方法中准确性较差，特异性不好。
发明内容
有鉴于此，本发明目的是针对现检测乙醇脱氢酶的方法精确度及灵敏度较差等问题，提供了一种准确度高、特异性好的检测乙醇脱氢酶的方法及试剂盒。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测乙醇脱氢酶的方法，在pH7.0～7.5的缓冲液中，待测样品与乙醛、除干扰剂、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸混合，在340nm波长处检测吸光度变化，通过每分钟吸光度的变化率计算待测样本中乙醇脱氢酶的含量。优选的，
作为优选，包括α-酮戊二酸、乳酸脱氢酶和乙二酸钠。
作为优选，所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸缓冲液。
本发明还提供了一种检测乙醇脱氢酶的试剂盒，包括乙醛溶液、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、pH7.0～7.5的缓冲液和除干扰剂。
作为优选，所述乙醛溶液为体积浓度为30％～70％的乙醛水溶液。
作为优选，所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸缓冲液。
作为优选，所述除干扰剂包括α-酮戊二酸、乳酸脱氢酶和乙二酸钠。
作为优选，本发明所述检测乙醇脱氢酶的试剂盒还包括防腐剂。
作为优选，所述防腐剂为叠氮钠。
作为优选，本发明所述检测乙醇脱氢酶的试剂盒包括体积浓度为30％～70％乙醛水溶液、1g/L～5g/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、100mmol/L～200mmol/LpH7.0～7.5三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸缓冲液、0.05wt％～0.5wt％叠氮钠、0.1wt％-0.5wt％α-酮戊二酸、1kU/L～5kU/L乳酸脱氢酶和4wt％-15wt％乙二酸钠。
与现有技术相比，本发明所述检测乙醇脱氢酶的方法可有效除去样品中酮类物质的内源性干扰，提高乙醇脱氢酶催化乙醛的反应的特异性，保证乙醇脱氢酶检测结果的准确性。实验表明，本发明所述检测乙醇脱氢酶的方法检测结果准确性高、灵敏度好，精密度好，线性范围宽。本发明所述试剂盒稳定性好，保存期长，方便在全自动生化分析仪上检测，适用范围广，便于推广使用，可广泛应用于各级医院、卫生预防部门和医学生物科研单位测定血清中乙醇脱氢酶含量。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种检测乙醇脱氢酶的方法及试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品和方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品和方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测乙醇脱氢酶的方法，在pH7.0～7.5的缓冲液中，待测样品与乙醛、除干扰剂、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸混合，在340nm波长处检测吸光度变化，通过每分钟吸光度的变化率计算待测样本中乙醇脱氢酶的含量。
本发明所述检测乙醇脱氢酶的方法，在pH7.0～7.5缓冲液中，以乙醛为底物，在除干扰剂的作用下，待检样品中的乙醇脱氢酶催化乙醛脱氢，使烟酰胺腺嘌呤二核苷酸被氧化，在340nm波长处检测吸光度变化，通过每分钟吸光度的变化率(NADH的消耗速率)测定待测样本中乙醇脱氢酶的含量。待测样品中乙醇脱氢酶的含量按如下公式计算：
乙醇脱氢酶含量(U/L)＝理论因数×△A/分钟，
其中，上式中△A/分钟通过仪器测定的，为待测样品每分钟吸光度的变化率；理论因数为已知的，计算公式为：理论因数(K)＝103×VT//(6.22×VS×b)＝2063(103：mmol转化umol的因数；VT：反应液总体积；6.22：NADH在340nm处的毫摩尔消光系数；VS：样品体积；b：比色杯光径(cm))。
乙醇脱氢酶，又名醛还原酶，英文名为Alcoholdehydrogase，缩写为ADH。可催化醛类、醇类及酮类物质脱氢，故ADH本身对底物的特异性不高，检测时易发生干扰反应，在反应过程中消耗还原型辅酶，对还原型辅酶吸光度的下降速率造成影响，进而影响待测样品中ADH检测的准确性。本发明所述检测方法中除干扰剂与待测样品混合，催化内源性酮类物质发生还原反应，除去待测样品中的内源性丙酮酸，使还原型辅酶在3～5min内达到恒定水平，提高ADH检测的准确性。
其中，作为优选，本发明所述检测乙醇脱氢酶的方法中所述除干扰剂包括α-酮戊二酸、乳酸脱氢酶和乙二酸钠。
在一些实施例中，所述除干扰剂为α-酮戊二酸、乳酸脱氢酶和乙二酸钠的混合物。
在pH7.0～7.5的缓冲液中，在α-酮戊二酸存在下，乳酸脱氢酶催化样品内源性丙酮酸发生还原反应生成乳酸，除去待测样品中的内源性丙酮酸，使还原型辅酶在3～5min内达到恒定水平，乳酸脱氢酶与样品中的内源性丙酮酸反应，在反应延迟期消除样品内源性丙酮酸，使还原型辅酶达到一个平衡，提高ADH检测的准确性。而乙二酸钠可络合样品中的重金属离子防止重金属离子抑制有效反应，提高乙醇脱氢酶催化乙醛的反应的特异性，进一步保证乙醇脱氢酶检测结果的准确性。
为了酶与底物很好的结合，酶和底物都需要缓冲液提供适宜的解离环境。缓冲液的离子强度也影响着酶的活性，离子强度过高，电解质干扰酶和底物结合，酶活性将逐步下降，但离子强度过低也可能无法激活酶活性。一般选择与生理环境的体液比较接近的离子强度。作为优选，本发明所述检测乙醇脱氢酶的方法中所述缓冲液为pH7.0～7.5三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸缓冲液。三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸缓冲液不仅起缓冲作用，还可起到防腐的作用，此外可作为底物参与除酮体干扰的作用，提高反应的特异性。
进一步的，为了保证待测样品中乙醇脱氢酶充分反应，本发明所述检测乙醇脱氢酶的方法中所述乙醛、除干扰剂、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸均过量。
本发明还提供了一种检测乙醇脱氢酶的试剂盒，包括乙醛溶液、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、pH7.0～7.5的缓冲液和除干扰剂。
其中，作为优选，本发明所述检测乙醇脱氢酶的试剂盒中，所述乙醛溶液为体积浓度为30％～70％的乙醛水溶液。更优选为体积浓度为30％～70％的乙醛水溶液。
作为优选，本发明所述检测乙醇脱氢酶的试剂盒中，所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸缓冲液。三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸缓冲液不仅起缓冲作用，还可起到防腐的作用，此外可作为底物参与除酮体干扰的作用，提高反应的特异性。
进一步的，作为优选，所述缓冲液的浓度为100mmol/L～200mmol/L。
作为优选，本发明所述检测乙醇脱氢酶的试剂盒中，所述除干扰剂包括酮戊二酸、乳酸脱氢酶和乙二酸钠。
在一些实施例中，本发明所述检测乙醇脱氢酶的试剂盒中，所述除干扰剂为α-酮戊二酸、乳酸脱氢酶和乙二酸钠。其中所述α-酮戊二酸浓度优选为0.1％～0.5％，更优选为0.2％；所述乳酸脱氢酶浓度优选为1kU/L～5kU/L，更优选为4kU/L；所述乙二酸钠浓度优选为4wt％-15wt％，更优选为5wt％。
进一步的，本发明所述检测乙醇脱氢酶的试剂盒还包括防腐剂。
作为优选，所述防腐剂为叠氮钠。进一步的，所述叠氮钠工作浓度为0.05wt％～0.5wt％，更优选为0.1wt％。
在一些具体实施方案中，本发明所述检测乙醇脱氢酶的试剂盒包括体积浓度为30％～70％乙醛水溶液、1g/L～5g/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、100mmol/L～200mmol/LpH7.0～7.5三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸缓冲液、0.05wt％～0.5wt％叠氮钠、0.1wt％-0.5wt％α-酮戊二酸、1kU/L～5kU/L乳酸脱氢酶和4wt％-15wt％乙二酸钠。
进一步的，在一些实施例中，本发明所述检测乙醇脱氢酶的试剂盒由体积浓度为2.4g/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、50v/v％乙醛、140mmol/LpH7.0～7.5三羟甲基氨基甲烷-丙氨酸缓冲液、0.2wt％叠氮钠、0.4wt％α-酮戊二酸、4kU/L乳酸脱氢酶和5wt％乙二酸钠组成。
本发明提供的检测乙醇脱氢酶的试剂盒可以为单一试剂。如，将缓冲液与乙醛、叠氮钠、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、除干扰剂制成单一试剂。本发明提供的检测乙醇脱氢酶的试剂盒也可以为多试剂。如，将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、除干扰剂制成第一试剂，将缓冲液与乙醛、叠氮钠制成第二试剂，在检测时，将第一试剂与第二试剂混合，从而检测待测样品中的乙醇脱氢酶；或者将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、除干扰剂配制为液体试剂后冻干，制成冻干粉，将缓冲液与乙醛、叠氮钠制成缓冲液，在利用该乙醇脱氢酶试剂盒检测时，将干粉用缓冲液溶解后，用于检测待测样品中的乙醇脱氢酶；
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：本发明所述检测乙醇脱氢酶的试剂盒。
本发明所述检测乙醇脱氢酶的试剂盒为液体单一试剂，包括：2.4g/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、30v/v％乙醛、140mmol/LpH7.0～7.5三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸缓冲液、0.2wt％叠氮钠、0.2wt％α-酮戊二酸，4kU/L乳酸脱氢酶，10wt％乙二酸钠。
实施例2：本发明所述检测乙醇脱氢酶的试剂盒。
本发明所述检测乙醇脱氢酶的试剂盒为双试剂，第一试剂包括2.4g/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、0.4wt％α-酮戊二酸和4kU/L乳酸脱氢酶，10wt％乙二酸钠第二试剂包括150mmol/LpH7.0～7.5三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸缓冲液、50v/v％乙醛和0.5wt％叠氮钠。
实施例3：本发明所述检测乙醇脱氢酶的试剂盒。
本发明所述检测乙醇脱氢酶的试剂盒为液体干粉试剂，干粉包括：2.4g/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、0.4wt％α-酮戊二酸和4kU/L乳酸脱氢酶，缓冲液包括150mmol/LpH7.0～7.5三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸缓冲液、50v/v％乙醛和0.5wt％叠氮钠，10wt％乙二酸钠。
实施例4：检测乙醇脱氢酶的方法。
设定全自动生化分析仪反应温度37℃，反应方法为速率法，测定主波长340nm，反应方向为负反应，延迟时间60s，测量时间为120s，理论因数为2063。然后取待测样品与试剂盒中的试剂混合均匀后，置于全自动生化分析仪，检测并记录340nm波长下的吸光度变化值。根据计算公式C样＝△A样/min×K，计算待测样品中乙醇脱氢酶的浓度，其中，C样为待测样品浓度；△A样/min为待测样品每分钟吸光度变化率；K为理论因数，已设定为2063。
实施例5：本发明所述试剂盒准确性检测
以不同浓度的乙醇脱氢酶溶液作为待测样品，与本发明实施例1所述试剂盒的试剂混合，按照实施例4所述方法(本发明所述检测方法)，对待测样品进行测试，利用日立7080全自动生化分析仪检测待测样品中的乙醇脱氢酶含量，每个浓度样本重复测定3次，计算样本测定结果的平均值()，按下式计算相对偏差(B％)，结果见表1。
表1不同浓度样品乙醇脱氢酶检测结果
由表1结果可见，本发明所述检测方法B％＜2％，符合《体外诊断试剂通用要求》，表明本发明所述检测方法准确性好。
实施例6：本发明所述试剂盒重复性检测
以常规血清样本作为待测样品，分成10份，分别与实施例1所述试剂盒混合，按照实施例4所述方法，利用日立7080全自动生化分析仪检测待测样品中的乙醇脱氢酶含量，结果见表2。
表2样品重复性检测结果
实施例1试剂盒
24.8
26.1
25.1
24.4
26.1
26.1
25.3
24.1
27.4
24.6
CV％＝4.00％
由表2的结果可见，采用本发明所述试剂盒检测乙醇脱氢酶的变异系数CV为4.00％，小于12％，符合《体外诊断试剂通用要求》，表明本发明所述试剂盒重复性好。
实施例7：本发明所述试剂盒线性的检测
取乙醇脱氢酶浓度接近50U/L的高值血清，稀释成5个不同的浓度梯度，理论浓度值依次为10、20、30、40、50U/L，与实施例1所述试剂盒混合，按照实施例4所述方法，利用日立7080全自动生化分析仪检测待测样品中的乙醇脱氢酶，每个浓度测定2次，取平均值，根据公式计算相关系数r值，结果见表3。
表3样品线性检测结果
由表3的结果可见，本发明所述检测方法线性范围可达50U/L，表明本发明所述检测方法线性范围宽、适用范围广。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.一种检测乙醇脱氢酶的试剂盒，其特征在于，包括乙醛溶液、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、pH7.0～7.5的缓冲液和除干扰剂；
所述除干扰剂为α-酮戊二酸、乳酸脱氢酶和乙二酸钠。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述乙醛溶液为体积浓度为30％～70％的乙醛水溶液。
3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸缓冲液。
4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，还包括防腐剂。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为叠氮钠。
6.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，包括体积浓度为30％～70％乙醛水溶液、1g/L～5g/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、100mmol/L～200mmol/LpH7.0～7.5三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸缓冲液、0.05wt％～0.5wt％叠氮钠、0.1wt％-0.5wt％α-酮戊二酸、1kU/L～5kU/L乳酸脱氢酶和4wt％-15wt％乙二酸钠。
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