CN104046578A - 一种慢生根瘤菌培养基的配置方法及其配制的培养基 - Google Patents

Abstract

一种慢生根瘤菌培养基的配制方法及其配置的培养基，方法包括混合5重量份的K₂HPO₄、5重量份的KH₂PO₄、4重量份的MgSO₄·7H₂O、2重量份的NaCl，加入以重量份单位为克相比的1ml的1wt％的柠檬酸铁溶液，和1ml的1wt％的MnSO₄溶液，再加入200重量份的大豆粉，4重量份的CaCO₃，然后用量筒量取1000ml的蒸馏水，并搅拌至完全溶解，调节培养基的pH值为6.8-7.0，将培养基装入锥形瓶，简单的封口，用高压灭菌锅在121℃灭菌40分钟，待灭菌锅压力降到0Pa，取出培养基自然降温。该方法活菌数高，生产成本低，适合大量工业发酵的培养基。

Description

一种慢生根瘤菌培养基的配置方法及其配制的培养基

技术领域

本发明涉及一种培养基的配置方法及其配置的培养基，特别的，本发明涉及一种慢生根瘤菌培养基配置方法及其配置的培养基。 

背景技术

接种根瘤菌剂已成为世界各国豆科作物增产的一项技术措施。根瘤菌剂主要有琼脂、固体、颗粒、液体和动感等5种主要剂型。琼脂剂型是最早应用的菌剂，也是应用较为广泛的剂型。在许多国家都有大规模的商品菌剂生产和出售，应用面积也不断扩大。因此，如何能够得到活菌数高，生产成本低，适合大量工业发酵的培养基成为现有技术亟需解决的技术问题。 

发明内容

本发明的目的在于提出一种慢生根瘤菌培养基配置方法及其配制的培养基。使得能够获得活菌数高，生产成本低，适合大量工业发酵的培养基。 

为达此目的，本发明采用以下技术方案： 

一种慢生根瘤菌培养基的配制方法，包括如下步骤： 

步骤1.准确称取5重量份的K₂HPO₄、5重量份的KH₂PO₄、4重量份的MgSO₄·7H₂O、2重量份的NaCl，置于大烧杯中； 

步骤2.相对于步骤1中的16重量份的混合物，单位为克，往所述大烧杯中加入1ml的1wt％的柠檬酸铁溶液，和1ml的1wt％的MnSO₄溶液； 

步骤3.准确称取大豆粉200重量份置于大烧杯中，所述大豆粉为干大豆磨成粉状，剔除表皮制成； 

步骤4.准确称取4重量份的CaCO₃置于玻璃容器中，将步骤3得到的混合 物与CaCO₃在玻璃容器中混合； 

步骤5.相对于步骤1中的16重量份的混合物，用量筒量取1000ml的蒸馏水加入所述玻璃容器中，用玻璃棒搅拌至完全溶解并混合均匀得到培养基； 

步骤6.调节所述培养基的pH值为6.8-7.0； 

步骤7.所述培养基装入锥形瓶中，简单的封口，用高压灭菌锅在121℃灭菌40分钟，待灭菌锅压力降到0Pa，取出培养基，置于无菌操作台上，让其自然降温。 

优选地，在步骤4中，还和CaCO₃一起加入300重量份的琼脂，同时在步骤7之后，还具有步骤8，待培养基温度降到约60℃，以无菌操作将培养基倒入无菌的有盖培养皿，每个培养皿放置少量的培养基，待培养基冷凝后将培养皿倒置，使所述培养皿的盖子向下。 

优选地，其中，无菌操作要求为：将培养基从所述锥形瓶中倒入所述培养皿中在酒精灯的无菌区来操作，但不能离火焰太近，倒培养基时培养皿的盖子的开口不超过45°。 

优选地，步骤4中所述玻璃容器为所述大烧杯，或试管。 

优选地，其中，配置柠檬酸铁溶液，或MnSO₄溶液的方法为：取柠檬酸铁或MnSO₄1g放入小烧杯中，加100ml蒸馏水溶解，如果是配置柠檬酸铁溶液，一边加热一边搅拌，加热前应在100ml位置处做标线，加热过程中及时补充蒸发水分，保证溶剂恒量。 

优选地，在步骤2中添加柠檬酸铁溶液，或MnSO₄溶液的方法：用移液枪 移液至大烧杯中，移液之前，要保证移液器、枪头和液体处于相同温度，吸取液体时，移液器保持竖直状态，将枪头插入液面下2－3毫米，在吸液之前，先吸放几次液体以润湿吸液嘴，并保证吸液嘴上不能悬挂有液滴。 

优选地，在步骤6中调节pH值的方法为：用pH计测定培养基的pH值，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH边加边搅拌，反之，用1mol/L HCl进行调节，将pH调节至6.8-7.0。 

优选地，所述培养基各个成分的配比为：大豆粉10g，K₂HPO₄0.25g，KH₂PO₄0.25g，MgSO₄·7H₂O0.2g，NaCl0.1g，CaCO₃0.2g，1wt％的柠檬酸铁1ml，1wt％的MnSO₄1ml，蒸馏水1000ml。 

本发明还公开了一种慢生根瘤菌培养基，采用上述的方法制成。 

因此，本发明通过不同培养基的比较和优化实验，得到了活菌数高，生产成本低，适合大量工业发酵的培养基。可以应用于矿山生态治理、土壤生态修复、根瘤菌的扩繁及研究等领域。 

具体实施方式

本发明意在寻找一种最优的培养基的配比，促进根瘤菌快速生长，保证培养基中的活菌数量高，生产成本低，以达到经济效益和生态效益的双赢。通过不同培养基的比较和优化实验，得到了活菌数高，生产成本低，适合大量工业发酵的培养基的配置方法，包括如下步骤： 

步骤1.准确称取5重量份的K₂HPO₄、5重量份的KH₂PO₄、4重量份的MgSO₄·7H₂O、2重量份的NaCl，置于大烧杯中； 

步骤2.相对于步骤1中的16重量份的混合物，单位为克，往所述大烧杯中加入1ml的1wt％的柠檬酸铁溶液，和1ml的1wt％的MnSO₄溶液； 

步骤3.准确称取大豆粉200重量份置于大烧杯中，所述大豆粉为干大豆磨成粉状，剔除表皮制成； 

步骤4.准确称取4重量份的CaCO₃置于玻璃容器中，将步骤3得到的混合物与CaCO₃在玻璃容器中混合； 

步骤5.相对于步骤1中的16重量份的混合物，用量筒量取1000ml的蒸馏水加入所述玻璃容器中，用玻璃棒搅拌至完全溶解并混合均匀得到培养基。 

步骤6.调节所述培养基的pH值为6.8-7.0。例如，用pH计测定培养基的pH值。如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH边加边搅拌，反之，用1mol/L HCl进行调节，将pH调节至6.8-7.0。 

步骤7.将配制好的培养基装入锥形瓶中，简单的封口。本领域技术人员应当知道，简单的封口指的是封闭开口，但不做到密封。例如，棉塞塞住瓶口后用干净的报纸和橡皮筋扎口，或者如果使用无盖的锥形瓶灭菌，可在瓶口包上一层铝箔纸，不能密闭，以免受热膨胀把容器胀碎。用高压灭菌锅在121℃灭菌40分钟，待灭菌锅压力降到0Pa，取出培养基，置于无菌操作台上，让其自然降温。 

根据上述的方法，可以培养出培养基，通常为液体培养基。 

优选的，在步骤4中，还和CaCO₃一起加入300重量份的琼脂，同时在步骤7之后，还具有步骤8，待培养基温度降到约60℃，以无菌操作将培养基倒入无菌的有盖培养皿，每个培养皿放置少量的培养基，例如约15-20ml的培养基，待培养基冷凝后将培养皿倒置，使所述培养皿的盖子向下。这样就能够制造出固体培养基。 

其中，无菌操作要求为：将培养基从所述锥形瓶中倒入所述培养皿中在酒精灯的无菌区来操作，但不能离火焰太近，倒培养基时培养皿的盖子的开口不宜过大，开口过大易污染培养基，优选地，所述盖子的开口不超过45°。 

其中，在配置柠檬酸铁溶液，或MnSO₄溶液的方法为：取柠檬酸铁或MnSO₄1g放入小烧杯中，加100ml蒸馏水溶解，如果是配置柠檬酸铁，由于柠檬酸铁难溶，需一边加热一边搅拌，加热前应在100ml位置处做标线，加热过程中及时补充蒸发水分，保证溶剂恒量。 

进一步的，在步骤2中添加柠檬酸铁溶液，或MnSO₄溶液的方法：用移液枪溶液至大烧杯中，移液之前，要保证移液器、枪头和液体处于相同温度。吸取液体时，移液器保持竖直状态，将枪头插入液面下2－3毫米，在吸液之前，先吸放几次液体以润湿吸液嘴(尤其是要吸取粘稠或密度与水不同的液体时)，并保证吸液嘴上不能悬挂有液滴。 

其中，步骤4中所述玻璃容器可以仍然为所述大烧杯，即将4重量份的CaCO₃放入大烧杯中与步骤3得到的混合物混合。步骤4中的所述玻璃容器也可以为试管，以便进行分装，在配置固体培养基时，CaCO₃和琼脂在常温下属难溶物质，优选，将CaCO₃和琼脂放入试管内，以便进行精确的配比，以确保 得到的各个培养基的营养物质成分相同，同时避免了过量的营养元素对根瘤菌的生长产生抑制。 

实施例1：液体培养基 

成分配比 

大豆粉10g，K₂HPO₄0.25g，KH₂PO₄0.25g，MgSO₄·7H₂O0.2g，NaCl0.1g，CaCO₃0.2g，柠檬酸铁(1％)1ml，MnSO₄(1％)1ml琼脂15g，蒸馏水1000ml。 

具体配制方法 

1.按所需培养基比例，用天平准确称取K₂HPO₄、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、NaCl，置于大烧杯中。 

2.柠檬酸铁、MnSO₄各称取1g放入小烧杯中，加100ml蒸馏水溶解，柠檬酸铁难溶需一边加热一边搅拌，加热前应在100ml位置处做标线，加热过程中及时补充蒸发水分，保证溶剂恒量；用移液枪分别移取一定比例的溶液至大烧杯中。移液之前，要保证移液器、枪头和液体处于相同温度。吸取液体时，移液器保持竖直状态，将枪头插入液面下2－3mm。在吸液之前，可以先吸放几次液体以润湿吸液嘴，尤其是要吸取粘稠或密度与水不同的液体时，应保证吸液嘴上不能悬挂有液滴。 

3.按一定比例称取大豆粉置于大烧杯中，大豆粉为干大豆磨成粉状，剔除表皮而成。 

4.按比例称取CaCO₃置于大烧杯中。 

5.用量筒量取一定比例的蒸馏水加入大烧杯中，用玻璃棒搅拌至完全溶解并混合均匀。 

6.调节pH值。用pH计测定培养基的pH值。如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH边加边搅拌，反之，用1mol/L HCl进行调节，将pH调节至6.8-7.0。 

7.将配制好的培养基装入锥形瓶中，棉塞塞住瓶口后用干净的报纸和橡皮筋扎口，如用无盖的锥形瓶灭菌，可在瓶口包上一层铝箔纸，不能密闭，以免受热膨胀把容器胀碎。用高压灭菌锅在121℃灭菌40分钟，待灭菌锅压力降到0Pa，取出培养基，置于无菌操作台上，让其自然降到常温。 

实施例2，配置固体培养基 

成分配比 

大豆粉10g，K₂HPO₄0.25g，KH₂PO₄0.25g，MgSO₄·7H₂O0.2g，NaCl0.1g，CaCO₃0.2g，柠檬酸铁(1％)1ml，MnSO₄(1％)1ml琼脂15g，蒸馏水1000ml。 

配置方法 

1.按所需培养基比例，用天平准确称取K₂HPO₄、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、NaCl，置于大烧杯中。 

2.柠檬酸铁、MnSO₄各称取1g放入小烧杯中，加100ml蒸馏水溶解,柠檬酸铁难溶需一边加热一边搅拌，加热前应在100ml位置处做标线，加热过程中及时补充蒸发水分，保证溶剂恒量；用移液枪分别移取一定比例的溶液至大烧杯中。移液之前，要保证移液器、枪头和液体处于相同温度。吸取液体时，移液器保持竖直状态，将枪头插入液面下2－3毫米。在吸液之前，可以先吸放几次液体以润湿吸液嘴,尤其是要吸取粘稠或密度与水不同的液体时，应保证吸液嘴上不能悬挂有液滴。 

3.按一定比例称取大豆粉置于大烧杯中，大豆粉为干大豆磨成粉状，剔除表皮而成。 

4.按比例称取琼脂、CaCO₃置于试管中，将步骤3中的混合物加入试管中，以便进行精确测量，确保各个培养基的营养物质成分相同，同时避免了过量的营养元素对根瘤菌的生长产生抑制。 

5.用量筒量取一定比例的蒸馏水加入试管中，用玻璃棒搅拌至完全溶解并混合均匀。 

6.调节pH值。用pH计测定培养基的pH值。如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH边加边搅拌，反之，用1mol/L HCl进行调节，将pH调节至6.8-7.0。 

7.将配制好的培养基装入锥形瓶中，棉塞塞住瓶口后用干净的报纸和橡皮筋扎口，如用无盖的锥形瓶灭菌，可在瓶口包上一层铝箔纸，不能密闭，以免受热膨胀把容器胀碎。用高压灭菌锅在121℃灭菌40分钟，待灭菌锅压力降到0Pa，取出培养基，置于无菌操作台上，让其自然降温。 

8倒板.待培养基温度降到60℃左右，以无菌操作倒入无菌的有盖培养皿，每个培养皿约15-20ml的培养基。待培养基冷凝后将培养皿倒置，使所述培养皿的盖子向下。其中，无菌操作要求为：将培养基从所述锥形瓶中倒入所述培养皿中在酒精灯的无菌区来操作，但不能离火焰太近，倒培养基时培养皿的盖子的开口不宜过大，开口过大易污染培养基，优选地，所述盖子的开口不超过45°。 

本发明还公开了一种慢生根瘤菌培养基，采用上述的方法制的。 

因此，本发明通过不同培养基的比较和优化实验，得到了活菌数高，生产成本低，适合大量工业发酵的培养基。可以应用于矿山生态治理、土壤生态修复、根瘤菌的扩繁及研究等领域。 

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施方式仅限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定保护范围。 

Claims (9)

1.一种慢生根瘤菌培养基的配制方法，包括如下步骤：

步骤1.准确称取5重量份的K₂HPO₄、5重量份的KH₂PO₄、4重量份的MgSO₄·7H₂O、2重量份的NaCl，置于大烧杯中；

步骤2.相对于步骤1中的16重量份的混合物，单位为克，往所述大烧杯中加入1ml的1wt％的柠檬酸铁溶液，和1ml的1wt％的MnSO₄溶液；

步骤3.准确称取大豆粉200重量份置于大烧杯中，所述大豆粉为干大豆磨成粉状，剔除表皮制成；

步骤4.准确称取4重量份的CaCO₃置于玻璃容器中，将步骤3得到的混合物与CaCO₃在玻璃容器中混合；

步骤5.相对于步骤1中的16重量份的混合物，用量筒量取1000ml的蒸馏水加入所述玻璃容器中，用玻璃棒搅拌至完全溶解并混合均匀得到培养基；

步骤6.调节所述培养基的pH值为6.8-7.0；

步骤7.所述培养基装入锥形瓶中，简单的封口，用高压灭菌锅在121℃灭菌40分钟，待灭菌锅压力降到0Pa，取出培养基，置于无菌操作台上，让其自然降温。

2.根据权利要求1所述的慢生根瘤菌培养基的配制方法，其特征在于：

在步骤4中，还和CaCO₃一起加入300重量份的琼脂，同时在步骤7之后，还具有步骤8，待培养基温度降到约60℃，以无菌操作将培养基倒入无菌的有盖培养皿，每个培养皿放置少量的培养基，待培养基冷凝后将培养皿倒置，使所述培养皿的盖子向下。

3.根据权利要求2所述的慢生根瘤菌培养基的配制方法，其特征在于：

其中，无菌操作要求为：将培养基从所述锥形瓶中倒入所述培养皿中在酒精灯的无菌区来操作，但不能离火焰太近，倒培养基时培养皿的盖子的开口不超过45°。

4.根据权利要求1-3所述的慢生根瘤菌培养基的配制方法，其特征在于：

步骤4中所述玻璃容器为所述大烧杯，或试管。

5.根据权利要求4所述的慢生根瘤菌培养基的配制方法，其特征在于：

其中，配置柠檬酸铁溶液，或MnSO₄溶液的方法为：取柠檬酸铁或MnSO₄1g放入小烧杯中，加100ml蒸馏水溶解，如果是配置柠檬酸铁溶液，一边加热一边搅拌，加热前应在100ml位置处做标线，加热过程中及时补充蒸发水分，保证溶剂恒量。

6.根据权利要求5所述的慢生根瘤菌培养基的配制方法，其特征在于：

在步骤2中添加柠檬酸铁溶液，或MnSO₄溶液的方法：用移液枪移液至大烧杯中，移液之前，要保证移液器、枪头和液体处于相同温度，吸取液体时，移液器保持竖直状态，将枪头插入液面下2－3毫米，在吸液之前，先吸放几次液体以润湿吸液嘴，并保证吸液嘴上不能悬挂有液滴。

7.根据权利要求4所述的慢生根瘤菌培养基的配制方法，其特征在于：

在步骤6中调节pH值的方法为：用pH计测定培养基的pH值，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH边加边搅拌，反之，用1mol/L HCl进行调节，将pH调节至6.8-7.0。

8.根据权利要求4所述的慢生根瘤菌培养基的配制方法，其特征在于：

所述培养基各个成分的配比为：大豆粉10g，K₂HPO₄0.25g，KH₂PO₄0.25g，MgSO₄·7H₂O0.2g，NaCl0.1g，CaCO₃0.2g，1wt％的柠檬酸铁1ml，1wt％的MnSO₄1ml，蒸馏水1000ml。

9.一种慢生根瘤菌培养基，采用权利要求1-7中任一项所述的方法制成。