CN104035194B - 用于显微镜的浸没物镜和其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于显微镜的浸没物镜（100），其中物镜具有NA>1.36的数值孔径并且具有前透镜组（101），它具有作为物体侧的第一光学元件的平面平行板（103）和作为第二光学元件的多半球（102），其中所述平面平行板（103）附着在多半球（102）的平面侧面上。

Description

用于显微镜的浸没物镜和其应用

技术领域

本发明涉及一个用于显微镜的浸没物镜，具有NA>1.36的数值孔径。

背景技术

现有技术中已知用于显微镜的浸没物镜。在此在物镜与标本之间加入浸没液体，由此提高可实现的分辨率，从而在高放大率时也不产生虚的放大。另一效果是抑制降低对比度的反射，尤其在使用与玻璃具有几乎相同的折射率的浸没油时。在NA=1.4的数值孔径的油浸没物镜中在波长为500nm时得到例如217nm的最大分辨率。数值孔径的上限由浸没介质的折射率给出，它对于油一般为1.518。

下面不失一般性地考虑油浸没物镜在实践中的相关情况。其它可能的浸没介质是水、甘油或硅油。但是本发明也适用于其它浸没介质。

油浸没物镜的常见使用领域是荧光显微镜。在这里必需要注意到，使用的浸没油没有自激荧光。

常见的油浸没物镜的特征通常是，最靠近物体的透镜组（前透镜组）至少由两个胶合透镜组成。在胶合时相邻的透镜面（它们必需具有相同半径）通过薄的、透明的胶层粘接到一起。大多由合成树脂制成的胶层也用于在两个没有胶的透镜之间的玻璃-空气表面上的全反射（和一般的反射）。但是所使用的胶在不同的显微镜应用中是有缺陷的。在某些显微方法中、尤其是荧光显微中以高功率的激光照明工作。由此尤其在激光聚焦到物镜里面的方法中导致在物镜内部，主要是在前透镜组的范围内的高强度。在那里使用的胶在以这种高强度照射时可能导致损伤。结果是在损伤的胶层位置产生阴影。

此外胶层显示出一定的自激荧光。这在（宽场）荧光显微方法中是不利的，因为在胶中产生的荧光同样大部分进入到图像里面并且在那里减小来自荧光试样的有用光的对比度。

由US7,199,938B2已知一种用于显微镜的复消色差的浸没物镜，具有物体侧的由胶合透镜组成的前透镜组。在这里前透镜组由平面-凸透镜（其平面的表面面对物体）和凹凸透镜（其凹面面对物体侧）组成并且与平面-凸透镜的凸面通过胶合连接。在该文中描述的物镜可以达到NA>1.4的数值孔径。

由US2002/0154414A1已知一种用于浸没应用、尤其是TIRF（全内反射荧光）的高孔径的显微镜物镜。前透镜组包括具有平面-凸透镜表面的正折光力的第一透镜，其中平面的表面面对物体。这个透镜与第二透镜胶合，第二透镜包围第一透镜的凸起表面并且具有负折光力。

此外由US7,046,451B2已知一个用于显微镜的油浸没物镜，具有NA>1.45的数值孔径，其第一物体侧的（正面）透镜组同样具有第一平面-凸透镜，其平面表面面对物体，其中平面-凸透镜与凹凸透镜胶合，后者的凸面面对图像侧。作为应用领域在这里也给出TIRF显微镜。在这里数值孔径要为AN>1.46。

一种已知的为了加工大孔径的结构原理（也是上述油浸没物镜的结构原理）为通过胶合将面对物体的平面-凸面透镜嵌入到第二透镜里面。但是透镜的胶合存在上述缺陷。

发明内容

因此本发明的目的是，给出一个用于NA>1.36的大数值孔径的显微镜的浸没物镜，它尽可能避免与使用胶合有关的缺陷（在高照射强度时损害胶合和/或胶层的自激荧光）。

本发明建议一种如权利要求1所述的用于显微镜的浸没物镜，以及这种浸没物镜在定位显微镜或TIRF显微镜中的应用。由各从属权利要求和下面的描述给出其它扩展结构。

按照本发明的具有NA>1.36的数值孔径的用于显微镜的浸没物镜具有前透镜组，即直接面对物体的透镜组，它具有平面平行板作为物体侧的第一光学元件和多半球作为第二光学元件，其中所述平面平行板附着（ansprengen）在多半球的平面侧面上。

对于光学专业人员公知概念“多半球”（英文“hyper hemisphere）。它是一个球的局部，具有大于180度、即超过顶点的打开角。这种多半球例如在图2b中示出。

下面要解释本发明对于油浸没物镜的具体情况，如同已经在说明书序言中提到的那样。但是本发明不局限于油浸没物镜。其它的浸没介质也可以在按照本发明的物镜中使用。

本发明的物镜具有在油浸没物镜部位中的新的附加物，其中所述平面平行板作为物体侧的第一光学元件带来整个物镜的全新设计。使用平面平行板能够使多半球的第二光学元件附着。在公知的附着技术中使两个光滑的、平面的表面没有污物颗粒地配合精确地相互对接（aufbringen），从而只通过分子引力保持相互间固定连接。所述平面平行板与多半球的平面侧面的连接必需是持久且稳定的。由于省去前透镜组的上述光学元件的相互胶合的必要性，没有由于高的光强度和胶的自激荧光可能损害胶的上述缺陷。已经令人惊奇地证实，与此相关的优点克服新的物镜设计的可能的缺陷（新的物镜结构的必要性和由于新的物镜带来的光学变差的可能性）。

在DE19929403A1中对于其它物镜类型、即用于半导体-平版印刷-投影照明设备的物镜，建议将薄的等距板附着至另一光学元件。所述薄的等距板在这里是所谓的封闭板，它使物镜防污并且密封。这个封闭板无框架地且可更换地附着至另一光学元件。

由DE10200243A1已知一种用于附着光学元件在对应元件上的一般方法。在此对应元件例如利用压电陶瓷变形，由此使其表面形状不再直接与光学元件的表面形状对应。在将光学元件对接在对应元件上以后连续地取消表面形状的改变，直到两个元件已经相互附着。

所述平面平行板有利地突出于多半球的平面侧面。这使得前透镜组能够机械地镶嵌或固定在突出的平面平行板上。原则上也可以设想相反的情况，如果多半球突出于平面平行板，则在多半球上实现机械的固定。

所述物镜放大率在按照本发明的油浸没物镜中最好为50倍至200倍，最好100倍至160倍。

已经证实，按照本发明的油浸没物镜的数值孔径可以为NA>1.40。尤其可以实现1.43、1.44或1.45的孔径。

所述平面平行板的厚度最多为1mm。此外0.6mm以下的厚度是有利的。作为下极限值0.4mm是有意义的。

特别有利的是，按照本发明的浸没物镜是平面复消色差的物镜。这公知地涉及一种修正色差并且使图形区在边缘部位也是平面的物镜。这尤其在使用TIRF显微镜时是特别有利的。特别地，也可以复消色差地利用按照本发明的浸没物镜的整个视觉范围。

按照本发明的浸没物镜有利地由三个透镜组G1，G2，G3组成。其中第一透镜组G1称为前透镜组，在这里即具有附着的平面平行板的多半球。第二透镜组G2由单透镜和胶合透镜组成，后者总共具有三个胶合面（即例如三个透镜对或者一个透镜对和一个三合透镜）。第三透镜组G3包括物镜的其余部分，它具有至少四个透镜，具有至少两个胶合面。所述透镜组G3一般不多于六个透镜。

在按照本发明的油浸没物镜中，其中具有上述序言中的透镜组G1至G3，如果满足下面的三个条件，对于有利地修正图形误差是适宜的。在这里f指焦距：

3.0<f（G1）/f（物镜）<4.0

6.0<f（G2）/f（物镜）<7.0

-15.5<f（G3）/f（物镜）<-14.5

按照本发明的浸没物镜尤其适用于定位显微镜以及TIRF显微镜。按照本发明的物镜也可以在荧光显微镜的所有其它方法中使用。

定位显微镜方法的特征在于，在摄取图像时总是只有几个物体点同时发射光。如果所述点比光学分辨率明显更远地相互远离，则可以通过用于确定质心的数学方法以比所使用的物镜的光学分辨率更高的精度确定这些点的位置。如果许多这样的单个图像相加，其中分别成像不同的物体点，最后可以以高分辨率图像地显示整个物体。这些方法的已知实施例的不同之处在于，如何保证，只几个物体点同时发射光。这些方法的名称例如是PALM、STORM或者GSDIM。下面要简述最后一种方法。

GSDIM源自（英文）“Groud State Depletion microscopy followed byIndividual Molecule return”。对于这种方法使用三重态（也称为“暗态”）荧光体。首先通过相应激光功率的入射使源自基态的颜料分子进入到激励的状态。从激励的状态过渡到三重态，其中这个三重态具有比激励的单态（只约3ns）高得多的使用寿命（约100ms），由此在足够的光强时分子以三重态蓄积。从三重态开始分子在自激发射条件下返回到基态。接收这个自激发射的单图像，其中通过上述的数学方法以高于光学分辨率的精度确定自激发射的位置。可达到的分辨率位于20至25nm，一般在60nm以下。可达到的分辨率也取决于激光功率和所使用相机的分辨率。

用于实现GSDIM的主要技术前提是以高的光功率荧光激励标本。这可以通过适合的激光照射实现。这种激光照射也可以由TIRF照射装置提供，它使激光射线聚焦到物镜光瞳里面（在物镜焦面后面）。其优点是，以大的照明景深得到均匀的标本照明。为了最佳地利用激光的光功率，减小激光的射线横截面，以使得照明的标本区与TIRF照明相比只为约四分之一（例如在使用放大率100倍的物镜时照明的标本区直径约为60μm，而在TIRF照明时这个直径约为250μm）。

关于TIRF显微镜简述如下。一般使用具有带非常大的数值孔径的油浸没物镜的反向光显微镜，以实现对于全反射所必需的表面入射角。全反射在从盖玻片到标本的边界面处实现。在盖玻片后面的范围里面形成所谓的倏逝场，其强度在标本中成指数地下降。对于可见光典型的入射深度为100至200nm。如果可以吸收入射波长光的荧光分子位于这个范围内，则其被激励以发射荧光。因为在标本中可观察的层厚只为100至200nm，因此可以沿着物镜的光轴达到比在一般的荧光显微镜（层厚范围一般为500nm）中明显更高的分辨率。在TIRF显微镜中激励光在物镜的边缘上耦入，由此使激励光以所需的表面角度入射到盖玻片上。

当然，上述的和下面还要解释的特征不仅可以在其各自给出的组合中、而且也在其它组合中或者独立地使用，而不偏离本发明的范围。

附图说明

借助于在附图中简示的实施例和下面的附图详细描述本发明。附图中：

图1简示出显微镜结构，以常见的荧光显微镜宽场方法，

图2示出按照本发明的物镜实施例的总视图（图2a）和其前透镜组的细节图（图2b），

图3简示出定位显微镜（图3a）和TIRF显微镜（图3b）的典型照明，

图4示出按照本发明的物镜实施例的光程，以总视图（图4a）和前透镜组的细节图（图4b）表示按照图3a的结构，

图5示出按照本发明的物镜实施例的光程，以总视图（图5a）和前透镜组的细节图（图5b）表示按照图3b的结构，

图6示出按照本发明的具有三个透镜组的油浸没物镜的特殊实施例，

图7示出这种物镜的功率图，即，纵向偏差（图7a）和正弦条件的损坏（英文：“OSC”，Offence against Sine-Condition）（图7b）。

具体实施方式

借助于下面的实施例要详细解释本发明的两个主要优点。一方面，在荧光显微镜中不会出现否则在两个光学表面之间常见的胶层中的自激荧光（见图1和2的实施例）。另一方面，对在两个光学表面的接触位置处产生非常高的光能密度的显微镜方法，不会损害否则在这些表面之间常见的胶层（对此参见图3、4和5的实施例）。

图1示出以常见的荧光显微镜宽场方法在以全孔径照明时的显微镜结构。光源（在这里未示出）、例如气体放电灯的光通过适合的照明光路（同样未示出）这样传播，使与标本7处于共轭的明场光阑面2被均匀地照明。在图1中以1表示光轴。照明透镜3准直来自明场光阑的光，后者被分反射镜偏转到物镜6里面。分反射镜4作为二色性的分反射镜一般配有前置的激励滤镜和后置的发射滤镜，大多以荧光滤镜组的形式。在此激励滤镜从照明光中选择激励波长，而发射滤镜为了提高对比度能够传输来自物体的荧光发射光并且阻隔其它波长范围。在图1中出于简单性没有详细给出这种通常公知的结构。

物镜6成像光在标本7上。在此物镜6的入射光瞳5一般完全被光充满。由荧光标本7给出的发射光本身通过物镜6、二色性的分光器4和通常连接在其后面的发射滤镜（在这里未示出）达到管透镜8，由此在图像面9中产生标本7的图像。

如同借助于图2a和2b解释的那样，物镜6入射光瞳5全照明的结果是，在物镜前透镜组中的大范围被光通过。如果前透镜组的相应透镜面通过胶连接，则胶显示出自激荧光。在胶层中产生的发射光根据波长谱可能完全或者部分地通过分反射镜4和发射滤镜并且达到图像面9，在那里由标本荧光发射产生的图像的对比度降低。

而如果如同在图2a和2b中所示的那样，使用按照本发明的物镜，不通过胶连接两个最前端的物体侧的光学元件，而是光学地接触（附着），由此也不会通过自激荧光产生干扰的发射光。

图2a示出在按照本发明的油浸没物镜100实施例中的光程111。该结构对应于在图1中所示的结构。物镜100的前透镜组以101表示。物镜的光瞳以105表示。图2b示出的局部涉及图2a的前透镜组101。前透镜组101具有平面平行板103、也称为平面小板以及多半球102，其中平面小板103附着在多半球102的平面一侧上。接触面以104表示。由图2b看出，在这个接触面104的大范围上光在标本7的方向上（参见图1）穿过。由于沿着接触面104没有胶从而避免上述的自激荧光。

图2b示出，平面平行板103在侧面方向突出于多半球102的平面表面。这个结构有两个优点：一方面，通过平面平行板103能够实现前透镜组的简单机械固定。另一方面，由多半球透镜与平面小板的组合提供了物镜光学修正方面的优点。

上述的第二个主要优点在显微镜方法中使得在物镜中达到高能量密度。这种显微镜方法的典型代表是定位显微镜和TIRF显微镜，两种都是荧光显微方法。下面借助于图3至5解释这些方法。

上述两种方法共同的是，激励光聚焦到物镜6的入射光瞳5里面。这个聚焦可以在光轴1的一个点上实现，如同在图3a中所示那样，或者侧面与其错开，如同在图3b中所示那样。与图1中相同的标记符号表示相同的零部件。因此参照结合图1的实施例。与图1不同，照明光首先达到翻转镜11并且从那里达到扫描目镜12，它使光聚焦在与物镜6入射光瞳5共轭的位置上。通过传输光路13使光聚焦到光轴1位置上的入射光瞳5里面（或者入射光瞳附近）。它产生靠近光轴的小孔径照明。

图3b源自图3a是适用于TIRF显微镜的结构，它与按照图3a的结构的主要不同只是，翻转镜11使照明光程从光轴1偏转出来，其中由扫描目镜12和传输光路13组成的光路保证，反射镜11的翻转被确定地转换为物镜6的后焦面5位置上的侧向偏移。按照图3b的结构以大的入射角得到小孔径的照明。在定位显微镜（图3a）与TIRF显微镜（图3b）的照明之间可以通过简单的方式转换，当切换为定位显微镜时，通过在翻转镜11前面使减小光束直径的透镜筒（未示出）翻入到光程中。由此减小在标本中照射的范围，从而可以显著地提高功率密度。

按照图3a的结构产生照明光程，它以围绕光轴1的小的范围以高功率密度照明标本7。由于上述原因定位显微方法需要这种高照明强度。在图4中详细示出通过物镜的相应光程。

在图3b中示出的光程以大的入射角照明标本7，如同对于上述的TIRF显微镜所需的那样。在图5中示出通过物镜的光程。

图4示出在按照图3a的结构中通过按照本发明的油浸没物镜100实施例的光程。标记符号对应于图2的标记符号；因此请参阅图2的解释。清楚地看出光轴附近小孔径的照明光程112。图4b以放大图示出前透镜组101。光程112只在围绕光轴的非常小的范围穿过平面平行板103与多半球102之间的接触面104。因此整个光能集中在这个小的范围里面，由此得到高的功率密度。这种高功率密度在接触面104上的胶合面中可能导致胶层损害。这些损害导致“盲斑”，它们降低图像以及照明的质量。由于在接触面104上没有胶，从而避免了这种缺陷。

图5最后示出按照本发明的油浸没物镜100实施例在按照图3b照明时的光程113。清楚地看出具有小孔径和大入射角的光程113。标记符号仍然与图2相同，因此也参阅图2。

图5b示出图5a的前透镜组101的放大图。可以清楚地看出，光程113在标本7方向上穿过接触面104的小范围。光程113以大的入射角进入标本7，用于在那里引起倏逝场照明。在接触面104的小范围中的高功率密度仍然可能导致损害常见的胶层。在这个接触面104上没有胶，从而避免了这种缺陷。

图6示出按照本发明的油浸没物镜100的特殊实施例，具有三个透镜组G1，G2和G3。透镜组G1是前透镜组101，如同上面已经详细解释过的那样。第二透镜组G2是单透镜和三个透镜对，即三个胶合的透镜对。透镜组G3是物镜的其余部分，在这里是两个透镜对。单个光学元件的表面如同常见那样编号。它们是表面1’至20’。在下面的表格中以常见的方式对于这些表面（F1）1’至20’给出相应的曲率半径（R,单位mm）、沿着光轴的间隔（d，单位mm）、折射率（n_e）和色散（v_e）。

F1	R/mm	d/mm	ne	ve
						1’	平面	0.53	1.62068	49.54	G1
2’	平面	3.15	1.57098	70.93
						3’	-2.45300	0.20
4’	257.52650	3.50	1.43985	94.49	G2
						5’	-7.78480	0.20
6’	20.91340	1.20	1.80811	46.32
						7’	9.61610	6.00	1.57098	70.93
8’	-11.15490	0.25
						9’	35.64880	4.00	1.59447	67.97
10’	-8.96400	1.20	1.64133	42.20
						11’	-84.89670	0.20
12’	15.85320	3.50	1.43985	94.49
						13’	-8.67990	1.20	1.88815	40.52
14’	219.36250	2.60
						15’	6.44310	3.50	1.43985	94.49	G3
16’	-49.92590	1.20	1.71616	53.61
						17’	6.81440	11.40
18’	7.56730	3.02	1.48914	70.22
						19’	2.99810	1.63	1.72310	29.28

20’

3.40630

由此描述的物镜是等光程的消色差镜头，具有1.25mm的焦距和NA=1.43的数值孔径。该焦距与焦距200mm的标准透镜筒相结合得到放大160倍的中间图像。在使用0.17mm厚的盖玻片时工作距离为W=0.10mm。该场平面对于利用照相机是最佳的。

为了有利地修正图像误差，透镜组G1至G3满足下面的条件（f=焦距）：

3.0<f（G1）/f（物镜）<4.0，

6.0<f（G2）/f（物镜）<7.0

-15.5<f（G3）/f（物镜）<-14.5

图7示出这种物镜的成像功率，其中图7a是纵向偏差（纵偏差），在图7b中示出OCR（正弦条件损害）。

曲线对于不同的波长标出e=546nm、g=436nm、C’=644nm和F’=480nm。在图7a中DOF指景深（英文“depth of focus”）,NA2指平方比例的数值孔径。在图7b中与通常一样以百分比标出正弦条件损害。

附图标记清单

1 光轴

2 明场光阑面

3 照明透镜

4 分反射镜

5 物镜的入射光瞳

6 物镜

7 标本

8 管透镜

9 成像面

11 翻转镜

12 扫描目镜

13 传输光路

100 油浸没物镜

101 前透镜组

102 多半球

103 平面平行板

104 接触面

105 物镜光瞳

111 光程

112 光程

113 光程

G1，G2，G3 透镜组

1’-20’ 透镜面

Claims (11)

1.一种用于显微镜的浸没物镜(100)，其中物镜具有NA>1.36的数值孔径并且具有前透镜组(101)，它具有作为物体侧的第一光学元件的平面平行板(103)和作为第二光学元件的多半球(102)，所述平面平行板具有两个平行的平面表面，所述多半球具有多半球表面和平面侧面，其中所述平面平行板的所述两个平行的平面表面中的至少一个和所述多半球的平面侧面均具有光滑平面表面，其中所述平面平行板(103)的所述两个平行的平面表面中的所述至少一个的光滑平面表面附着在多半球(102)的平面侧面的光滑平面表面上。

2.如权利要求1所述的物镜，其特征在于，所述平面平行板(103)突出于多半球(102)的平面侧面。

3.如权利要求2所述的物镜，其特征在于，所述前透镜组(101)在突出的平面平行板(103)处被机械地镶嵌。

4.如权利要求1至3中任一项所述的物镜，其特征在于，所述物镜放大率为50倍至200倍。

5.如权利要求1至3中任一项所述的物镜，其特征在于，所述数值孔径为NA>1.40。

6.如权利要求1至3中任一项所述的物镜，其特征在于，所述平面平行板(103)的厚度最多为1mm。

7.如权利要求1至3中任一项所述的物镜，其特征在于，所述浸没物镜(100)是平面-复消色差的物镜。

8.如权利要求1至3中任一项所述的物镜，它由三个透镜组G1，G2，G3组成，其中第一透镜组G1由前透镜组(101)组成，第二透镜组G2由单透镜和总共具有三个胶合面的胶合透镜组成，第三透镜组G3是物镜的其余部分，其中对于焦距f满足下面的条件：

3.0<f(G1)/f(物镜)<4.0，

6.0<f(G2)/f(物镜)<7.0

-15.5<f(G3)/f(物镜)<-14.5。

9.如权利要求4所述的物镜，其特征在于，所述物镜放大率为100倍至160倍。

10.如权利要求6所述的物镜，其特征在于，所述平面平行板(103)的厚度最多为0.6mm。

11.使用了上述权利要求中任一项所述的浸没物镜(100)的定位显微镜或TIRF显微镜。