CN104031951A

CN104031951A - 一种利用乳酸菌静息细胞发酵生产γ-氨基丁酸工艺

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Publication number: CN104031951A
Application number: CN201410295837.3A
Authority: CN
Inventors: 田永强; 雷祖超; 刘波; 田杰伟; 王磊; 邱鹏; 龙秀锋
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2014-06-27
Filing date: 2014-06-27
Publication date: 2014-09-10

Abstract

本发明公开了乳酸菌静息细胞发酵生产γ-氨基丁酸（GABA）工艺，利用经过诱导的乳酸菌活性静息细胞体，分散于含有底物的转化缓冲液中，在合适的条件下转化生产γ-氨基丁酸。利用该方法可以大幅度缩短转化时间，提高转化效率，产物成份简单，利于分离提纯。且转化无需无菌条件，设备要求简单，耗能低。经条件优化，本工艺已适合工业化生产。附图说明：附图2为pH对乳酸菌株的生长与发酵生产GABA的影响(▼生长影响；▲发酵影响)。

Description

一种利用乳酸菌静息细胞发酵生产γ-氨基丁酸工艺

技术领域

本发明涉及γ-氨基丁酸生物转化的方法，特别是涉及利用乳酸菌的活性静息细胞作为转化反应的酶源。

背景技术

GABA在人体中是一种重要的抑制性神经递质，在脑内，GABA以突触后抑制为主，在脊髓中，GABA以突触前抑制为主，减少谷氨酸的释放，L-谷氨酸作为兴奋性神经递质，传递神经冲动，通过突触前抑制作用可以减少神经冲动的传递。如果人体内兴奋和抑制的平衡失控，将会导致许多神经紊乱相关的临床疾病。因此，GABA在人体内具有极其重要的生理功能，健脑益智，抗击癫痫，还能美容皮肤，延缓脑衰老，同时还具有镇静、催眠、抗惊厥、降血压、利尿、改善老年痴呆症和帕金森症等神经衰败症等的作用，还能降低血氨，解除氨毒，促进乙醇代谢。作为抑制剂，它还具有抑制癌细胞的增殖的作用。最近的一项研究表明，γ-氨基丁酸能够促进胰腺分泌胰岛素，并有效地防止糖尿病的发生。

GABA的制备方法主要有植物富集法、化学合成法和生物合成法三种。植物富集法操作复杂，且得率低，不适于规模化生产。化学合成法成本较高，得率较低，并且在生产工艺中使用危险溶剂，甚至是有毒溶剂。因此化学合成法制备的GABA不能用于食品，也不能被认为是一种天然食品添加剂。生物合成法相比较来说是一种既安全、又低成本的方法。

生物法合成GABA是利用生物所含谷氨酸脱羧酶，将L-谷氨酸或其钠盐经α-脱羧生成GABA的过程，再分离纯化得到GABA制品的方法。谷氨酸脱羧酶存在于多种细菌、古细菌和真菌中。乳酸菌是被人们普遍接受且安全的、对人体友好、有益的菌株，已经被广泛应用到食品发酵生产中。利用乳酸菌发酵生产GABA是一种环保有效的生物合成方法。

国内外对乳酸菌发酵生产GABA的研究主要是高产菌株的筛选及传统发酵方法的优化。但研究表明乳酸菌的生长与发酵转化产GABA所需的pH值并不一致，传统发酵方法为了保证发酵菌体的良好生长，同时兼顾GABA的高效转化，通常采用2步法控制发酵培养基的pH，首先保持菌体的最佳生长pH，待菌体生长到一定浓度后将pH条件为发酵转化的最佳值。同时传统发酵方法时间较长，需防止杂菌污染，且产物杂质较多。由此可以看出，传统发酵方法生产GABA操作复杂，产物分离困难，阻碍了工业化生产的进一步发展，需在发酵方式上进行改进，以简化发酵生产的条件控制及减少产物中杂质，以利于产物的分离纯化，从而降低生产成本，提高转化效率。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种利用乳酸菌转化生产GABA的新方法，将细胞培养与GABA转化过程彻底分开，简化控制条件控制，且能将每个部分的作用最大化，从而提高转化的综合效率。

本发明提出的一种利用乳酸菌静息细胞发酵生产γ-氨基丁酸工艺，步骤如下：

（1）将斜面上的GABA高产乳酸菌种接种于改良的MRS培养基中，培养基中含有2%-4%的谷氨酸脱羧酶诱导剂MSG，于30-40℃下静置培养20-40h。

（2）12000rmp，4℃离心上述培养液，收集菌体，并利用0.2M的柠檬酸缓冲液冲洗3遍，获得具有GABA转化能力的活性静息细胞体，备用。

（3）将所获得静息细胞均匀分散于转化缓冲液中，静息细胞的浓度为OD₆₀₀为1.0-8.0，pH控制在3.0-6.0，温度控制在25-35℃，缓冲液中引入了乙醇，浓度控制在0.5-2%，转速50-150rmp；转化时间3-5h获得GABA。

本发明所述的菌株是GABA高产乳酸菌株，包括短乳杆菌、肠球菌、戊糖片球菌等多种类群乳酸菌菌株。

本发明中在菌体培养阶段需要添加谷氨酸脱羧酶的诱导剂MSG，因该酶为诱导酶，只有经过诱导培养获得的静息细胞体才有GABA转化的活性。

本发明中采用改良的MRS培养基培养菌体，在合适的pH值下，菌体能够快速生长，能够在较短时间内获得大量菌体。

本发明中在转化缓冲液中引入乙醇，在0.5-2%的浓度下能大幅提高静息细胞转化产GABA的效率。

作为优选，所述的改良MRS各成份的质量浓度分别为蛋白胨(5 g/L)、牛肉膏(5 g/L)、酵母粉(20 g/L)、葡萄糖(20 g/L)、乙酸钠(2.5 g/L)、磷酸氢二钾(2 g/L)、柠檬酸二胺(1 g/L)、吐温0.1 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.05 g/L、碳酸钙20 g/L。pH为6.5-7.5。

作为优选，所述的柠檬酸缓冲液浓度为0.2M。

作为优选，所述的转化缓冲液为0.2M的柠檬酸缓冲液，含60-200mM的转化底物MSG

作为优选，转化缓冲液中引入乙醇，且体积浓度为0.5-2%。

本发明解决了传统发酵转化产GABA工艺过程中条件控制困难，产物成分复杂等问题。将细胞培养与GABA转化两个步骤分离开来，分别保证每个步骤都处于最优条件下，使细胞生长迅速、GABA转化高效，且保证了产物成分相对单一，便于分离提纯，提高了GABA生产的综合效率，节省成本。本发明的技术成熟，菌体培养迅速，静息细胞转化率高（90-95%），转化时间短，适合与工业规模化生产。

附图说明

图1 乳酸菌株的生长曲线

图2 pH对乳酸菌株的生长与发酵生产GABA的影响(▼生长影响；▲发酵影响)

图3 pH对静息细胞转化产GABA的影响

图4 乙醇浓度对静息细胞转化产GABA的影响

图5 温度对静息细胞转化产GABA的影响

图6 底物浓度对静息细胞转化产GABA的影响

图7 静息细胞转化过程中GABA的积累

图8 重复利用静息细胞对其转化效率的影响

具体实施方法

一下结合实施例进一步说明本发明，但不能理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属本发明的范围。

本实施例所采用的菌种为乳酸菌（Lactic acid bacteria）,包括短乳杆菌、肠球菌、戊糖片球菌等。

培养基及转化缓冲液成份1

斜面培养基：蛋白胨(5g/L)、牛肉膏(5g/L)、酵母粉(10 g/L)、葡萄糖(10 g/L)、乙酸钠(2.5 g/L)、磷酸氢二钾(0.5 g/L)、柠檬酸二胺(0.5 g/L)、吐温0.1 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.05 g/L、琼脂粉18g/L。pH为6.0。

改良MRS培养基：蛋白胨(5g/L)、牛肉膏(5g/L)、酵母粉(10 g/L)、葡萄糖(10 g/L)、乙酸钠(2.5 g/L)、磷酸氢二钾(0.5 g/L)、柠檬酸二胺(0.5 g/L)、吐温0.1 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.05 g/L。pH为6.0

转化缓冲液:0.2M的柠檬酸，60mM的转化底物MSG，乙醇0.5%（v/v）,pH为3.0。

培养基及转化缓冲液成份2

斜面培养基：蛋白胨(10g/L)、牛肉膏(10g/L)、酵母粉(20 g/L)、葡萄糖(20 g/L)、乙酸钠(5 g/L)、磷酸氢二钾(0.75 g/L)、柠檬酸二胺(0.5 g/L)、吐温0.1 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.05 g/L、琼脂粉18g/L。pH为6.0。

改良MRS培养基：蛋白胨(10g/L)、牛肉膏(10g/L)、酵母粉(20 g/L)、葡萄糖(20 g/L)、乙酸钠(5 g/L)、磷酸氢二钾(0.75 g/L)、柠檬酸二胺(0.5 g/L)、吐温0.1 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.05 g/L。pH为6.0

转化缓冲液:0.3M的柠檬酸，100mM的转化底物MSG，乙醇1.0%（v/v）,pH为4.0。

培养基及转化缓冲液成份3

斜面培养基：蛋白胨(5g/L)、牛肉膏(5g/L)、酵母粉(20 g/L)、葡萄糖(5 g/L)、乙酸钠(5 g/L)、磷酸氢二钾(1 g/L)、柠檬酸二胺(0.75 g/L)、吐温0.1 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.05 g/L、琼脂粉18g/L。pH为6.0。

改良MRS培养基：蛋白胨(5g/L)、牛肉膏(5g/L)、酵母粉(10 g/L)、葡萄糖(10 g/L)、乙酸钠(2.5 g/L)、磷酸氢二钾(1 g/L)、柠檬酸二胺(0.75 g/L)、吐温0.1 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.05 g/L。pH为6.0

转化缓冲液:0.4M的柠檬酸，120mM的转化底物MSG，乙醇1.25%（v/v）,pH为4.5。

培养基及转化缓冲液成份4

斜面培养基：蛋白胨(5g/L)、牛肉膏(5g/L)、酵母粉(10 g/L)、葡萄糖(10 g/L)、乙酸钠(2.5 g/L)、磷酸氢二钾(1.5 g/L)、柠檬酸二胺(1 g/L)、吐温0.1 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.05 g/L、琼脂粉18g/L。pH为6.0。

改良MRS培养基：蛋白胨(5g/L)、牛肉膏(5g/L)、酵母粉(10 g/L)、葡萄糖(10 g/L)、乙酸钠(2.5 g/L)、磷酸氢二钾(1.5 g/L)、柠檬酸二胺(1 g/L)、吐温0.1 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.05 g/L。pH为6.0

转化缓冲液:0.2M的柠檬酸，160mM的转化底物MSG，乙醇1.75%（v/v）,pH为5。

培养基及转化缓冲液成份5

斜面培养基：蛋白胨(5g/L)、牛肉膏(5g/L)、酵母粉(10 g/L)、葡萄糖(10 g/L)、乙酸钠(2.5 g/L)、磷酸氢二钾(2 g/L)、柠檬酸二胺(1 g/L)、吐温0.1 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.05 g/L、琼脂粉18g/L。pH为6.0。

改良MRS培养基：蛋白胨(5g/L)、牛肉膏(5g/L)、酵母粉(10 g/L)、葡萄糖(10 g/L)、乙酸钠(2.5 g/L)、磷酸氢二钾(2 g/L)、柠檬酸二胺(1 g/L)、吐温0.1 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.05 g/L。pH为6.0

转化缓冲液:0.3M的柠檬酸，200mM的转化底物MSG，乙醇2.0%（v/v）,pH为6。

实施例1

使用培养基及转化缓冲液成份1

(1)斜面培养：将分离的乳酸菌株接种于新鲜的斜面上，26℃培养20h

(2)菌体细胞培养及静息细胞获取：步骤（1）斜面上的培养菌株接种于改良的MRS培养基中，培养基中含有2%的谷氨酸脱羧酶诱导剂MSG，于30℃下静置培养20h。12000rmp，4℃离心上述培养液，收集菌体，并利用0.2M的柠檬酸缓冲液冲洗3遍，获得具有GABA转化能力的活性静息细胞体，备用。

(3)静息细胞转化：将步骤（2）所获得的活性乳酸菌静息细胞分散于1L转化缓冲液中，28℃，100rmp恒温孵育3h。（静息细胞在缓冲液中的浓度为OD₆₀₀=1.0）

实施例2

使用培养基及转化缓冲液成份2

(1)斜面培养：将分离的乳酸菌株接种于新鲜的斜面上，28℃培养24h

(2)菌体细胞培养及静息细胞获取：步骤（1）斜面上的培养菌株接种于改良的MRS培养基中，培养基中含有2.5%的谷氨酸脱羧酶诱导剂MSG，于32℃下静置培养24h。12000rmp，4℃离心上述培养液，收集菌体，并利用0.2M的柠檬酸缓冲液冲洗3遍，获得具有GABA转化能力的活性静息细胞体，备用。

(3)静息细胞转化：将步骤（2）所获得的活性乳酸菌静息细胞分散于5L转化缓冲液中，30℃，100rmp恒温孵育3h。（静息细胞在缓冲液中的浓度为OD₆₀₀=2.0）

实施例3

使用培养基及转化缓冲液成份3

(1)斜面培养：将分离的乳酸菌株接种于新鲜的斜面上，30℃培养30h

(2)菌体细胞培养及静息细胞获取：步骤（1）斜面上的培养菌株接种于改良的MRS培养基中，培养基中含有3%的谷氨酸脱羧酶诱导剂MSG，于34℃下静置培养30h。12000rmp，4℃离心上述培养液，收集菌体，并利用0.2M的柠檬酸缓冲液冲洗3遍，获得具有GABA转化能力的活性静息细胞体，备用。

(3)静息细胞转化：将步骤（2）所获得的活性乳酸菌静息细胞分散于10L转化缓冲液中，32℃，100rmp恒温孵育3h。（静息细胞在缓冲液中的浓度为OD₆₀₀=4.0）

实施例4

使用培养基及转化缓冲液成份4

(1)斜面培养：将分离的乳酸菌株接种于新鲜的斜面上，32℃培养40h

(2)菌体细胞培养及静息细胞获取：步骤（1）斜面上的培养菌株接种于改良的MRS培养基中，培养基中含有3.5%的谷氨酸脱羧酶诱导剂MSG，于36℃下静置培养36h。12000rmp，4℃离心上述培养液，收集菌体，并利用0.2M的柠檬酸缓冲液冲洗3遍，获得具有GABA转化能力的活性静息细胞体，备用。

(3)静息细胞转化：将步骤（2）所获得的活性乳酸菌静息细胞分散于20L转化缓冲液中，34℃，100rmp恒温孵育3h。（静息细胞在缓冲液中的浓度为OD₆₀₀=6.0）

实施例5

使用培养基及转化缓冲液成份5

(1)斜面培养：将分离的乳酸菌株接种于新鲜的斜面上，37℃培养48h

(2)菌体细胞培养及静息细胞获取：步骤（1）斜面上的培养菌株接种于改良的MRS培养基中，培养基中含有2%-4%的谷氨酸脱羧酶诱导剂MSG，于37℃下静置培养40h。12000rmp，4℃离心上述培养液，收集菌体，并利用0.2M的柠檬酸缓冲液冲洗3遍，获得具有GABA转化能力的活性静息细胞体，备用。

(3)静息细胞转化：将步骤（2）所获得的活性乳酸菌静息细胞分散于50L转化缓冲液中，38℃，100rmp恒温孵育3h。（静息细胞在缓冲液中的浓度为OD₆₀₀=8.0）。

Claims

1.一种利用乳酸菌静息细胞发酵生产γ-氨基丁酸工艺，其特征包括以下步骤：

(1)静息细胞获取：将具有γ-氨基丁酸转化能力的乳酸菌株从斜面培养基上接种于含有诱导剂-谷氨酸钠（MSG）的改良MRS培养基, 30-40℃培养20-40h，12000rmp，4^oC低温离心收集菌体，用柠檬酸缓冲液冲洗3遍后备用;

所说的斜面培养基为：蛋白胨(5-10g/L)、牛肉膏(5-10g/L)、酵母粉(10-20 g/L)、葡萄糖(10-20 g/L)、乙酸钠(2.5-5 g/L)、磷酸氢二钾(0.5-2 g/L)、柠檬酸二胺(0.5-1 g/L)、吐温0.1 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.05 g/L、琼脂粉18g/L,pH为6.0-8.0;

所说的改良MRS培养基为：蛋白胨(5-10g/L)、牛肉膏(5-10g/L)、酵母粉(10-20 g/L)、葡萄糖(10-20 g/L)、乙酸钠(2.5-5 g/L)、磷酸氢二钾(0.5-2 g/L)、柠檬酸二胺(0.5-1g/L)、吐温0.1 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.05 g/L,pH为6.0-8.0;

所说的柠檬酸缓冲液为：0.2M柠檬酸缓冲液;

(2)将活性乳酸菌静息细胞分散于转化缓冲液中，于30-40℃，100rmp孵育3-5h，完成转化,静息细胞在缓冲液中的浓度为OD₆₀₀值为1.0-8.0;

所说的转化缓冲液为0.2-0.4M的柠檬酸缓冲液，并含有60-200mM的转化底物MSG，乙醇0.5%-2%（v/v）,pH为3.0-6.0。