CN104004821A

CN104004821A - 一种单核苷酸多态性分析方法

Info

Publication number: CN104004821A
Application number: CN201310062203.9A
Authority: CN
Inventors: 郭安亮; 姚见儿; 王方金; 刘榴
Original assignee: Shanghai Toujing Life Sci & Tech Co Ltd
Current assignee: Shanghai Toujing Life Sci & Tech Co Ltd
Priority date: 2013-02-27
Filing date: 2013-02-27
Publication date: 2014-08-27

Abstract

本发明涉及一种单核苷酸多态性分析方法。揭示了一种测定已知单核苷酸多态性的新方法；针对待测基因模板，设计特异性引物分别向两个不同的方向扩增，控制另外两条分别与特异性引物配对的外围引物扩增效率，使整个PCR反应体系在野生型或者纯合突变型标本检测时只有一种型特异性PCR产物，在杂合标本检测时有两种PCR产物，明确区分野生型/杂合型/突变型。本发明为临床检测提供了一种结果稳定、重复性好、适用机型广的SNP分析方法。

Description

一种单核苷酸多态性分析方法

技术领域

本发明涉及体外诊断核酸分析检测技术领域；更具体地，本发明涉及一种单核苷酸多态性分析方法。

背景技术

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，是指基因组DNA中某一特定核苷酸位置上发生转换、颠换、插入或缺失等变化。SNP在人类基因组中广泛存在，大概每1000个碱基就有一个SNP。SNP是人类遗传学变异中最常见的一种。绝大多数疾病的发生与环境因素和遗传因素的综合作用有关，通常认为是在个体具有遗传易感性的基础上，环境有害因素作用而导致疾病。不同群体和个体对疾病的易感性、抵抗性以及其他生物学性状(如对药物的反应性等)有差别，其遗传学基础是人类基因组DNA序列的变异性，其中最常见的是SNP，占所有已知多态性的90%以上。随着人类基因组计划的进展，人们愈来愈相信基因组中的SNP有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病的易感性以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。因此，寻找和研究SNP已成为人类基因组计划的内容和目标之一。继限制性片段长度多态性和微卫星多态性这两个遗传标记之后，成为第三代分子标记。

SNP具有数量多，分布广及高度稳定性，适于快速、规模化筛查，易于基因分型等特点，很适合对复杂性状与疾病的遗传解剖以及基于群体的基因识别等方面的研究。SNP检测在分子诊断、临床检验、法医学、病原检测、遗传疾病和新药研发等方面凸显出越来越重要的价值。

SNP检测技术发展很快，出现了许多SNP检测技术。大致可以分为以下几种：(1)测序方法：Sanger双脱氧测序，焦磷酸测序(Pyrosequencing)，SNaPshot微测序；(2)基于杂交的方法：Taqman探针法，DNA芯片法；(3)熔解曲线：高分辨率熔解曲线分析技术(High Resolution Melt，HRM)；(4)引物延伸：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Timeof Flight，MALDI-TOF)；(5)变性高效液相色谱技术(Denaturing HighPerformance Liquid Chromatography，DHPLC)；(6)以构象为基础的方法：限制性片段长度多态性分析法(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)，单链构象多态性分析法(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP)，变性梯度凝胶电泳法(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)。

各种不同的检测方法，各有优缺点，以构象为基础的方法目前已很少使用，Sanger测序是SNP检测的金标准，能发现已知SNP，也能发现未知SNP；缺点是每个样本的每个位点均需要经PCR扩增，跑胶，然后切胶纯化，再测序，步骤多而分散，成本较高，工作量大，周期长，价格昂贵，不适合大样本多位点检测。微测序方法(SNaPshot)类似普通测序，10个位点PCR产物同时引物延伸，通量增加；劣势在于每个样品的每个位点都需要PCR预先扩增，跑胶，割胶，DNA纯化。10个位点可以同时测序，提高了测序效率，但对延伸引物要求极高，如每个引物有4-6个碱基差异，不能有互补区段，还要相同条件延伸，除厂家已经验证的少数位点外，很难自己设计针对新位点的检测。多个分散步骤，费钱费时，易出错。基于杂交的方法包括实时荧光Taqman探针检测和DNA芯片法，只能检测已知SNP位点，不能同时发现未知SNP，Taqman探针法的通量低，DNA芯片法的准确性低，需重复验证。MALDI-TOF和DHPLC优点是快捷、所需样标本量极少，MALDI-TOF适宜于已经优化的特定SNP检测，不适宜该服务从未做过的新SNP检测。DHPLC可判断有否突变，不能确定SNP的位置和类型，需用标准样品或结合测序验证。

不同核酸分子的片段长短、GC含量、GC分布等是不同的，任何双链DNA分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。高分辨率熔解曲线分析(high resolution melting analysis，HRM)就是在PCR反应体系中加入饱和染料，在PCR反应完成后进行升温变性，并在升温过程中采集荧光信号，随着温度升高，双链DNA逐渐减少，荧光强度也就下降了，仪器实时记录温度和荧光强度的变化，形成熔解曲线，根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分。高分辨率熔解曲线-HRM技术具有如下优点：高通量、简单、快速、低成本、高灵敏度；闭管检测，避免污染造成的假阳性；可检测已知和未知SNP；与传统的扩增后需借助额外的仪器进行凝胶电泳的非均一性的突变检测(例如dHPLC)相比，HRM提供了更高特异性和灵敏度的检测，同时允许更高的样本检测通量，大大降低了成本。

高分辨率熔解曲线对应分析为图像学分析，所有分析都基于野生型、突变型、杂合型参比品熔解曲线的结果，目前实验过程中，突变型多为质粒，质粒和标本扩增效率还是存在差异的，最后熔解曲线峰和实际的标本扩增结果有差异，会导致实验结果误判。另外HRM对标本定量要求非常严格，如果标本定量不准，不同标本之间扩增效率会有差异，会影响后面的分析结果，两种纯合状态可能会误判，也可能会被判读为未知突变。在标本定量较准的情况下，也有可能因为不同标本中存在的抑制PCR扩增的因素不一样，导致扩增效率有所不同，同样也会干扰最后的分析结果。

针对高分辨率熔解曲线法的一些弊端，需要一种适用机型更广，结果稳定，重复性好，适用于临床应用的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的单核苷酸多态性分析方法。

本发明提供一种基于等位基因特异性扩增的SNP检测方法，包括如下步骤：

(1)以待测基因为模板，以针对SNP位点的特异性引物以及与特异性引物配对的外围引物为引物，以Taq DNA聚合酶进行PCR扩增；

其中，所述的针对SNP位点的特异性引物包括：针对野生型等位基因位点的内引物1，以其3’末端碱基起算第1-3位的碱基与野生型SNP位点碱基匹配；针对突变型等位基因位点的内引物2，以其3’末端碱基起算第1-3位的碱基与突变型SNP位点碱基匹配而；

所述的外围引物是远离SNP位点的引物，包括：与内引物1构成引物对的外围引物1，与内引物2构成引物对的外围引物2；

并且，控制(抑制)外围引物1和外围引物2的扩增效率使之比内引物1和内引物2的扩增效率低；使外围引物1和外围引物2之间不形成扩增产物；

(2)分析PCR扩增产物，确定待测样品中待测基因的SNP类型(包括：野生型基因、突变型基因或杂合型基因)。

在一个优选例中，步骤(1)中，控制扩增效率的方法是：控制外围引物1的Tm值，使之比内引物1的Tm值低1-8℃(较佳地低2-7℃；更佳地低3-6℃；如5℃)；控制外围引物2的Tm值，使之比内引物2的Tm值低2-8℃(较佳地低2-7℃；更佳地低3-6℃；如5℃)。

在另一优选例中，步骤(1)中，控制扩增效率的方法是：控制外围引物1浓度使之比内引物1的浓度低5-20倍；控制外围引物2浓度使之比内引物2的浓度低5-20倍。

在另一优选例中，一个PCR扩增体系中，所述的外围引物与内引物的浓度相同或相近。

在另一优选例中，所述的内引物1和/或内引物2中，以其3’末端碱基起算，第2-6个碱基处设置一与待测基因模板不匹配的碱基；和/或所述的内引物2中，以其3’末端碱基起算，第2-6个碱基处设置一与待测基因模板不匹配的碱基。

在另一优选例中，内引物和外围引物中，除了上述特别限定的不匹配碱基外，其它碱基与待测基因模板相应碱基互补。

在另一优选例中，步骤(2)中，确定待测样品中待测基因的SNP类型的方法如下：

如生成单一的型特异性PCR产物，则判断为野生型基因或突变型基因；

如同时生成两种型特异性PCR产物，则判断为杂合型基因。

在另一优选例中，步骤(2)中，采用熔解曲线分析的方法分析PCR扩增产物。

在另一优选例中，以待测基因为模板，调整外围引物1和外围引物2的位置，使得内引物1和外围引物1扩增产物的熔解温度(Tm)与内引物2和外围引物2的扩增产物的熔解温度差异显著。

在另一优选例中，所述的熔解温度差异显著是应用熔解曲线分析仪器足够区分的差异(如扩增产物Tm值差异在2℃或以上；更佳地在3℃或以上；更佳地在4℃或以上)。

在另一优选例中，所述的内引物1或内引物2的长度为10-60bp(较佳地12-50bp；更佳地18-30bp)。

在另一优选例中，所述的外围引物1或外围引物2的长度为10-60bp(较佳地12-50bp；更佳地18-30bp)。

在另一优选例中，步骤(2)中，采用Taqman分析的方法分析PCR扩增产物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、特异性引物及突变的设计示意图，其中，长实线表示核苷酸链，表示两条核苷酸链中相应碱基之间存在匹配关系，或表示两条核苷酸链中相应碱基之间不存在匹配关系。

图2、对于野生型模板、突变型模板、杂合型模板，引物与模板结合扩增模式图。其中PF1、PR2表示两种特异性引物，PR1、RF2表示两种普通引物。

图3、本发明实施例中PCR扩增的流程示意图。

图4、实施例1中各组PCR扩增产物的电泳图。A：组别一；B：组别二；C：组别三；D：组别四。其中，P 10⁵表示参比品模拟的突变型标本(10⁵拷贝)，P 10⁴表示参比品模拟的突变型标本(10⁴拷贝)，P:H(1:1)表示突变型标本(10⁴拷贝)与野生型标本(10⁴拷贝)比例1:1混合模拟杂合标本(复孔)，HGD表示野生型标本，Blank表示空白对照。Marker为DL2000，其条带自下而上为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。

图5、实施例2中组一PCR扩增产物的熔解曲线图。A、TPMT2-PF01和TPMT2-PR01熔解曲线图；B-C、TPMT2-PF01和TPMT2-PR01HRM分析结果。

图6、实施例2中组二PCR扩增产物的熔解曲线图。A、PMT2-PF02和TPMT2-PR02熔解曲线图；B-C、TPMT2-PF02和TPMT2-PR02HRM分析结果。

图7、实施例2中组三：TP-2_W_F3，Set2-M R2，TP-2-F，TP-2-R2 PCR扩增产物的熔解曲线图。

图8、实施例3中组一PCR扩增产物电泳检测结果。其中，P10⁵表示参比品模拟的突变型标本(10⁵拷贝)，P 10⁴表示参比品模拟的突变型标本(10⁴拷贝)，P:H(1:1)表示突变型标本(10⁴拷贝)与野生型标本(10⁴拷贝)比例1:1混合模拟杂合标本(复孔)，HGD表示野生型标本，Blank表示空白对照。

图9、实施例3中组二PCR扩增产物电泳检测结果。各泳道定义同图8。

图10、实施例3中组一的熔解曲线；其中，A、突变型熔解曲线如，B、杂合型熔解曲线，C、野生型熔解曲线。

图11、实施例3中组二的熔解曲线；其中，A、突变型熔解曲线如，B、杂合型熔解曲线，C、野生型熔解曲线。

图12、应用Roche480进行熔解曲线绘制的结果；其中，A、野生型和突变型熔解曲线，B、杂合型熔解曲线。

图13、应用ABI7300进行熔解曲线绘制的结果；其中，A、野生型和突变型熔解曲线，B、杂合型熔解曲线。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，开发了一种测定已知SNP的新方法。针对待测基因模板，设计特异性引物分别向两个不同的方向扩增，控制另外两条分别与特异性引物配对的外围引物扩增效率，使整个PCR反应体系在野生型或者纯合突变型标本检测时，只有一种型特异性PCR产物，在杂合标本检测时，有两种PCR产物，明确区分野生型/杂合型/突变型。本发明为临床检测提供了一种结果稳定、重复性好、适用机型广的SNP分析方法。

如本文所用，所述的“内引物”与“特异性引物”或“等位基因特异性引物”可互换使用，是指针对SNP位点的引物，所述内引物3’末端碱基对应于SNP位点，分别与野生型和突变型模板匹配的引物。

如本文所用，所述的“外围引物”与“普通引物”可互换使用，是指

如本文所用，碱基的“匹配”或“配对”是指两条核苷酸序列中相应的碱基构成了键(如氢键)的连接，例如“A”与“T”之间可形成键。两条序列中足够多(如多于60%的核苷酸是配对的)核苷酸的“匹配”使得两条序列发生互补。

如本文所用，“熔解曲线(Dissociation curve)”指反映随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。

如本文所用，“熔解温度(Tm)”指总的DNA双螺旋结构降解一半的温度，不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G-C含量越高则Tm值越高，成正比关系。

本发明的方法基于等位基因特异性PCR(allele specific PCR；AS-PCR)，即将突变碱基设计于突变引物的3′端，利用引物与模板不能很好地匹配，延伸反应受阻，扩增反应后，根据电泳谱即可确定样品的基因型。由于PCR过程中引物延伸是3’端开始的，所以3’末端的碱基对引物的延伸来说处于至关重要的位置。如果这个碱基与模板互补，则引物能从不间断延伸，PCR可以正常进行，得到特定长度扩增带；反之亦然。所以只要将突变与正常等位基因所不同的那个碱基安排在3’最末端，当用某一含突变序列的引物进行PCR时，如果得到特异扩增带，表明被测基因含有该种突变。没有特异扩增带出现，则表示没有这种突变。

本发明的方法中，通过设计两条特异性引物(分别与两条模板链互补，且涵盖SNP位置)、两条普通引物(分布在两条特异性引物外围)，通过引物设计和反应体系中加入引物比例控制外围引物的有效扩增，从而在反应体系中，野生型和突变型标本检测时，只生成单一的型特异性PCR产物，杂合标本检测时，生成两种型特异性PCR产物。

作为本发明的优选方式，在特异性引物设计，结合扩增目的片段，将SNP突变位点置于引物3’端，同时在靠近引物3’端其它碱基处引入一个错配碱基，使之与另外一种模板之间形成双重错配以阻止错误延伸，而相对在靠近3’端存在错配的引物则可以较好与该模板互补，相应引物得以延伸并得到相应PCR扩增产物，达到选择性扩增靶标序列的目的。

一种引物及突变的设计如图1所示，其中①②分别为野生型和突变型特异性引物，③④分别为野生型和突变型模板，⑤⑥分别是①②引物中引入的突变。采用特异性引物针对SNP突变类型进行特异性扩增，野生型引物和突变型引物分别和模板的正义和反义链结合，分别向两个不同的方向扩增，并分别设计相配对的另外一条引物。控制外围引物的有效扩增，从而达到一个非常好的区分效果。结合SNP位点，引物和模板结合扩增模式图如图2。

采用双向多重特异性PCR扩增，可以在一个反应体系中对已知SNP进行检测，如果采用熔解曲线分析的方法，需要调整相应匹配的另外一条引物的位置，从而调整两种不同型特异性PCR产物的Tm值，达到区分不同特异性产物的目的。如果采用Taqman的分析方法，则需要在两种不同通道设计相关检测探针，通过两个不同通道的检测，区分不同特异性PCR产物。

作为本发明的优选方式，采用熔解曲线分析法。不同核酸分子的片段长短、GC含量、GC分布等是不同的，因此任何双链DNA分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。高分辨率熔解曲线HRM技术的基本原理就是在PCR反应之前加入饱和染料，在PCR反应之后进行升温变性，采集荧光信号，根据熔解曲线的不同即Tm值的不同来对样品来进行区分。而G-C突变和A-T突变Tm值差异非常小，采用HRM分析技术，区分突变尤为困难。本项发明针对G-C和A-T突变采用一种全新的解决方案，采用多重特异性PCR扩增的方法进行设计，采用普通熔解曲线分析方法，即可达到非常好的区分效果，该方案也可以很方便地拓展至双通道Taqman探针检测。

熔解曲线和Taqman探针检测法，双向多重特异性PCR扩增设计方法一致，仅检测手段不同；因此，虽然本发明的实施例仅围绕熔解曲线分析的方法展开，但是其它下游检测手段如Taqman探针检测法也应包含在本发明中。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例序列相关信息

野生型DNA序列(SEQ ID NO:1)突变GCA-CCA

tatagatctg ctttcctgca tgttctttga aaccctatga acctgaattc atataaattc

ctctaaatta aagaaaatat atgcttactc taatataacc ctctatttag tcatttgaaa

acataattta agtgtaaatg tatgatttta tgcaggtttgaccgggg acacagtgta

gttggtgtgg aaatcagtga acttgggata caagaatttt ttacagagca gaatctttct

tactcagaag aaccaatcac cgaaattcct ggaaccaaag tatttaaggt ttgttttgat

突变型DNA序列(SEQ ID NO:2)

tatagatctg ctttcctgca tgttctttga aaccctatga acctgaattc atataaattc

ctctaaatta aagaaaatat atgcttactc taatataacc ctctatttag tcatttgaaa

acataattta agtgtaaatg tatgatttta tgcaggtttgaccgggg acacagtgta

gttggtgtgg aaatcagtga acttgggata caagaatttt ttacagagca gaatctttct

tactcagaag aaccaatcac cgaaattcct ggaaccaaag tatttaaggt ttgttttgat

检测相关操作步骤

1、野生型DNA序列样本的制备

野生型样本制备直接从正常人外周血液中抽提人基因组DNA，正常人外周血DNA抽提步骤如下：

a.血液DNA抽提前，打开恒温水浴槽，将温度设定为70℃。

b.准备血液DNA抽提时，将OB蛋白酶从-20℃冰箱取出来，置于室温，解冻。

c.根据抽提标本的数量(大约每个样本250ul)，取出相应数量DNA洗脱缓冲液置于70℃预热。

d.取250ul标本置于一干净的小离心管，并做上标记。

e.加入25ul的OB蛋白酶，振荡均匀。加入250ul的XY缓冲液，剧烈振荡10秒以使溶液和标本混和均匀。

f.70℃水浴15min，水浴期间短时间内颠倒混匀管子一次，如果抗凝血放置时间较长，建议延长水浴时间至30min。

g.加入260ul的无水乙醇，混匀。

h.把Mu-Pu基因组DNA分离柱置于一个2ml收集试管中(已提供)，将第五步得到的溶液转入柱子中，10000rpm离心2min，弃去该收集试管和流出液。

i.置柱子于另一收集试管，用700ul的乙醇稀释的DNA洗涤缓冲液洗涤，10000rpm再次离心2min，弃去该收集试管及流出液。

j.加入700ul的DNA洗涤缓冲液再洗涤一次并按上一步条件离心。弃去流出液。

k.用极速(12000rpm)离心4min以甩干柱子。

l.将柱子置于一1.5ml灭菌离心管中，加入100ul70℃预热的DNA洗脱缓冲液。将离心管置于室温3min。

m.将柱子以10000rpm离心5min，以洗脱DNA。保留含DNA的流出液，弃去柱子，洗脱DNA。

n.将得到的DNA用HITCH分光光度仪检测OD260、OD280数值，平行测量三次，计算检测DNA浓度，纯度检定参考比值OD260/OD280为：1.5～2.0。

o.将测定的浓度归一化到10⁴拷贝，进行小量分装，-20℃保存备用。

2、突变型DNA序列样本的制备(突变参比品)

突变型标本比较难以获得，采用合成的方式，合成相应片段，装入pGEM-Teasy载体(Promega)，转化至大肠杆菌DH5α。抗性LB培养基体外培养，抽提质粒，得到的质粒重新定量，并稀释至10⁵拷贝、10⁴拷贝，并小量分装，-20℃保存备用。

3、杂合型DNA序列样本制备(杂合参比品)

将归一化至10⁴拷贝的野生型DNA序列样本和稀释至10⁴拷贝的突变DNA序列样本等量混合，并小量分装，-20℃保存备用。

4、PCR扩增

4.1引物的工作液的配制

a.由于引物为很轻的干粉附在管壁上，打开极易散失，在打开管盖前，将装有待稀释引物的离心管以15000rpm的转速，离心5分钟；

b.从离心机取出离心管后，小心打开管盖，加入相应体积的灭菌水(引物储存液浓度100uM)，然后将管盖盖紧；

c.将离心管置于涡旋仪漩涡振荡30s，然后以15000rpm的转速离心1分钟，室温静置30分钟；

d.将取出的引物液体稀释，用分光光度仪检测OD260、OD280数值，计算检测引物。参照定量结果，取少量储存液稀释至10uM。

4.3PCR扩增

流程如图3。

实施例1、特异性引物筛选实验

实验目的：引入突变，调整SNP位点和引入突变位点的位置及碱基，筛选特异性引物。

1、实验材料

采用野生型，突变型和杂合样本筛选引物，分析引物灵敏度和特异性。

2、实验分组

组别一：引物组TPPF_WT_1(特异性引物，简称“特”)和TP-2-R2(普通引物，简称“普”)；

组别二：引物组TPPF_WT_2(特)和TP-2-R2(普)；

组别三：引物组TP-2_W_F3(特)和TP-2-R2(普)；

组别四：引物组TP-2_W_F4(特)和TP-2-R2(普)。

3、引物序列及PCR产物相关信息

TPPF_WT_1：5’-TGTATGATTTTATGCAGGTTC-3’(SEQ ID NO:3)；

TPPF_WT_2：5’-TGTATGATTTTATGCAGGTTC-3’(SEQ ID NO:4)；

TP-2_W_F3：5’-AATGTATGATTTTATGCAGGTT-3’(SEQ ID NO:5)；

TP-2_W_F4：5’-AAATGTATGATTTTATGCAGGTT-3’(SEQ ID NO:6)；

TP-2-R2：5’-CTTCTGAGTAAGAAAGATTCTGC-3’(SEQ ID NO:7)。

注：碱基为SNP位点，碱基是设计引入的突变位点。

4、野生型标本制备，突变型样本制备，杂合样本制备，PCR扩增，具体操作如前面提供的相应序列信息及操作步骤。

PCR体系如下：

5、实验结果

检测结果如表1。

表1

注：Plasmids(10⁵)表示参比品模拟的突变型标本(10⁵拷贝)；Plasmids(10⁴)表示参比品模拟的突变型标本(10⁴拷贝)；P:HGD(1:1)表示突变型标本(10⁴拷贝)与野生型标本(10⁴拷贝)比例1:1混合模拟杂合标本；HGD表示野生型标本。Blank表示空白对照。

PCR扩增产物的电泳结果如图4所示。可见，TP-2_W_F3/TP-2-R2、TP-2_W_F4/TP-2-R2两组特异性引物Ct值在突变型标本与野生型标本及杂合标本之间存在显著性差异，效果较为理想。

6、结论

将SNP位点放在不同的地方，在不同的位置引入不同的突变，扩增效率会有所不同，可以通过调整引物中SNP位点和引入错配碱基的位置和引入不同的错配碱基来设计调整引物，以控制其非特异。

实施例2、普通引物和多重等位基因特异性引物PCR扩增熔解曲线分析

实验目的：考察普通引物和多重等位基因特异性引物PCR扩增熔解曲线分析结果。

1、实验材料

采用野生型，突变型和杂合样本考察不同引物组熔解曲线分析结果。

2、实验分组

普通引物组：组一：TPMT2-PF01(普)和TPMT2-PR01(普)，组二：TPMT2-PF02(普)和TPMT2-PR02(普)；

多重等位基因特异性引物组：组三：TP-2_W_F3(特)和TP-2-R2(普)，TP-2-F(普)和Set2-M R2(特)(引物比例有调整)。

3、引物序列及PCR产物相关信息

TPMT2-PF01：5’-AAATGTATGATTTTATGCAGGTTT-3’(Tm=55.6℃)(SEQ ID NO:8)；

TPMT2-PR01：5’-CACACCAACTACACTGTGTCCC-3’(Tm=57.5℃)(SEQID NO:9)；

PCR产物长度54bp。

TPMT2-PF02：5’-CCCTCTATTTAGTCATTTGAAAACA-3’(Tm=57.5℃)(SEQ ID NO:10)；

TPMT2-PR02：5’-TGATTTCCACACCAACTACACTG-3(Tm=57.7℃)(SEQID NO:11)；

PCR产物长度98bp。

TP-2_W_F3：5’-AATGTATGATTTTATGCAGGTT-3’(Tm=54.3℃)(SEQ ID NO:12)；

TP-2-R2：5’-CTTCTGAGTAAGAAAGATTCTGC-3’(Tm=53.0℃)；野生型PCR产物长度114bp。

TP-2-F：5’-CCCTCTATTTAGTCATTTGAAA-3’(Tm=51.7℃)(SEQ ID NO:13)；

Set2-M R2：5’-ACTGTGTCCCCGGTTG-3’(Tm=55.4℃)(SEQ ID NO:14)；

突变型PCR产物长度79bp。

注：碱基为SNP位点，单下划线加粗碱基是为了控制非特异引入突变位点。

4、野生型标本制备，突变型样本制备，杂合样本制备，PCR反应体系配制及PCR扩增，如前。

PCR体系如下：

组三中，TP-2_W_F3，Set2-M R2，TP-2-F，TP-2-R2调整引物比例，TP_2_W_F3(1ul，10uM)，TP-2-R2(0.1ul，10uM)，TP-2-F(0.1ul，10uM)，Set2-MR2(1ul，10uM)。可见，普通引物的浓度比特异性引物低10倍。

5、实验结果

PCR扩增的检测结果如表2。

表2

组一：TPMT2-PF01和TPMT2-PR01熔解曲线图如图5A；TPMT2-PF01和TPMT2-PR01HRM其它分析结果如图5B和5C。

组二：TPMT2-PF02和TPMT2-PR02熔解曲线图如图6A；TPMT2-PF02和TPMT2-PR02HRM其它分析结果图如图6B和6C。

组三：TP-2_W_F3，Set2-M R2，TP-2-F，TP-2-R2熔解曲线图如图7。

6、结论

(a)普通设计引物只能做高分辨率熔解曲线分析，且做高分辨率溶解曲线时，归一化熔解曲线峰图正常和突变型两条曲线非常接近，容易导致误判；做普通的熔解曲线分析除了杂合情况比较容易区分以外，野生型和纯合型没有办法分辨(如组一、组二结果)。

(b)多重等位基因特异性引物组，因为两组PCR产物Tm值差异相对较大，可以比较方便的采用熔解曲线分析模式，观察熔解峰图，判断相应实验结果(如组三结果)。

实施例3、外围引物扩增，对多重等位基因特异性引物PCR扩增熔解曲线分析的影响

实验目的：考察外围引物扩增，对多重等位基因特异性引物PCR扩增熔解曲线分析的影响。

1、实验材料

采用野生型，突变型和杂合样本考察不同引物组熔解曲线分析结果；

2、实验分组

组一：TP-2_W_F3(特)(1ul)，Set2-M R2(特)(1ul)和TP-2-F(普)(0.1ul)，TP-2-R2(0.1ul)(普)(外围引物不能有效扩增)；普通引物的浓度比特异性引物低10倍；

组二：TP-2_W_F3(0.5ul)(特)，Set2-M R2(0.5ul)(特)和TP-2-F(普)(0.5ul)，TP-2-R2(0.5ul)(普)(外围引物可以有效扩增)。

3、引物及PCR产物相关信息

TP-2_W_F3：5’-AATGTATGATTTTATGCAGGTT-3’(Tm=54.3)；

TP-2-R2：5’-CTTCTGAGTAAGAAAGATTCTGC-3’(Tm=53.0℃)；

野生型PCR产物长度114bp。

TP-2-F：CCCTCTATTTAGTCATTTGAAA-3’(Tm=51.7℃)；

Set2-M R2：5’-ACTGTGTCCCCGGTTG-3’(Tm=55.4)；

突变型PCR产物长度79bp。

注：碱基为SNP位点，碱基是为了控制非特异引入的突变位点。

PCR体系如下：

5、实验结果

溶解曲线分析结果如表3。

表3

组一PCR产物电泳检测结果如图8所示，组一的熔解曲线如图10所示，可见外围引物无法有效扩增，获得的熔解曲线可以明确地将突变型、杂合型与野生型区分。

组二PCR产物电泳检测结果如图9所示，组二的熔解曲线如图11所示，可见外围引物可以有效扩增。但是，获得的熔解曲线无法明确地将突变型、杂合型与野生型区分。

6、结论

(a)抑制外围引物的有效扩增，使之形成单一的型特异性PCR产物，通过调整外围引物的位置，改变相应PCR引物的Tm值，两种不同的型特异性PCR产物，Tm值差异显著，可以很方便地采用熔解曲线的方法进行分析；

(b)两条外围引物之间发生有效扩增后，会影响特异性引物的扩增，同时外围引物和其中片段较大的特异性PCR产物相对Tm值比较靠近，比较难以区分。

实施例4、多重等位基因特异性引物在不同仪器上PCR扩增熔解曲线结果

实验目的：考察多重等位基因特异性引物在不同仪器上PCR扩增熔解曲线分析结果。

1、实验材料

2、实验分组

组一：TP-2_W_F3(特)(1ul)，Set2-M R2(特)(1ul)和TP-2-F(普)(0.1ul)，TP-2-R2(普)(0.1ul)；应用Roche480仪器检测；

组二：TP-2_W_F3(特)(0.5ul)，Set2-M R2(特)(0.5ul)和TP-2-F(普)(0.5ul)，TP-2-R2(普)(0.5ul)；应用ABI7300仪器检测。

3、引物及PCR产物相关信息

TP-2_W_F3：5’-AATGTATGATTTTATGCAGGTT-3’(Tm=54.3)；

TP-2-R2：5’-CTTCTGAGTAAGAAAGATTCTGC-3’(Tm=53.0℃)；

野生型PCR产物长度114bp。

TP-2-F：5’-CCCTCTATTTAGTCATTTGAAA-3’(Tm=51.7℃)；

Set2-M R2：5’-ACTGTGTCCCCGGTTG-3’(Tm=55.4)；

突变型PCR产物长度79bp。

注：碱基为SNP位点，碱基是为了控制非特异引入突变位点。

PCR体系如下：

5、检测结果

应用Roche480(组一)进行熔解曲线分析的结果如图12。

应用ABI7300(组二)进行熔解曲线分析的结果如图13。

6、结论

a.Roche480和ABI7300都能够通过熔解曲线明确区分出野生型，突变型，杂合型。因此，本发明的方法对仪器要求比较低，相对使用机型更广。

综上所述，在SNP分析中，采用两条特异性引物，双向扩增的方法，抑制外围引物的有效扩增，使之形成型特异性PCR产物，调节外围引物的位置，增加Tm值的差异，采用熔解曲线分析的方法可行。亦可很方便地拓展，采用双向特异性引物，双通道Taqman探针，不同通道检测一种型别，在一管反应中进行检测。

引物特异性控制，需要调整SNP位点和突变引入位点的位置，同时考察引入不同突变碱基对扩增的影响，选择特异性好的引物进行组合。双向多重等位基因特异性引物PCR扩增应用过程中，需要有效控制外围(和特异性引物配对的引物)的扩增，否则对结果产生干扰，无法判断。采用该方案进行分析比普通PCR引物有更好的区分效果，能够明确区分野生型，突变型和杂合型。由于Tm值之间差异比较大，降低了对仪器和专业SNP分析软件要求，是一种适用机型更广，结果稳定，重复性好，适合于临床应用的方法。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种基于等位基因特异性扩增的SNP检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

并且，控制外围引物1和外围引物2的扩增效率使之比内引物1和内引物2的扩增效率低；使外围引物1和外围引物2之间不形成扩增产物；

(2)分析PCR扩增产物，确定待测样品中待测基因的SNP类型。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，控制扩增效率的方法是：控制外围引物1的Tm值，使之比内引物1的Tm值低1-8℃；控制外围引物2的Tm值，使之比内引物2的Tm值低1-8℃。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，控制扩增效率的方法是：控制外围引物1浓度使之比内引物1的浓度低5-20倍；控制外围引物2浓度使之比内引物2的浓度低5-20倍。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的内引物1和/或内引物2中，以其3’末端碱基起算，第2-6个碱基处设置一与待测基因模板不匹配的碱基；和/或

所述的内引物2中，以其3’末端碱基起算，第2-6个碱基处设置一与待测基因模板不匹配的碱基。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，确定待测样品中待测基因的SNP类型的方法如下：

如同时生成两种型特异性PCR产物，则判断为杂合型基因。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，采用熔解曲线分析的方法分析PCR扩增产物。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，以待测基因为模板，调整外围引物1和外围引物2的位置，使得内引物1和外围引物1扩增产物的熔解温度与内引物2和外围引物2的扩增产物的熔解温度差异显著。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的熔解温度差异显著是应用熔解曲线分析仪器足够区分的差异。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的内引物1或内引物2的长度为10-60bp。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外围引物1或外围引物2的长度为10-60bp。