CN104004761A - 一种具有高效驱动活性的启动子 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有高效驱动活性的启动子。揭示一种来源于植物Histone3.3基因的多核苷酸，将其作为启动子元件，可指导目的基因高水平表达。本发明的启动子具有广泛的活性，能够指导目的基因高水平表达。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及一种具有高效驱动活性的启动子。
背景技术
在植物基因工程中常用的启动子按其作用和功能分为三种：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异型启动子。其中组成型启动子最为常用。组成型启动子分为内源组成型和异源组成型启动子两大类。植物基因工程中常用的内源启动子主要有水稻肌动蛋白(actin)基因和玉米泛素(ubiquitin)基因的启动子。异源组成型启动子有来自农杆菌的Nos和Ocs启动子以及来源于烟草花叶病毒基因的CaMV35S启动子。组成型启动子在所有组织中都有表达，具有持续性但不具有时空特异性。重复使用同一启动子驱动两个或两个以上的外源基因可能引起基因沉默或共抑制现象。然而关于CaMV35S启动子在转基因生物安全性角度存在潜在风险的问题报道比较多。已有文献报道认为CaMV35S启动子来源于烟草花叶病毒，一旦在转基因过程中整合到病毒隐性基因附近就有可能激活病毒的表达，或者CaMV35S启动子插入到编码毒素蛋白的基因上游，将增强毒素蛋白的表达，使得转基因植物的安全性面临巨大的挑战。
真核生物的细胞核中与DNA结合的蛋白质包括组蛋白和非组蛋白类。组蛋白指细胞核中与DNA结合的碱性蛋白质的总称。组蛋白富含精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸，二者加起来约为所有氨基酸残基的1/4。它们分子量较小，大约10000～20000道尔顿。组蛋白主要有五种——H1、H2A、H2B、H3、H4，它们具有不同的分子量和氨基酸组成。在五种组蛋白中，四种组蛋白(H2A、H2B、H3、H4)分子量较小(102～135个氨基酸残基)，H1的分子量较大(约含220个氨基酸残基)，序列保守程度相对较低，但结构相似，H1组蛋白其球形中心结构域在进化上保守，而N端和C端两个“臂”的氨基酸变异较大，所以H1在进化上不如核小体组蛋白那么保守，在构成核小体时H1起连接作用，它赋予染色质以极性。
除常规的组蛋白外，组蛋白还有各种不同的变体，尤其是在核心组蛋白H2A、H3和连接组蛋白H1中。核心组蛋白H2B和H4变化相对较少。根据与对应的常规组蛋白氨基酸序列的不同，组蛋白变体可分为两类：一类是由氨基酸替换产生的变体，氨基酸总数不变，称为同型变体(Homomorphous variants)，如植物常规组蛋白H3(即H3.1)及其变体H3.3。它们之间只在四个位置氨基酸呈现不同，分别在第31位(H3.1中为甘氨酸，H3.3中为苏氨酸)、41位(H3.1中为苯丙氨酸，H3.3中为酪氨酸)、87位(H3.1中为半胱氨酸，H3.3中为组氨酸)和90位(H3.1中为甘氨酸，H3.3中为亮氨酸)。虽然H3.1和H3.3之间只有四个氨基酸的区别，但它们在染色质上的分布和功能有很大不同。H3.1主要在DNA复制过程中加载入染色质，而H3.3则可以不依赖于DNA复制而加载入间期染色质。H3.1主要与沉默的染色质有关，而H3.3主要与转录活跃的染色质有关。在植物包括拟南芥、水稻和玉米组蛋白H3.3的氨基酸序列分析结果中发现植物的组蛋白H3.3非常保守。
因此，结合现有的植物工程技术，对高表达保守蛋白的启动子的功能研究是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有高效驱动活性的启动子及其应用。
在本发明的第一方面，提供分离的多核苷酸，所述的多核苷酸是：
(1)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(2)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(3)SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(4)SEQ ID NO:34中(1-743)～1405位所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(5)SEQ ID NO:35中(1-1076)～1369位所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(6)SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(7)SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(8)SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(9)SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(10)SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(11)核苷酸序列在严格条件下能够与(1)-(10)任一限定的多核苷酸序列杂交且具有(1)-(10)任一限定的多核苷酸功能的多核苷酸；或
(12)核苷酸序列与(1)-(10)任一限定的多核苷酸序列有80%以上(较佳地85%以上；更佳地90%以上；更佳地95%以上；更佳地99%以上)相同性且具有(1)-(10)任一限定的多核苷酸功能的多核苷酸。
在另一优选例中，(4)中，包括：SEQ ID NO:34中第464-1405位(pHTR4-5(942bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；SEQ ID NO:34中第276-1405位(pHTR4-6(1130bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；或SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列的多核苷酸。
在另一优选例中，(5)中，包括：SEQ ID NO:3中第201-521位(pHTR711-2(521bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；SEQ ID NO:35中第624-1369位(pHTR711-4(746bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；SEQ ID NO:35中第416-1369位(pHTR711-5(954bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；SEQ ID NO:35中第200-1369位(pHTR711-6(1170bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；或SEQ ID NO:35所示的核苷酸序列的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于作为启动子元件。
在一个优选例中，所述的启动子元件用于指导目的基因强表达。
在另一优选例中，所述的目的基因是结构基因。
在另一优选例中，所述的目的基因可编码具有特定功能的蛋白。
在另一优选例中，所述的目的基因是外源基因。
在本发明的另一方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的多核苷酸，作为启动子元件。
在一个优选例中，所述的载体还含有与所述的多核苷酸操作性连接的目的基因。
在另一优选例中，所述的目的基因位于所述多核苷酸的下游。
在另一优选例中，所述的目的基因位于所述多核苷酸的下游，且与所述多核苷酸的间隔小于1000bp；优选的，小于500bp；更优选的，小于200bp。
在另一优选例中，所述的目的基因位于所述多核苷酸的下游，且与所述多核苷酸的间隔小于100bp，更佳地小于50bp。
在另一优选例中，所述的载体是真核表达载体。
在另一优选例中，在所述多核苷酸的下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。
在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞(较佳地，所述的宿主细胞不是动植物繁殖材料)，所述的细胞：
含有所述的载体；或其基因组中整合有外源的所述的多核苷酸。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、拟南芥基因HTR1和HTR4启动子驱动GUS基因表达图。
A：pCambia1300-CaMV35S-GUS转化烟草，在愈伤组织中GUS组织化学染色结果；
B：pCambia1300-pHTR1-GUS转化烟草，在愈伤组织中GUS组织化学染色结果；
C：pCambia1300-pHTR4-GUS转化烟草，在愈伤组织中GUS组织化学染色结果。
图2、拟南芥基因HTR1和HTR4启动子驱动GUS基因表达图。
A：pCambia1300-pHTR1-GUS转化烟草，在烟草叶片中GUS组织化学染色结果；
B：pCambia1300-pHTR4-GUS转化烟草，在烟草叶片中GUS组织化学染色结果；
C：pCambia1300-CaMV35S-GUS转化烟草，在烟草叶片中GUS组织化学染色结果。
图3、拟南芥基因HTR1和HTR4启动子驱动GUS基因表达图。
A1，A2：pCambia1300-pHTR1-GUS转化拟南芥，在拟南芥莲座叶、茎生叶和花序中的GUS组织化学染色结果；
B1，B2：pCambia1300-pHTR4-GUS转化拟南芥，在拟南芥莲座叶、茎生叶和花序中GUS组织化学染色结果；
C1，C2：pCambia1300-CaMV35S-GUS转化拟南芥，在拟南芥莲座叶、茎生叶和花序中GUS组织化学染色结果。
图4、转基因拟南芥中HTR1，HTR4和YFP的Ct值差异图。横坐标为三株样本，分别是35S-1，35S-2，35S-3；纵坐标为Ct值。
图5、水稻基因HTR711和HTR712启动子驱动GUS基因表达图。
A：pCambia1300-CaMV35S-GUS转化中花11愈伤组织，GUS组织化学染色结果；
B：pCambia1300-pHTR711-GUS转化中花11愈伤组织，GUS组织化学染色结果；
C：pCambia1300-pHTR712-GUS转化中花11愈伤组织，GUS组织化学染色结果。
图6、水稻基因HTR711和HTR712启动子驱动GFP基因表达在亚细胞水平的定位图。
A：水稻基因HTR711和HTR712启动子驱动GFP基因在三叶期狐尾草叶片细胞核中的表达情况；
B：在单个狐尾草叶片细胞中GFP基因的表达情况；
C：狐尾草植株(Green foxtail，Setaria viridis(L.)P.Beauv)。
图7、7个拟南芥基因HTR4启动子片段示意图。其中，pHTR4-1(116bp)代表SEQID NO:2序列中第548-663位；pHTR4-2(263bp)代表SEQ ID NO:2序列中第401-663位；pHTR4-3(453bp)代表SEQ ID NO:2序列中第211-663位；pHTR4-4(663bp)即SEQID NO:2序列；pHTR4-5(942bp)序列如SEQ ID NO:34中第464-1405位；pHTR4-6(1130bp)序列如SEQ ID NO:34中第276-1405位；pHTR4-7(1405bp)序列如SEQ ID NO:34序列。
图8、7个水稻基因HTR711启动子片段示意图。其中，pHTR711-1(201bp)代表SEQ ID NO:3序列中第321-521位；pHTR711-2(321bp)代表SEQ ID NO:3序列中第201-521位；pHTR711-3(521bp)代表SEQ ID NO:3序列；pHTR711-4(746bp)序列如SEQ ID NO:35中第624-1369位；pHTR711-5(954bp)序列如SEQ ID NO:35中第416-1369位；pHTR711-6(1170bp)序列如SEQ ID NO:35中第200-1369位；pHTR711-7序列如SEQ ID NO:35序列。
图9、7个拟南芥基因HTR4启动子的荧光图。
A：pHTR4-1启动子的荧光图；
B：pHTR4-2启动子的荧光图；
C：pHTR4-3启动子的荧光图；
D：pHTR4-4启动子的荧光图；
E：pHTR4-5启动子的荧光图；
F：pHTR4-6启动子的荧光图；
G：pHTR4-7启动子的荧光图。
图10、7个水稻基因HTR711启动子的荧光图。
A：pHTR711-1启动子的荧光图；
B：pHTR711-2启动子的荧光图；
C：pHTR711-3启动子的荧光图；
D：pHTR711-4启动子的荧光图；
E：pHTR711-5启动子的荧光图；
F：pHTR711-6启动子的荧光图；
G：pHTR711-7启动子的荧光图。
图11、7个拟南芥基因HTR4和7个水稻基因HTR711启动子荧光值的箱体图。
A：7个拟南芥基因HTR4启动子荧光值的箱体图；
B：7个拟南芥基因HTR711启动子荧光值的箱体图。
图12、拟南芥基因HTR1、HTR4启动子及CaMV35S启动子驱动GUS基因表达图。
A：pCambia1300-pHTR1-GUS转化拟南芥，在整株中GUS组织化学染色结果；
B：pCambia1300-CaMV35S-GUS转化拟南芥，在整株中GUS组织化学染色结果；
C：pCambia1300-pHTR4-GUS转化拟南芥，在整株中GUS组织化学染色结果。
图13、玉米基因HTR101、HTR102、HTR104和HTR113启动子驱动GUS基因表达图。
A1，A2：pCambia1300-pHTR101-GUS转化拟南芥，在拟南芥茎生叶和莲座叶中GUS组织化学染色结果；
B1，B2：pCambia1300-pHTR102-GUS转化拟南芥，在拟南芥茎生叶和莲座叶中GUS组织化学染色结果；
C1，C2：pCambia1300-pHTR104-GUS转化拟南芥，在拟南芥茎生叶和莲座叶中GUS组织化学染色结果；
D1，D2：pCambia1300-pHTR113-GUS转化拟南芥，在拟南芥茎生叶和莲座叶中GUS组织化学染色结果。
图14、水稻基因HTR706启动子驱动GUS基因表达图。
A：pCambia1300-pHTR706-GUS转化拟南芥，在茎生叶中GUS组织化学染色结果；
B：pCambia1300-pHTR706-GUS转化拟南芥，在莲座叶中GUS组织化学染色结果。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，揭示一种核酸，将其作为启动子元件，可指导目的基因高水平表达。本发明的启动子来源于Histone3.3基因的启动子区域。本发明的启动子具有广泛的活性，能够指导目的基因高水平表达(强表达)。在此基础上完成了本发明。
如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体，其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，所述的“可操作地连接”或“操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
如本文所用，所述的“高水平表达”是指：利用本发明的启动子指导一目的基因(如GUS基因)的表达与CaMV35S启动子指导该目的基因表达相比，利用本发明的启动子所得的表达量显著更高。蛋白表达量的检测是本领域技术人员熟知的技术。
如本文所用，所述的“SEQ ID NO:34中(1-743)～1405位所示的核苷酸序列”也即指所述序列可起始于SEQ ID NO:34中第1位至第743位中的任一位的碱基，终止于SEQ ID NO:1中第1405位的碱基。
如本文所用，所述的“SEQ ID NO:35中(1-1076)～1369位所示的核苷酸序列”也即指所述序列可起始于SEQ ID NO:35中第1位至第1076位中的任一位的碱基，终止于SEQ ID NO:1中第1369位的碱基。
启动子及其指导的基因表达
基于本发明人的新发现，提供一种分离的核酸，所述的核酸具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列或这些序列的片段以及含有这些序列的长度更长的核苷酸序列，所述的核酸可作为指导目的基因表达的启动子元件。
此外，本发明还包括上述核酸的一些具有相同功能的变异体。包括：
序列在严格条件下能够与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列或其片段或延长序列杂交且具有指导目的基因高水平表达功能的核酸；或
序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列或其片段或延长序列有80%以上同源性且具有指导目的基因高水平表达功能的核酸；或
序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列或其片段或延长序列互补(优选完全互补)的核酸。
多核苷酸的杂交是本领域技术人员熟知的技术，特定的一对核酸的杂交特性指示它们的相似性或同一性。因此，本发明还涉及与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17所示的核苷酸序列或其片段或延长序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80%(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%)相同性的核酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述核酸可杂交的多核苷酸。
在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1%SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的核酸也具有指导目的基因高水平表达的功能。
在本发明的实例中，在本发明的启动子的指导下，可以使GUS基因或GFP基因高水平地表达。因此可见，本发明的启动子是一种特别适合于指导目的基因表达的启动子，在基因表达的研究中具有重要的应用价值。
本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上，该目的基因相对于启动子而言可以是外源(异源)的。所述的目的基因通常可以是任何核酸序列(如一种结构性核酸序列)，所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白，例如某些具有重要特性或功能的蛋白。
例如，所述的目的基因包括但不限于：GUS基因、GFP基因、荧光素酶基因等。GUS作为一种代表性的指示基因表达状况的工具，可良好地指示由启动子指导的基因表达情况。而由本发明的启动子可指导GUS高表达这一实例，可显而易见地得知本发明的启动子作为基因调控元件，可指导其它任何合适的基因的高表达。
作为本发明的优选方式，所述的目的基因可以是一种对于某一植物或特定植物组织或器官而言缺失或表达量不足的基因，可将该目的基因与本发明的启动子可操作地连接，或将目的基因与本发明的启动子可操作的连接入合适的载体中，采取适当的方式导入到适当的细胞内，并传递到该植物或特定植物组织或器官内，从而驱动目的基因高水平地表达。
所述的“植物”没有特别的限制，只要该植物适合进行基因的转化操作(转基因操作)，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。例如但不限于：十字花科(如芸薹属的大白菜、小白菜)，十字花科(如鼠耳芥属植物(如拟南芥))，禾本科(如水稻)，茄科(如烟草)，此外还包括瓜果、蔬菜、油菜等等。更具体地，所述的植物包括(但不限于)：小麦、大麦、黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。
本发明的启动子还可以被可操作地连接到被改进的目的基因序列上，该目的基因相对于启动子是外源(异源)的。所述的目的基因可以被改进来产生各种期望的特性。例如，目的基因可以被改进来增加必需氨基酸的含量，提高氨基酸序列的翻译，改变翻译后的修饰(如磷酸化位点)，将翻译产物转运到细胞外，改善蛋白的稳定性，插入或删除细胞信号等。
此外，启动子和目的基因可以设计成下调特定基因。这一般是通过将启动子连接到目的基因序列上来实现，该序列以反义反向被引导。本领域的普通技术人员熟悉这种反义技术。任何核酸序列可以以这种方式被调节。
本发明的启动子和目的基因序列可被包含在重组载体中。
所述的重组载体一般包括(从5’到3’方向)：引导目的基因转录的启动子，和目的基因。如果需要，所述的重组载体还可以包括3’转录终止子，3’多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列、抗性选择标记、增强子或操作子。
作为一种方式，所述的重组载体包括本发明的启动子，在所述启动子的下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。
用于制备重组载体的方法是本领域技术人员所熟知的。术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。优选的，所述的表达载体是真核表达载体。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)、GUS等。
重组载体中除了含有本发明的启动子，还可含有一种或多种其它启动子。所述的其它启动子例如是：组织特异性的、组成型的或诱导型的。例如甘露氨酸合成酶的花椰菜花叶病毒19S和35S(CaMV19S CaMV35S)、增强的CaMV、烟草RB7等。
作为本发明的一种实例，所述的载体是pCambia系列载体。即利用pCambia上的多克隆位点，可将本发明的启动子区域构建到报告基因如GUS或GFP的前面，转化宿主细胞，启动子激活GUS或GFP编码基因的表达，所述启动受到启动子区各顺式作用元件的调控，模拟了基因在体内被激活转录的状况。
包含上述适当的启动子和目的基因的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，酵母，动物的组织细胞，植物细胞等。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子或宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。
作为一种方式，制备转基因植物的方法是：将携带启动子和目的基因(两者可操作地连接)的双元载体转入农杆菌，农杆菌再将含启动子和目的基因的载体片段整合到植物的染色体上。涉及的转基因受体植物例如是拟南芥、烟草和水稻。
本发明的主要优点在于：
(1)揭示一种可指导目的基因高水平表达的启动子，利用本发明的启动子可以高强度地启动目的基因的大量表达。
(2)本发明为外源基因表达导致相关基因沉默的现象以及水稻育种过程中引进的外源启动子如Cauliflower Mosaic Virus35S Promoter(CaMV35S)存在潜在的生物安全性风险等问题提供了一种新的解决途径。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1、启动子的获得
本发明分别克隆了拟南芥组蛋白变体H3.3基因HTR4(AT4G40030)以及水稻组蛋白基因HTR711(LOC_Os03g27310)和HTR712(LOC_Os06g04030)的5’端调控区启动子。拟南芥基因HTR4启动子序列如SEQ ID NO:2；水稻基因HTR711启动子序列如SEQ ID NO:3；水稻基因HTR712启动子序列如SEQ ID NO:4；拟南芥基因HTR1启动子序列如SEQ ID NO:1，作为对照。
上述启动子序列可用于构建报告基因表达载体。
实施例2、拟南芥基因HTR4启动子驱动GUS基因表达的活性检测
1、转基因烟草GUS组织化学染色检测启动子活性
在拟南芥基因HTR1和HTR4启动子、CaMV35S的驱动下，以GUS为报告基因构建植物表达载体pHTR1-GUS、pHTR4-GUS及CaMV35S-GUS。
拟南芥基因HTR1、HTR4启动子、CaMV35S序列分别插入到pCambia1300表达载体(购自Cambia公司)的HindIII和BamHI酶切位点中(即位于GUS报告基因的上游)。GUS元件插入到pCambia1300的BamHI和SacI酶切位点。
获得的重组载体分别命名为：pCambia1300-pHTR1-GUS、pCambia1300-pHTR4-GUS及pCambia1300-CaMV35S-GUS。
将构建的重组载体转化农杆菌EHA105(参见Hood,E.E.等，Transgenic Res.,1993,2,208–218)，筛选阳性克隆。以获得的含有目的基因质粒的农杆菌转染烟草叶片，共培养2天后转入筛选培养基，去除残余的农杆菌。大约1个月左右将感染了农杆菌的阳性愈伤组织进行组织化学染色，检测GUS基因的瞬时表达。待烟草长出抗性不定芽之后，将芽切下转入含有抗性的生根培养基中，约一个月左右将生根的烟草小苗转入盆中，在温室中培养，1个月左右取叶片进行组织化学染色检测GUS基因的瞬时表达。
将共培养的愈伤组织或叶片用灭菌蒸馏水漂洗后置于1.5ml离心管中，加入没过愈伤组织的GUS染色液并混匀，使愈伤组织与染色液充分接触；于37℃温浴2小时或过夜；以70%的乙醇为脱色液对愈伤组织进行脱色并观察蓝色斑点。
HTR4(H3.3)的启动子主要在细胞间期高度表达，在营养器官高水平组成性表达。HTR1(H3.1)的表达是与DNA复制紧密相关的，在DNA复制过程中即S期H3.1大量合成。GUS组织化学染色结果表明了在烟草愈伤组织中拟南芥基因HTR1启动子驱动的GUS基因的表达活性明显高于HTR4和CaMV35S驱动的GUS表达活性，如图1所示。
在转基因烟草叶片中，拟南芥基因HTR4启动子驱动的GUS基因的表达活性明显高于HTR1驱动的GUS表达活性，如图2所示。但是，在不同时期，拟南芥基因HTR1和HTR4启动子的驱动活性均比常用的组成型启动子CaMV35S的活性高。
2、转基因拟南芥GUS组织化学染色检测启动子活性
将构建的植物表达载体pCambia1300-pHTR1-GUS、pCambia1300-pHTR4-GUS及pCambia1300-CaMV35S-GUS转化农杆菌GV3101(Invitrogen)，筛选阳性克隆。以获得的含有目的基因质粒的农杆菌转染拟南芥花序，用保鲜膜包裹拟南芥苗后暗培养2天，之后转入光培养，在温室培养约1个半月后收集种子。在筛选培养基上筛选T0代种子，鉴定T1代苗后转入盆中，在温室培养2周后，取叶片进行组织化学染色检测GUS基因的瞬时表达。
在转基因拟南芥叶片(尤其在花序)中，拟南芥基因HTR4启动子驱动的GUS基因的表达活性明显高于HTR1和CaMV35S驱动的GUS表达活性，GUS染色最明显，如图3所示。以上实验说明在不同生长时期，拟南芥基因HTR4启动子的驱动活性较常用的组成型启动子CaMV35S的活性高。
3、定量RT-PCR(qRT-PCR)方法检测启动子活性
构建植物表达载体pCambia1301-CaMV35S-Cop1-YFP：将CaMV35S启动子片段克隆到载体pCambia1301(购自Cambia公司)的HindIII和BamHI酶切位点；之后将cop1(以拟南芥cDNA为模板，以sal1-cop1-5：CCCGTCGACATGGAAGAGATTTCGACGGATCCGG(SEQ ID NO:5)；speI-cop1-3：CCCACTAGTCGCAGCGAGTACCAGAACTTTG(SEQ ID NO:6)为引物的PCR扩增产物)片段克隆到载体上的SalI和SpeI位点；将YFP片段克隆到载体的SpeI和SacI位点。
将构建的植物表达载体pCambia1301-CaMV35S-Cop1-YFP转化农杆菌GV3101(Invitrogen)，筛选阳性克隆。以获得的含有目的基因质粒的农杆菌转染拟南芥花序，用保鲜膜包裹拟南芥苗后暗培养2天，之后转入光培养，在温室培养约1个半月后收集种子。在筛选培养基上筛选T0代种子，鉴定T1代苗后转入盆中，在温室培养2周后，取叶片抽提RNA，反转录成cDNA后做定量PCR反应。
HTR1和HTR4启动子(内源)的表达水平可以通过检测HTR1和HTR4基因cDNA的表达来反映，因为Cop1是拟南芥的内源基因，所以通过检测YFP的活性来反映CaMV35S启动子的表达水平。
RT-PCR检测引物如下：
HTR1：F:CGTACCAAGCAAACCGCAAGGAAA(SEQ ID NO:7)；
R:AGGACGGAATCTGTGTGGCTTCTT(SEQ ID NO:8)；
HTR4：F:TGCACCAACTACTGGTGGAGTCAA(SEQ ID NO:9)；
R:AGCTAAGACAGCATGGCTCTGGAA(SEQ ID NO:10)；
YFP：F:TGACCCTGAAGTTCATCTGCACCA(SEQ ID NO:11)；
R:TCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGA(SEQ ID NO:12)。
图4显示了HTR1，HTR4，YFP基因Ct值的差异图，本发明人选取了3株转pCambia1301-CaMV35S-Cop1-YFP的转基因拟南芥苗作为材料，横坐标为3个样本(35S-1，35S-2，35S-3)，纵坐标为Ct值。
定量的结果显示三个材料中，HTR4基因的Ct值最小，HTR1比YFP略低。这就反映了在三株转基因拟南芥叶片中，HTR4启动子的表达是最强的。
实施例3、水稻基因HTR711和HTR712启动子驱动GUS基因表达
在水稻基因HTR711和HTR712启动子的驱动下，以GUS为报告基因构建植物表达载体pCambia1300-pHTR711-GUS、pCambia1300-pHTR712-GUS及pCambia1300-CaMV35S-GUS，将构建的质粒转化农杆菌EHA105，筛选阳性克隆。
水稻基因HTR711和HTR712启动子、CaMV35S序列分别插入到pCambia1300表达载体的HindIII和BamHI酶切位点中(即位于GUS报告基因的上游)。GUS元件插入到pCambia1300的BamHI和SacI酶切位点。
以获得的含有目的质粒的农杆菌转染水稻转化受体(中花11)的愈伤组织，共培养两天后转入筛选培养基，去除残余的农杆菌；三天后将感染了农杆菌的阳性愈伤组织进行组织化学染色检测GUS基因的瞬时表达。将共培养的愈伤组织用灭菌蒸馏水漂洗后置于1.5ml离心管中，加入没过愈伤组织的GUS染色液并混匀，使愈伤组织与染色液充分接触；于37℃温浴2小时或过夜；以70%的乙醇为脱色液对愈伤组织进行脱色并观察蓝色斑点。
GUS组织化学染色结果表明，水稻基因HTR711和HTR712启动子驱动的GUS基因的表达活性较CaMV35S驱动的GUS表达活性高，如图5所示。
以上实验说明，水稻基因HTR711和HTR712启动子的驱动活性较常用的组成型启动子CaMV35S的活性高。
实施例4、水稻基因HTR711和HTR712启动子驱动GFP基因瞬间表达分析
在水稻基因HTR711和HTR712启动子驱动下，以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因，构建植物表达载体pCambia1300-pHTR711-GFP和pCambia1300-pHTR712-GFP。
水稻基因HTR711和HTR712启动子、CaMV35S序列分别插入到pCambia1300表达载体的HindIII和BamHI酶切位点中(即位于GFP基因的上游)。GFP元件插入到pCambia1300的BamHI和SacI酶切位点。
将构建好的质粒转化农杆菌EHA105，筛选阳性克隆。选择三叶期的狐尾草(Greenfoxtail，Setaria viridis(L.)P.Beauv)为瞬间表达受体材料。挑取pCambia1300-pHTR711-GFP和pCambia1300-pHTR712-GFP阳性菌株EHA105的单克隆在28℃，200rpm培养至OD600为0.8左右。取1.5ml菌液于1.5ml灭菌离心管中，4℃，2000rpm离心5分钟，弃上清；向收集的菌体中加入1ml灭菌蒸馏水，重悬菌液，4℃，2000rpm离心5分钟，弃上清。向收集的菌体中加入灭菌蒸馏水至OD600为0.8左右用于注射植物叶片。取较健康幼嫩的三叶期狐尾草叶片进行注射实验，将注射叶片区域作好标记。两天后取注射区域的叶片进行显微观察实验。以去卷积荧光显微镜观察pCambia1300-pHTR711-GFP和pCambia1300-pHTR712-GFP质粒在狐尾草叶片中的表达状况。取注射区域1～2cm2大小的叶片置于加有一滴蒸馏水的载玻片上，以放大倍数为60倍的水镜镜头观察GFP的表达情况。
如图6，在水稻基因HTR711和HTR712启动子的驱动下，GFP基因在狐尾草叶片细胞核内有强的表达。
实施例5、拟南芥基因HTR4以及水稻基因HTR711启动子关键位点分析
对于pHTR4和pHTR711两个启动子，分别取长短不一的7个片段，以鉴定其关键位点。pHTR4和pHTR711两个启动子各自构建了7个片段，见图7和8。分别以拟南芥和水稻基因组为模板，以表1引物(注：应用正向引物为pHTR4-(1～7)-KpnI时，反向引物均是反向PHTR4-R-BamHI；应用正向引物为PHTR711-(1～7)-HindIII时，反向引物均是反向PHTR711-R-BamHI)来扩增所述片段，以黄色荧光蛋白(YFP)为报告基因的植物表达载体，各自构建7个载体，引物序列见表1。
表1、7个拟南芥基因HTR4和7个水稻基因HTR711启动子引物序列
拟南芥基因HTR4启动子分别插入到pCambia1300表达载体KpnI和BamHI酶切位点中(即位于YFP基因的上游)，YFP元件插入到pCambia1300的SpeI和SacI酶切位点。水稻基因HTR711启动子分别插入到pCambia1300表达载体HindIII和BamHI酶切位点中(即位于YFP基因的上游)，YFP元件插入到pCambia1300的SpeI和SacI酶切位点。
将构建好的质粒分别转化农杆菌GV3101，筛选阳性克隆。选择烟草SNN为瞬间表达受体材料。挑取阳性菌株GV3101的单克隆在28℃，200rpm培养至OD600为0.8左右。取1.5ml菌液于1.5ml灭菌离心管中，4℃，2000rpm离心5分钟，弃上清；向收集的菌体中加入1ml灭菌蒸馏水，重悬菌液，4℃，2000rpm离心5分钟，弃上清。向收集的菌体中加入灭菌蒸馏水至OD600为0.8左右用于注射植物叶片。取较健康幼嫩的烟草叶片进行注射实验，将注射叶片区域作好标记。两天后取注射区域的叶片进行显微观察实验。以去卷积荧光显微镜观察质粒在烟草叶片中的表达状况。取注射区域1～2cm2大小的叶片置于加有一滴蒸馏水的载玻片上，以放大倍数为60倍的水镜镜头观察YFP的表达情况。7个拟南芥基因HTR4和7个水稻基因HTR711启动子片段的荧光图如图9和10所示。计算7个拟南芥基因HTR4和7个水稻基因HTR711启动子片段10×10pixel的荧光值绘制箱体图，如图11所示。
通过图9-10的荧光值和图11的箱体图可以得出两个基因HTR4和HTR711启动子的关键区段。从实验结果可以看到拟南芥基因HTR4启动子的关键区域位于距离翻译起始位点453-663bp，水稻基因HTR711启动子的关键区域位于距离翻译起始位点201-321bp。因为拟南芥基因HTR4启动子在翻译起始位点和转录起始位点之间有一段463bp的intron，所以这两个启动子的关键区域都是在距离转录起始位点不到100bp的位置。
实施例6、转基因拟南芥GUS组织化学染色检测启动子活性
将前述构建的植物表达载体pCambia1300-pHTR1-GUS、pCambia1300-pHTR4-GUS及pCambia1300-CaMV35S-GUS转化农杆菌GV3101(Invitrogen)，筛选阳性克隆。以获得的含有目的基因质粒的农杆菌转染拟南芥花序，用保鲜膜包裹拟南芥苗后暗培养2天，之后转入光培养，在温室培养约1个半月后收集种子。在筛选培养基上筛选T0代种子，鉴定T1代苗后转入盆中，在温室培养收种后将收集的种子铺于筛选培养基中，培养约10天后，分别取30颗整株进行组织化学染色检测GUS基因的瞬时表达。
在转基因拟南芥整株中，拟南芥基因HTR4启动子驱动的GUS基因的表达活性明显高于HTR1和CaMV35S驱动的GUS表达活性，GUS染色最明显，如图12所示。
实施例7、转基因拟南芥GUS组织化学染色检测玉米启动子活性
建立以玉米H3.3基因HTR101(SEQ ID NO:13)、HTR102(SEQ ID NO:14)、HTR104(SEQ ID NO:15)、HTR113(SEQ ID NO:16)为启动子，以GUS为报告基因构建植物表达载体pHTR101-GUS、pHTR102-GUS、pHTR104-GUS及pHTR113-GUS。
玉米基因HTR101、HTR102、HTR104和HTR113启动子序列分别插入到pCambia1300表达载体(购自Cambia公司)的HindIII和BamHI酶切位点中(即位于GUS报告基因的上游)。GUS元件插入到pCambia1300的BamHI和SacI酶切位点。
获得的重组载体分别命名为：pCambia1300-pHTR101-GUS、pCambia1300-pHTR102-GUS、pCambia1300-pHTR104-GUS及pCambia1300-pHTR113-GUS。
将构建的植物表达载体pCambia1300-pHTR101-GUS、pCambia1300-pHTR102-GUS、pCambia1300-pHTR104-GUS及pCambia1300-pHTR113-GUS转化农杆菌GV3101(Invitrogen)，筛选阳性克隆。以获得的含有目的基因质粒的农杆菌转染拟南芥花序，用保鲜膜包裹拟南芥苗后暗培养2天，之后转入光培养，在温室培养约1个半月后收集种子。在筛选培养基上筛选T0代种子，鉴定T1代苗后转入盆中，在温室培养2周后，取叶片进行组织化学染色检测GUS基因的瞬时表达，如图13所示。结果说明玉米H3.3基因HTR101(SEQ ID NO:13)、HTR102(SEQ ID NO:14)、HTR104(SEQ ID NO:15)、和HTR113(SEQ ID NO:16)启动子均具有驱动活性，且在拟南芥中表达强度从高到低依次是HTR104(SEQ ID NO:15)、HTR101(SEQ ID NO:13)、HTR102(SEQ ID NO:14)、HTR113(SEQ ID NO:16)。
实施例8、转基因拟南芥GUS组织化学染色检测水稻启动子活性
在水稻H3.1基因HTR706启动子(SEQ ID NO:17)的驱动下，以GUS为报告基因构建植物表达载体pHTR706-GUS。
水稻基因HTR706启动子序列分别插入到pCambia1300表达载体(购自Cambia公司)的HindIII和BamHI酶切位点中(即位于GUS报告基因的上游)。GUS元件插入到pCambia1300的BamHI和SacI酶切位点。获得的重组载体命名为：pCambia1300-pHTR706-GUS。
将构建的植物表达载体pCambia1300-pHTR706-GUS转化农杆菌GV3101(Invitrogen)，筛选阳性克隆。以获得的含有目的基因质粒的农杆菌转染拟南芥花序，用保鲜膜包裹拟南芥苗后暗培养2天，之后转入光培养，在温室培养约1个半月后收集种子。在筛选培养基上筛选T0代种子，鉴定T1代苗后转入盆中，pCambia1300-pHTR706-GUS的转基因拟南芥在温室培养2周后，取叶片进行组织化学染色检测GUS基因的瞬时表达，如图14所示。结果说明，水稻H3.1基因HTR706启动子(SEQ ID NO:17)具有驱动活性，在拟南芥中较高的表达。
目前来源于玉米H3.3基因HTR101、HTR102、HTR104和HTR113启动子以及来源于水稻H3.3基因HTR711和H3.1基因HTR706验证了它们在拟南芥中有增强表达的效果，虽未在水稻和玉米中验证其功能，但是鉴于它们与来源于拟南芥H3.3基因HTR4具有高度的同源性，所以可以理解，它们在各自相应的作物中也具有很高的表达水平。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (12)
1.分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸是：
(1)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(2)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(3)SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(4)SEQ ID NO:34中(1-743)～1405位所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(5)SEQ ID NO:35中(1-1076)～1369位所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(6)SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(7)SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(8)SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(9)SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(10)SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(11)核苷酸序列在严格条件下能够与(1)-(10)任一限定的多核苷酸序列杂交且具有(1)-(10)任一限定的多核苷酸功能的多核苷酸；或
(12)核苷酸序列与(1)-(10)任一限定的多核苷酸序列有80%以上相同性且具有(1)-(10)任一限定的多核苷酸功能的多核苷酸。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，(4)中，包括：
SEQ ID NO:34中第464-1405位(pHTR4-5(942bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；
SEQ ID NO:34中第276-1405位(pHTR4-6(1130bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；或
SEQ ID NO:34所示的核苷酸序列的多核苷酸。
3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，(5)中，包括：
SEQ ID NO:3中第201-521位(pHTR711-3(521bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；
SEQ ID NO:35中第624-1369位(pHTR711-4(746bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；
SEQ ID NO:35中第416-1369位(pHTR711-5(954bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；
SEQ ID NO:35中第200-1369位(pHTR711-6(1170bp))所示的核苷酸序列的多核苷酸；或
SEQ ID NO:35所示的核苷酸序列的多核苷酸。
4.权利要求1所述的多核苷酸的用途，用于作为启动子元件。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的启动子元件用于指导目的基因强表达。
6.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求1所述的多核苷酸，作为启动子元件。
7.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述的载体还含有与所述的多核苷酸操作性连接的目的基因。
8.如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述的目的基因位于所述多核苷酸的下游。
9.如权利要求8所述的载体，其特征在于，所述的目的基因位于所述多核苷酸的下游，且与所述多核苷酸的间隔小于100bp，更佳地小于50bp。
10.如权利要求8所述的载体，其特征在于，所述的载体是真核表达载体。
11.如权利要求8所述的载体，其特征在于，在所述多核苷酸的下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。
12.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞：
含有权利要求6-11任一所述的载体；或
其基因组中整合有外源的权利要求1所述的多核苷酸。
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