CN104004063B - 一种关于Npas2蛋白激动剂多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物领域，具体涉及具有促进Npas2蛋白表达，治疗治疗乳腺癌的多肽。其序列为QTEICDAAIQQDWKP是全新的序列，该多肽可体内促进Npas2蛋白表达，治疗乳腺癌。提高在体内荷瘤小鼠生存率；抑制人乳腺癌细胞MDA‑MB‑435S的增殖、迁移；具有潜在的新药开发价值。

Description

一种关于Npas2蛋白激动剂多肽及其应用

技术领域

本发明涉及Npas2蛋白激动剂多肽及其应用，具体涉及具有促进Npas2蛋白表达，治疗乳腺癌的多肽。

背景技术

昼夜节律是生物体的生理功能、生化指标和生理行为等多种生命现象以 24 小时为周期呈节律性振荡的一种生物节律。生物钟系统涉及人体系统的生理、生化和行为的各个方面，在整体水平、细胞水平影响周围器官、组织和细胞，控制和调节代谢、睡眠和觉醒、内分泌、免疫以及细胞周期等，使生命活动协调一致；在分子水平上，调控与细胞周期、细胞增殖和凋亡、DNA 损伤修复应答有关的一系列细胞因子，与恶性肿瘤的发生、发展和治疗等关系密切。因此昼夜节律紊乱可引起生物钟基因及其相关蛋白产物的异常表达，从而促使肿瘤发生，加速肿瘤进展。

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其死亡率的上升速度在女性恶性肿瘤位居第一。流行病学的研究表明，昼夜节律的破坏与乳腺癌的发生密切相关。Npas2在乳腺癌中表达明显下调，与乳腺癌的发生、病理和临床分期关系密切。Npas2基因是在哺乳动物中最大生物钟基因，是Clock的同源基因，可以通过调控和干扰癌基因、抑癌基因、与细胞周期、细胞增殖和凋亡相关基因，在细胞周期调控、DNA损伤修复应答和肿瘤生长抑制的过程等多方面可能参与了乳腺癌的发生和发展。研究表明，Npas2蛋白低表达与肿瘤瘤体大小、浸润深度有关，Npas2蛋白高表达对乳腺癌发展具有保护性作用。在乳腺癌癌前病变中Npas2表达增强，可以阻止癌前病变恶变。Npas2蛋白功能降低是乳腺癌发生的一个重要因素。因此，促进Npas2蛋白表达，抑制乳腺癌发展，是治疗乳腺癌的新靶点。但是，尚未有开发成熟的Npas2蛋白激动剂多肽的治疗乳腺癌的药物

本专利中的Npas2蛋白激动剂多肽已证明在乳腺癌中有效，具有在其他肿瘤模型中开发的前景。

发明内容

发明目的

本发明提供全新的序列，该序列Npas2蛋白激动剂多肽，对乳腺癌具有很好的疗效。

技术方案

一种药物组合物，其特征在于其包含如权利要求1所述多肽与一种以上药学上可接受的赋形剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、或稳定剂。

所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物为注射剂。

所述的Npas2蛋白激动剂多肽，其特征在于有效剂量为10mg/kg。

所述的Npas2蛋白激动剂多肽在制备治疗乳腺癌药物中的应用。

有益效果

利用固相合成法化学合成Npas2蛋白激动剂多肽，该多肽具有全新的序列，该多肽可体内促进Npas2蛋白表达，治疗乳腺癌。提高在体内荷瘤小鼠生存率；抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-435S的增殖，迁移；具有潜在的新药开发价值。

具体实施方式

本发明涉及的多肽由吉尔生化（上海）合成。

实施例1

Npas2蛋白激动剂多肽对人乳腺癌细胞MDA-MB-435S增殖的作用。

采用MTT 比色法。将对数生长的MDA-MB-435S细胞，以 1.0×105加入 96 孔培养板中，培养 24h，实验孔、阳性药物对照孔分别加入不同浓度的实验药物Npas2蛋白激动剂多肽4和阳性对照药物长春新碱；空白组加入相同体积的溶剂。每孔设五个复孔，培养 48h，分别在0h、2h、8h、14h、20h、24h、36h、48h 每孔加入MTT，作用4h后，加入 DMSO，孵育 30min，在酶标仪 620nm 处测定吸光度 A 值，按公式肿瘤细胞生长抑制率＝（1-实验组吸光值/对照组吸光值）×100％。计算出实验药物的最大增殖抑制率为74.02%。

实施例2

Npas2蛋白激动剂多肽对人乳腺癌细胞MDA-MB-435S迁移的作用。

将10mg/ml Matrigel（BD公司，USA）用无血清的细胞培养液以1:3稀释，涂布于Transwell小室（Greiner公司，USA）膜上，室温风干。将培养到对数生长期的人乳腺癌细胞MDA-MB-435S用胰蛋白酶消化，收集，用无血清细胞培养液重悬，于显微镜下计数，将细胞浓度调整到1×105个/ml。配制各组试验用液，分组如下：空白对照组：为不含药物的无血清细胞培养液；恩度组：用不含药物的无血清细胞培养液将5mg/ml的恩度储液稀释到预定浓度；Npas2蛋白激动剂多肽组：用不含药物的无血清细胞培养液将Npas2蛋白激动剂多肽稀释到各个预定浓度。将细胞接种到Transwell小室中，每孔100μl，并将各组试验用液加入小室中。24孔板中加入0.6ml含5%胎牛血清和1% 内皮细胞生长因子（ECGS）的细胞培养液刺激细胞迁移，于5%CO2，37℃孵育24小时。弃去孔中培液，用无水乙醇常温固定30分钟，0.1%结晶紫常温染色10分钟，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜下观察并随机选择四个视野拍照计数。按照公式计算迁移抑制率（migration inhibition,MI）：

MI（%）=(1-Ntest/Ncontrol)×100%

其中Ntest为测试组的细胞迁移数，Ncontrol为空白对照组的细胞迁移数。试验得到的结果以mean ± SD表示，并进行统计T检验，*P < 0.05为显著性差异，**P < 0.01为极显著性差异。

表1多肽对人乳腺癌细胞MDA-MB-435S迁移抑制作用

结果：在多肽的作用下，迁移的人乳腺癌细胞MDA-MB-435S数显著减少。与空白对照组相比，多肽能抑制5%胎牛血清及1% ECGS诱导的HUVEC的迁移作用。在0.5μg/ml和1μg/ml两个剂量下，多肽对细胞迁移的抑制作用与空白对照相比有极显著性差异，当多肽的剂量为0.5μg/ml时，对人乳腺癌细胞MDA-MB-435S迁移的抑制率达到最大。

实施例3

多肽对人乳腺癌细胞MDA-MB-435S裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制试验

取对数生长期的人乳腺癌细胞MDA-MB-435S细胞株，在无菌条件下制备成5×107/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试多肽的抗肿瘤效果。肿瘤直径的测量次数为每2天测1次。给药方式均采用尾静脉注射。阴性对照组注射等量生理盐水，每天1次；紫杉醇组10mg/kg，每周给药1次；恩度组2.5mg/kg，每天给药1次；多肽高中低组分别以20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg，每天给药1次。试验结束后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。

表2多肽对人乳腺癌细胞MDA-MB-435S裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用

因此，多肽对人乳腺癌细胞MDA-MB-435S裸鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，多肽20mg/kg组对人乳腺癌细胞MDA-MB-435S移植瘤的生长有极显著性的抑制作用，多肽10mg/kg组对人乳腺癌细胞MDA-MB-435S移植瘤的生长有显著性的抑制作用。与阳性对照组紫杉醇相比，多肽对实验动物的体重没有明显影响，未见明显的毒副反应。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州普罗达生物科技有限公司

<120> 一种关于Npas2蛋白激动剂多肽及其应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Thr Glu Ile Cys Asp Ala Ala Ile Gln Gln Asp Trp Lys Pro

1 5 10 15

Claims (5)

1.Npas2蛋白激动剂多肽，其特征在于其序列为QTEICDAAIQQDWKP。

2.一种药物组合物，其特征在于其包含如权利要求1所述多肽与一种以上药学上可接受的赋形剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、或稳定剂。

3.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物为注射剂。

4.如权利要求1所述的Npas2蛋白激动剂多肽，其特征在于有效剂量为10mg/kg。

5.如权利要求1所述的Npas2蛋白激动剂多肽在制备治疗乳腺癌药物中的应用。