CN103992970B

CN103992970B - 一株鞘氨醇杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用

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Publication number: CN103992970B
Application number: CN201410190528.XA
Authority: CN
Inventors: 杨虹; 李正华; 林升钦
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2014-05-07
Filing date: 2014-05-07
Publication date: 2017-05-24
Anticipated expiration: 2034-05-07
Also published as: CN103992970A

Abstract

本发明公开了一株鞘氨醇杆菌及其在控制蓝藻水华中的应用。从太湖水体中分离获得了一株具有显著溶藻活性的鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)Lzh‑3，保藏号为CGMCC No.8281，并且从其发酵产物中分离纯化并鉴定出其有效溶藻成分六氢吡咯并[1,2‑a]吡嗪‑1,4‑二酮和3‑异丁基‑6‑甲基哌嗪‑2,5‑二酮，其中六氢吡咯并[1,2‑a]吡嗪‑1,4‑二酮和3‑异丁基‑6‑甲基哌嗪‑2,5‑二酮对铜绿微囊藻9110的半致死量LD50分别为5.7μg/mL和8.2μg/mL。可用于新型生物杀藻剂的研发和生产，最终应用于湖泊蓝藻水华的控制。

Description

一株鞘氨醇杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用

技术领域

本发明涉及环境微生物领域，特别涉及一株分泌溶藻物质的鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)Lzh-3及其在蓝藻水华控制中的应用。

背景技术

近些年来由于水体富营养化，太湖爆发了严重的蓝藻水华，造成的环境和经济问题日益突出，因此探索控制蓝藻水华发生的有效途径是非常必要的。

目前控制蓝藻水华的方法可分为物理方法、化学方法和生物方法。但物理方法耗费大量人力物力，化学方法易造成二次污染，生物方法因其高效、专一、环境友好等优点而得到越来越多的关注。之前的报道显示溶藻菌导致了蓝藻水华的消退，因此溶藻菌在控制蓝藻水华方面具有很大的应用潜力。

因此，本领域的技术人员致力于筛选高效溶藻细菌或分离富集溶藻细菌代谢产生的高效溶藻活性物质，以开发微生物杀藻剂，用以安全和高效的控制蓝藻水华问题。

发明内容

鉴于现有控制蓝藻水华技术中物理方法耗费大量人力物力、处理能力有限和化学方法容易造成二次污染的缺陷，本发明所要解决的技术问题是寻找高效溶藻细菌及分离富集溶藻细菌代谢产生的高效溶藻活性物质，用以安全和高效的控制蓝藻水华问题。

为实现上述目的，本发明提供了一株具有溶藻活性的鞘氨醇杆菌及其发酵产物在蓝藻水华控制中的应用。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：提供一株从太湖水体中分离获得的具有溶藻活性的鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)Lzh-3，该菌株属革兰氏染色阴性菌,细胞呈直杆状，0.6～0.8μm×0.6～4μm；无鞭毛，少有滑行运动；过氧化氢酶阳性，化能异养,无特殊营养需求；室温下放置数日后菌落通常呈淡黄色；不产生吲哚，不水解蛋白,不液化明胶，氧化糖醇类产酸。经16srRNA基因序列分析和同源性比较，得知其与GenBank中某鞘氨醇杆菌菌株有99％的同源性，故鉴定为鞘氨醇杆菌属细菌，命名为鞘氨醇杆菌Lzh-3。

该菌株已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.8281，保藏日期为2013年9月27日。保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，邮编：100101，电话：86-10-64807355。该菌种的16S rRNA基因在GenBank中的登录号是HQ896843。

进一步地，本发明提供了上述鞘氨醇杆菌Lzh-3在控制蓝藻水华中的应用。

进一步地，本发明鞘氨醇杆菌Lzh-3在控制蓝藻水华中的应用方式可以是通过其发酵产物，包括发酵液、发酵液浓缩物、发酵液粗提物或发酵液提取物。

鞘氨醇杆菌Lzh-3发酵产物的制备步骤如下：

1)、发酵鞘氨醇杆菌Lzh-3菌株，获得发酵液；

2)、用萃取剂萃取发酵液，获得萃取液；

3)、将萃取液蒸干，获得粗提物；

4)、将粗提物溶于水后过滤；

5)、将步骤4)过滤后的滤液进一步提纯得到多组分或单一组分的有效溶藻物质，即为发酵液提取物。

优选地，步骤1)中，发酵条件为，鞘氨醇杆菌Lzh-3接种于pH7.0的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基中，28℃、200rpm环境条件下发酵48h。

优选地，步骤2)中，萃取剂为乙酸乙酯，萃取体系中乙酸乙酯与发酵液的体积比为1:1，混合后，放入振荡器中振荡24h，分离出的上层乙酸乙酯溶液即鞘氨醇杆菌Lzh-3发酵液的萃取液。

优选地，步骤3)中，过滤为使用0.22μm孔径滤膜过滤。

优选地，步骤4)中，进一步提纯手段为组层析，具体为：将滤液通过半制备柱，用HPLC进行初步纯化，得到溶藻成分；将得到的溶藻成分通过分析柱，用HPLC进行进一步纯化，得到两种有效溶藻成分S-3A和S-3B。

鞘氨醇杆菌Lzh-3的发酵产物中有效的溶藻成分S-3A和S-3B的化学结构通过LC-MS﹑GC-MG和NMR分析获得。

有效溶藻成分S-3A的分子离子峰为155.0820m/z，样品分子量为154.0742，分子式为C₇H₁₀N₂O₂，GC-MS分析结果显示S-3A与GC-MS数据库中六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的结构相似，核磁共振氢谱结果是¹H NMR(400MHz,D₂O)δ4.31(dd,J＝11.5,4.7Hz,1H),4.15(dd,J＝17.3,2.6Hz,1H)，3.86(d,J＝17.3Hz,1H),3.53(dd,J＝8.7,4.8Hz,2H),2.31(dd,J＝8.5,3.2Hz,1H)，2.05(dd,J＝7.3,3.2Hz,1H),1.94(ddd,J＝16.6,6.6,4.6Hz,2H)。

有效溶藻成分S-3B的分子离子峰为185.1288m/z，样品分子量为184.1212，分子式为C₉H₁₆N₂O₂，GC-MS分析结果显示S-3B与已知文献中3-异丁基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮的结构相似，核磁共振氢谱结果是¹H NMR(400MHz,D₂O)δ4.16(d,J＝7.2Hz,2H),1.74(s,3H),1.49(d,J＝7.1Hz,3H),0.95(s,6H)。

由此可以确定，上述鞘氨醇杆菌Lzh-3的发酵提取物中两种具有溶藻活性的有效成分分别为具有结构式(I)的六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和具有结构式(II)的3-异丁基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮。

经测定，六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(I)和3-异丁基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮(II)对铜绿微囊藻9110的半致死量LD50分别为5.7μg/mL和8.2μg/mL。

进一步地，本发明所提供的具有溶藻活性的鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)Lzh-3可制成溶藻菌剂。

进一步地，本发明所提供的具有溶藻活性的鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)Lzh-3的发酵产物包括发酵液、发酵液浓缩物、发酵液粗提物或发酵液提取物，可制成溶藻药剂。

在本发明的实施例3中给出了鞘氨醇杆菌Lzh-3发酵液对不同蓝藻和真核藻类的溶藻效果数据。

4天溶藻率分别为：铜绿微囊藻9110为83.7±4.3％，铜绿微囊藻PCC7806为83.6±8.3％，颤藻BN35为80.6±9.4％，绿色微囊藻FACHB-979为74.9±1.9％,色球藻FACHB-191为79.4±6.9％，绿藻B1为72.5±5.3％，衣藻BS3为18.2±6.2％，聚球藻BN60为23.6±3.6％；

6天溶藻率分别为：铜绿微囊藻9110为92.8±7.5％，铜绿微囊藻PCC7806为90.8±5.3％，颤藻BN35为89.4±2.8％，绿色微囊藻FACHB-979为86.7±5,0％，色球藻FACHB-191为88.6±6.4％，绿藻B1为84.6±3.9％，衣藻BS3为27.1±4.9％，聚球藻BN60为32.5±5.7％。

本发明的鞘氨醇杆菌Lzh-3的溶藻效果具有广谱性。其发酵液制备方法简单，制备周期短。鞘氨醇杆菌Lzh-3的发酵液对太湖中的铜绿微囊藻9110、绿藻和颤藻BN35等具有很好的溶藻效果，而铜绿微囊藻是太湖蓝藻水华中的主要蓝藻。鞘氨醇杆菌Lzh-3发酵液和乙酸乙酯萃取液均可用于蓝藻水华或其它微藻的控制，且溶藻效果较好。其中，鞘氨醇杆菌Lzh-3发酵液对铜绿微囊藻9110的6天溶藻率达到92.8±7.5％。鞘氨醇杆菌Lzh-3的发酵产物六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和3-异丁基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮对太湖蓝藻水华中的主要蓝藻铜绿微囊藻9110具有较好的致死作用，可用于新型杀藻剂的研发和生产，最终应用于湖泊蓝藻水华的控制。

以下将结合附图对本发明的鞘氨醇杆菌Lzh-3菌株及其发酵产物六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和3-异丁基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮在蓝藻水华控制中的效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是加入溶藻菌Lzh-3后铜绿微囊藻9110细胞浓度随时间变化的曲线图；

图2是溶藻菌Lzh-3的发酵液乙酸乙酯萃取液加入到铜绿微囊藻9110藻平板上的溶藻效果照片；

图3是溶藻物质六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(I)和3-异丁基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮(II)分别加入到铜绿微囊藻9110藻平板上的溶藻效果照片；

图4是溶藻物质六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(I)和3-异丁基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮(II)分别加入到铜绿微囊藻9110藻液中后，铜绿微囊藻9110的24小时存活率随加入的溶藻物质浓度变化的曲线图。

具体实施方式

实施例1溶藻细菌的筛选

将太湖梅梁湾水域采集的10mL自然水样加入到90mL对数期的铜绿微囊藻9110的藻液中，放入光照培养箱中培养至藻液黄华。取黄化藻液用梯度稀释法涂牛肉膏蛋白胨培养基琼脂平板，28℃培养24h，取菌落密度适中的平板，按照菌落形态的不同挑选不同菌株。

将筛选出来的菌株分别接种入10mL灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基中，28℃，200rpm培养24h，将10mL培养好的菌液分别加入90mL对数期铜绿微囊藻的藻液中。另外将10mL灭菌后的牛肉膏蛋白胨培养基同样加入90mL藻液中作为对照。所有实验组和对照组的藻液在光照培养箱中培养，计算其溶藻效率，选取了其中溶藻效率高的一株细菌进行进一步研究，该菌株代号为Lzh-3。

藻液培养条件：铜绿微囊藻9110用BG11液体培养基培养，放置于光照培养箱中，25℃，光照强度40μmol photons m^-2s^-1，光暗周期比为12h：12h(光照：黑暗)。

溶藻效率计算方法：溶藻效率(％)＝(对照组藻细胞密度-实验组藻细胞密度)/对照组藻细胞密度×100。其中铜绿微囊藻的藻细胞密度用血球计数板测定。

图1为加入溶藻菌Lzh-3后铜绿微囊藻9110细胞浓度随时间的变化曲线(溶藻菌Lzh-3(初始浓度1×10⁸cells/mL)(■)和空白对照(◆))。

实施例2鞘氨醇杆菌Lzh-3菌株的鉴定

用形态观察、染色、生理生化反应、16srRNA基因序列分析等方法对溶藻效果最强的Lzh-3进行鉴定，该菌株为属革兰氏染色阴性菌,细胞呈直杆状，0.6～0.8μm×0.6～4μm。无鞭毛，少有滑行运动。过氧化氢酶阳性，化能异养,无特殊营养需求。室温下放置数日后菌落通常淡黄色。不产生吲哚，不水解蛋白,不液化明胶，氧化糖醇类产酸。经16srRNA基因序列分析和同源性比较，得知其与GenBank中某鞘氨醇杆菌菌株有99％的同源性，故鉴定为鞘氨醇杆菌属细菌，命名为鞘氨醇杆菌Lzh-3。

实施例3鞘氨醇杆菌Lzh-3发酵液及其乙酸乙酯萃取液的制备方法

将鞘氨醇杆菌Lzh-3按照1％接种量接种于pH7.0的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基中，28℃下200rpm摇床培养48h后得到鞘氨醇杆菌Lzh-3含菌发酵液。将乙酸乙酯按照1：1的比例加入发酵液中，放入振荡器中振荡24h，分离出上层溶液，即乙酸乙酯萃取液。将乙酸乙酯蒸干，加水溶解，再使用0.22μm孔径的微孔滤膜过滤后用于进一步纯化发酵产物。

实施例4鞘氨醇杆菌Lzh-3发酵液对不同蓝藻和真核藻类的溶藻效果比较

将8份培养好的(培养条件：pH7.0的牛肉膏蛋白胨培养基，28℃，200rpm培养24h)10mL鞘氨醇杆菌Lzh-3发酵液分别加入6株蓝藻(原核藻)和2株真核藻(表1)的藻液中(90mL，所有藻液均培养到对数期)，同样使用10mL无菌牛肉膏蛋白胨培养基分别加入8种藻液中(90mL，所有藻液均培养到对数期)作为对照，在光照培养箱中培养4天和6天后分别测定所有实验组和对照组的藻液的叶绿素浓度，计算其溶藻效率。每个样品测三个平行样，表示成平均值±标准差的形式。

实验中用到的藻种有3株购自武汉水生所藻种库，另外5株筛选自太湖水体。实验结果表明，鞘氨醇杆菌Lzh-3的发酵液对于绝大部分原核藻种具有很好的溶藻效果(表1)。此结果表明鞘氨醇杆菌Lzh-3的溶藻能力具有广谱性，是一种非常有潜力的溶藻细菌。

表1.鞘氨醇杆菌Lzh-3对8株藻株的溶藻效果

注：表中用星号(*)标记的藻株是从太湖无锡梅梁湾水体中筛选得到的，其余藻株都是购买自中国淡水藻种库。

鞘氨醇杆菌Lzh-3对太湖蓝藻水华中的主要蓝藻铜绿微囊藻9110的溶藻效果如图1所示。图1表明，加入鞘氨醇杆菌Lzh-3后，铜绿微囊藻9110细胞浓度随时间的延长而下降，而空白对照中铜绿微囊藻9110细胞浓度随时间的延长而上升，第六天时几乎所有的铜绿微囊藻9110(＞91％)死亡。其中加入藻液的鞘氨醇杆菌Lzh-3初始浓度为1×10⁸cells/mL。

实施例5Lzh-3菌株溶藻机制的研究

将鞘氨醇杆菌Lzh-3发酵液按照步骤3所述的方法制成乙酸乙酯萃取液，用离心干燥器蒸干后，用无菌水溶解后备用。最后把灭菌牛肉膏蛋白胨培养基同样离心干燥浓缩作为对照。将按照上述方法制得的萃取液以及浓缩牛肉膏蛋白胨对照分别加到圆纸片(直径1cm)上，放置于铜绿微囊藻制成的BG11固体平板上。藻平板放入光照培养箱中培养2天后观察圆纸片周围的抑藻圈的形成以判断其溶藻效果。

铜绿微囊藻琼脂平板的制作方法：向每块平板上倒入适量(约20mL)BG11琼脂培养基(琼脂比例1.5％)，待其凝固后备用。将300mL培养好的铜绿微囊藻藻液4000g离心20min后弃掉上清，收集藻细胞沉淀加入到100mL灭菌后的BG11软琼脂固体培养基中(1％琼脂，放置于53℃水浴中防止凝固)，摇匀后倒入制好的BG11固体平板上层(每块平板约倒入20mL)，待其凝固后放入光照培养箱中培养并备用。

实验结果如图2所示，显示鞘氨醇杆菌Lzh-3的发酵液萃取液有很好的溶藻效果，这表明该菌株具有分泌胞外溶藻物质进行溶藻的性能。

实施例6鞘氨醇杆菌Lzh-3发酵产物中溶藻有效成分的提取纯化

利用HPLC技术将溶藻菌Lzh-3的溶藻发酵产物纯化，得到两种具有溶藻功能的纯化物质S-3A和S-3B，具体步骤如下：

将鞘氨醇杆菌Lzh-3发酵液的萃取液通过DIKMA公司的SupersilTM C18-EP半制备柱，水和甲醇为流动相的HPLC技术手段进行初步纯化，得到溶藻有效成分。然后通过DIKMASupersilTM C18-EP分析柱，水和甲醇为流动相的HPLC技术手段进行进一步纯化，得到两种有效溶藻成分S-3A和S-3B，用于结构鉴定。

实施例7鞘氨醇杆菌Lzh-3发酵产物中溶藻有效成分的化学结构鉴定

利用LC-MS﹑GC-MG和NMR分析(核磁共振分析)具有溶藻功能的发酵产物的化学结构。

将纯化后的样品S-3A进行LC-MS分析，得到样品S-3A的分子离子峰为155.0820m/z，样品分子量为154.0742，分子式为C₇H₁₀N₂O₂。GC-MS分析结果显示，S-3A与GC-MS数据库中六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的结构相似，相似性指数＞850。将样品S-3A进行核磁共振氢谱分析，得到以下结果：¹H NMR(400MHz,D₂O)δ4.31(dd,J＝11.5,4.7Hz,1H),4.15(dd,J＝17.3,2.6Hz,1H),3.86(d,J＝17.3Hz,1H),3.53(dd,J＝8.7,4.8Hz,2H),2.31(dd,J＝8.5,3.2Hz,1H),2.05(dd,J＝7.3,3.2Hz,1H),1.94(ddd,J＝16.6,6.6,4.6Hz,2H)。将样品S-3A的LC-MS﹑GC-MS和NMR结果进行分析，可以确定具有溶藻效果的发酵产物S-3A是六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮，其化学结构如下图所示。

将纯化后的样品S-3B进行LC-MS分析，得到样品S-3B的分子离子峰为185.1288m/z，样品分子量为184.1212，分子式为C₉H₁₆N₂O₂。GC-MS分析结果显示，S-3B与已知文献中3-异丁基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮的结构相似。将样品S-3B进行核磁共振氢谱分析，得到以下结果：¹H NMR(400MHz,D₂O)δ4.16(d,J＝7.2Hz,2H),1.74(s,3H),1.49(d,J＝7.1Hz,3H),0.95(s,6H)。将样品S-3B的LC-MS﹑GC-MS和NMR结果进行分析，可以确定具有溶藻效果的发酵产物S-3B是3-异丁基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮，其化学结构如下图所示。

实施例8鞘氨醇杆菌Lzh-3发酵产物六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和3-异丁基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮的溶藻效能研究

使用上述Lzh-3菌株溶藻机制的研究中的方法，经实验发现六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和3-异丁基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮在铜绿微囊藻制成的藻平板上能形成明显的抑藻圈，而空白对照则不会形成抑藻圈(图3)。

将六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和3-异丁基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮分别加入蓝藻即铜绿微囊藻9110中，使六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和3-异丁基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮的浓度分别形成一个系列：100μg/mL﹑50μg/mL﹑40μg/mL﹑30μg/mL﹑20μg/mL﹑10μg/mL和5μg/mL。将加入六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和3-异丁基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮的铜绿微囊藻9110放入光照培养箱中培养24小时后测定铜绿微囊藻9110的存活率。实验结果表明，六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和3-异丁基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮对铜绿微囊藻9110的半致死量LD50分别为5.7μg/mL和8.2μg/mL(图4)。此结果表明鞘氨醇杆菌Lzh-3的发酵产物六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和3-异丁基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮是十分有效的控制蓝藻的物质。

图4显示了加入不同浓度溶藻物质六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和3-异丁基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮后，铜绿微囊藻9110存活率的变化曲线。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.一株具有溶藻活性的鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)Lzh-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.8281，保藏日期为2013年9月27日，所述鞘氨醇杆菌Lzh-3呈过氧化氢酶阳性，且能发酵产生3-异丁基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮。

2.如权利要求1所述的鞘氨醇杆菌Lzh-3在控制蓝藻水华中的应用。

3.如权利要求1所述的鞘氨醇杆菌Lzh-3的发酵产物在控制蓝藻水华中的应用。

4.一种溶藻菌剂，其特征在于，所述溶藻菌剂中包含权利要求1所述的鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)Lzh-3。

5.一种溶藻药剂，其特征在于，所述溶藻药剂中包含权利要求1所述的鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)Lzh-3的发酵产物，所述发酵产物为发酵液、发酵液浓缩物或发酵液提取物。

6.一种制备鞘氨醇杆菌Lzh-3发酵提取物的方法，包括如下步骤：

1)、发酵权利要求1所述的鞘氨醇杆菌Lzh-3，获得发酵液；

2)、用萃取剂萃取发酵液，获得萃取液；

3)、将萃取液蒸干，获得粗提物；

4)、将粗提物溶于水后过滤；

7.如权利要求6所述的方法，其中步骤1)中，发酵条件为，鞘氨醇杆菌Lzh-3接种于pH7.0的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基中，28℃、200rpm环境条件下发酵48h。

8.如权利要求6所述的方法，其中步骤2)中，萃取剂为乙酸乙酯，乙酸乙酯与发酵液的体积比为1:1。

9.如权利要求6所述的方法，其中步骤5)中，所述进一步提纯手段为：将滤液通过半制备柱，用HPLC进行初步纯化，得到溶藻成分；将得到的溶藻成分通过分析柱，用HPLC进行进一步纯化，得到单一组分的有效溶藻成分。