CN103987846A

CN103987846A - 一种双链核酸及其在核糖核酸酶检测中的应用和试剂盒

Info

Publication number: CN103987846A
Application number: CN201280045875.2A
Authority: CN
Inventors: 张鸿雁; 黄唯燕
Original assignee: Suzhou Ribo Life Science Co Ltd
Current assignee: Suzhou Ruibo Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2011-09-20
Filing date: 2012-09-10
Publication date: 2014-08-13
Anticipated expiration: 2032-09-10
Also published as: CN103987846B; US20150037805A1; US9540682B2; WO2013040992A1

Abstract

提供了一种双链核酸及其在核糖核酸酶检测中的应用、一种核糖核酸酶的检测方法及其在肿瘤检测和/或诊断中的应用。具体地，该双链核酸底物中包含至少一个核糖核酸酶的敏感位点，通过分析核糖核酸酶对双链核酸底物的降解来检测样本中核糖核酸酶的活性及含量。还提供了一种核糖核酸酶检测试剂盒和一种肿瘤检测试剂盒。

Description

一种双链核酸及其在核糖核酸酶检测中的应用和试剂盒技术领域

本发明涉及分子生物学领域。具体而言，本发明涉及一种双链核酸及其在核糖核酸酶检测中的应用、一种核糖核酸酶的检测方法及其在肿瘤检测和 /或诊断中的应用，以及一种核糖核酸酶检测试剂盒和一种肿瘤检测试剂盒。背景技术

核糖核酸酶（Ribonuclease, RNase) 或称 R A酶，是一大类包括数十个种类的、能够将 R A底物水解成小分子核酸的酶。按切割位点的位置，可将这些酶分为内切酶和外切酶两类，分属于 EC 2.7 (磷酸化酶）与 EC 3.1 (水解酶）中的多个次分类。不同来源的核糖核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。例如，核糖核酸酶 T1 的催化产物为单核苷酸、和以 3'-鸟苷酸为组成的或末端为 3'-鸟苷酸的低聚核苷酸，核糖核酸酶 T2的催化产物为单核苷酸、和以 3'-腺苷酸为组成的或末端为 3'-腺苷酸的低聚核苷酸。绝大部分的核糖核酸酶需要二价阳离子作为辅因子 (例如 Ca²⁺、 Mg²⁺等)，因此其活性可被乙二胺四乙酸 (EDTA)阻断。

在实验室研究中，最主要的两种核糖核酸酶是 RNase A和 RNase H。 RNase H是一种核糖核酸内切酶，能特异性地水解与 DNA链形成互补的 RNA链骨架上的磷酸二酯键，即，分解 R A/DNA杂交链中的 R A链，但该酶不能消化单链或双链 DNA。 RNase A 是另一种被详细研究和具有广泛应用的核酸内切酶。 RNase A对 R A有水解作用，但对 DNA则不起作用。RNase A在嘧啶核苷酸残基 C和 U的 3'端处高效且专一地催化 R A 链骨架上的磷酸二酯键的裂开，形成具有 2'，3'-环磷酸衍生物的寡聚核苷酸，从而可以用来去除 DNA制品中的污染 RNA。

为了检测样本中核糖核酸酶的活性或含量，研究人员在分析底物降解的基础上，建立了许多技术方案。这些方案大体上分为两类：一类是以异质性的核糖核酸分子为底物，另一类是以人工合成的核糖核酸分子为底物，例如寡聚核糖核苷酸。通常情况下，以人工合成的寡聚核糖核酸为底物的检测技术具有更高的灵敏度和更好的特异性。在这些方案中，众多检测技术得到了巧妙的应用，其中包括直接染色法、分光光度法、比色法检测、级联显色法、同位素示踪技术、荧光偏振技术和荧光淬灭技术。检测手段的选择在很大程度上决定了分析技术的灵敏度和适用范围。例如，为了检测实验试剂是否受到核糖核酸酶的污染，需要使用非常灵敏的检测技术，以确定实验试剂中微量核糖核酸酶的存在，从而避免实验样本的降解。如果检测手段不够灵敏，不能检测到虽然微量但足以影响实验结果的核糖核酸酶的存在，将会直接导致实验的失败；反之，如果检测手段过于灵敏，将会排除虽然存在极微量的核糖核酸酶但不至于对实验结果产生影响的试剂，这种高灵敏性虽然能够保证实验结果的准确性，但同时会增加实验的难度，提高实验成本。在实际操作中，检测灵敏度在 1-100 picogram/ml (pg/ml) RNase A 的范围内是比较理想的，但目前商品化的检测试剂的灵敏度在 10-100 pg/ml RNase A范围内。另一方面，由于核糖核酸酶的监测是一项常规的实验室操作，这就要求检测技术具有较高的稳定性并易于操作。

早期的核糖核酸酶活性检测是建立在 Kunitz 技术上（Kunitz M. A spectrophotometric method for the measurement of ribonuclease activity. J. Biol. Chem., 1946, 164:563-568)。在该技术中，他们向被检测样本中加入异质性的 RNA样本，通过分光光度法检测 R A样本在 300 nm吸收值的变化，计算样本中核糖核酸酶的活性。 Oshima 随后对这项技术进行了优化 (Oshima T, Uenishi N and Imahori K. Simple assay methods for ribonuclease Tl， T2, and nuclease PL Anal. Biochem., 1976, 71 :632-634)。总的来说，这种检测方案的灵敏度不高，不适合核糖核酸酶活性检测的要求。

另一种核糖核酸酶活性检测方案首先利用聚丙烯酰胺凝胶对样本进行分离 (Wilson CW. A rapid staining technique for detection of RNase after polyacrylamide gel electrophoresis. Anal. Biochem., 1969, 31 :506-511)。利用使凝胶中被分离的核糖核酸酶样本与异质性 R A底物接触及随后的 R A染色，分析 R A底物的降解情况，并进而检测核糖核酸酶的活性。虽然这种方案在概念上较为简单，但实施起来非常耗时，并且灵敏度不高，只能检测 1个单位或以上的 RNase I。在该方案的改进型中， Karpetsky通过改善凝胶分离技术，使检测灵敏度提高到能检测 100 pg以下的 RNase A (Karpetsky TP, Davie GE， Shriven KK and Levy CC. Use of polynucleotide/polyacrylamide-gel electrophoresis as a sensitive technique for the detection and comparison of ribonuclease activities. Biochem. J.， 1980, 189:277-284)。即便如此，改进方案并没有有效的减少检测时间，使得该方案仍然不适合实验检验的需要。

另一种核糖核酸酶活性检测方案是由 Egly和 Kempf建立的（Egly JM and KempfJ. Detection and estimation of very low ribonuclease activities in biological fluids. FEBS Letters, 1976, 63:250-254)。利用核糖核酸酶对不溶性底物的降解，通过分析降解产生的 ¹²⁵lodine 标记的核苷酸，他们的检测灵敏度可达到 0.01 pg/ml ，适合于常规的质控检测应用。但是由于这项技术采用了具有危害性的放射性同位素，使其不适合普通实验室或产业界的常规使用，大大限制了该技术的适应范围。

另一项核糖核酸酶活性检测技术是由 Wagner建立的（Wagner AP， Iordachel MC and Wagner LP. A simple spectrophotometric method for the measurement of ribonuclease activity in biological fluids. J. Biochem. Biophys. Methods, 1983, 8:291-297)。通过使 R A与 Pyronine-Y结合，使其最大吸收峰值提高到 572 nm，样本中核糖核酸酶对 R A的降解导致该吸光值呈现线性降低。这项检测技术的灵敏度在 2 ng/ml R ase A左右，不适合用于核糖核酸酶活性的检测。

另一种核糖核酸酶检测技术是由 Greiner-Stoeffiele 建立的（Greiner-Stoeffiele T, Grunow M and Hahn U. A general ribonuclease assay using methylene blue. Anal. Biochem., 1996, 240:24-28) 利用一种染料 methylene blue与高分子量的 RNA底物结合形成一种染料 -RNA复合物，样本中核糖核酸酶对底物 R A的降解使得染料从复合物中释放出来，导致 688 nm处的吸光值下降。这种方案也存在敏感性较低的问题，最低检测限只有 25 ng/ml, 不适合检测常规样本中核糖核酸酶活性的需要。

另一种核糖核酸酶检测技术是由 Kam建立的（Kam RC, Crisp M， Yount EA and Hodes ME. A positive zymogram method for ribonuclease. Anal. Biochem., 1979, 96:464-468) 在这个方案中，利用 RNase A对一种合成底物的降解，产生一系列级联反应，最终形成一种可检测蓝色物质。这种检测方案可以检测到 0.066单位的 RNase A (；大约 lOO ng), 也不适合通常的核糖核酸酶检测的需要。

另一种核糖核酸酶检测技术是由 Witmer建立的（Witmer MR, Falcomer CM, Weiner MP, Kay MS, Begley TP, Ganem B and Scheraga HA. U-3'-BCIP: a chromogenic substrate for the detection of RNase A in recombinant DNA expression systems. Nucleic Acids Res., 1991， 19:1-4)。该技术的主要特点是合成了核糖核酸酶底物 U-3'-BCIP，该底物在核糖核酸酶的作用下会释放一种报告基团，利用分光光度计在 650 nm条件下检测报告基团的释放情况，从而计算样本中核糖核酸酶的活性和含量。这种方案虽然简便易行，但是仍然不够敏感。

荧光淬灭技术是一项被广泛应用于生命科学不同领域的研究技术，例如被应用于蛋白酶活性的检测 (Yaron A, Carmel A and Katchalski-Katzir E. Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes. Anal. Biochem., 95:228-235, 1979)、 DNA限制性内切酶的活性的检测 (Ghosh SS, Eis PS, Blumeyer K， Fearon K and Millar DP. Real time kinetics of restriction endonuclease cleavage monitored by fluorescence resonance energy transfer. Nucleic Acids Res.， 1994， 22:3155-3159)、 DNA聚合酶的 5'外切酶活性的检测 (Gelfand DH, Holland PM, Saiki RK and Watson RM. Homogenous assay using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase. U.S. Pat. No. 5,210,015, 1993)、特异性核酉爱序列的检测 (Gelfand DH, Holland PM, Saiki RK and Watson RM. Homogenous assay using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase. U.S. Pat. No. 5,210,015, 1993; Tyagi S, Kramer FR and Lizardi PM. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits. U.S. Pat. No. 5,925,517, 1999; Livak KJ, Flood SJA, Marmara J and Mullah KB. Hybridization assay using self-quenching fluorescence probe. U.S. Pat. No. 5,876,930, 1999; Nazarenko IA， Bhatnagar SK， Winn-Deen ES and Hohman RJ. Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon. U.S. Pat. No. 5,866,336, 1999; Nadeau JG, Pitner B， Linn CP and Schram JL. Detection of nucleic acids by fluorescence quenching. U.S. Pat. No. 5,958,700, 1999)、以及免疫反应检测等 (Maggio ET. Chemically induced fluorescence immunoassay. U.S. Pat. No. 4,220,450， 1980)。在一个应用荧光共振能量转移技术检测锤头样核酶活性的方案中，使用了一条合成的寡聚核糖核酸底物，该寡聚核糖核酸底物的一端与 Fam荧光基团连接，另一端与 Tamara 淬灭基团连接 (Hanne A, Ramanujam MV, Rucker R and Krupp G. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) to follow ribozyme reactions in real time. Nucleosides and Nucleotides. 1998, 17:1835-1850)。

在另一个技术方案中， Zelenko等人合成了一条双核苷酸的底物，其一端与荧光基团（O-aminobenzoic acid)连接，另一端与淬灭基团连接（2，4-nitroaniline) (Zelenko 0， Neumann U, Brill W, Pieles U, Moser HE and Hofsteenge J. A novel fluorogenic substrate for ribonucleases: synthesis and enzymatic characterization. Nucleic Acids Res., 1994, 22:2731-2739), RNase A对该底物的切割使得荧光基团与淬灭基团分离，使反应体系的荧光读值增加。这个方案被设计用于研究 RNase A的作用动力学，在检测灵敏度上存在一定的局限，也不适合常规样本核糖核酸酶活性的检测。

在另一个方案中， James设计了一条 9-mer长的嵌合寡聚核苷酸，用于 RNase A的作用动力学研究，在该嵌合底物的中间是一个尿嘧啶核苷酸，两侧均为脱氧核糖核酸，寡核苷酸的一端与荧光基团连接，另一端与淬灭基团连接（James DA and Woolley GA. A fluorescence-based assay for ribonuclease a activity. Anal. Biochem., 1998, 264:26-33 该方案的缺陷在于仅能应用于研究能切割尿嘧啶核苷酸的核糖核酸酶的活性，另一方面需要用到灵敏的荧光光度计。

在另一个方案中， Kelemen等人报告了另一项类似的技术 CKelemen BR, Klink TA， Behlke MA, Eubanks SR, Leland PA and Raines RT. Hypersensitive substrate for ribonucleases. Nucleic Acids Res., 1999, 27:3696-3701)。与 James的研究方案一样，这个方案也只能检测能切割尿嘧啶核苷酸的核糖核酸酶，并且需要用到荧光光度计。

在另一个方案中， Burke等人报道了利用荧光偏振技术检测核糖核酸酶对合成底物的切割活性（Burke TJ， Bolger RE, Checovich WJ and Tompson DV. Method and kit for detecting nucleic acid cleavage utilizing a covalently attached fluorescent tag. U.S. Pat. No. 5,786,139, 1998), 目前市场上已有基于该技术的商品化的试剂盒（PanVera Corporation Catalog 2000, Section 3.10. 545 Science Drive, Madison, Wis. 53711)。 Wilson等人对该技术做了进一步的改进，实现了实时检测的目标（Wilson GM， Lu H， Sun H， Kennedy A and Brewer G. A fluorescence-based assay for 3' S' exoribonucleases： potential applications to the study of mR A decay. R A, 2000, 6:458-464)。但是该技术需要用到一般实验室不具备的荧光偏振仪，影响了该技术方案的广泛使用。

另一个商品化的核糖核酸酶活性检测试剂盒由 PanVera 公司提供 (PanVera Corporation Catalog 2000, Section 3.10. 545 Science Drive, Madison, Wis. 53711)。与荧光偏振方案相比，该技术的灵敏度较低。

另一个商品化的核糖核酸酶活性检测试剂盒由 Ambion 公司提供，该方案基于一种生物素标记的核糖核酸底物，通过普通的显色反应进行核糖核酸酶活性的检测 (Ambion, Inc. Catalog 1999， pi 04. 2130 Woodward Street, Austin, Tex. 78744.)。在没有核糖核酸酶的情况下，底物能够保持完整，在显色反应中呈现蓝色；如果底物被样本中的核糖核酸酶降解，则不能形成蓝色反应。该方案工作量较大，并且不适合高通量应用。

另一个商品化的核糖核酸酶活性检测试剂盒是通过凝胶电泳分析底物的降解情况 (Mo Bio, Web Catalog, 2000) 该方案涉及多步反应，工作量较大，不适合常规的检测工作。

综上所述，尽管以上这些现有的检测方法在提高核糖核酸酶活性检测的灵敏度和准确性方面起了一定的作用，但均存在一定的缺陷，不适合作为一个通用的手段用于样本中核糖核酸酶活性的高灵敏的检测，相关技术方案还有较大的可改进的空间。发明内容

为了开发一种更稳定、更特异的核糖核酸酶检测底物，提高检测的灵敏度和特异性，发明人对核糖核酸酶降解双链核糖核酸底物的降解过程及机制进行了广泛而深入的研究，意外地发现绝大多数降解发生在双链核糖核酸底物的两个敏感位点 CA/UG 和 UA/UA上。在这一研究结果的基础上，完成了本发明。

一方面，本发明提供一种双链核酸，所述双链核酸为能够被核糖核酸酶切割的双链核酸，所述双链核酸的长度为 7-30个碱基对，所述双链核酸的第一单链的碱基序列中含有至少一个 CA碱基序列或 UA碱基序列，所述双链核酸的第二单链的碱基序列中含有与所述第一单链中 CA碱基序列或 UA碱基序列互补的 UG碱基序列或 UA碱基序列，所述双链核酸的一端连接有能量供体基团，另一端连接有能量受体基团，且所述能量供体基团和能量受体基团之间能够进行能量转移。

根据本发明的一种实施方式，所述双链核酸的长度为 7-30个碱基对，优选为 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29或 30个碱基对；还可以优选为 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20或 21个碱基对，进一步优选为 9、 10、 11、 12、 13、 14或 15个碱基对，还可以进一步优选为 7、 8、 9、 10、 11、 12或 13个碱基对。

根据本发明的一个实施方式，其中，所述双链核酸的第一单链的碱基序列中含有至少一个 CA碱基序列，所述双链核酸的第二单链的碱基序列中含有与所述第一单链中 CA碱基序列互补的 UG碱基序列。

根据本发明的一个实施方式，其中，所述双链核酸的第一单链的碱基序列中含有至少一个 UA碱基序列，所述双链核酸的第二单链的碱基序列中含有与所述第一单链中 UA碱基序列互补的 UA碱基序列。

根据本发明的一种实施方式，所述双链核酸的第二单链与第一单链完全互补，所述双链核酸的第一单链的碱基序列优选为 5'-AUGAGCCUGAUUU、 5'-AUGAGCCUAA UUU、 5'-GGCUGCU、 5'-GAAUGAGCU、 5 '-GAGUCAGCUAATCUU或 5'-UGGUAU GAGCCUGAUUUUGAU, 进一步优选为 5'-AUGAGCCUGAUUU。

根据本发明的一种实施方式，所述双链核酸中含有至少一个脱氧核糖核苷酸基团。根据本发明的一种实施方式，所述双链核酸中含有至少一个修饰的核苷酸基团。根据本发明的一种实施方式，所述修饰的核苷酸基团为磷酸基团、核糖基团和碱基中的至少一种被修饰的核苷酸基团，其中，核糖基团被修饰的核苷酸基团为核糖基团的 2'-羟基被修饰的核苷酸基团，所述核糖基团被修饰的核苷酸基团优选为核糖基团的 2'-羟基被甲氧基（2'-meth_0Xy) 或氟（2'-Fl_UOra) 取代的核苷酸基团。

根据本发明的一种实施方式，所述能量供体基团和所述能量受体基团位于双链核酸的同一条核酸单链上，或者位于不同核酸单链上。优选所述能量供体基团和所述能量受体基团分别位于两条单链的 5'-端。所述能量供体基团和能量受体基团可共价连接在核酸单链的末端。

根据本发明的一种实施方式，所述能量供体基团为荧光供体基团，所述能量受体基团为荧光受体基团，其中，所述的荧光受体基团优选为荧光淬灭基团。

优选所述荧光供体基团为选自荧光素（fluorescein)基团、四氯荧光素 (tetrachloro fluorescein)基团、六氯焚光素 (hexachlorofluorescein)基团、罗丹明 (rhodamine) 基团、四甲基罗丹明 (tetramethylrhodamine)基团、花青染料 (Cy dye)、德克萨斯红 (Texas Red)基团、氟硼荧光染料 (Bodipy dye)基团和亚历克萨荧光染料 (Alexa dye)基团中的至少一种，更优选为选自 6-羧基荧光素基团、 5-四氯荧光素基团、 5-六氯荧光素基团、 6-羧基 -X-罗丹明基团、 Ν,Ν'-对羧苄基吲哚三菁基团和 6-羧基四甲基罗丹明基团中的至少一种。

优选所述荧光受体基团为选自氮代氧杂蒽（nitrogen-substituted xanthene)基团、取代或未取代的四偶氮苯基苯胺 (substituted 4-(phenyldiazenyl) phenylamine)基团、取代或未取代的四偶氮苯基萘胺（substituted 4-(phenyldiazenyl) naphthylamine)基团，更优选所述荧光受体基团为选自 4-(4'-二甲基对氨基偶氮苯)苯甲酸 (4-(4'-dimethylaminophenylazo) benzoic acid))基团、 Ν,Ν'-双甲基 -Ν,Ν'-联苯 -4-(5-叔丁氧羰基戊胺）哌啶砜基罗丹明 (N,N' -dimethyl-N,N' -diphenyl-4-((5 -t-butoxycarbonylaminopentyl)

aminocarbonyl) piperidinylsulfonerhodamine) 基团、 4',5'- 二硝基焚光素 (4'，5'-dinitrofluorescein)基团、氨基哌啶酸 (pipe-colic acid amide)基团、 4-(4-硝化苯嗪基) 苯胺（4-[4-nitrophenyldiazinyl]phenylamine) 基团、 4-(4- 硝化苯嗪基）萘胺 (4- [4-nitrophenyldiazinyl] naphthylamine)基团中的至少一禾中。

另一方面，本发明提供如上所述的双链核酸在核糖核酸酶检测中的应用。其中，所述核糖核酸酶包括但不限于 R ase I、 R aseA、 R ase H。

另一方面，本发明提供如上所述的双链核酸在制备核糖核酸酶检测试剂中的应用。其中，所述核糖核酸酶包括但不限于 R ase I、 R ase A、 R ase H。

另一方面，本发明提供一种核糖核酸酶的检测方法，具体包括以下步骤： 1 ) 获得如上所述的双链核酸； 2)使步骤 1 ) 中的双链核酸与被检测样本接触，使得所述双链核酸能够被所述被检测样本中可能存在的核糖核酸酶切割； 3 )检测步骤 2)中的接触后的产物，从而检测所述被检测样本中的核糖核酸酶。

另一方面，本发明提供一种核糖核酸酶的定量检测方法，该方法包括以下步骤： 1 ) 获得如上所述的双链核酸； 2)使步骤 1 ) 中的双链核酸与被检测样本接触，使得所述核酸能够被所述被检测样本中可能存在的核糖核酸酶切割； 3 )检测步骤 2)中的接触后的产物中的切割产物的量，从而检测所述被检测样本中核糖核酸酶的含量。

根据本发明的一种实施方式，其中，所述切割产物或切割产物的量通过测量连接在所述双链核酸两端的能量供体基团和 /或能量受体基团所发出的特定波长的荧光信号而进行检测。

根据本发明的一种实施方式，其中，所述被检测样本为血液、血浆、血清、唾液、组织液和尿液样本中的至少一种。

根据本发明的一种实施方式，检测所述切割产物的方法可以包括直接检测法和间接检测法。所述直接检测法是指直接检测双链核酸底物在与样本接触前后的变化，具体方法包括但不限于电泳法、杂交法或高效液相色谱（HPLC) 法。所述间接检测法是指利用间接的检测技术检测双链核酸底物在与样本接触前后的变化，具体方法包括但不限于荧光能量共振转移方法、和 /或荧光淬灭方法。

另一方面，本发明还提供如上所述的检测方法在肿瘤检测和 /或诊断中的应用。根据本发明的一种实施方式，其中，所述肿瘤为胃癌、结肠癌或肺癌。

本发明还提供一种核糖核酸酶检测试剂盒，该试剂盒含有有效量的如上所述的双链核酸。优选所述试剂盒进一步还包含核糖核酸酶标准品。所述标准品即为阳性对照品，是已知的具有核糖核酸酶活性的物质。

本发明还提供一种肿瘤测试剂盒，该试剂盒含有有效量的如上所述的双链核酸。优选所述试剂盒进一步还包含核糖核酸酶标准品。所述标准品即为阳性对照品，是已知的具有核糖核酸酶活性的物质。

利用本发明所提供的双链核酸底物和核糖核酸酶检测方法，能够灵敏、准确地检测不同来源样本中核糖核酸酶的活性和含量。本发明提供的核糖核酸酶检测方法不仅操作简便，而且大大降低了检测费用，对于多种疾病的早期检测、疗效评价、人群普查等大规模应用均具较高的使用价值。相对于现有技术而言，本发明提供的双链核酸底物和核糖核酸酶检测方法具有明显技术优势，具体体现在以下几个方面。

1) 底物稳定性：相对于现有技术的单链核糖核酸底物，本发明提供的双链核酸底物的稳定性更高，在实际应用中具有更为明显的技术优势。

2) 高度特异性：本发明是建立在对核糖核酸底物中的核糖核酸酶切割敏感位点进行分析的基础上完成的，利用所鉴定的核糖核酸酶切割敏感位点，本发明能够实现核糖核酸酶的特异性检测，提高了检测的特异性和准确性。

3) 定量检测技术：在本发明的两个突出的技术特点，即，底物稳定性和高度特异性的基础上，本发明提供的检测方案能够更加稳定地检测样本中核糖核酸酶的活性，并进一步计算出核糖核酸酶的含量，从而建立了可行的核糖核酸酶定量检测技术，是对现有检测技术的一个重大发展和进步。

4) 高通量检测技术：本发明提供的利用荧光能量共振转移法检测样本中核糖核酸酶活性和含量的方法操作简单，适合于作为标准化的检测方法，从而对大量样本进行高通量、低成本的检测。

5) 广泛的适用性：本发明提供的双链核酸底物及核糖核酸酶检测方法可用于建立标准的核糖核酸酶检测体系，及用于分析、比较样本中或样本间不同核糖核酸酶的活性及含量。附图说明

图 1为本发明一种实施方式中 R ase A处理前的反应体系在 500-650 nm范围内的荧光光谱。

图 2为本发明一种实施方式中 RNase A处理后的反应体系在 500-650 nm范围内的荧光光谱。

图 3为本发明一种实施方式中酶促反应时的检测时间对荧光强度的曲线。

图 4为本发明一种实施方式中 RNase A浓度对 K值的曲线。

图 5 为本发明一种实施方式中健康对照个体与肿瘤个体样本中核糖核酸酶含量的比较图。具体实施方式

本发明中，焚光共振能量转移 (Fluorescence resonance energy transfer, FRET)是指，当一个荧光基团 (又称为荧光供体基团)的荧光光谱与另一个荧光基团 (又称为荧光受体基团)的激发光谱相重叠时，荧光供体基团的激发能诱发荧光受体基团发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减的一种现象。 FRET的产生及效率与荧光供体基团与荧光受体基团的空间距离紧密相关，该空间距离在 7-10 nm时 FRET的效率最佳。随着距离延长， FRET呈显著减弱。荧光供体基团和荧光受体基团之间的 FRET的效率，可以由反映。其中， R表示荧光供体基团和荧光受体基团之间的距离， Ro 表示福氏距离。在福氏距离 Ro处，荧光供体基团与荧光受体基团间的 FRET效率为 50%。福氏距离 Ro依赖于供体发射谱和受体激发谱的重叠程度、以及供体和受体能量转移的偶极子的相对方位。

应当理解，凡是具有荧光发射光谱和荧光激发光谱重叠的荧光基团组合，即，能够发生 FRET现象的荧光基团组合均能应用于本发明。这些荧光基团组合包括但不限于本说明书中提到的荧光基团组合。

本发明中，当采用荧光淬灭基团作为荧光受体基团时，荧光能量供体基团受激发产生的荧光能量通过荧光共振能量迁移转移到荧光淬灭基团后被荧光淬灭基团吸收和 / 或淬灭。本发明中，所采用的荧光淬灭基团可以是自身不产生荧光的淬灭基团（dark quenchers), 也可以是吸收能量后自身可产生特定波长荧光的荧光发光基团（fluorescent quenchers ) o 利用荧光淬灭方法对检测样本中的核糖核酸酶进行检测时，检测样本中的核糖核酸酶会对本发明的双链底物施行酶切，使得连接在双链底物两端的荧光供体基团与荧光淬灭基团产生物理分离，并由此释放被荧光淬灭基团吸收和 /或淬灭的荧光供体基团的荧光信号。即，采用荧光淬灭基团作为荧光受体基团时，双链核酸底物被检测样本中的核糖核酸酶酶切后，荧光供体基团的荧光信号增强，从而通过测量荧光供体基团的荧光信号强弱即可定性和 /或定量检测样本中的核糖核酸酶。

本发明中，作为荧光淬灭基团，可列举但不限于 4-(4'-二甲基对氨基偶氮苯)苯甲酸 (4-(4'-dimethylaminophenylazo) benzoic acid))基团、 Ν,Ν'-双甲基 -Ν,Ν'-联苯 -4-(5-叔丁氧羰基戊胺）哌啶砜基罗丹明（N，N ' -dimethyl-N，N ' -diphenyl-4- ((5 -t-butoxycarbonylamino entyl) amino carbonyl) piperidinylsulfonerhodamine)基团、 4'，5'-二硝基荧光素 (4'，5'-dinitrofluorescein)基团、氨基哌啶酸 (pipe-colic acid amide)基团、 4-(4-硝化苯嗪基)苯胺 (4-[4-nitrophenyldiazinyl]phenylamine)基团、 4-(4-硝化苯嗪基)萘胺 (4-[4-nitrophenyldiazinyl] naphthylamine)基团等。毋庸多言，只要可以吸收和 /或淬灭荧光供体基团受激发产生的荧光能量的基团均可用于本发明，但优选自身不产生荧光的淬灭基团（dark quenchers) 作为本发明的荧光淬灭基团。

本发明中，对双链核酸进行修饰的方式为本领域技术人员所公知。例如，本发明对双链核酸进行的化学修饰为以下的一种或一种以上化学修饰的组合： ( 1 ) 对双链核酸的骨架结构中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；

(2) 对双链核酸的骨架结构中核糖的修饰；

(3 ) 对双链核酸的核苷酸残基中碱基的修饰。

所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰 (Phosphorthioate) 和硼垸化磷酸盐修饰（Boranophosphate)。如下式所示分别用硫和硼垸置换磷酸二酯键中的氧。两种修饰都能稳定核糖核酸分子的结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。

所述核糖修饰是指对核苷酸戊糖中 2'-羟基 (2'-OH)的修饰。在核糖的 2'-羟基位置引入某些取代基如甲氧基或氟后，使血清中的核糖核酸酶不易识别小干涉核酸，由此增加了小干涉核酸的稳定性，使小干涉核酸具有更强的抵抗核酸酶水解的性能。对核苷酸戊糖中 2'-羟基的修饰包括 2'-氟修饰（2'-fluro modification), 2'-甲氧基 (2'-methoxy)修饰、 2'- 甲氧乙氧基 (2'-methoxyethoxy)修饰、 2'-2，4-二硝基苯酚修饰（2'-DNP modification)、锁核酸修饰（LNA modification)、2'-氨基修饰（2 '-Amino modification)、 2'-脱氧修饰（2'-Deoxy modification)等。

2'-氟修饰 2'-甲氧基修饰

2'-甲氧乙氧基修饰 2'-2 4-二硝基苯酚修饰

锁核酸修饰 2'-氨基修饰 2'-脱氧修饰

所述碱基修饰是指对核苷酸的碱基进行修饰，如在尿嘧啶的 5 位点引入溴或碘的 5'-溴尿嘧啶（5'-bromo-uracil) 禾卩 5'-碘尿嘧啶 (5'-iodo-uracil)修饰是常使用的碱基修饰方法，其他还有 N3-甲基脲嘧啶 (N3-methyl-uracil)修饰、 2， 6-二氨基嘌呤 (2， 6-diaminopurine) 修饰等。

5'-溴尿嘧啶 .碘尿嘧啶

优选所述修饰为对所述双链核酸的骨架结构中核糖的 2'-羟基的修饰。进一步优选所述修饰为所述双链核酸的骨架结构中核糖的 2'-羟基被甲氧基（2'-meth_0Xy) 或氟 (2'-fluoro) 取代。

本发明中，利用双链核酸底物检测样本中核糖核酸酶的方法可以是直接或间接检测方法。对双链核酸底物的降解和切割产物的直接检测可通过电泳法、杂交法和 HPLC 法等来进行。这些方法均可通过常规的操作及分析步骤来实施。例如，采用 HPLC法时，可通过对双链核酸底物与测试样本接触后的产物进行定性或定量分析来判断测试样本中是否含有核糖核酸酶或对测试样本中的核糖核酸酶进行定量。

本发明中提到的间接检测方法包括利用荧光共振能量转移法检测核糖核酸酶的方法。这一方法具体包括以下步骤。步骤 1 ): 获得本发明的双链核酸，其中，双链核酸为线形的双链核酸，长度可为 7-30个碱基对，所述双链核酸的一端连接有荧光供体基团，另一端连接有荧光受体基团，所述荧光供体基团和荧光受体基团之间能够进行能量转移；步骤 2): 使步骤 1 ) 中的双链核酸与被检测样本接触，使得所述双链核酸能够被检测样本中可能存在的核糖核酸酶切割；步骤 3 ):检测所述荧光受体基团发出的特定波长的荧光信号，从而定性或定量检测被检测样本中核糖核酸酶。

本发明中提到的间接检测方法也包括利用荧光淬灭方法检测核糖核酸酶的方法。这一方法具体包括以下步骤。步骤 1 ): 获得本发明的双链核酸，其中，双链核酸为线形的双链核酸，长度可为 7-30个碱基对，所述双链核酸的一端连接有荧光供体基团，另一端连接有荧光淬灭基团，所述荧光供体基团和荧光淬灭基团之间能够进行能量转移，且所述荧光供体基团受激发产生的荧光能量可被所述荧光淬灭基团吸收和 /或淬灭；步骤 2)：使步骤 1 ) 中的双链核酸与被检测样本接触，使得所述双链核酸能够被检测样本中可能存在的核糖核酸酶切割；步骤 3 ):检测所述荧光供体基团发出的特定波长的荧光信号，从而定性或定量检测被检测样本中核糖核酸酶。

下面将结合实施例进一步详细描述本发明。应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明的范围。除非特别说明，本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品。实施例中未注明具体条件的实验方法是按照常规实验方法进行，例如按照 Sambrook等编著的《分子克隆：实验室手册》（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中的实验方法，或按照制造厂商所建议的实验方法等。实施例 1

本实施例用于说明本发明中使用的寡聚核糖核苷酸的序列结构及荧光基团的光学参数。委托广州锐博生物科技有限公司合成一系列的寡聚核糖核苷酸。荧光基团标记在寡聚核糖核苷酸的 5'端。互补的寡聚核糖核苷酸可按《分子克隆：实验室手册》中的方法退火形成双链核糖核酸。表 1示出了合成的寡聚核糖核苷酸的序列。其中， SEQ ID NO: 11 表示的寡聚核糖核苷酸中，对 3 位处的鸟苷酸残基的戊糖进行了 2'-甲氧基 (2'-methoxy)修饰。 SEQ ID NO: 12表示的寡聚核糖核苷酸中，对 14位处的脲苷酸残基的戊糖进行了 2'-氟取代（2'-Fluoro substitution)修饰。 SEQ ID NO: 13表示的寡聚核糖核苷酸中，对 20位处的胞苷酸残基的戊糖进行了 2'-甲氧基（2'-meth_0Xy)修饰。表 2 示出了用于标记的荧光基团的光学参数和中英文全称。

表 1. 寡聚核糖核苷酸的序列结构

表 2. 荧光基团的光学参数

缩写英文全称；激发波长；发射波长；颜色中文全称

FAM 6-carboxy-fluorescein; 494; 518; 绿色 6-羧基荧光素

TET 5 -tetrachloro-fluorescein; 521; 538; 橙色 5-四氯荧光素

HEX 5 -hexachloro-fluorescein; 535; 553; 粉红色 5-六氯焚光素

ROX 6-carboxy-x-rhodamine; 587; 607; 红色 6-羧基 -X-罗丹明

CYS Indodicarbocyanine; 643; 667; 蓝紫色 Ν'-对羧苄基吲哚三菁 tetramethyl-6-carboxyrhodamine; 560; 582;

TAMRA 6-羧基四甲基罗丹明

玫瑰色

4-(4'-二甲基对胺基偶氮苯)苯

DABCYL 4-(4'-dimethylaminophenylazo)benzoic acid

甲酸

实施例 2

本实施例用于说明本发明的荧光共振能量转移现象的鉴定。在本发明提供的应用荧光共振能量转移法检测核糖核酸酶水平的技术方案中，一个关键的条件是标记在双链核酸底物两端的荧光供体基团和荧光受体基团之间能够发生荧光共振能量转移。

为了验证这一点，首先使 SEQ ID NO ： 1 的寡聚核糖核苷酸 (5'-FAM-AUGAGCCUGAUUU)和与其互补的 SEQ ID NO : 2 的寡聚核糖核苷酸 (UACUCGGACUAAA-TAMRA-5')退火形成双链核糖核酸底物 DS1。取 4 μΐ的 DS1加入到 2 ml荧光共振能量转移缓冲液 (0.01 M Tris-HCl, H 7.4, 0.002 M MgCl₂)中混匀， DS1 的终浓度为 10 nM。随后，将该反应体系加入荧光光谱仪的石英检测杯中，石英杯中放置有微磁力转子。将含有反应体系的石英杯放入荧光光谱仪，设定 480 nm激发，光谱扫描的范围为 500-650nm。结果如图 1所示，其中，横轴表示波长，纵轴表示荧光强度。可以看出，在 515 nm处荧光强度较低， 575 nm处荧光强度较高。向反应体系中加入 20 ^ R ase A (；终浓度为 1χ 10—⁶ μ_§/μ1)后，部分反应底物被 R ase Α降解，导致与这些反应底物连接的荧光供体基团与荧光受体基团分离，这时候再进行相同的光谱扫描，得到的光谱图如图 2所示。其中，横轴表示波长，纵轴表示荧光强度。可以看出，在 515 nm 处荧光光强显著提高， 575 nm处荧光光强基本消失，降低到本底水平。这个结果表明与双链核糖核酸底物结合的荧光供体基团与荧光受体基团之间确实能够进行荧光共振能量转移。另一方面，这个结果也表明底物被加入的 RNase A降解后，荧光供体基团与荧光受体基团之间的距离远大于荧光共振能量转移所需的最大距离，因而不能进行能量转移。

利用同样的检测方法，分别检测了由 SEQ ID NO: 3的寡聚核糖核苷酸和 SEQ ID NO: 4的寡聚核糖核苷酸退火形成的双链底物 DS2的荧光共振能量转移、由 SEQ ID NO: 5的寡聚核糖核苷酸和 SEQ ID NO: 6的寡聚核糖核苷酸退火形成的双链底物 DS3的荧光共振能量转移、由 SEQ ID NO: 7的寡聚核糖核苷酸和 SEQ ID NO: 8的寡聚核糖核苷酸退火形成的双链底物 DS4的荧光共振能量转移、由 SEQ ID NO: 9的寡聚核糖核苷酸和 SEQ ID NO: 10的寡聚核糖核苷酸退火形成的双链底物 DS5的荧光共振能量转移、由 SEQ ID NO: 11的寡聚核糖核苷酸和 SEQ ID NO: 11的寡聚核糖核苷酸退火形成的双链底物 DS6的荧光共振能量转移、由 SEQ ID NO: 13的寡聚核糖核苷酸和 SEQ ID NO:

14的寡聚核糖核苷酸退火形成的双链底物 DS7的荧光共振能量转移。结果表明，与这些底物两端结合的荧光供体基团和荧光受体基团之间均能发生荧光共振能量转移，因此这些荧光基团标记的双链核糖核酸底物也可用在本发明的核糖核酸酶活性检测中。实施例 3

本实施例用于说明本发明的应用荧光共振能量转移法检测核糖核酸酶的方法。为了利用荧光共振能量转移法检测样本中核糖核酸酶的活性和含量，取 4 μΐ双链 R A底物 DS1加入到 2 ml荧光共振能量转移缓冲液 (0.01 M Tris-HCl, pH 7.4, 0.002 M MgCl₂) 中混匀， DSl的终浓度为 10 nM。随后，将该反应体系加入荧光光谱仪的石英检测杯中，石英杯中放置有微磁力转子。在向反应体系中加入 20 μΐ—定浓度的 RNase A后，对反应体系进行持续的 480 nm激发，并同时在 515 nm进行检测，得到以秒为间隔的荧光强度值。利用这些数值绘制时间对荧光强度的曲线，结果如图 3所示。其中，横轴表示检测时间，纵轴表示荧光强度。该曲线符合以下所示的酶促动力学公式（1)。公式 a)

其中，？„^为双链核糖核酸底物分解后，标记在其两端的荧光基团完全分开时产生的最大的荧光强度变化值，可由实验测得，同一批次实验只需测得一个 F_max。为时间， t₀为实验开始计时后加入核糖核酸酶 RNase A的时间，可为 0。为描述反应速度的 Κ值。

随后，使用 prism软件对这条曲线进行分析。首先，根据完全分解后的荧光强度的变化值对曲线进行标准化。其次，对这条标准化曲线进行非线性回归拟合，非线性回归拟合的范围为 0至 100%，拟合后即可得到与反应速度相关的 K值，且拟合的曲线与标准化的反应曲线的拟合率高达 0.99以上。相关数据分析过程及公式也可参见以下两篇文献。

1) Liu JQ, Chen CY, Xue Y， Hao YH and Tan Z. G-quadruplex hinders translocation of BLM helicase on DNA: a real-time fluorescence spectroscopic unwinding study and comparison with duplex substrates. J Am Chem Soc. 2010, 132(30): 10521-7

2) Lucius AL， Wong CJ and Lohman TM. Fluorescence stopped-flow studies of single turnover kinetics of E.coli RecBCD helicase-catalyzed DNA unwinding. J Mol Biol. 2004 339(4):731-50

将已知浓度的商品化的 R ase A用 DEPC 水进行浓度梯度稀释，并用稀释后的 RNase A处理终浓度为 10 nM的、在其两端用荧光基团进行标记的双链核糖核酸底物。反应温度 25°C，时间长度为 900秒。通过采用一系列不同浓度的 RNase A与底物反应，分别测得一系列 K值。

将由以上结果得到的 K值与其相应的浓度做成一条表示 R ase A浓度与 K值之间关系的标准曲线，结果如图 4所示。其中，横轴表示 RNase A的浓度，纵轴表示在该浓度条件下测得的 K值。这条曲线符合如下所示的非线性回归拟合公式（Π) 。

Y = Y_mn+ ( Y_mm) / ( 1 + ( 10^§^{EC 50}" ^ ^X ))^Kh) 公式（n)

其中， „^为曲线最大值，表示相应于足够量 R ase A的最大响应的 K值。 Y_mm 为曲线的最小值，表示 RNase A活性于趋近 0时的 K值。 X为 RNase A的浓度， EC₅₀ 为半效应浓度， K_H为曲线中线性区段的斜率。

这条曲线的关系符合剂量累计效应，且由这条标准曲线也可以将得到的 K值反向回归成相对应的 RNase A浓度。相关数据分析过程及公式也可参见以下两篇文献。

应用同样的检测方法，分别将由 SEQ ID NO: 3的寡聚核糖核苷酸和 SEQ ID NO: 4的寡聚核糖核苷酸退火形成的双链底物 DS2、由 SEQ ID NO: 5的寡聚核糖核苷酸和 SEQ ID NO: 6的寡聚核糖核苷酸退火形成的双链底物 DS3、由 SEQ ID NO: 7的寡聚核糖核苷酸和 SEQ ID NO: 8的寡聚核糖核苷酸退火形成的双链底物 DS4、由 SEQ ID NO: 9的寡聚核糖核苷酸和 SEQ ID NO: 10的寡聚核糖核苷酸退火形成的双链底物 DS5、由 SEQ ID NO: 11的寡聚核糖核苷酸和 SEQ ID NO: 12的寡聚核糖核苷酸退火形成的双链底物 DS6、以及由 SEQ ID NO: 13的寡聚核糖核苷酸和 SEQ ID NO: 14的寡聚核糖核苷酸退火形成的双链底物 DS7 用于本实施例中的核糖核酸酶含量的检测。结果表明，由这些双链核糖核酸底物均能得到有效的剂量累计曲线，因此这些双链核糖核酸底物也可用于核糖核酸酶活性的检测。实施例 4

本实施例中，对利用荧光共振能量转移法定量检测人血清中核糖核酸酶的方法进行说明。利用实施例 2和实施例 3的核糖核酸酶检测方法，对人血清中核糖核酸酶的活性和含量进行了分析。具体来说，将 SEQ ID NO: 1的寡聚核糖核苷酸和 SEQ ID NO: 2的寡聚核糖核苷酸退火形成双链核糖核酸底物 DS1。将 -80°C保存的人血清样本从冰箱中取出，置于冰上低温融化。将融化后的血清在 4°C条件下进行 500xg、 10分钟低温离心，去除血清中的不溶物，获得的上清用于核糖核酸酶含量的检测。

取 2 ml荧光共振能量转移缓冲液 (0.01 M Tris-HCl, H 7.4， 0.002 M MgCl₂), 向其中加入终浓度为 ΙΟ ηΜ的 DS1，混匀后将该反应体系加入荧光光谱仪的石英检测杯中，石英杯中放置有微磁力转子。将 50 μΐ上述制备好的上清加入到反应体系中，在 25 °C条件下进行反应，反应时间为 900秒。对反应体系进行持续的 480 nm激发，并同时在 515 nm 进行检测，得到以秒为间隔的荧光强度值。利用这些数值绘制时间对荧光强度的曲线，将其定义为反应曲线。按照与上述步骤同样的步骤将 50μ1 的上述制备好的上清加入只含有 2 ml荧光共振能量转移缓冲液的反应体系中，该反应体系中不含 DS1。在 25 °C条件下进行反应，将获得的时间对荧光强度的曲线定义为背景曲线。

将反应曲线和背景曲线的加样点取齐后，用反应曲线的荧光强度值减去背景曲线中对应的每一个时间点的荧光强度值，得到用于核糖核酸酶含量分析的实际反应曲线。根据完全反应后荧光强度的变化值对实际反应曲线进行标准化，在 0至 100%的范围进行非线性拟合，得到代表反应速度的 K值。然后根据之前得到的 R ase A浓度与 K值之间关系的标准曲线，最后反向回归得到与 K值相对应的 RNase A浓度。相关数据分析过程及公式也可参见以下两篇文献。

1) Liu JQ, Chen CY, Xue Y, Hao YH and Tan Z. G-quadruplex hinders translocation of BLM helicase on DNA: a real-time fluorescence spectroscopic unwinding study and comparison with duplex substrates. J Am Chem Soc. 2010, 132(30): 10521-7; 2) Lucius AL, Wong CJ and Lohman TM. Fluorescence stopped-flow studies of single turnover kinetics of E.coli RecBCD helicase-catalyzed DNA unwinding. J Mol Biol. 2004 339(4):731-50 实施例 5

本实施例用于说明应用本发明的检测方法检测临床样本中的核糖核酸酶含量、及健康对照个体与肿瘤个体的核糖核酸酶含量的差异分析结果。分别获得来源于 18例胃癌、 20例结肠癌、 18例肺癌、 19例乳腺癌患者的血清各 2 ml, 同时获得 24例健康对照个体的对照血清样本各 2 ml, 利用实施例 4中的方法分别对这些样本进行荧光共振能量转移实验，获得每个样本中核糖核酸酶的浓度。以健康对照个体的平均值为基准对癌症患者的核糖核酸酶浓度进行统计学分析，结果如表 3和图 5所示，其中，图 5为健康对照个体与肿瘤个体样本中核糖核酸酶含量的比较图，横坐标标出了健康对照以及肿瘤类型组，纵坐标为用健康对照个体的平均值进行归一化的各肿瘤类型的血清样本中的核糖核酸酶的含量。结果表明，与健康对照个体相比，胃癌、结肠癌以及肺癌患者血清中核糖核酸酶的含量降低了 30%以上， t检验的结果表明这些差异的 P值小于 0.05，具有显著性，而乳腺癌患者血清核糖核酸酶的含量与健康对照组相比则没有显著的变化。

表 3

7 66.42 67

8 59.26 59

9 28.27 28

10 43.86 44

11 26.66 27

12 45.25 45

13 11.65 12

14 69.93 70

15 52.2 52

16 24.18 24

17 47.11 47

18 32.12 32 结肠癌 1 55.71 56 结肠癌 2 49.45 49 结肠癌 3 53.68 54 结肠癌 4 37.44 37 结肠癌 5 66.04 66 结肠癌 6 59.88 60 结肠癌 7 49.28 49 结肠癌 8 68.98 69 结肠癌 9 34.22 34 结肠癌 10 42.46 42 结肠癌 11 68.69 69 结肠癌 12 72.94 73 结肠癌 13 49.85 50 结肠癌 14 53.44 53 结肠癌 15 35.71 36 结肠癌 16 26.83 27 结肠癌 17 52.51 53 结肠癌 18 16.49 16 结肠癌 19 34.48 34 结肠癌 20 45.63 46 肺癌 1 42.67 43 肺癌 2 32.41 32 肺癌 3 54.08 54 肺癌 4 58.84 59 肺癌 5 71.35 71 肺癌 6 51.87 52 肺癌 7 55.21 55 肺癌 8 44.85 45 肺癌 9 58.6 59 肺癌 10 31.15 31 肺癌 11 33.44 33 肺癌 12 63.79 64 肺癌 13 61.5 62 肺癌 14 52.82 53 肺癌 15 60.76 61 肺癌 16 13.57 14 肺癌 17 9.15 9 肺癌 18 64.61 65 乳腺癌 1 60.5 60 乳腺癌 2 73.15 73 乳腺癌 3 76.87 77 乳腺癌 4 84.56 85 乳腺癌 5 85.05 85 乳腺癌 6 113.07 113 乳腺癌 7 109.6 110 乳腺癌 8 88.15 88 乳腺癌 9 62.98 63 乳腺癌 10 111.52 112 乳腺癌 11 90.07 90 乳腺癌 12 95.65 96 乳腺癌 13 93.61 94 乳腺癌 14 102.47 102 乳腺癌 15 84 84 乳腺癌 16 77.06 77 乳腺癌 17 92.55 93 乳腺癌 18 90.32 90 乳腺癌 19 94.29 94

Claims

权利要求

1、一种双链核酸，所述双链核酸为能够被核糖核酸酶切割的双链核酸，其中，所述双链核酸的长度为 7-30个碱基对，所述双链核酸的第一单链的碱基序列中含有至少一个 CA碱基序列或 UA碱基序列，所述双链核酸的第二单链的碱基序列中含有与所述第一单链中 CA碱基序列或 UA 碱基序列互补的 UG碱基序列或 UA碱基序列，所述双链核酸的一端连接有能量供体基团，另一端连接有能量受体基团，且所述能量供体基团和能量受体基团之间能够进行能量转移。
2、根据权利要求 1所述的双链核酸，其中，所述双链核酸的长度为 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20或 21个碱基对。
3、根据权利要求 2所述的双链核酸，其中，所述核酸的长度为 9、 10、 11、 12、 13、 14或 15个碱基对。
4、根据权利要求 2所述的双链核酸，其中，所述核酸的长度为 7、 8、 9、 10、 11、 12或 13个碱基对。
5、根据权利要求 1-4中任意一项所述的双链核酸，其中，所述双链核酸的第一单链的碱基序列中含有至少一个 CA碱基序列，所述双链核酸的第二单链的碱基序列中含有与所述第一单链中 CA碱基序列互补的 UG碱基序列。
6、根据权利要求 1-4中任意一项所述的双链核酸，其中，所述双链核酸的第一单链的碱基序列中含有至少一个 UA碱基序列，所述双链核酸的第二单链的碱基序列中含有与所述第一单链中 UA碱基序列互补的 UA碱基序列。

7、根据权利要求 1-6中任意一项所述的双链核酸，其中，所述双链核酸的第一单链和第二单链完全互补，所述第一单链的碱基序列为 5 ' -AUGAGCCUGAUUU, 5 ' -AUGAGCCUAAUUU、 5 ' -GGCUGCU、 5 ' -GAAUGAGCU、 5 ' -GAGUCAGCUAATCUU、或 5， -UGGUAUGAGCCUGAUUUUGAU o
8、根据权利要求 1-6中任意一项所述的双链核酸，其中，所述双链核酸的第一单链和第二单链完全互补，所述第一单链的碱基序列为 5 ' -AUGAGCCUGAUUUo 9、根据权利要求 1-8中任意一项所述的双链核酸，其中，所述双链核酸中含有至少一个脱氧核糖核苷酸基团。
10、根据权利要求 1-9中任意一项所述的双链核酸，其中，所述双链核酸中含有至少一个修饰的核苷酸基团。
11、根据权利要求 10所述的双链核酸，其中，所述修饰的核苷酸基团为磷酸基团、核糖基团和碱基中的至少一种被修饰的核苷酸基团。
12、根据权利要求 11所述的双链核酸，其中，核糖基团被修饰的核苷酸基团为核糖基团的 2' -羟基被修饰的核苷酸基团。
13、根据权利要求 12所述的双链核酸，其中，所述核糖基团被修饰的核苷酸基团为核糖基团的 2' -羟基被甲氧基或氟取代的核苷酸基团。
14、根据权利要求 1-13中任意一项所述的双链核酸，其中，所述能量供体基团和所述能量受体基团位于同一条核酸单链上。
15、根据权利要求 1-13中任意一项所述的双链核酸，其中，所述能量供体基团和所述能量受体基团位于不同核酸单链上。
16、根据权利要求 1-15中任意一项所述的双链核酸，其中，所述能量供体基团为荧光供体基团，所述能量受体基团为荧光受体基团。
17、根据权利要求 16所述的双链核酸，其中，所述荧光受体基团为荧光淬灭基团。
18、根据权利要求 16所述的双链核酸，其中，所述荧光供体基团为选自荧光素基团、四氯荧光素基团、六氯荧光素基团、罗丹明基团、四甲基罗丹明基团、花青染料基团、德克萨斯红基团、氟硼荧光染料基团和亚历克萨荧光染料基团中的至少一种。
19、根据权利要求 18所述的双链核酸，其中，所述荧光供体基团为选自 6-羧基荧光素基团、 5-四氯荧光素基团、 5-六氯荧光素基团、 6-羧基 -X-罗丹明基团、 Ν，Ν'-对羧苄基吲哚三菁基团和 6-羧基四甲基罗丹明基团中的至少一种。
20、根据权利要求 16所述的双链核酸，其中，所述荧光受体基团为选自氮代氧杂蒽基团、四偶氮苯基苯胺基团和四偶氮苯基萘胺基团中的至少一种。

21、根据权利要求 20所述的双链核酸，其中，所述荧光受体基团为选自 4-(4' - 二甲基对氨基偶氮苯)苯甲酸基团、 Ν,Ν'-双甲基 -Ν,Ν'-联苯 -4-(5-叔丁氧羰基戊胺) -哌啶砜基罗丹明基团、 4'，5'-二硝基荧光素基团、氨基哌啶酸基团、 4-(4-硝化苯嗪基)苯胺基团和 4-(4-硝化苯嗪基)萘胺基团中的至少一种。
22、权利要求 1-21中任意一项所述的双链核酸在核糖核酸酶检测中的应用。
23、根据权利要求 22所述的应用，其中，所述核糖核酸酶为 RNase I、 R ase A和 R ase H中的至少一种。
24、权利要求 1-21 中任意一项所述的双链核酸在制备核糖核酸酶检测试剂中的应用。
25、根据权利要求 24所述的应用，其中，所述核糖核酸酶为 RNase I、 RNase A和 RNase H中的至少一种。
26、一种核糖核酸酶的检测方法，该方法包括以下步骤：

1 ) 获得权利要求 1-21中任意一项所述的双链核酸；

2) 使步骤 1 ) 中的双链核酸与被检测样本接触，使得所述双链核酸能够被所述被检测样本中可能存在的核糖核酸酶切割；

3 ) 检测步骤 2) 中的接触后的产物，从而检测所述被检测样本中的核糖核酸酶。
27、一种核糖核酸酶的定量检测方法，该方法包括以下步骤：

1 ) 获得权利要求 1-21中任意一项所述的双链核酸；

2) 使步骤 1 ) 中的双链核酸与被检测样本接触，使得所述双链核酸能够被所述被检测样本中可能存在的核糖核酸酶切割；

3 ) 检测步骤 2) 中的接触后的产物中的切割产物的量，从而检测所述被检测样本中核糖核酸酶的含量。
28、根据权利要求 26或 27所述的检测方法，其中，所述切割产物或切割产物的量通过测量连接在所述双链核酸两端的能量供体基团和 /或能量受体基团所发出的特定波长的荧光信号而进行检测。
29、根据权利要求 26-28中任意一项所述的检测方法，其中，所述被检测样本为血液、血浆、血清、唾液、组织液和尿液样本中的至少一种。
30、权利要求 26-29中任意一项所述的检测方法在肿瘤检测和 /或诊断中的应用。 31、根据权利要求 30所述的应用，其中，所述肿瘤为胃癌、结肠癌或肺癌。
32、一种核糖核酸酶检测试剂盒，该试剂盒含有有效量的权利要求 1-21 中任意一项所述的双链核酸。
33、一种肿瘤检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求 1-21中任意一项所述的双链核酸。
34、权利要求 32或 33所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还含有核糖核酸酶标准

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