CN103981029B - 一种香草兰豆荚提取物、其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物提取技术领域，公开了一种香草兰豆荚提取物、其制备方法和应用。该香草兰豆荚提取物的制备方法包括以下步骤：获得香草兰豆荚；取所得香草兰豆荚，经冷冻，解冻，粉碎后，得第一产品；与水混合，得第二产品；取所得第二产品与果胶酶混合，于40℃～60℃、pH4～6条件下酶解6h～10h后，灭活，过滤，收集滤液，即得。本发明提供的制备方法操作简单、成本低，所得香草兰豆荚提取物中香兰素的含量高，抗氧化能力强，可以应用于制备香料，更有利于香草兰资源的充分利用。
Description
技术领域
本发明属于植物提取技术领域，特别涉及一种香草兰豆荚提取物、其制备方法和应用。
背景技术
香草兰(Vanilla planifolia Andrews)又名香荚兰、香子兰、香果兰，属兰科(Orchidaceae)香子兰属多年生热带藤本植物，其充分生长、生理成熟的香草兰豆荚(也被称为香草兰豆)为香料原料，为高级食用香料，有“食用香料之王”之称，被广泛用于食品、烟、酒、茶、化妆品及医药产品中。但是，刚采收的鲜香草兰豆荚没有香草兰的特征香味，必须经过生香处理才能产生独特的香气。
传统的利用香草兰豆荚发酵生香的过程包括四个步骤：杀青、发酵、干燥、陈化生香，最终形成组分复杂的加工产品，其中包括烷烃、醇类、醛酮类、酯类、酚类、酸类，少量苯、醚类等。将香草兰豆荚进行发酵生香后，用乙醇、丙二醇、异丙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂进行浸提，即得香草兰豆荚提取物，也称之为香草兰酊剂、香草兰豆酊。香草兰豆荚提取物为多种成分的混合物，以其中香兰素含量的多少来衡量其质量的好坏，香兰素的含量越高其质量越好。目前市场上常用香草兰豆荚提取物作为配香原料，用于加工食品、制备高级烟、调制酒、茶、饮料、化妆品等。
研究发现，香草兰豆荚生香后形成的加工产品中最重要的香味成分是香兰素。为了满足香兰素的需求，科学家已经研究出了香兰素的化学合成方法，但是，化学合成的香兰素存在安全性问题、风味也较差，严重限制了其应用，尤其是在高档附加值产品中的应用。天然香兰素一般以香草兰豆荚提取物为原料进一步分离提取获得。目前，天然香兰素的价格十分昂贵，天然香兰素的价格昂贵的原因一方面在于香草兰豆荚的来源非常有限，受产地、天气等因素的限制，特别是香草兰种植过程中需要对花朵进行人工授粉，难以大规模种植。另一方面，因为香草兰豆荚的加工以传统发酵生香的粗放形式为主，鲜香草兰豆荚中葡萄糖香草醛的含量在15～20％，理论上经酶解后能够转化为约5％(干基重)的香兰素，但是经过传统的发酵生香方法，仅产生了约2％(干基重)的香兰素，也导致了天然香兰素价格昂贵。所以，对香草兰豆荚提取物制备方法的研究是十分必要的。
尽管香草兰传统发酵生香技术比较成熟，但是其发酵时间长、香兰素转化率低限制了其在制备香草兰豆荚提取物中的应用和发展。目前，国内外研究人员通过外源酶酶解香草兰豆荚来提高香草兰豆荚提取物中香兰素的含量，为了提高酶解效率，一般采用复合酶法，例如，Ruiz-Terán等人采用纤维素酶和果胶酶处理香草兰青豆荚使得香草兰豆荚提取物中香兰素含量达到了3.66％。
虽然复合酶法能够提高香草兰豆荚提取物中香兰素的含量，但是复合酶法操作复杂，成本较高，也不利于推广，所以急需一种操作简单、香兰素含量高的香草兰豆荚提取物的制备方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的发明目的在于提供一种香草兰豆荚提取物、其制备方法和应用，本发明提供的香草兰豆荚提取物的制备方法操作简单、成本低，香草兰豆荚提取物中香兰素的含量高，所得香草兰豆荚提取物可以应用于制备香料，更有利于香草兰资源的充分利用。
为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明提供了一种香草兰豆荚提取物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：获得香草兰豆荚；
步骤2：取步骤1所得香草兰豆荚，经冷冻，解冻，粉碎后，得第一产品；与水混合，得第二产品；
步骤3：取步骤2制备获得的第二产品与果胶酶混合，于40℃～60℃、pH4～6条件下酶解6h～10h后，灭活，过滤，收集滤液，即得。
优选地，本发明提供的制备方法中，步骤2中冷冻的温度为-40℃～-80℃。
优选地，本发明提供的制备方法中，步骤2中冷冻的时间为20h～28h。
优选地，本发明提供的制备方法中，步骤2中解冻的温度为20℃～30℃。
优选地，本发明提供的制备方法中，步骤2中解冻的时间为0.4h～2.5h。
优选地，本发明提供的制备方法中，以g/U计，步骤1中香草兰豆荚的干重与步骤3中果胶酶的酶活力之比为1:540～2160。
优选地，本发明提供的制备方法中，步骤2中第一产品与水的质量比为1:1～3。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法中，以U/mL计，步骤3中果胶酶的酶活力与第二产品的体积之比为100～200:1。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，以U/mL计，步骤3中果胶酶的酶活力与第二产品的体积之比为120～150:1。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，步骤3中酶解所用搅拌桨的转速为50～240转/min。
优选地，本发明提供的制备方法中，步骤3中灭活具体为：
90℃～100℃条件下，加热10min～15min。
优选地，本发明提供的制备方法中，步骤3中灭活之后、过滤之前还包括浸提步骤。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法中，步骤3中浸提所用的溶剂为有机溶剂。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，步骤3中的有机溶剂为乙醇、丙二醇、异丙醇、乙醚或丙酮中的一种或两者以上混合物。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，步骤3中浸提所用的有机溶剂具体为乙醇。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，步骤3中浸提步骤具体为：加入有机溶液混合，提取；在加入有机溶剂混合之后得到的混合物中，以体积百分比计，其中有机溶剂的体积百分含量为40％～60％。
优选地，本发明提供的制备方法中，步骤3中浸提所用的时间为30min～240min。
优选地，本发明提供的制备方法中，步骤3中浸提的温度为30℃～55℃。
优选地，本发明提供的制备方法中，步骤3中的过滤所用过滤介质的孔径为60目～150目。
优选地，本发明提供的制备方法中，步骤1中香草兰豆荚为生理成熟的香草兰青豆荚。
更为优选地，本发明提供的制备方法中，步骤1中香草兰青豆荚具体为鲜香草兰青豆荚，即为刚采收的新鲜的生理成熟的香草兰青豆荚，其中香草兰青豆荚中的水的质量百分含量为70％～85％。
本发明提供的香草兰豆荚提取物的制备方法首先采用“冷冻-融解”方法对香草兰豆荚进行破壁处理，使其中的香兰素前体物质释放出来；再通过加入果胶酶进行酶解，即将香兰素前体转化为了香兰素。本发明提供的制备方法巧妙地将“冷冻-融解”与酶解结合在了一起，通过条件筛选实验获得了较佳的技术方案，相比复合酶酶解体系而言，更容易控制反应条件、操作简单、成本低；所得香草兰豆荚提取物中香兰素的含量为2.33％～4.76％。实验结果证实，本发明提供的制备方法与复合酶解法相比，所得香草兰豆荚提取物中香兰素的含量高，抗氧化能力强，可以用于制备香草兰浸膏，也可以用于制备香料。
本发明还提供了一种香草兰豆荚提取物，该香草兰豆荚提取物的制备方法包括以下步骤：
步骤1：获得香草兰豆荚；
步骤2：取步骤1所得香草兰豆荚，经冷冻，解冻，粉碎后，得第一产品；与水混合，得第二产品；
步骤3：取步骤2制备获得的第二产品与果胶酶混合，于40℃～60℃、pH4～6条件下酶解6h～10h后，灭活，过滤，收集滤液，即得。
本发明还提供了一种香草兰豆荚提取物在制备香料中的应用，该香草兰豆荚提取物的制备方法包括以下步骤：
步骤1：获得香草兰豆荚；
步骤2：取步骤1所得香草兰豆荚，经冷冻，解冻，粉碎后，得第一产品；与水混合，得第二产品；
步骤3：取步骤2制备获得的第二产品与果胶酶混合，于40℃～60℃、pH4～6条件下酶解6h～10h后，灭活，过滤，收集滤液，即得。
本发明提供了一种香草兰豆荚提取物、其制备方法和应用。该香草兰豆荚提取物的制备方法包括以下步骤：获得香草兰豆荚；取所得香草兰豆荚，经冷冻，解冻，粉碎后，得第一产品；与水混合，得第二产品；取所得第二产品与果胶酶混合，于40℃～60℃、pH4～6条件下酶解6h～10h后，灭活，过滤，收集滤液，即得。相比复合酶酶解方法而言，本发明提供的香草兰豆荚提取物的制备方法更容易控制反应条件、操作简单、成本低，所得香草兰豆荚提取物中香兰素的含量高，更有利于香草兰资源的充分利用。实验结果证实，本发明提供的制备方法与复合酶解法相比，所得香草兰豆荚提取物中香兰素的含量高，抗氧化能力强，可以用于制备香草兰浸膏，也可以用于制备香料。
具体实施方式
本发明公开了一种香草兰豆荚提取物、其制备方法和应用。本领域技术人员可以参考本文内容，获得该香草兰豆荚提取物，实现其应用，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的制备方法及应用已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的一种香草兰豆荚提取物、其制备方法和应用中所用到的试剂和原料均可由市场购得。
为了使本技术领域的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1实验条件的筛选
(1)不同的酶对香草兰豆荚中香兰素生成的影响
实验设置两组，实验组1和实验组2，实验组1所用的酶为纤维素酶、实验组2所用的酶为果胶酶，两组所用香草兰豆荚原材料相同，来源于中国热带农业科学院香料饮料研究所；酶解方法相同：均采用单一酶酶解香草兰豆荚。
实验组1酶解方法为：取100g香草兰豆荚，向所得香草兰豆荚中加水200mL，进行打浆，用胶体磨进一步细化处理5min后；加入纤维素酶0.27g(购买于国药集团化学试剂有限公司公司，酶活力值为1.5万U/g)，酶解条件为：pH为5.4；温度为53℃；时间为7h。酶解完毕后，将酶解液于100℃沸水中水浴中处理10min灭活；加入乙醇使得乙醇的含量为47.5％(V/V)，提取1h，之后将所得液体通过100目的自动压滤机，过滤去除纤维和部分蛋白质，收集滤液，即得香草兰豆荚提取物。
实验组2酶解方法为：取100g香草兰豆荚，向所得香草兰豆荚中加水200mL，进行打浆，用胶体磨进一步细化处理5min；加入果胶酶0.135g(购买于杰能科公司，酶活力值为3万U/g)，酶解条件为：pH为4.2；温度为50℃；时间为7h。酶解完毕后，将酶解液于100℃沸水中水浴中处理10min灭活；加入乙醇使得乙醇的含量为47.5％(V/V)，提取1h，之后将所得液体通过100目的自动压滤机，过滤去除纤维和部分蛋白质，收集滤液，即得到香草兰豆荚提取物。
香草兰豆荚提取物中香兰素含量的检测方法为液相色谱检测方法，具体为：采用1260型安捷伦液相色谱配备反相色谱柱(4.6mm×100mm，3.5μm)，柱温箱温度为30℃，采用乙腈和水10:90(v/v)进行等度洗脱，流速为1mL/min。配制不同浓度标准品溶液(20，40，60，80，100和120μg/mL)绘制标准曲线，进样量为5μL，紫外检测波长设置为280nm。待测样品过0.45μm滤膜进样，根据标准曲线得出待测样品中香兰素的浓度，进一步计算出待测香草兰豆荚提取物中香兰素的含量，换算成干基含量(％)即为香草兰豆荚提取物中香兰素的含量，计算公式为：香草兰豆荚提取物中香兰素的含量(％)＝香草兰豆荚提取物中香兰素的总量/香草兰豆荚干重×100。
实验结果：实验组1制备获得的香草兰豆荚提取物中香兰素的含量为1.31％，实验组2制备获得的香草兰豆荚提取物中香兰素的含量为2.46％，实验结果说明了相同条件下，用果胶酶处理香草兰豆荚所获得的香草兰豆荚提取物中香兰素的含量较高，说明果胶酶更适合用于酶解香草兰豆荚，本发明选用果胶酶酶解香草兰豆荚。
(2)冷冻-融解对香草兰豆荚中香兰素生成的影响
取100g香草兰豆荚，于-40℃低温冰箱处理24h，将冷冻的香草兰豆荚置于25℃条件下进行融解，融解时间为1h，向所得香草兰豆荚中加水200mL打浆，用胶体磨进一步细化处理5min后，pH5.3、50℃条件下放置7h；将所得溶液于100℃沸水中水浴中处理10min灭活；加入乙醇使得乙醇的含量为47.5％(V/V)，提取1h，之后将所得液体通过100目的自动压滤机，过滤去除纤维和部分蛋白质，收集滤液，即得到香草兰豆荚提取物。
采用相同的检测方法检测所得香草兰豆荚提取物中香兰素的含量，得其中香兰素的含量为0.98％，说明只采用冷冻-融解方法时，所得香草兰豆荚提取物中香兰素的含量较低，不适合用于提取香草兰豆荚提取物。
(3)冷冻-融解与酶解相结合对香草兰豆荚中香兰素的生成的影响
实验组3：冷冻-融解与果胶酶酶解相结合对香草兰豆荚中香兰素的生成的影响：
取100g香草兰豆荚，于-40℃低温冰箱冷冻处理24h，将冷冻的香草兰豆荚置于25℃条件下进行融解，融解时间为1h，向所得香草兰豆荚中加水200mL打浆，用胶体磨进一步细化处理5min；加入果胶酶0.135g(购买于杰能科公司，酶活力值为3万U/g)，酶解条件为：pH为4.2；温度为50℃；时间为7h；将酶解液于100℃沸水中水浴中处理10min灭活；加入乙醇使得乙醇的含量为47.5％(V/V)，提取1h，之后将所得液体通过100目的自动压滤机，过滤去除纤维和部分蛋白质，收集滤液，即得到香草兰豆荚提取物。
实验组4：冷冻-融解与纤维素酶酶解相结合对香草兰豆荚中香兰素的生成的影响：
称取100g香草兰豆荚，-40℃低温冰箱冷冻处理24h，将冷冻的香草兰豆荚置于25℃条件下进行融解，融解时间为1h，向所得香草兰豆荚中加水200mL打浆，用胶体磨进一步细化处理5min；加入纤维素酶0.27g(购买于国药集团化学试剂有限公司公司，酶活力值为1.5万U/g)，酶解条件为：pH为5.4；温度为53℃；时间为7h；将酶解液于100℃沸水中水浴中处理10min灭活；加入乙醇使得乙醇的含量为47.5％(V/V)，提取1h，之后将所得液体通过100目的自动压滤机，过滤去除纤维和部分蛋白质，收集滤液，即得到香草兰豆荚提取物。
采用相同的检测方法检测实验组3和实验组4所得香草兰豆荚提取物中香兰素的含量，得实验组3制备获得的香草兰豆荚提取物中香兰素的含量为4.63％，实验组4制备获得的香草兰豆荚提取物中香兰素的含量为2.18％。实验结果表明“冷冻-融解”与果胶酶结合比与纤维素酶结合处理香草兰豆荚所得的香草兰豆荚提取物中香兰素的含量更高，差异显著(P＜0.05)，说明采用“冷冻-融解”结合果胶酶处理香草兰豆荚制备香草兰豆荚提取物的制备方法最优。
实施例2香草兰豆荚提取物的制备
称取100kg香草兰豆荚(来源于中国热带农业科学院香料饮料研究所，其干重为30kg)，于-40℃低温冰箱中冷冻处理28h，将冷冻的香草兰豆荚置于30℃条件下进行融解，融解时间为0.4h，香草兰豆荚被完全融解；向所得香草兰豆荚中加水100kg，进行打浆，用胶体磨进一步细化处理5min，得180L浆液。
将所得浆液全部加入到酶解罐中，加入果胶酶1.20kg(购买于杰能科公司，酶活力值为3万U/g)，酶解条件为：pH为4；温度为60℃；时间为10h；搅拌桨的转速为240转/min。酶解完毕后，将所得酶解液于100℃水浴处理10min灭活；之后将所得液体通过150目的自动压滤机，过滤去除纤维和部分蛋白质，得到香草兰豆荚提取物100L。
实施例3香草兰豆荚提取物的制备
称取50kg香草兰豆荚(来源于中国热带农业科学院香料饮料研究所，为刚采收的新鲜的生理成熟的香草兰青豆荚，其中香草兰青豆荚中的水的质量百分含量为70％，其干重为15kg)，于-80℃低温冰箱中冷冻处理20h，将冷冻的香草兰豆荚置于20℃条件下进行融解，融解时间为2.5h，香草兰豆荚被完全融解；向所得香草兰豆荚中加水50kg，进行打浆，用胶体磨进一步细化处理8min，得80L浆液。
将所得浆液全部加入到酶解罐中，加入果胶酶0.27kg(购买于杰能科公司，酶活力值为3万U/g)，酶解条件为：pH为6；温度为40℃；时间为6h；搅拌桨的转速为50转/min。酶解完毕后，将所得酶解液于90℃水浴处理15min灭活；之后将所得液体通过60目的自动压滤机，过滤去除纤维和部分蛋白质，得到香草兰豆荚提取物43L。
实施例4香草兰豆荚提取物的制备
称取80kg香草兰豆荚(来源于中国热带农业科学院香料饮料研究所，为刚采收的新鲜的生理成熟的香草兰青豆荚，其中香草兰青豆荚中的水的质量百分含量为85％，其干重为12kg)，于-60℃低温冰箱中冷冻处理24h，将冷冻的香草兰豆荚置于25℃条件下进行融解，融解时间为2h，香草兰豆荚被完全融解；向所得香草兰豆荚中加水80kg，进行打浆，用胶体磨进一步细化处理5min，得140L浆液。
将所得浆液全部加入到酶解罐中，加入果胶酶0.70kg(购买于杰能科公司，酶活力值为3万U/g)，酶解条件为：pH为5；温度为45℃；时间为7h；搅拌桨的转速为100转/min。酶解完毕后，将所得酶解液于100℃水浴处理12min灭活；之后将所得液体通过150目的自动压滤机，过滤去除纤维和部分蛋白质，得到香草兰豆荚提取物76L。
实施例5香草兰豆荚提取物的制备
称取100kg香草兰豆荚(来源于中国热带农业科学院香料饮料研究所，为刚采收的新鲜的生理成熟的香草兰青豆荚，其中香草兰青豆荚中的水的质量百分含量为80％，其干重为20kg)，于-60℃低温冰箱中冷冻处理24h，将冷冻的香草兰豆荚置于25℃条件下进行融解，融解时间为2h，香草兰豆荚被完全融解；向所得香草兰豆荚中加水300kg，进行打浆，用胶体磨进一步细化处理5min，得360L浆液。
将所得浆液全部加入到酶解罐中，加入果胶酶1.44kg(购买于杰能科公司，酶活力值为3万U/g)，酶解条件为：pH为5；温度为45℃；时间为7h；搅拌桨的转速为100转/min。酶解完毕后，将所得酶解液于100℃水浴处理12min灭活；之后将所得液体通过150目的自动压滤机，过滤去除纤维和部分蛋白质，得到香草兰豆荚提取物196L。
实施例6香草兰豆荚提取物的制备
称取100kg香草兰豆荚(来源于中国热带农业科学院香料饮料研究所，为刚采收的新鲜的生理成熟的香草兰青豆荚，其中香草兰青豆荚中的水的质量百分含量为70％，其干重为30kg)，于-60℃低温冰箱中冷冻处理24h，将冷冻的香草兰豆荚置于25℃条件下进行融解，融解时间为2h，香草兰豆荚被完全融解；向所得香草兰豆荚中加水300kg，进行打浆，用胶体磨进一步细化处理5min，得360L浆液。
将所得浆液全部加入到酶解罐中，加入果胶酶1.68kg(购买于杰能科公司，酶活力值为3万U/g)，酶解条件为：pH为5；温度为45℃；时间为7h；搅拌桨的转速为100转/min。酶解完毕后，将所得酶解液于100℃水浴处理12min灭活；之后将所得液体通过150目的自动压滤机，过滤去除纤维和部分蛋白质，得到香草兰豆荚提取物182L。
实施例7香草兰豆荚提取物的制备
称取100kg香草兰豆荚(来源于中国热带农业科学院香料饮料研究所，为刚采收的新鲜的生理成熟的香草兰青豆荚，其中香草兰青豆荚中的水的质量百分含量为80％，其干重为20kg)，于-40℃低温冰箱中冷冻处理24h，将冷冻的香草兰豆荚置于20℃条件下进行融解，融解时间为2.5h，香草兰豆荚被完全融解；向所得香草兰豆荚中加水300kg，进行打浆，用胶体磨进一步细化处理5min，得360L浆液。
将所得浆液全部加入到酶解罐中，加入果胶酶1.44kg(购买于杰能科公司，酶活力值为3万U/g)，酶解条件为：pH为4.5；温度为45℃；时间为7h；搅拌桨的转速为100转/min。酶解完毕后，将所得酶解液于100℃沸水中水浴处理12min灭活；加入乙醇使得乙醇的含量为47.5％(V/V)，于45℃温度下，提取100min，之后将所得液体通过100目的自动压滤机，过滤去除纤维和部分蛋白质，得到香草兰豆荚提取物372L。
实施例8香草兰豆荚提取物的制备
称取50kg香草兰豆荚(来源于中国热带农业科学院香料饮料研究所，为刚采收的新鲜的生理成熟的香草兰青豆荚，其中香草兰青豆荚中的水的质量百分含量为85％，其干重为12.5kg)，于-80℃低温冰箱中冷冻处理24h，将冷冻的香草兰豆荚置于30℃条件下进行融解，融解时间为0.4h，香草兰豆荚被完全融解；向所得香草兰豆荚中加水100kg，进行打浆，用胶体磨进一步细化处理5min，得140L浆液。
将所得浆液全部加入到酶解罐中，加入果胶酶0.70kg(购买于杰能科公司，酶活力值为3万U/g)，酶解条件为：pH为4.2；温度为50℃；时间为7h；搅拌桨的转速为240转/min。酶解完毕后，将所得酶解液于100℃沸水中水浴处理10min灭活；加入乙醇使得乙醇的含量为60％(V/V)，于40℃温度下，提取240min，之后将所得液体通过150目的自动压滤机，过滤去除纤维和部分蛋白质，得到香草兰豆荚提取物182L。
实施例9香草兰豆荚提取物的制备
称取100kg香草兰豆荚(来源于中国热带农业科学院香料饮料研究所，其干重为30kg)，于-60℃低温冰箱中冷冻处理20h，将冷冻的香草兰豆荚置于25℃条件下进行融解，融解时间为2h，香草兰豆荚被完全融解；向所得香草兰豆荚中加水100kg，进行打浆，用胶体磨进一步细化处理5min，得162L浆液。
将所得浆液全部加入到酶解罐中，加入果胶酶0.54kg(购买于杰能科公司，酶活力值为3万U/g)，酶解条件为：pH为4；温度为60℃；时间为6h；搅拌桨的转速为50转/min。酶解完毕后，将所得酶解液于90℃水浴处理13min灭活；加入异丙醇使得异丙醇的含量为40％(V/V)，于55℃温度下，提取30min，之后将所得液体通过60目的自动压滤机，过滤去除纤维和部分蛋白质，得到香草兰豆荚提取物143L。
实施例10香草兰豆荚提取物的制备
称取50kg香草兰豆荚(来源于中国热带农业科学院香料饮料研究所，其干重为17.5kg)，于-50℃低温冰箱中冷冻处理28h，将冷冻的香草兰豆荚置于28℃条件下进行融解，融解时间为1h，香草兰豆荚被完全融解；向所得香草兰豆荚中加水150kg，进行打浆，用胶体磨进一步细化处理8min，得166L浆液。
将所得浆液全部加入到酶解罐中，加入果胶酶1.11kg(购买于杰能科公司，酶活力值为3万U/g)，酶解条件为：pH为6；温度为40℃；时间为10h；搅拌桨的转速为100转/min。酶解完毕后，将所得酶解液于95℃水浴处理15min灭活；加入异丙醇与乙醇的混合物(异丙醇与乙醇的体积比为1：3)使得混合物的含量为60％(V/V)，于30℃温度下，提取240min，之后将所得液体通过150目的自动压滤机，过滤去除纤维和部分蛋白质，得到香草兰豆荚提取物216L。
实施例11香草兰豆荚提取物的制备
称取50kg香草兰豆荚(来源于中国热带农业科学院香料饮料研究所，为刚采收的新鲜的生理成熟的香草兰青豆荚，其中香草兰青豆荚中的水的质量百分含量为85％，其干重为12.5kg)，于-80℃低温冰箱中冷冻处理24h，将冷冻的香草兰豆荚置于30℃条件下进行融解，融解时间为0.4h，香草兰豆荚被完全融解；向所得香草兰豆荚中加水100kg，进行打浆，用胶体磨进一步细化处理5min，得140L浆液。
将所得浆液全部加入到酶解罐中，加入果胶酶0.65kg(购买于杰能科公司，酶活力值为3万U/g)，酶解条件为：pH为4.2；温度为50℃；时间为7h；搅拌桨的转速为240转/min。酶解完毕后，将所得酶解液于100℃沸水中水浴处理10min灭活；加入乙醇使得乙醇的含量为60％(V/V)，于40℃温度下，提取240min，之后将所得液体通过150目的自动压滤机，过滤去除纤维和部分蛋白质，得到香草兰豆荚提取物182L。
实施例12不同组别所得香草兰豆荚提取物的质量评价
采用以下方法分别测定实施例2至实施例11制备获得的香草兰豆荚提取物的浓度、其中香兰素的含量、以及对DPPH自由基清除作用的IC50值，以评价香草兰豆荚提取物的质量，香兰素的含量越高质量越好、对DPPH自由基清除作用的IC50值越低抗氧化能力越好。以复合酶法制备获得的香草兰豆荚提取物作为对照组。
以复合酶法制备香草兰豆荚提取物的具体步骤为：
称取100kg香草兰豆荚(来源于中国热带农业科学院香料饮料研究所，为刚采收的新鲜的生理成熟的香草兰青豆荚，其中香草兰青豆荚中的水的质量百分含量为70％，其干重为30kg)，将所得香草兰豆荚中加水200kg，进行打浆，用胶体磨进一步细化处理5min，得280L浆液。将所得浆液全部加入到酶解罐中，加入戊聚糖复合酶(购买于诺维信公司，其中含有纤维素酶、半纤维素、阿拉伯糖酶、木聚糖酶)0.6kg，酶解条件为：pH为5.0；温度为50℃；时间为7.1h；搅拌桨的转速为100转/min。酶解完毕后，将所得酶解液于100℃水浴处理5min灭活；加入乙醇使得乙醇的含量为47.5％(V/V)，于45℃温度下，提取100min，之后将所得液体通过100目的自动压滤机，过滤去除纤维和部分蛋白质，得到香草兰豆荚提取物156L。
采用以下方法检测香草兰豆荚提取物的浓度：将所得香草兰豆荚提取物进行减压回收乙醇和水，直至乙醇和水不再蒸出为止，即得浸膏，称重，计算浸膏收率，以浸膏收率代表香草兰豆荚提取物的浓度，其计算公式为：收率(％)＝浸膏质量/香草兰豆荚提取物的质量×100。
香草兰豆荚提取物中香兰素含量的检测方法为液相色谱检测方法，具体为：采用1260型安捷伦液相色谱配备反相色谱柱(4.6mm×100mm，3.5μm)，柱温箱温度为30℃，采用乙腈和水10:90(v/v)进行等度洗脱，流速为1mL/min。配制不同浓度标准品溶液(20，40，60，80，100和120μg/mL)绘制标准曲线，进样量为5μL，紫外检测波长设置为280nm。样品过0.45μm滤膜进样，根据标准曲线算出样品中香兰素的浓度，进一步计算出所得香草兰豆荚提取物中香兰素的含量，换算成干基含量(％)即为香草兰豆荚提取物中香兰素的含量，计算公式为：香草兰豆荚提取物中香兰素的含量(％)＝香草兰豆荚提取物中香兰素的总量/香草兰豆荚干重×100。
香草兰豆荚提取物的抗氧化能力测试方法：首先准备0.6mol/L的DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)乙醇溶液，用乙醇配制香草兰豆荚提取物的不同浓度溶液：0.05mg/mL，0.10mg/mL，0.20mg/mL，0.30mg/mL，0.40mg/mL，0.50mg/mL，0.60mg/mL，0.70mg/mL，0.80mg/mL，0.90mg/mL，1.00mg/mL，1.10mg/mL，1.20mg/mL。分别吸取DPPH乙醇溶液和香草兰豆荚提取物各0.5mL，混合，再加入4.45mL乙醇溶液充分混合，得混合物；在暗处反应30min后，以Vc为对照品，采用紫外分光光度计测定混合物在517nm处的吸光值，以吸光度对香草兰豆荚提取物浓度作图。自由基清除能力用IC50值表示，IC50值代表混合物在517nm的吸光值降低50％时所对应的香草兰豆荚提取物的浓度，IC50值越低说明其抗氧化能力越好，根据吸光度对香草兰豆荚提取物浓度图即可获得香草兰豆荚提取物对DPPH自由基清除作用的IC50值。
各个实施例和对照组所得香草兰豆荚提取物的浓度、香兰素的含量、以及对DPPH自由基清除作用的IC50值检测结果见表1。
表1各个组别各个检测项所得检测结果
对比各组别香草兰豆荚提取物中香兰素的含量可知，与对照组相比，实施例2、实施例3、实施例4、实施例5和实施例6提供的制备方法制备获得的香草兰豆荚提取物中香兰素的含量相当或有小幅度提高，说明本发明提供的制备方法在单一酶处理、没有浸提的步骤下，即达到了与复合酶相似的实验结果，更容易控制反应条件、操作过程简单、节约了成本。与对照组相比，实施例7、实施例8、实施例9、实施例10和实施例11制备获得的香草兰豆荚提取物中香兰素的含量大幅提高，差异显著(P＜0.05)说明实施例7、实施例8、实施例9、实施例10和实施例11提供的制备方法进一步提高了香草兰豆荚提取物中香兰素的含量。对比各组别香草兰豆荚提取物对DPPH自由基消除作用的IC50值可知，相比对照组，其他组别香草兰豆荚提取物的IC50值要低于对照组，差异显著(P＜0.05)，说明本发明提供的制备方法制备获得的香草兰豆荚提取物的抗氧化能力要优于对照组。综上所述，本发明提供的制备方法操作简单，成本低，获得的香草兰豆荚提取物中香兰素的含量高，抗氧化能力强，所得香草兰豆荚提取物可以应用于制备香草兰浸膏，也可以应用于制备香料。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种香草兰豆荚提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：获得香草兰豆荚；
步骤2：取所述香草兰豆荚，经冷冻，解冻，粉碎后，得第一产品；与水混合，得第二产品；
步骤3：取所述第二产品与果胶酶混合，于40℃～60℃、pH4～6条件下酶解6h～10h后，灭活，过滤，收集滤液，即得；
其中，步骤2中所述冷冻的温度为-40℃～-80℃；所述冷冻的时间为20h～28h；
步骤2中所述解冻的温度为20℃～30℃；所述解冻的时间为0.4h～2.5h；
步骤1中所述香草兰豆荚的干重与步骤3中所述果胶酶的酶活力之比为1:540～2160；
步骤2中所述第一产品与所述水的质量比为1:1～3。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述灭活之后、所述过滤之前还包括浸提步骤。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述浸提所用的溶剂为有机溶剂。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述香草兰豆荚为生理成熟的香草兰青豆荚。
5.一种如权利要求1至4中任意一项所述的制备方法制备获得的香草兰豆荚提取物。
6.如权利要求5所述的香草兰豆荚提取物在制备香料中的应用。
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