CN103977398A - 栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用。本发明由栖土曲霉获得的能够对无活力组织进行伤口清创的蛋白酶，清创能力强、副作用小，并且制备工艺简单、产量高。
Description
技术领域
本发明涉及一种栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用。
背景技术
压疮、糖尿病足、烧伤及慢性伤口内存在很多失活组织。失活组织是机会性感染的优良培养基，会阻碍伤口的愈合。因此有效的清创是必要的。目前临床上最常用的清创方式仍是手术清创。除此之外，还有采用蛋白水解酶的酶清创。酶清创可以将坏死或失活的组织分解清除，同时又不损害邻近正常组织，从而达到清创目的。己有描述将枯草菌蛋白酶、胶原酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶及链激酶作为清创剂。但这些清创酶各有优缺点，并且早期清创效果尚未能完全令人满意。
己发现栖土曲霉能够产生水解能力很强的栖土曲霉中性蛋白酶。但把栖土曲霉蛋白酶作为伤口清创酶并未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种清创能力强、副作用小，并且制备工艺简单、产量高的栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用。
本发明的技术解决方案是：
一种栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用。
所述伤口为烧伤伤口、压疮伤口、慢性感染伤口或糖尿病足伤口。
所述栖土曲霉蛋白酶由下列步骤制得：
(1)培养基的制备
发酵培养基配比为：麸皮3％、米糠1％、玉米粉1％、KH2PO40.4％，加水至100％，并于120℃下高温灭菌30分钟；
(2)粗酶液的制备液
将栖土曲霉3.942菌种按培养基8％的重量接种后，在250r/min振荡器中30℃下培养72小时；终止培养后，将发酵培养物于离心机中3000r/min离心10分钟，取上清液即为粗酶液；
(3)栖土曲霉蛋白酶的分离
粗酶液过滤，滤液调节pH至7.0，加入20％浓度的单宁酸，边加边搅拌；单宁酸用量为粗酶液重量的1％；待沉淀完全后离心，收集沉淀；沉淀用pH7.2、0.02M磷酸缓冲液溶解；使用聚乙二醇洗脱单宁酸，在搅拌下加入10％浓度的PEG，使PEG与单宁酸之比值达到3:1ml/g；离心，收集上清液，加人2倍重量的冷丙酮，静置过夜，离心，收集沉淀；沉淀再浸泡于冷丙酮，静置过夜，然后过滤，沉淀用乙醚再洗涤一次，干燥即得栖土曲霉蛋白酶丙酮粉粗制剂；
(4)栖土曲霉蛋白酶的纯化
上述丙酮粉粗酶用pH8.4、0.05M Tris‐HCL缓冲液溶解，上DEAE‐Sephadex A‐25柱，然后用平衡缓冲液洗涤；层析共分离出7个峰，酶活力存在于P2峰内；收集P2峰，对水于低温下透析至无盐止，再用PEG脱水浓缩后，冷冻干燥。
(5)蛋白酶活力的测定
采用福林酚法测定蛋白酶活力。酶活定义为在40℃，适当的PH条件下，1分钟内水解酪蛋白产生1微克酪氨酸所需的酶量为1个蛋白酶活力单位。测得栖土曲霉蛋白酶冷干粉的酶活力为1.1×105U/g。
本发明由栖土曲霉获得的能够对无活力组织进行伤口清创的蛋白酶，清创能力强、副作用小，并且制备工艺简单、产量高。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
具体实施方式
栖土曲霉蛋白酶的制备
(1)培养基的制备
发酵培养基配比为：麸皮3％、米糠1％、玉米粉1％、KH2PO40.4％，加水至100％并于120℃下高温灭菌30分钟。
(2)粗酶液的制备液
将栖土曲霉3.942菌种按培养基8％的重量接种后，在250r/min振荡器中30℃下培养72小时。终止培养后，将发酵培养物于离心机中3000r/min离心10分钟，取上清液即为粗酶液。
(3)栖土曲霉蛋白酶的分离
粗酶液过滤，滤液调节pH至7.0。加入20％质量浓度的单宁酸，边加边搅拌。单宁酸用量为粗酶液重量的1％。待沉淀完全后离心，收集沉淀。沉淀用pH7.2、0.02M磷酸缓冲液溶解。使用聚乙二醇(PEG)洗脱单宁酸。在搅拌下加入10％质量浓度的PEG，使PEG(ml)与单宁酸(g)之比值达到3:1。离心，收集上清液，加人2倍重量的冷丙酮，静置过夜，离心，收集沉淀。沉淀再浸泡于冷丙酮，静置过夜，然后过滤，沉淀用乙醚再洗涤一次，干燥即得栖土曲霉蛋白酶丙酮粉粗制剂。
(4)栖土曲霉蛋白酶的纯化
上述丙酮粉粗酶用少量pH8.4、0.05M Tris‐HCL缓冲液溶解，上DEAE‐Sephadex A‐25柱，然后用平衡缓冲液洗涤。层析共分离出7个峰，酶活力存在于P2峰内。收集P2峰，对水于低温下透析至无盐止，再用PEG脱水浓缩后，冷冻干燥。
(5)蛋白酶活力的测定
采用福林酚法测定蛋白酶活力。酶活定义为在40℃，适当的PH条件下，1分钟内水解酪蛋白产生1微克酪氨酸所需的酶量为1个蛋白酶活力单位。测得栖土曲霉蛋白酶冷干粉的酶活力为1.1×105U/g。
实施例1：烧伤组织体外酶清创效果
将猪耳皮片烧伤并将其经受栖土曲霉蛋白酶蛋白水解作用，监测由栖土曲霉蛋白酶对组织的裂解时间。根据如下方法进行分析：通过将皮肤与软骨分离并去除多余脂肪制备猪耳皮肤。煮沸猪耳皮片(约直径1cm)20分钟模拟烧伤皮肤。将0.1g栖土曲霉蛋白酶粉与水相5ml混合，调节PH为7.0，并使用装配有塑料管的注射器或吸量管将其应用于细胞底部。在37℃的环境下孵育，检测猪耳皮肤的裂解时间。结果显示栖土曲霉蛋白酶于63.2±10.2分钟内对烧伤的猪耳皮肤进行了清创。结果详见表1。
表1：栖土曲霉蛋白酶的烧伤组织体外清创活性
实施例2:烧伤创口体内酶清创效果
使用了用于评估栖土曲霉蛋白酶的清创效果的体内小鼠烧伤模型。剪去小鼠背部毛，用8％硫化钠脱毛。麻醉下用恒温控压电烫仪在动物背部一侧以90℃烫10秒的致伤条件，制成直径为2.0cm的圆形烧伤创面。待醒后分组给药，单笼饲养。烧伤小鼠分为酶清创组和对照组，每组各10只。造模成功后24小时进行栖土曲霉蛋白酶清创。清创前无菌生理盐水擦拭创面，去腐皮及局部坏死组织。酶清创组将5m1溶于水的含有磷酸氢二钠的凝胶载体(pH7.0)与栖土曲霉蛋白酶粉末0.1g混合，外敷于创面上，纱布覆盖。对照组仅使用不含栖土曲霉蛋白酶的5ml凝胶，同样纱布覆盖。每日无菌纱布换药。观察清创7日时创面愈合的情况(以创面愈合的面积计)、7日内创面感染的情况(以感染发生率计)，及酶清创当时小鼠疼痛的情况(每10分钟扭体的次数计)。实验结果详见表2。统计分析显示栖土曲霉蛋白酶酶清创较对照组能对烧伤伤口进行有效清创，加快创面愈合，降低创面感染，但并不增加感染时的疼痛。
表2：栖土曲霉蛋白酶的烧伤创口体内清创活性
实施例3:压疮创口体内酶清创效果
使用了用于评估栖土曲霉蛋白酶的清创效果的体内小鼠压疮模型。将铁片植入小鼠臀肌下，磁铁置于铁片处的皮肤上施压2h，移除磁铁0.5h，此为一个循环。6个循环后再次放置磁铁施压直至第2天，每天反复如此至压疮出现。压疮小鼠分为酶清创组和对照组，每组各10只。酶清创前无菌生理盐水擦拭创面，去腐皮及局部坏死组织。酶清创组将5m1溶于水的含有磷酸氢二钠的凝胶载体(pH7.0)与栖土曲霉蛋白酶粉末0.1g混合，外敷于创面上，纱布覆盖。对照组仅使用不含栖土曲霉蛋白酶的5ml凝胶，同样纱布覆盖。每日无菌纱布换药。观察酶清创7日时创面愈合的情况(以愈合创口的面积占原创口面积的百分比计)，及酶清创当时小鼠疼痛的情况(每10分钟扭体的次数计)。实验结果详见表3。统计分析显示栖土曲霉蛋白酶酶清创较对照组能进行有效清创，加快创面愈合，但并不增加感染时的疼痛。
表3：栖土曲霉蛋白酶的压疮创口体内清创活性
由此可见本发明的优异效果。
Claims (3)
1.一种栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用，其特征是：所述伤口为烧伤伤口、压疮伤口、慢性感染伤口或糖尿病足伤口。
3. 根据权利要求1或2所述的栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用，其特征是：所述栖土曲霉蛋白酶由下列步骤制得：
（1）培养基的制备
发酵培养基配比为：麸皮3%、米糠1%、玉米粉1%、KH2PO4 0.4%，加水至100%，并于120℃下高温灭菌30分钟；
（2）粗酶液的制备液
将栖土曲霉3.942菌种按培养基8%的重量接种后，在250r/min振荡器中30℃下培养72小时；终止培养后，将发酵培养物于离心机中3000 r/min离心10分钟，取上清液即为粗酶液；
（3）栖土曲霉蛋白酶的分离
粗酶液过滤，滤液调节pH至7.0，加入20％浓度的单宁酸，边加边搅拌；单宁酸用量为粗酶液重量的1％；待沉淀完全后离心，收集沉淀；沉淀用pH 7.2、0.02M磷酸缓冲液溶解；使用聚乙二醇洗脱单宁酸，在搅拌下加入10％浓度的PEG，使PEG与单宁酸之比值达到3:1ml/g；离心，收集上清液，加人2倍重量的冷丙酮，静置过夜，离心，收集沉淀；沉淀再浸泡于冷丙酮，静置过夜，然后过滤，沉淀用乙醚再洗涤一次，干燥即得栖土曲霉蛋白酶丙酮粉粗制剂；
（4）栖土曲霉蛋白酶的纯化
上述丙酮粉粗酶用pH8.4、0.05M Tris-HCL缓冲液溶解，上DEAE-Sephadex A-25柱，然后用平衡缓冲液洗涤；层析共分离出7个峰，酶活力存在于P2峰内；收集P2峰，对水于低温下透析至无盐止，再用PEG脱水浓缩后，冷冻干燥。
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|---|---|---|---|---|
| WO2002002155A1 (en) * | 2000-07-04 | 2002-01-10 | C.T.P. Cable Technology Procurement Ag | Wound dressing comprising a therapeutically active agent |
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2014
- 2014-06-03 CN CN201410243456.0A patent/CN103977398A/zh active Pending
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|---|---|---|---|---|
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