CN103969300B - 一种识别cgg三核苷酸重复序列的双功能电活性探针、探针的制备及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有电信号传导和核酸序列识别功能的双功能电活性探针FecNCD，FecNCD的制备方法以及用FecNCD制成的检测CGG三核苷酸重复序列的试剂盒。本发明设计合成的新型双功能电化学探针集识别功能和电化学信号为一体，丰富了免标记核酸电化学探针的应用，构建了一种检测神经性疾病脆性X染色体综合征标志物CGG重复序列的新型免标记电化学传感器，取得了满意的结果。
Description
技术领域
本发明涉及三重复核苷酸重复序列检测领域，特别是一种识别CGG三核苷酸重复序列的双功能电活性探针、探针的制备及试剂盒。
背景技术
基因诊断是通过直接检测基因的存在状态或缺陷对疾病做出诊断的一种方法，其探测的目的物通常是核酸。近年来发现很难诊治的神经精神性疾病与特定的三核苷酸重复序列基因有关，如脆性X染色体综合征与CGG重复序列相关，亨廷顿病(HD)与CAG相关，弗里德赖希共济失调(Friedreich’)与GAA有关，强直性肌营养不良(MD)与CTG有关，因此在利用这些基因来诊断这类神经精神性疾病方面进行了大量的研究。在基因诊断的方法中主要有限制性内切酶酶谱分析、核酸分子杂交、限制性片段长度多态性连锁分析、聚合酶链式反应（PCR），和近年来发展的DNA传感器以及DNA芯片等。DNA传感领域的发展日新月异，在众多检测方法中，电化学方法检测核酸具有其独特的优越性，高灵敏度、低的费用、简便快速，更重要的是容易微型化设计成芯片，符合手持式检测装置以及未来芯片实验室的要求。因此，电化学方法检测核酸引起了人们的极大兴趣，特别是电化学传感技术。同时电化学探针的发展也受到了化学领域研究专家的青睐，成为研究热点之一。通常电化学方法分析检测核酸都要求标记核酸，此方法成本较高、操作也比较复杂，因此免标记法得到了专家的推崇。免标记核酸的电化学检测通常基于能够与核酸相互作用并同时具备电活性的探针，应用较多的一般是金属络合物，如二茂铁、钴络合物、钌络合物等，二茂铁是常用的电活性标记分子，已被广泛应用到标记DNA，由于二茂铁小的体积、高的可逆性、高的氧化还原速率、高的生物稳定性、因此二茂铁的衍生物在化学生物、医疗等领域也得到了广泛应用，虽然这些探针有较好的电活性，但是对核酸序列的选择性却很差。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种双功能电活性探针；本发明的目的之二在于提供一种该探针的制备方法；本发明的目的之三在于介绍该探针在识别CGG的应用；本发明的目的之四在于提供一种包含该探针的检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明所采用以下技术方案：
一种具有电信号传导和核酸序列识别功能的双功能电活性探针FecNCD，其化学结构式为：
一种制备FecNCD的方法，包括下述步骤：
将萘啶衍生物NC(4)和二茂铁末端醛基化合物（6）溶于二氯甲烷，在三乙酰氧基硼氢化钠（NaBH(OAc)3）的还原作用下回流，得到双功能电化学探针FecNCD。
反应过程如下：
作为优选方案，萘啶衍生物（4）制备方法选择为：化合物(3)在4M的盐酸乙酸乙酯溶液中脱保护得萘啶衍生物(4，即NC)。
反应过程如下：
萘啶衍生物（4，即NC）详细制备方法参考我们组的前期工作(Kazuhiko Nakatani,Hanping He,Shin-nosuke Uno,Tsuyoshi Yamamoto,and Chikara Dohno.Current Protocols inNucleotide Acid Chemistry 2008,UNIT 8.6,1-21.)。
作为优选方案，二茂铁末端醛基化合物（6）制备方法选择为：将化合物(5)在对甲苯吡啶磺酸嗡盐（PPTS）的作用下，在丙酮/水（V/V:`7/3）的溶液里回流脱缩醛得到二茂铁末端醛基化合物(6)。
反应过程如下：
本发明合成的新型双功能电化学探针用1HNMR，13C{H}NMR和MS分析手段进行了结构表征，证实其结构为以上结构式所标示。
功能电化学探针FecNCD与三核苷酸重复序列相互作用的圆二色谱研究
本发明中的这种双功能电化学探针FecNCD与CGG的相互作用首先通过圆二色谱（图1）和熔点温度来进行检测分析。如图1所示，自由态的d(CGG)10圆二色谱图分别在280nm和255nm处存在很弱的一个正峰和负峰，这说明它没有稳定的二级结构。然而当不同浓度的FecNCD与d(CGG)10相互作用后，圆二色谱的信号发生了明显的变化，在249nm和260nm处出现明显的正峰和在230nm的负峰，信号强度明显增强，同时在342nm左右还出现了一个明显的正诱导峰。这些结果证明了本发明中的双功能探针与CGG有着较强的相互作用。为了说明它的选择性，我们也通过圆二色谱检测了它与其它引起神经性遗传疾病的三核苷酸重复序列（如CCG，GAA，TGG，CTG，CAG，CTG三核苷酸重复序列）的相互作用，发现作用前后它们的圆二色谱信号并没有什么明显变化，这说明FecNCD不能和它们相互作用而稳定其结构。而且熔点温度结果也表明FecNCD的相互作用增强了CGG重复序列的稳定性。总的来说，本发明中的新型双功能电化学探针FecNCD有能力选择性地识别CGG三核苷酸重复序列。
功能电化学探针FecNCD的电化学性能研究
本发明中设计合成的新型双功能电化学探针具有良好的电化学性能，其循环伏安曲线如图2（A）所示。此电化学探针分别在0.464V和0.409V表现出清晰的氧化峰和还原峰（E1/2=0.4365V,△Ep=0.055V）。当扫描速度在0.01～1Vs-1范围内，FecNCD的氧化还原峰电流与扫描速率的平方根成线性正比(如图2B，线性方程为a:ipa=-0.19201+6.4474v1/2,R2=0.996;b:ipc=0.45063-4.3297v1/2,R2=0.993)，这表明裸金电极对FecNCD的电催化氧化还原过程受扩散控制。然而，对于没有结合二茂铁的萘啶衍生物，在相同的电化学窗口，并没有发现任何电化学信号（图2A曲线b）。
三核苷酸重复序列修饰电极的制备过程（示意图见图3）：
将抛光过的金电极在0.5MH2SO4中进行电化学清洗和活化，然后将其浸泡在2μM的SH-DNA(5'-HS-(CH2)6-GGC CAC GAG TTG ACA-3')中12小时后取出，清洗，之后再用1mM6-巯基己醇封闭金电极表面空出的电化学活性位点。最后再将该金电极放入4μM的d(CGG)10(5'-CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG TGT CAA CTC GTG GCC-3')中培养7小时，使得d(CGG)10的3'端部分碱基与SH-DNA碱基杂化，最终制得CGG三核苷酸重复序列修饰的电极。制备过程中通过电化学交流阻抗记录裸金电极、SH-DNA/Au、三重复核苷酸杂化的金电极以及FecNCD对d(CGG)10相互作用后电极的表面电荷传递电阻的变化，表征金电极的自组装、杂交反应以及FecNCD对d(CGG)10识别等过程（图4）。
为了证明双功能电化学探针FecNCD识别三核苷酸重复序列d(CGG)10的选择性，另外又选取了六种神经性疾病中常见的三核苷酸重复序列，分别是：
d(TGG)10:5'-TGG TGG TGG TGG TGG TGG TGG TGG TGG TGG TGT CAA CTC GTGGCC-3'(1)
d(CCG)10:5'-CCG CCG CCG CCG CCG CCG CCG CCG CCG CCG TGT CAA CTC GTGGCC-3'(2)
d(GAA)10:5'-GAA GAA GAA GAA GAA GAA GAA GAA GAA GAA TGT CAA CTC GTGGCC-3'(3)
d(CAG)10:5'-CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG TGT CAA CTC GTGGCC-3'(4)
d(CTG)10:5'-CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG TGT CAA CTC GTGGCC-3'(5)
d(ATT)10:5'-ATT ATT ATT ATT ATT ATT ATT ATT ATT ATT TGT CAA CTC GTGGCC-3'(6)
与d(CGG)10同样方法，3'端部分碱基与SH-DNA碱基互补配对，杂化后得到不同的三核苷酸重复序列修饰的电极（我们也称之为三核苷酸重复序列电化学传感器）。
三核苷酸重复序列电化学传感器的分析检测
分别将制备好的核酸传感器与20μM本发明设计合成的新型双功能电化学探针在磷酸缓冲溶液培育，而后用方波伏安法(SWV)来表征这样一种新型双功能电化学探针对三核苷酸重复序列CGG的选择性识别（图5）。如果能够识别某种重复序列，培育后的传感器将会检测出明显的电化学信号；反之，将没有或者很弱的电化学信号（图3）。从实验结果分析(图5)，新型电化学探针能够选择性的作用于CGG三核苷酸重复序列。
CGG三核苷酸重复序列电化学传感器的分析应用
将制备好的CGG电化学传感器与含有三重复核苷酸序列和干扰DNA(ct-DNA)的FecNCD磷酸缓冲溶液培育，我们把这些有干扰DNA的体系分别标记为b，c，d，e，f，g，h和i，将没有任何干扰物的FecNCD溶液标记为a（各培育溶液组分如表1所示）。用方波伏安法来表征这种CGG电化学传感器对CGG三核苷酸重复序列的检测及抗干扰能力。如果培育后的传感器有明显的电化学信号，表明体系中没有FecNCD识别的CGG三核苷酸重复序列，如果培育后的传感器没有或者有较弱的电化学信号，说明培育溶液中含有CGG重复序列（图6）。
表1：检测体系中培育溶液组分（注：＋表示含有；－表示不含有）
用于识别CGG三核苷酸重复序列的试剂盒
根据上面的相互作用研究，基于双功能电化学探针FecNCD的电化学传感器对识别CGG三核苷酸重复序列有着明显的选择性。为了尽可能的推进这种探针和技术，我们构建了检测CGG三核苷酸重复序列的试剂盒，此试剂盒包含下列物质：
（1）双功能电化学探针FecNCD 0.1M甲醇溶液
（2）2ODSH-DNA(5'-HS-(CH2)6-GGC CAC GAG TTG ACA-3')
（3）2OD5'-CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG TGT CAA CTC GTGGCC-3'。
按上述方案，所述试剂盒还包括0.1M磷酸缓冲溶液50mL。
按上述方案，所述试剂盒还包括6-巯基己醇1mL。
按上述方案，所述试剂盒还包括金电极一支。
具体使用方法如下：
（1）CGG三核苷酸重复序列电化学传感器的制备：参考说明书“三核苷酸重复序列修饰电极的制备”部分。将抛光过的金电极浸泡于1～2μM的SH-DNA(5'-HS-(CH2)6-GGC CACGAG TTGACA-3')中12小时后取出，清洗，之后再用1mM6-巯基己醇封闭金电极表面空出的电化学活性位点。最后再将该金电极放入2～4μM的d(CGG)10(5'-CGG CGG CGG CGGCGG CGG CGG CGG CGG CGG TGT CAA CTC GTG GCC-3')中培养7小时，最终制得CGG三核苷酸重复序列修饰的电极。
（2）检测溶液配制：用磷酸缓冲液(pH=7)配制检测溶液.0.1～2.0mL（需要检测的核酸序列和双功能电化学探针FecNCD），稀释核酸序列使其终浓度为5μM或者高于5μM，双功能电化学探针FecNCD的终浓度10～20μM,磷酸缓冲液终浓度为0.01M。
（3）三重复核苷酸序列的检测：（1）中制备的CGG三核苷酸重复序列电化学传感器置于配置的检测溶液中培育30分钟，然后用电化学工作站中的方波伏安法（SWV）在0.01M的磷酸缓冲液(pH=7)中检测电化学信号。如果有明显的电化学信号，表明体系中没有CGG三核苷酸重复序列，如果培育后的传感器没有电化学信号，说明培育溶液中含有CGG重复序列。
本发明巧妙的将具有可逆电化学性质的二茂铁和能够识别GG错配对的萘啶衍生物结合在一起，合成了一种新型的双功能有机小分子：识别功能和电信号功能。并通过实验总结了这种双功能探针的电化学性能及其在电化学核酸传感器中的应用，利用这种新型探针设计制备了免标记电化学传感器，对CGG三重复核苷酸序列进行识别检测。
本发明设计合成的新型双功能电化学探针集识别功能和电化学信号为一体，丰富了免标记核酸电化学探针的应用，构建了一种检测神经性疾病脆性X染色体综合征标志物CGG重复序列的新型免标记电化学传感器，取得了满意的结果。同样的原理还可以推广到其他神经性疾病标志物或肿瘤标志物的检测，应用前景广泛。
附图说明
图1：不同浓度双功能电化学探针下的CGG三核苷酸重复序列(2.5μM)的园二色谱图。随着图中箭头方向，FecNCD浓度分别为：0,2.5,5.0,7.5,12.5,17.5,25.0,30.0,35.0,40.0,45.0,50.0μM。
图2：(A)裸金电极的循环伏安曲线a:在pH7.0的磷酸盐缓冲溶液中；b:a+50μM NCD；c:a+50μM FecNCD，扫描速度0.1mV/s；(B)v1/2与峰电流(ipa,ipc)的线性关系(R2=0.9955fora,R2=0.9931forb)，在50μM FecNCD的pH7.0的磷酸盐缓冲溶液中，扫描速度从0.01到1Vs-1。
图3：电化学传感器制备的示意图。
图4：(A)修饰电极的方波伏安曲线图。a:裸金电极；b:a+SH-ssDNA;c:a+SH-ssDNA+MCH;d:a+SH-ssDNA+MCH+d(CGG)10;e:(a+SH-ssDNA+MCH+d(CGG)10)修饰电极与20μMFecNCD的磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)中室温下培养30min后；(B)相对应的电化学交流阻抗曲线a，b，c，d和e同A）。
图5：(A)不同三核苷酸重复序列修饰的传感器在20μMFecNCD的磷酸盐缓冲溶液（pH7.0）中在室温下培养30min后的方波伏安氧化峰曲线；(B)d(CGG)10,d(CCG)10,d(GAA)10,d(CTG)10,d(TGG)10,d(CAG)10和d(ATT)10修饰的传感器在20μMFecNCD的磷酸盐缓冲溶液（pH7.0）中在室温下培养30min后氧化峰电流值的变化。
图6：(A)CGG电化学传感器的检测示意图；(B)CGG电化学传感器在a，b，c，d，e，f，g，h和i的磷酸盐缓冲溶液（pH7.0）中室温培养30min后的方波伏安氧化峰曲线；(C)CGG电化学传感器在a，b，c，d，e，f，g，h和i的磷酸盐缓冲溶液（pH7.0）中在室温下培养30min后的氧化峰电流值的变化。
图7：d(CGG)10修饰的电化学传感器分别与pH7.0的磷酸盐缓冲溶液(a)、20μM NCD(b)、20μM二茂铁(c)和20μMFecNCD(d)磷酸盐缓冲溶液培育后的方波伏安曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明。
试验例1：新型双功能电化学探针FecNCD的合成及表征
将化合物(5)(158.58mg,0.5mmol)，PPTS(502.00mg,2.00mmol)溶于20mLacetone/H2O(V/V,7/3)回流脱保护，约5小时反应完全。溶液经旋转蒸发仪蒸干后，溶于氯仿，分别用饱和NaHCO3水溶液和水洗涤,Na2SO4干燥，过滤，旋干得到粗产物，柱色谱纯化(Rf=0.6,20:1v/vCHCl3/CH3OH)得到黄色固体化合物（6）141mg,产率52.01%。
取60mg(0.1mmol)萘啶衍生物化合物(3)溶于8mL氯仿，在冰水浴下滴加1.5mL 4MHCl/EA脱保护半小时，旋干后用少量氯仿洗涤粗产物得到脱保护的萘啶衍生物（4）。
将萘啶衍生物（4）溶于30mL二氯甲烷，依次加入NaBH(OAc)3(519.3mg,2.45mmol)和化合物（6）(27.1mg,0.1mmol)，回流12小时后停止反应。反应混合液分别用饱和的NaHCO3水溶液和水洗涤萃取，氯仿用无水Na2SO4干燥，过滤，将液体旋干得FecNCD粗产物。柱色谱纯化粗产品(Rf=0.5(5:1v/vCHCl3/CH3OH)得到纯的新型双功能电化学探针FecNCD(79.7mg,53.92%)。1HNMR，13C{H}NMR和MS的表征结果1HNMR(CDCl3,600MHz)δ:8.26(d,2H,J=4.2Hz),8.11(d,2H,J=9Hz),7.97(d,2H,J=7.8Hz),7.26(d,2H,J=8.4Hz),6.48(s,1H),4.75(s,2H),4.35(t,4H,J=6.6Hz),4.31(s,4H,Fc),4.20(s,5H,Fc),3.46(s,2H),2.75(s,6H),2.64(br,6H),1.92(t,4H).13C{H}NMR(CH3OD,150MHz)δ:170.22,162.93,154.13,153.17,153.09,138.87,136.23,122.13,117.76,112.50,77.20,76.99,76.78,76.12,70.17,69.50,67.93,63.47,53.07,49.71,36.98,29.50,26.37,25.40.ESI-MScalculatedforC39H42FeN8O5[(M+H)+]759.1,found758.65.
实验例2：新型双功能电化学探针的电化学性能
裸金电极分别在pH7.0的磷酸盐缓冲溶液中50μM NCD、50μM FecNCD的pH7.0的磷酸盐缓冲溶液中的循环伏安曲线，扫描速度为0.1Vs-1，其循环伏安如图2（A）所示。在-0.1V～0.7V，化合物NCD并没有发现任何氧化还原峰，而本发明双功能电化学探针却在0.464V和0.409V表现出清晰的氧化峰和还原峰（E1/2=0.4365V,△Ep=0.055V）。此结果说明我们设计合成的这种新型双功能电化学探针具有良好的电活性。进一步我们将CGG电化学传感器分别置于磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)、20μM NCD、20μM二茂铁和20μM FecNCD磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)中，得到方波伏安曲线图。如图7所示，CGG电化学传感器只有与本发明中设计的双功能电化学探针FecNCD培育后才出现明显的电化学信号，对于萘啶衍生物NCD和二茂铁，它并没有表现出电化学信号，说明本发明设计合成的这种新型双功能电化学探针中识别部分萘啶衍生物NCD和电信号部分二茂铁都是不可缺少的。
本发明中设计合成的新型双功能电化学探针具有良好的电化学性能，其循环伏安曲线如图2（A）所示。此电化学探针分别在0.464V和0.409V表现出清晰的氧化峰和还原峰（E1/2=0.4365V,△Ep=0.055V）。当扫描速度在0.01～1Vs-1范围内，FecNCD的氧化还原峰电流与扫描速率的平方根成线性正比(如图2B，线性方程为a:ipa=-0.19201+6.4474v1/2,R2=0.996;b:ipc=0.45063-4.3297v1/2,R2=0.993)，这表明裸金电极对FecNCD的电催化氧化还原过程受扩散控制。然而，对于没有结合二茂铁的萘啶衍生物，在相同的电化学窗口，并没有发现任何电化学信号（图2A曲线b）。
实施例3：CGG三核苷酸重复序列修饰电极的制备
将抛光过的金电极在0.5MH2SO4中进行电化学清洗和活化，然后将其浸泡在2μM的SH-DNA(5'-HS-(CH2)6-GGC CAC GAG TTG ACA-3')中12小时后取出，清洗，再用1mM6-巯基己醇封闭金电极表面空出的电化学活性位点。然后将该金电极浸入4μM的d(CGG)10(5'-CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG TGT CAA CTC GTG GCC-3')中培养7小时，使得d(CGG)10的3'端与SH-DNA碱基杂化，最终得到CGG三核苷酸重复序列修饰的电极。修饰电极通过电化学交流阻抗进行表征，如图4B所示,经DNA修饰后的电化学交流阻抗逐渐增大，表明SH-DNA和CGG重复序列成功地组装和杂化到了金电极上。同时，当CGG修饰电极与FecNCD溶液培育后，也表现出明显的电化学信号（图4A），进一步证实了CGG修饰电极的成功制备。
本发明中，其它六种三核苷酸重复序列如d(TGG)10，d(CCG)10，d(GAA)10，d(CAG)10，d(CTG)10，d(ATT)10。与d(CGG)10，通过上述同样的方法制备各三核苷酸重复序列修饰的金电极。
实施例4：新型双功能电化学探针FecNCD对CGG三重复核苷酸序列的选择性
将制备好的每种三核苷酸重复序列传感器置于20μM本发明中的新型双功能电化学探针磷酸缓冲溶液(pH7.0)中培育30分钟，而后用磷酸缓冲溶液清洗以除去非特异性相互作用的探针分子。此培育后的传感器在磷酸缓冲溶液中通过方波伏安法曲线(SWV)来表征本发明中新型双功能电化学探针对三核苷酸重复序列CGG的选择性识别。如图5A所示，CGG传感器在0.46V左右表现出在明显的电化学信号，然而其它三核苷酸重复序列(TGG,CCG,GAA,CAG,CTG,ATT与CGG)传感器却没有明显的电化学信号。这些结果说明本发明中新型双功能电化学探针能够选择性的相互作用于CGG三核苷酸重复序列。
实施例5：CGG电化学传感器对不同三重复核苷酸序列的检测及其抗干扰能力。
将CGG电化学传感器置于含有本发明中的双功能电化学探针FecNCD(20μM)、干扰DNA(ct-DNA,100μM)和需检测的三核苷酸重复序列(50μM)的磷酸缓冲溶液(pH7.0)中培养，各检测溶液的成分如表1所示。用方波伏安法来表征这样一种CGG电化学传感器对三核苷酸重复序列的检测及其抗干扰能力（图6）。如图5所示，ct-DNA对本体系并没有干扰。当检测溶液中含有CGG三重复核苷酸序列时，由于溶液中的探针已先于与CGG作用了，因此CGG电化学传感器并没有出现电化学信号。然而对于含有其它三重复核苷酸序列时，溶液中的探针并没有与其作用，这时很明显CGG电化学传感器表现出很好的电化学信号。
实施例6：用于识别CGG三核苷酸重复序列试剂盒的使用
将试剂盒的物质按说明书进行前处理，具体包括CGG三核苷酸重复序列电化学传感器的制备、检测溶液的配制以及三重复核苷酸序列的检测。使用方法如下：
此试剂盒包含下列物质：
（1）双功能电化学探针FecNCD0.1M甲醇溶液；
（2）2OD SH-DNA(5'-HS-(CH2)6-GGC CAC GAG TTG ACA-3')；
（3）2OD5'-CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG TGT CAA CTC GTGGCC-3'；
（4）0.1M磷酸缓冲溶液50mL；
（5）6-巯基己醇1mL；
（6）金电极一支。
CGG三核苷酸重复序列电化学传感器的制备：参考说明书“三核苷酸重复序列修饰电极的制备”部分。将抛光过的金电极浸泡于2μM的SH-DNA(5'-HS-(CH2)6-GGC CAC GAGTTG ACA-3')中12小时后取出，清洗，之后再用1mM6-巯基己醇封闭金电极表面空出的电化学活性位点。最后再将该金电极放入4μM的d(CGG)10(5'-CGG CGG CGG CGG CGGCGG CGG CGG CGG CGG TGT CAA CTC GTG GCC-3')中培养7小时，最终制得CGG三核苷酸重复序列修饰的电极。
检测溶液的配制：用磷酸缓冲液(pH=7)配制检测溶液.0.1～2.0mL（需要检测的核酸序列和双功能电化学探针FecNCD），稀释核酸序列使终浓度为5μM或者高于5μM，双功能电化学探针FecNCD的终浓度20μM,磷酸缓冲液终浓度为0.01M。
三重复核苷酸序列的检测：将制备的CGG三核苷酸重复序列电化学传感器置于配置的检测溶液中培育30分钟，然后用电化学工作站中的方波伏安法（SWV）在0.01M的磷酸缓冲液(pH=7)中检测电化学信号。如果有明显的电化学信号，表明体系中没有CGG三核苷酸重复序列，如果培育后的传感器没有电化学信号，说明培育溶液中含有CGG重复序列如图6。
Claims (8)
1.一种具有电信号传导和核酸序列识别功能的双功能电活性探针FecNCD，其化学结构式为：
2.一种制备权利要求1所述双功能电活性探针FecNCD的方法，包括如下步骤：
将萘啶衍生物NC(4)和二茂铁末端醛基化合物(6)溶于二氯甲烷，在三乙酰氧基硼氢化钠的还原作用下回流，得到双功能电活性探针FecNCD；
所述萘啶衍生物NC(4)的结构式如下：
所述二茂铁末端醛基化合物(6)的结构式如下：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述萘啶衍生物NC(4)制备方法选择为：化合物A(3)在4M的盐酸乙酸乙酯溶液中脱保护得萘啶衍生物NC(4)；
所述化合物A(3)的结构式为：
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述二茂铁末端醛基化合物(6)制备方法选择为：将化合物B(5)在对甲苯吡啶磺酸嗡盐(PPTS)的作用下，在丙酮/水的溶液里回流脱缩醛得到二茂铁末端醛基化合物(6)；所述丙酮/水的体积比(V/V)为7/3；
所述化合物B(5)的结构式如下：
5.一种检测CGG三核苷酸重复序列的试剂盒，包括：
(1)权利要求1所述双功能电活性探针FecNCD 0.1M甲醇溶液；
(2)2OD SH-DNA；
(3)2OD d(CCG)10；
所述SH-DNA的结构式为：
5'-HS-(CH2)6-GGC CAC GAG TTG ACA-3'；
所述d(CCG)10的结构式为：
5'-CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG CGG TGT CAA CTC GTG GCC-3'。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：还包括0.1M磷酸缓冲溶液50mL。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：还包括6-巯基己醇1mL。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：还包括金电极一支。
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| Facile electrochemical biosensor based on a new bifunctional probe for label-free detection of CGG trinucleotide repeat;Hanping He,et al.;《Biosensors and Bioelectronics》;20130528;第49卷;第282-289页 * |
| Selective recognition of G-G mismatch using the double functional probe with electrochemical active ferrocenyl;Hanping He,et al.;《Biosensors and Bioelectronics》;20121023;第42卷;第36-40页 * |
| 喻芳 等.1,8-萘啶类化合物及其配合物的研究进展.《云南师范大学学报》.2003,第23卷(第3期), * |
| 韩江燕 等.二茂铁甲酸及其衍生物的研究进展.《应用化工》.2014,第43卷(第4期), * |
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