BR112013016240B1

BR112013016240B1 - Novos marcadores de ferroceno para ensaio eletroquímico e seu uso em métodos analíticos

Info

Publication number: BR112013016240B1
Application number: BR112013016240-6A
Authority: BR
Inventors: Barrie MARSH; Jonathan Sharp; Stephen Flower; Christopher Frost
Original assignee: Atlas Genetics Limited
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2011-12-22
Publication date: 2019-05-21
Also published as: AU2011346861A1; US20180252664A1; US10495600B2; DK2655387T3; BR112013016240A2; CN103459407B; US11768167B2; GB201021896D0; CA2822477A1; CN103459407A; HK1191015A1; WO2012085591A1; EP2655387B1; JP2014501925A; ES2528700T3; US20140051080A1; US10830728B2; EA201390916A1; US20200064299A1; AU2011346861B2

Abstract

novos marcadores de ferroceno para ensaio eletroquímico e seu uso em métodos analíticos compostos de fórmula geral i são usados como rótulos em um ensaio eletroquímico (i) em que: fc e fc' são porções ferrocenil substituídas ou não substituídas, x é uma cadeia a alquileno que é opcionalmente interrompida por -0- ou -nh-; y é uma cadeia c1 a c6 alquileno que é opcionalmente interrompida por -0- ou - nh-; z é uma cadeia c1 a c12 alquileno que pode ser opcionalmente substituída e/ou pode ser opcionalmente interrompida por -o-, -s-, cicloalquil f -co- f -conr 1 -,nr1co- ou -nr1- em que r1 representa hidrogênio ou c1 a c4alquil; e r é -um grupo encadeado r. compostos i são usados para confeccionar substratos rotulados, bem como compostos funcionalizados para a confecção dos substratos rotulados.

Description

NOVOS MARCADORES DE FERROCENO PARA ENSAIO ELETROQUÍMICO E SEU USO EM MÉTODOS ANALÍTICOS

Campo da invenção

A invenção relaciona-se a métodos de detecção eletroquimica. Mais especialmente, a invenção relaciona-se a ensaios eletroquímicos, a marcadores eletroquimicamente ativos para uso em métodos de detecção eletroquimica, e a seu uso.

Fundamento da invenção

A detecção de certas moléculas biológicas possui uma parte importante em vários aspectos da vida. Por exemplo, no campo médico, há uma necessidade sempre presente para a detecção de patógenos bacterianos ou virais, ou moléculas biológicas. Outros campos em que ensaios sensíveis são essenciais incluem as indústrias de alimentos e bebidas.

WO 03/074731 revela um método de análise para um ácido nucleico. Uma solução de ácido nucleico faz contato com uma sonda de oligonucleotídeo com um marcador eletroquimicamente ativo. A sonda causa hibridização pelo menos parcial com qualquer sequência alvo complementar que possa estar presente na solução de ácido nucleico. Após degradação enzimática da sonda de ácido nucleico, a informação é eletroquimicamente determinada em relação ao marcador. Compostos para uso no método sao também revelados.

W02005/05657 revela um método de detecção de atividade de protease em que uma solução da amostra faz contato com um substrato de protease com um marcador eletroquimicamente ativo, fornecendo condições sob as quais qualquer protease que possa estar presente na amostra pode degradar o

2/51 substrato de protease e informação em relação ao marcador eletroquimicamente ativo é eletroquimicamente determinada. Certos novos compostos para uso no processo também foram revelados.

Há uma necessidade contínua para o desenvolvimento de rótulos que permitam a detecção da presença em pequenas concentrações de substratos biológicos ou indicadores, por exemplo, ácidos nucleicos (em forma isolada ou na forma de moléculas maiores, por exemplo, oligonucleotídeos naturais ou sintéticos), ou aminoácidos (em forma isolada ou na forma de moléculas maiores, por exemplo, peptídeos naturais ou sintéticos). Em particular, há uma necessidade contínua por novos rótulos com diferentes potenciais de oxidação com isso ampliando a escala de ensaios possíveis disponíveis e aumentado o escopo para o desenvolvimento de reações multiplex.

Sumário da invenção

A invenção fornece o uso como um rótulo em um ensaio eletroquímico de um a composto de fórmula geral I:

Fc — (X) — N —	(¥)—Fc’ '	I
1 (Z)	- R
em gue:
Fc é uma porção	ferrocenil	substituída ou	não
substituída,
Fc' é uma porção	ferrocenil	substituída ou	não

substituída, e pode ser a mesma ou diferente de Fc;

X é uma cadeia Ci a Cê alguileno gue é opcionalmente interrompida por -O- , -S- , ou -NR⁵-, em gue R⁵ representa hidrogênio ou Ci a C₆ alguil;

3/51

Y é uma cadeia Ci a C₆ alquileno que é opcionalmente interrompida por -O-, -S- , ou - NR⁵ em que R⁵ representa hidrogênio ou Ci a Cê alquil;

Z é uma cadeia Ci a Ci₂ alquileno que pode ser opcionalmente substituída e/ou pode ser opcionalmente interrompida por -O-, -S-, cicloalqui 1., -CO-, CONR¹-,

NR¹CO- ou -NR¹- em que R¹ representa hidrogênio ou Ci a C₄alquil; e

R é um grupo encadeador.

Os compostos usados de acordo com a invenção são rótulos eficazes para uso em ensaios eletroquimicos. Em particular, os compostos podem ser usados para formar substratos rotulados. Moléculas de interesse como substratos que podem ser rotuladas incluem, sem limitação, aminoácidos, nucleotídeos, nucleosideos, açúcares, peptideos, proteínas, oligonucleotídeos, polinucleotídeos, carboidratos e derivados de qualquer uma daquelas moléculas. Outros substratos que posem ser rotulados com o uso dos compostos da invenção incluem micropartículas de látex/paramagnéticas e nanopartículas. Os compostos de rotulagem de fórmula geral I e moléculas de rotulagem que incluem rótulos derivados dos compostos de rotulagem são potencialmente úteis em técnicas eletroquímicas em que suas características eletroquímicas podem ser utilizadas para derivar informação a respeito do rótulos ou seu ambiente. Por exemplo, os compostos da invenção podem ter uso em um método como descrito em WO 03/07 4731 ou em um método como descrito em W02005/05657.

Nos compostos usados de acordo com a invenção é preferível que X represente Ci a C₆-alquileno opcionalmente

4/51 interrompido por oxigênio; Y representa Ci a Cõ-alquileno opcionalmente interrompido por oxigênio; e Z representa Ci a C₈ alquileno opcionalmente interrompido por oxigênio. X é preferivelmente -(CH₂)x- em que x é de 1 a 6, preferivelmente 1 a 4, especialmente 1 ou 2; ou Ci a (¾ alquileno interrompido por oxigênio, por exemplo - (CH₂)₃-O

-CH₂-, - (CH₂)₂-O- (CH₂)₂-, ou -CH₂-O-(CH₂)₃-. Y é preferivelmente -(CH₂)_y- em que y é de 1 a 6, preferivelmente 1 a 4, especialmente 1 ou 2; ou Ci a (¾ alquileno interrompido por oxigênio, por exemplo —(CH₂)₃.— O-CH₂-, - (CH₂) ₂—O— (CH₂) ₂— ou -CH₂-O- (CH₂) ₃- . Preferivelmente

X e Y são o mesmo. Preferivelmente Fc e Fc' são o mesmo e X e Y são o mesmo. Preferivelmente Z é -(CH₂)_Z- em que z é de a 8, com z preferivelmente representando de 1 a 6, especialmente de 2 a 6; ou é Ci a C₈ alquileno interrompido por oxigênio, por exemplo - ( (CH₂) ₂-O- (CH₂) 3- ou -(CH₂)₂-O(CH₂)₃—. Em uma modalidade preferida, X é -(CH₂)_X- em que x é 1 ou 2; Y é -(CH₂)_y- em que yélou2; eZé (CH₂)_Z- em que z é de 1 a 8. Quando X e Y representam uma cadeia alquileno interrompida por

-NR⁵-,

R⁵ preferivelmente representa hidrogênio ou

Ci

C₄ alquil, mais preferivelmente hidrogênio.

Em uma modalidade preferida, a invenção fornece o uso, como um rótulo eletroquímico, de um composto da fórmula geral II:

em que:

Fc é uma porção ferrocenil substituída ou não substituída

5/51

Fc' é uma porção ferrocenil substituída ou não substituída, e pode ser a mesma ou diferente de Fc;

X	é	1	ou	2;
y	é	1	ou	2;
z	é	de	1	a 8;
e	R	é	um	grupo encadeador.

Preferivelmente, x e y são iguais a 1.

Porções ferrocenil nos compostos de fórmula geral I ou fórmula geral II podem ser ferrocenil não substituído ou um ou ambos podem ser substituídos como também revelado abaixo. É preferível que as porções ferrocenil sejam a mesma, e é portanto preferível que quando Fc é substituído com um ou mais substituintes, Fc' carregue os mesmos substituintes nas mesmas posições.

Exceto quando o contrário é aparente a partir do contexto, o termo substrato é usado por todo o restante deste documento para incluir tanto substratos de ocorrência natural quanto substratos sintéticos. Os substratos sintéticos incluem análogos sintéticos de substratos de ocorrência natural. Substratos incluem nucleotídeos únicos e aminoácidos únicos. No caso de um ensaio que se baseia na divagem de um substrato, por exemplo, por uma enzima, um aminoácido único pode ser visto como um substrato porque, embora ele seja desprovido de uma ligação interna capaz de ser clivada por uma enzima protease, tal ligação pode ser formada através da anexação de um marcador.

A invenção fornece um método de detecção de uma entidade química que usa um composto de acordo com a invenção. O uso em um ensaio eletroquímico de acordo com a invenção pode ser, por exemplo, em um ensaio para a

6/51 detecção de um substrato eletroquimicamente rotulado. O ensaio eletroquimico pode ser, por exemplo, um ensaio para a determinação da quantidade de um substrato eletroquimicamente rotulado. O ensaio pode ser vantajoso para a detecção ou determinação da quantidade de um substrato rotulado em que o substrato rotulado é selecionado de aminoácidos, nucleotideos, nucleosideos, açúcares, peptideos, proteínas, oligonucleotídeos, polinucleotídeos, carboidratos, micropartículas e nanopartículas. Em certas modalidades preferidas, o ensaio é para a detecção ou determinação da quantidade de um substrato rotulado em que o substrato rotulado é selecionado de nucleotideos, nucleosideos, oligonucleotídeos, e polinucleotídeos. Em outra modalidade vantajosa, o ensaio é para a detecção ou determinação da quantidade de um substrato rotulado em que o substrato rotulado é selecionado de aminoácidos, peptideos, e proteínas.

Para o objetivo de anexação aos substratos, o rótulo pode ser funcionalizado por adição de um grupo de funcionalização. Portanto, a invenção também fornece derivados funcionalizados que compreendem uma porção derivada dos compostos da invenção anexada a um grupo de funcionalização adequado para aumento da anexação a um substrato.

A invenção também fornece um método para a manufatura de um composto de rotulagem funcionalizado que compreende uma porção de rótulo para uso em um ensaio eletroquimico, que compreende a reação de um composto de fórmula geral I:

7/51

I

Fc-pCJ-N-W-Fc* I

Jl «IX» em que:

Fc é uma porção ferrocenil substituída ou não substituída, Fc' é uma porção ferrocenil substituída ou não substituída, e pode ser a mesma ou diferente de Fc;

X é uma cadeia Ci a Cê alquileno que é opcionalmente interrompida por -0-, -S-, ou -NR⁵ -, em que R⁵ representa hidrogênio ou Ci a Cê alquil;

Y é uma cadeia Ci a Cô alquileno que é opcionalmente interrompida por -0-, -S-, ou -NR⁵ -, em que R⁵ representa hidrogênio ou Ci a alquil;

Z é uma cadeia Ci a C12 alquileno que pode ser opcionalmente substituída e/ou pode ser opcionalmente interrompida por -0-, -S-, cicloalquil, -CO-, CONR¹-,

NR^XCO- ou -NR¹- em que R¹ representa hidrogênio ou 1 a C₄alquil; e

R é um grupo encadeador que compreende um átomo de oxigênio com um composto de funcionalização para obter um composto de rotulagem funcionalizado de fórmula geral III:

A-L-F m em que A representa

Fc-(X)-N-(Y)-Fc’

.. . . .. . | . . . . Ia (Z)’ em que Fc, Fc' , X, Y e Z são como acima definido com referência à fórmula geral I; F representa uma porção de funcionalização, especialmente uma porção de

8/51 funcionalização para reação com um substrato para anexação da porção de rotulagem ao. substrato; e

L representa uma porção encadeadora.

A porção encadeadora L geralmente será uma porção encadeadora derivada do grupo encadeador R. Por exemplo, em que R é ou contém um grupo OH L representará ou compreenderá comumente -0-.

Além disso, a invenção fornece um método para a manufatura de um substrato, que compreende a reação de um composto de fórmula geral III:

A-L-F ΙΠ em que A, F e L são como acima definido;

com um substrato para formar um substrato rotulado.

A invenção, além disso, fornece um composto de rotulagem funcionalizado para uso na manufatura de um substrato, o composto de rotulagem funcionalizado tendo a fórmula geral III:

A.-L-F - III em que A, L e F são como acima definido.

A invenção também fornece um substrato rotulado para uso em um ensaio eletroquimico, o substrato rotulado sendo de fórmula geral Illa:

A-L-F’ — [S] Dia em que A representa

Fc-(X)-N-(Y)-Fc’

I ^Ia (Z)em que:

Fc é uma porção ferrocenil substituída ou não substituída,

9/51

X é uma cadeia Ci a C₆ alquileno que é opcionalmente interrompida por -0-, -S-, ou -NR⁵ -, em que R⁵ representa hidrogênio ou Ci a C6 alquil;

Y é uma cadeia Ci a C6 alquileno que é opcionalmente interrompida por -0- S -, ou -NR⁵ -, em que R⁵ representa hidrogênio ou Ci a Cç alquil;

Z é uma cadeia C₄ a C_i2 alquileno que pode ser opcionalmente substituída e/ou pode ser opcionalmente interrompida por -0-, -S-, cicloalquil, -CO-, CONR¹-,

NR¹CO- ou -NR¹- em que R¹ representa hidrogênio ou C_x a C₄alquil;

L-F' representa uma porção de ligação; e [S] representa um substrato.

A porção de ligação -L-F'- é em geral uma porção derivada da porção -L-F- de acordo com fórmula geral III.

A invenção também fornece ensaios que compreendem substratos de acordo com a invenção.

0 Descrição detalhada

A aplicação de detecção eletroquímica tem inúmeras vantagens sobre detecção fluorescente. A detecção eletroquímica tem o potencial por níveis muito altos de sensibilidade e exibe uma escala dinâmica linear mais ampla 25 que fluorescência. Não há necessidade que as amostras sejam oticamente claras. Há também menos interferência a partir dos contaminantes de base (várias amostras biológicas autofluoresce).

A detecção eletroquímica é baseada na observação de 30 que um marcador eletroquimicamente ativo exibe diferentes

10/51 características eletroquímicas dependendo de se ele é ou não anexado a um substrato e na natureza do substrato. Por exemplo, no caso de um rótulo eletroquimico anexado a um aminoácido, as características exibidas dependerão não apenas da identidade do aminoácido mas também de se aquele resíduo de aminoácido é ou não incorporado em um peptídeo ou proteína, e do comprimento de qualquer peptídeo ou proteína. Sob circunstâncias adequadas, a atividade eletroquímica de um marcador anexado a um resíduo de aminoácido pode alterar por um grau detectável após perda de anexação de um único ou de alguns resíduos de aminoácidos.

O tamanho e características de uma molécula a qual um marcador eletroquimicamente ativo é anexado influencia as características observáveis do marcador eletroquimico. Isso pode ocorrer, por exemplo, por influência da taxa de migração do marcador por difusão ou de sua taxa em resposta a um campo elétrico.

A atividade eletroquímica de um marcador de migração também pode ser influenciada por efeitos esféricos que resultam da presença da molécula à qual ele é ligado. Por exemplo, impedimento estérico pode prevenir o marcador de se aproximar de um eletrodo e aceitar ou doar elétrons.

Se o marcador anexado a um peptídeo então a estrutura secundária do peptídeo (como determinado pela sequência primária) pode influenciar as propriedades físicas do marcador.

Por exemplo, se o marcador é anexado a um resíduo de aminoácido em um peptídeo de modo que a estrutura do peptídeo impeça estericamente o marcador eletroquimicamente ativo então os sinais observáveis por

11/51 voltametria podem ser reduzidos. A digestão do peptideo pode destruir ou liberar elementos de estrutura secundária e assim reduzir ou abolir a influência da estrutura do peptideo sobre o marcador. Portanto, a digestão do peptideo resulta em uma alteração, comumente um aumento, no sinal eletroquimico produzido pela porção de marcador. Em um experimento de voltametria de pulso diferencial, a resposta de corrente farádica em uma voltagem aplicada particular pode aumentar após digestão do peptideo.

De forma análoga, se um marcador é anexado a um nucleotideo, as características eletroquimicas serão influenciadas por se o nucleotideo é incorporado ou não em um oligonucleotídeo, ao longo do comprimento daquele oligonucleotídeo, e ao longo da sequência do oligonucleotídeo especialmente na vizinhança do ponto de anexação.

A informação em relação ao marcador eletroquimicamente ativo pode ser obtida por voltametria ou by por método amperométrico. Voltametria de pulso diferencial é particularmente adequada. Se desejado, a etapa de detecção eletroquímica pode ser realizada com o uso de um ou mais eletrodos cobertos por uma membrana que é capaz seletivamente de excluir moléculas baseadas em uma ou mais características, por exemplo, tamanho, carga ou hidrofobicidade. Isso pode ajudar na eliminação de ruído de fundo que surge atualmente de, por exemplo, espécies carregadas na solução.

Em uma modalidade da invenção, os compostos de fórmula geral I usados em ensaio eletroquimico são N,N-di(ferrocenilalquil)aminoálcoois, a porção aminoálcool

12/51 vantajosamente tendo de 2 a 10 átomos de carbono, preferivelmente de 2 a 8 átomos de carbono, especialmente de 3 a 6 átomos de carbono. Preferivelmente, a porção de álcool é uma porção álcool de cadeia linear que não é substituída ou substituída e que é opcionalmente interrompida por um ou mais heteroátomos e/ou um ou mais grupos. Ilustrativos de heteroátomos são, por exemplo, oxigênio, enxofre ou nitrogênio. Grupos que podem estar presentes incluem, sem limitação, -O-, -S-, cicloalquil, incluindo heterocicloalquil, -CO-, CONH-, -NHCO- e -NH- e NR¹- em que R¹ é Ci a C₄ alquil. Substituintes, quando presentes, podem ser, por exemplo, Ci~C₄ alquil que pode ser opcionalmente substituído por um ou mais grupos selecionado de um hidroxi, halo, ciano, oxo, amino, éster ou amido; C₄-C₄ alquenil; Ci-C₄ alquenil substituído com um hidroxi, halo, ciano, oxo, amino, éster ou amido; aril; ou aril substituído com um hidroxi, halo, ciano, oxo, amino, éster ou amido.

Preferivelmente, a porção alquileno do grupo diferrocenilalquil tem de 1 a 4 átomos de carbono, preferivelmente um ou dois átomos de carbono. Preferivelmente, a porção alquileno é a mesma em ambos os grupos ferrocenilalquil. Portanto, preferivelmente, o grupo diferrocenilalquil é diferrocenilmetil ou diferroceniletil, em que a porção ferrocenil pode ser em cad caso independentemente não substituída ou substituída por um ou mais substituintes.

Nos compostos (que incluem compostos de rotulagem, o compostos de rotulagem funcionalizados e substratos rotulados) usados de acordo com a invenção, incluindo os

13/51 compostos de acordo com as fórmulas gerais I, II e III e a porção de rótulo de fórmula geral Ia, os dois grupos ferrocenil Fc e Fc' são preferivelmente independentemente selecionados de grupos ferrocenil não substituídos e substituídos. Em uma modalidade, os dois grupos ferrocenil nos compostos de acordo com as fórmulas gerais I, II e III e porção de rotulagem de fórmula geral Ia são ferrocenil não substituído. Em outras modalidades, um ou ambos os anéis pentadienil de uma ou cada uma das porções ferrocenil podem ser substituídos por um ou mais substituintes, a natureza e localização dos quais são selecionadas de modo a influenciar em uma maneira desejada as características redox da porção ferroceno. Os anéis pentadienil da porção ferrocenil podem ser adicionalmente substituídos por qualquer anel substituinte que não reduza materialmente a sensibilidade eletroquímica do rótulo. Em uma modalidade, pelo menos um e preferivelmente ambos os grupos ferrocenil são porções ferrocenil substituídas tendo um ou mais substituintes selecionado de halo; Ci-C₄ alquil que pode ser opcionalmente substituído por um ou mais grupos selecionados de um hidroxi, halo, ciano, oxo, ãmino, éster ou amido; Ci-C₄ alquenil; Ci~C₄ alquenil substituído com um hidroxi, halo, ciano, oxo, amino, éster ou amido; aril; ou aril substituído com um hidroxi, halo, ciano, oxo, amino, éster ou amido. Substituintes preferidos incluem Ci a C₄alquil, por exemplo, metil ou etil; Ci-C₄ alquil substituído com NH₂, NHR², NR³R⁴ em que R², R³ e R⁴ são independentemente selecionados de C_x a C₄ alquil de cadeia linear ou ramificada; halo, por exemplo, bromo ou flúor; ou Ci a C₄ alquenil, por exemplo, vinil.

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Por exemplo, em uma modalidade da invenção, cada grupo ferrocenil inclui um substituinte único em uma posição de anel adjacente à posição em que o grupo ferrocenil é anexado ao restante da molécula. Exemplo ilustrativo daquela modalidade é o composto bis((2(dimetilamino)ferrocenil)metil)-6-aminohexanol.

modalidade, ambos os grupos ferrocenil

Em outra são não substituídos. Exemplo ilustrativo daquela modalidade é o composto N,N-di(ferrocenilmetil)-6-aminohexanol. Grupos ferrocenil ilustrativos adicionais incluem 1'-metil ferrocenil; 2-metilferrocenil; 1'-vinilferrocenil; 1'bromoferrocenil; e 2,3,4,5-tetrametil-l',2',3',4’, 5'pentametilferrocenil.

É preferível que as porções ferrocenil sejam idênticas. Acredita-se que isso gere um sinal mais forte.

A porção Z pode ser não substituída ou substituída. Substituintes, quando presentes, podem ser, por exemplo, um ou mais substituintes selecionados de hidroxi, halo, ciano, amino, e C1-C4 alquil não substituído ou substituído, C1-C4 alquenil, ou aril; em que em cada caso substituintes opcionais incluem, sem limitação, hidroxi, halo, ciano, oxo, amino, éster ou amido. A porção Z pode, se desejado, ser interrompida por um, ou opcionalmente mais de um, átomo ou porção selecionada de -O-, -S-, cicloalquil, incluindo heteroçicloalquil, - CO -, -CONH-, -NHCO- e -NH- e -NR'- em que R¹ é Ci a C₄ alquil. Exemplos ilustrativos de porções cicloalquil que podem ser incluídos como interrupções na porção Z são anéis cicloalquil com de 5 a 7 átomos de anel, especialmente 6 átomos de anel, por exemplo, ciclohexil, piperidinil, morfolinil.

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As porções X e Y, que são preferivelmente as mesmas, possuem vantajosamente um comprimento de cadeia de 1 a 6, preferivelmente de 1 a 4 átomos de carbono, especialmente um ou dois átomos de carbono, e mais especialmente um átomo de carbono. As porções X e Y 'pde, representar uma cadeia alquileno, opcionalmente interrompida por -O- S - ou -NR⁵ por exemplo -NH-. Porções X e Y preferidas incluem, por exemplo, -CH₂ -, -CH₂ -CH₂ -, - (CH₂) ₃-O-CH₂-, -CH₂-O- (CH₂) ₃-,

-(CH₂)₃-O-(CH₂)₂- e - (CH₂) ₂-O-(CH₂) ₃-.

A ligação ao substrato pode ser qualquer ligação adequada, tipicamente por ligação a uma cadeia lateral de substrato. O grupo encadeador R nos compostos de fórmula geral I pode ser qualquer grupo eficaz ao substrato diretamente funcionalização como aqui descrito.

grupo hidroxil ou um grupo hidroxil adequado para ligação ou via um grupo de

R é preferivelmente um protegido ou um grupo que contém um grupo hidroxil ou um grupo hidroxil protegido

Deve-se perceber, no entanto, que qualquer outro grupo encadeador R adequado pode ser selecionado tendo relação ao substrato ao qual, em uso, o composto está para ser anexado. Vários métodos sintéticos foram desenvolvidos para a derivatização de cadeias laterais de proteína, peptídeo ou aminoácido ou porções terminais de proteína, peptídeo ou aminoácido. Por exemplo, resíduos de lisina em uma proteína podem ser derivatizados por reação com um succinimidil éster. Para derivatização em outros resíduos de aminoácido, outros métodos sintéticos conhecidos podem ser usados. Por exemplo, um reagent de maleimida pode ser usado para derivatizar resíduos de cisteína. Um N-hidroxi succinimida éster pode ser usado para derivatizar o

16/51 terminal amino ou grupo amino de cadeia lateral de uma proteína ou peptídeo, ou uma porção amino de um aminoácido.

Métodos adeguados de derivatização para nucleotideos são também bem conhecidos, por exemplo, com o uso da porção de fosforamidita.

Os métodos de derivatização acima são ilustrativos dos métodos que podem ser usados para unir os compostos da invenção a um substrato, embora outros métodos possam ser usados.

Substratos rotulados de acordo com a invenção podem ser preparados por reação de um composto de acordo com a invenção, opcionalmente depois de funcionalização para obter um composto de rotulagem funcionalizado, com um substrato, por exemplo, com aminoácidos, nucleotideos desoxirribonucleotídeos ou nucleosídeos, açúcares, substrato selecionado de (por exemplo oligo oligo ribonucleotídeos), peptídeos, proteínas, oligonucleotideos, polinucleotídeos, carboidratos e derivados de gualquer uma daquelas moléculas.

Em uma modalidade preferida, o substrato é um nucleotídeo ou um oligonucleotídeo. O nucleotídeo pode ser selecionado de adenosina, timidina, guanosina, citidina ou uridina. Preferivelmente o nucleotídeo, ou um nucleotídeo do oligonucleotídeo, é anexado ao rótulo através de um grupo anexado ao grupo ribose ou desoxirribose do nucleotídeo, por exemplo, na posição 2' , 3' ou 5' , por exemplo através de um átomo de oxigênio ou nitrogênio atom. Mais preferivelmente, o nucleotídeo é anexado na posição 3' ou 5' , por exemplo, na posição 5'. A ligação em outras posições é também possível.

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No caso de nucleotideos, uma via vantajosa de anexação de rótulos da invenção por funcionalização com fosforamidita. A ligação de grupos fosforamidita oligonucleotideos é amplamente praticada em síntese de oligonucleotideo e assim os métodos e condições para anexação a um oligonucleotideo de rótulos funcionalizados com fosforamidita será bem conhecida e uma matéria rotineira para aqueles habilitados na técnica. Além disso, ela permite vantajosamente o uso de métodos padrão de manufatura de oligo.

Oligonucleotideos a serem usados em um ensaio de acordo com a invenção são vantajosamente nucleotideos que possuem de 2 a 50 nucleotideos, mais preferivelmente de 2 a 40 nucleotideos especialmente de 15 a 35 nucleotideos, com de 18 a 30 nucleotideos sendo especialmente preferido. Para algumas aplicações, oligonucleotideos mais curtos podem ser úteis, por exemplo, oligonucleotideos com de 2 a 14 nucleotideos, mais preferivelmente de 2 a 10 nucleotideos.

A anexação a proteínas, por exemplo, via cisteína, lisina, pode ser realizada em alguns casos por incubação da proteína e rótulo de ferrocenil juntos em temperatura ambiente em uma solução tampão adequada. Quando o rótulo é vantajosamente ligado a cisteína ou lisina, mas a sequência do substrato não contém cisteína ou lisina em uma posição adequada, a sequência pode, se desejado, ser mutada para adicionar um ou mais resíduos de cisteína ou lisina como um resíduo adicional ou como uma substituição por outro resíduo. Um método alternativo para a anexação a proteínas pode incluir biotinilação dos rótulos e uso de proteínas comerciais com estreptavidina (ou vice versa) . Como um

18/51 exemplo, o substrato pode ser biotinilatado por qualquer técnica padrão, por exemplo, pelo uso de um kit de biotinilação comercialmente disponível.

O substrato biotinilatado se ligará compostos conjugados a estrepavidina ou avidina como anticorpos (que são comercialmente e amplamente disponíveis).

que uma uso

Será, no entanto, aparente para a rótulos similares podem localização selecionada de um grupo funcional de ser anexados de inúmeras pessoa habilitada a um substrato em localizações pelo rotulagem adequado.

Em compostos de rotulagem funcionalizados de fórmula geral III:

A-L-F III

A-L é preferivelmente uma porção derivada de um composto de acordo com fórmula geral I e F é um grupo de funcionalização. Compostos de rotulagem funcionalizados preferidos de fórmula geral III incluem os compostos de fórmula geral Illb:

Á-O-F · Hlb em que A-0 é uma porção derivada de um composto de acordo com a fórmula geral I, preferivelmente por perda de um átomo de hidrogênio de hidroxi ou grupo de proteção quando o grupo R encadeador de fórmula geral I é hidroxil ou um grupo que contém hidroxil ou é um grupo hidroxil protegido, e F é um grupo de funcionalização.

Grupos de funcionalização adequados que podem ser úteis com rótulos da invenção, que incluem como grupo de funcionalização F na fórmula geral III e fórmula geral Illb, podem incluir, sem limitação, grupos succinimidil éster, grupos fosforamidita, grupos maleimida, grupos

19/51 biotina e azida. Deve-se perceber, no entanto, que pode ser usado qualquer grupo de funcionalização que facilite a anexação do composto de rotulagem ao substrato a ser rotulado.

A invenção também fornece um método de detecção de um ácido nucleico (por exemplo, RNA ou DNA) em uma amostra que compreende a etapa opcional de amplificação do ácido nucleico (por exemplo, por PCR ou outra técnica de amplificação de ácido nucleico) seguido pela etapa de contato do amplicon com uma sonda de ácido nucleico complementar sob condições para permitir hibridização entre a sonda e amplicon, seguido pela etapa de degradação seletiva da sonda hibridizada ou não hibridizada (por exemplo, pelo uso de nucleases específicas para filamento único ou duplo), em que a referida sonda é rotulada com um composto eletroquimicamente ativo da invenção e em que o método fornece a etapa de medição da atividade eletroquímica do composto que rotula a sonda em que a referida atividade eletroquímica é dependente quantitativamente ou qualitativamente da extensão de degradação da sonda.

A invenção também fornece um método de detecção de um anticorpo ou derivado que pode ser, por exemplo, ligado a antígeno alvo em um ensaio) com um composto eletroquimicamente ativo da invenção que compreende a etapa de medição da atividade eletroquímica do composto.

A invenção também fornece métodos de diagnóstico ou monitoramento de uma doença em um indivíduo que compreende o uso de um método da invenção na detecção de uma protease ou um inibidor de protease associado com a referida doença

20/51 em um tecido ou fluido corporal do indivíduo.

A invenção também fornece métodos de diagnóstico ou manutenção de uma doença em um indivíduo que compreende o uso de um método da invenção para detectar um peptídeo ou proteína associada com a referida doença em um tecido ou fluido corporal do indivíduo.

A invenção também fornece métodos de diagnóstico ou monitoramento de uma doença em um indivíduo que compreende o uso de um método da invenção na detecção de uma nuclease ou um inibidor de nuclease associado com a referida doença em um tecido ou fluido corporal do indivíduo.

Além disso, a invenção fornece o uso de um método da invenção para a detecção de uma doença em um indivíduo.

A invenção também fornece métodos de detecção de um patógeno ou outro organismo indesejado, por exemplo, um organismo que estraga alimentos, que compreende o uso de um método da invenção.

Além disso, a invenção fornece o uso de um derivado de N,N-di(ferrocenilalquil)glicina, por exemplo, um derivado de N,N-di(ferrocenilalquil)glicinamido, como um rótulo eletroquímico em um método de medição eletroquímica.

A invenção também fornece um ensaio que compreende um substrato rotulado da invenção, opcionalmente em combinação com outros componentes do ensaio, por exemplo, um frasco de amostra, um recipiente que compreende eletrodos para detecção eletroquímica, enzimas para uso no ensaio ou padrões e controles.

O referido ensaio pode compreender mais de um diferente substrato rotulado da invenção. Se for este o caso, a presença de diferentes substratos rotulados pode ser diferencialmente detectada por rotulagem deles com

21/51 rótulos eletroquimicos da invenção tendo diferentes características eletroquímicas (por exemplo, diferentes potenciais de oxidação) com isso permitindo que o ensaio seja um ensaio multiplex (por exemplo, um duplex) em que diferentes substratos podem ser discriminados quando presentes no mesmo frasco de amostra.

A invenção fornece em uma modalidade adicional um composto de acordo com a fórmula geral I

Fc-(X)-N-(Y)-Fc’ . I (Z) - R em que:

Fc é uma porção ferrocenil substituída,

Fc' é uma porção ferrocenil substituída, e pode ser a mesma ou diferente de Fc;

X é uma cadeia Ci a Cê alquileno que é opcionalmente interrompida por -O-, -S-, ou -NR⁵-, em que R⁵ representa hidrogênio ou Ci a Cg alquil;

Y é uma cadeia Ci a Cg alquileno que é opcionalmente interrompida por -O-, -S -, ou -NR⁵-, em que R⁵ representa hidrogênio ou Ci a C6 alquil;

Z é lima cadeia Ci a Ci₂ alquileno que pode ser opcionalmente substituída e/ou pode ser opcionalmente interrompida por -O-, -S-, cicloalquil, -CO-, -CONR¹-, NR¹CO- ou -NR¹- em que R¹ representa hidrogênio ou Ci a C₄alquil; e

R é um grupo encadeador.

Naquela modalidade é preferível que cada porção ferrocenil seja substituída por pelo menos um substituinte selecionado de halo, Ci a C₄-alquil, haloalquil, aril, C_x a

22/51

C₄ alquenil, e ciano.

Em uma modalidade adicional, a invenção fornece um composto de acordo com a fórmula geral I

Fc-(X)-N-(Y)-Fc’ i (Z)-R em que:

Fc e Fc' são uma porção ferrocenil não substituída,

X é uma cadeia Ci a Cê alquileno que é opcionalmente interrompida por -0-, -S-, ou -NR⁵-, em que R⁵ representa hidrogênio ou Ci a C6 alquil;

Y é uma cdeia Ci a C₆ alquileno que é opcionalmente interrompida por -0-, -S-, ou -NR⁵-, em que R⁵ representa hidrogênio ou Ci a C₆ alquil;

Z é uma cadeia Cê a C_i2 alquileno ou é um Ci a Ci₂alquileno que é substituído por um ou mais substituintes e/ou é interrompido por uma porção selecionada de -0-, -S-, cicloalquil, -CO-, -CONH-, -NHCO- ou -NR¹- em que R¹representa hidrogênio ou C_x a C₄ alquil; e

R é um grupo encadeador.

Naquela modalidade adicional, é preferível que X represente -(CH₂)_X- em que x é de 1 a 6; e Y represente (CH₂)_y- em que y é de 1 a 6.

Nas referidas modalidades adicionais, Z preferivelmente representa C₈ a C₈ alquileno opcionalmente interrompido por oxigênio. Preferivelmente, o grupo encadeador R compreende um grupo capaz de reagir com um grupo compatível de uma porção de funcionalização ou de um substrato para anexar o composto à referida porção de funcionalização ou referido substrato, por exemplo, R pode

23/51 ser hidroxi, hidroxi protegido ou uma porção gue contém um grupo hidroxi ou hidroxi protegido.

A Tabela 1 abaixo apresenta nas fórmulas gerais IVa,

Va, Via, Vila e VlIIa certos compostos preferidos de acordo com a invenção que podem ser usados como rótulos em ensaios eletroquímicos de acordo com a invenção, e que podem ser usados para confeccionar os compostos de rotulagem funcionalizados e substratos rotulados de acordo com a invenção. A tabela 1 também apresenta nas fórmulas gerais

IVb, Vb, VIb, Vllb e VlIIb ilustrações que correspondem aos compostos de rotulagem funcionalizados de acordo com a invenção. Nas fórmulas da Tabela 1, exceto onde considerações de impedimento estérico falam contra ele, cada ferrocenil pode ter mais um substituinte R, que pode 15 ser o mesmo ou diferente, e em qualquer posição de anel.

Quando há um ou mais substituintes em um dos grupos ferrocenil, o outro grupo ferrocenil deve ser entendido como tendo o mesmo substituinte(s) nas mesmas posições.

24/51

Tabela 1: Compostos ilustrativos e compostos de rotulagem funcionalizados

25/51

26/51

27/51

28/51

Nas fórmulas gerais IVa, Va, Via, Vila e VlIIa e em suas contrapartes funcionalizadas na Tabela 1, quando um ou mais substituintes de anel R¹¹ ou R¹³, são presentes no anel pentadienil proximal de cada ferrocenil, ou seja, o anel que é diretamente ligado ao restante da molécula, há preferivelmente um referido anel substituinte em uma posição de anel adjacente àquela ligação. Quando mais de um substituinte de anel R¹¹, R¹³ é presente e cada anel pentadienil proximal, aqueles substituintes podem estar em qualquer posição em relação um ao outro. Quando mais de um substituinte de anel R¹⁰, R¹² ou R¹⁴ é presente em cada anel de pentadienil distai de cada ferrocenil, este é o anel remoto da ligação que une o ferrocenil ao restante da molécula, aqueles substituintes podem estar em qualquer posição em relação um ao outro. Enquanto que nas fórmulas gerais IVa, Va, Via, Vila e VlIIa e em suas contrapartes funcionalizadas na Tabela 1 são mostrados substituintes de anel no anel proximal ou no anel distai, também é possível para ambos os anéis pentadienil de cada ferrocenil carregar um ou mais substituintes.

Em uma modalidade especialmente preferida o composto é N,N-di(ferrocenilmetil)-6-aminohexanol (referido nos Exemplos abaixo como rótulo A) . outros rótulos preferidos que podem ser usados de acordo com a invenção incluem:

2-((diferrocenilmetil)amino)-1-(4-hidroximetil) piperidin-l-il)etanona; e N,N-di-(ferrocenilmetil)-2aminoetoxi)etanol em que cada porção ferrocenil pode ser não substituída ou substituída por um ou mais substituintes. O composto N,N-diferrocenilmetil-6-aminohexanol, em que os grupos

29/51 ferrocenil são ambos não substituídos, possui boas características eletroquímicas. Como ilustrado nos Exemplos nessa, a incorporação de um ou mais substituintes em cada um dos grupos ferrocenil (os substituintes em cada ferrocenil sendo os mesmos) naquele composto pode ser usada para obter compostos com características eletroquímicas modificadas, fornecendo através de seleção adequada de substituinte um conjunto de compostos dos quais dois ou mais podem ser selecionados para o objetivo de reações multiplex.

Certos compostos ilustrativos de acordo com a invenção que possuem boas propriedades eletroquímicas são apresentados na Tabela 2:

Tabela 2: Compostos de rotulagem ilustrativos de acordo com a invenção

. Fe	F-e \
Fe / n Fe	Fe ) Te'''Ν' 1

30/51

Fé	Fe 0 _rA--^ ΫΤ
Fe	OH Fe Fe
OH Fe Fe gr	OH ......r \___ Fe Fe

Breve descrição dos desenhos

Fig. 1 é uma representação esquemática de uma célula eletroquimica usada em medições de voltametria de pulso diferencial aqui descritas;

Fig.	2	é um voltamograma de	pulso diferencial	de
rótulo A	como	manufaturado no Exemplo	1 abaixo;
Fig.	3	é um voltamograma de	pulso diferencial	de
rótulo B	como	manufaturado no Exemplo	2 abaixo;
Fig.	4	é um voltamograma de	pulso diferencial	de
rótulo C	como	manufaturado no Exemplo	3 abaixo;

Fig. 5 mostra as varreduras voltamétricas para amostra positiva e uma amostra negativa de Chlamydia de acordo com

31/51 o Exemplo 5(a) abaixo;

Fig. 6 é uma análise de espectrometria de massa de um mononucleotideo e um dinucleotideo sintetizado com o rótulo eletroquimico A como descrito no Exemplo 5(a) abaixo;

Fig. 7 é uma análise de espectrometria de massa do produto do ensaio do Exemplo 5 (a);

Fig. 8 é um gráfico em barra que mostra medições de corrente feitas quando um alvo de Chlamydia é adicionado diretamente a uma reação de PCR em uma faixa de concentrações e detectadas com o uso de uma sonda de oligonucleotideo como descrito no Exemplo 5(b) abaixo;

Fig. 9 é um gráfico em barra que mostra pico de corrente em uma faixa de concentrações quando o alvo de Chlamydia foi adicionado a um processo de extração de DNA e o resultado do processo de extração foi amplificado com o uso de PCR, então detectado com o uso de uma sonda de oligonucleotideo rotulada com o rótulo A, como descrito no Exemplo 5(c) abaixo;

Fig. 10 mostra uma comparação entre detecção eletroquímica com o uso da sonda de rótulo A e um ensaio qPCR baseado em SYBR Green para Norovírus;

Fig. 11 mostra uma comparação entre a detecção eletroquímica que usa a sonda de rótulo A e um ensaio qPCR baseado em SYBR Green para Streptococcus equi;

Fig. 12a é uma varredura voltamétrica que usa rótulo A ligado a uma IgG anti-cabra comercialmente disponível;

Fig. 12b mostra varreduras voltamétricas realizadas em intervalos de tempo com o uso de rótulo A ligado a uma IgG anti-cabra comercialmente disponível;

Fig. 13a mostra varreduras voltamétricas de

32/51 micropartículas de acordo com o Exemplo 8 em várias concentrações;

Fig. 14 é um voltamograma de pulso diferencial de rótulo D como manufaturado no Exemplo 9 abaixo;

Descrição detalhada de certas modalidades preferidas

Com referência à Fig. 1, é mostrado esquematicamente uma célula eletroquímica 1 adequada para uso nos experimentos de voltametria cíclica aqui descritos. A célula compreende um frasco 2, que contém uma solução base de eletrólitos 3, que é uma solução aquosa 100 mM de cloreto de sódio. Imerso na solução 3 é um eletrodo de trabalho de carbono impresso 5, um contra eletrodo de carbono impresso 6 e um eletrodo de referência de prata/cloreto de prata 7, todos com conectores de prata. A amostra é espalhada na superfície do eletrodo de trabalho e voltametria é realizada por conexão dos conectores de prata ao condutor adequado no potenciômetro. Como uma ilustração, a amostra pode ser preparada como se segue: precursor de rótulo de ferrocenil (2 ng) é dissolvido em DMSO (1 mL) . Uma alíquota de 10 μΐ é retirada dessa solução e é então também diluída no tampão (500 μΐ). Então uma alíquota (20 μΐ) é aplicada ao eletrodo de serigrafado para realizar a varredura eletroquímica.

Os seguintes Exemplos ilustram a invenção:

Materiais e métodos - Sintese e ensaios de rótulo

Ácido Ferroceno carboxílico foi obtido de SigmaAldrich. Ferroceno carboxaldeído foi obtido de SigmaAldrich.

6-Aminohexanol foi obtido de Sigma-Aldrich.

Glicina foi obtida de Sigma-Aldrich.

33/51

N,N-diisopropiletilamina foi obtida de Sigma-Aldrich.

2-cianoetildiisopropilclorofosforamidita foi obtida de

Sigma-Aldrich. Solução de papaina em concentração de 1 mg/mL foi obtida de Sigma-Aldrich.

IgG anti-cabra e IgG de cabra biotinilatada foram obtidas de Sigma.

Métodos de PCR foram realizados com o uso de um

Controlador Térmico Programável PTC-100 ou PTC-200 (MJ

Research Inc.), ou um termociclor de leito plano PeqLab. Cavidades de microtitulo revestidas com estreptavidina eram cavidade sde alta densidade Sigma Screen™.

Materiais e métodos - Detecção eletroquimica

Os eletrodos são a base de tinta e são serigrafados a cura a calor - produzidos por GM Name plate (Seattle, WA)

EXEMPLO 1- Sintese de N,N-diferrocenilmetil-6-aminohexanol [rótulo A]

NaBH(OAcfa

H_SN

THF, 12hrs

	Rótulo	Fe A
Ferroceno carboxaldeido	(2,1 g, 9,81	mmol) e	6-
aminohexan-l-ol (0,5	<3,	4,27	mmol) em THF	seco (25	mL)
foram adicionados	a	um	frasco seco	em forno.
Triacetoxiborohidreto	de	sódi	o (2,3 g, 10,	90 mmol)	foi

adicionado à

solução.

em porções

A reação foi deixada em repouso de um dia para o outro.

A reação foi iniciada em acetato de

NaCO₃ (sat;

etila (40 mL), a camada orgânica foi lavada com mL), Salmoura (20 mL) e água MilliQ (20 mL)

34/51 a fração orgânica foi então seca sobre sulfato de magnésio e o solvente removido in vacuo. O produto bruto é então colocado em coluna com o uso de 9:1 solução B: solução A (solução A: acetato de etila 95% TEA 5%, solução B: éter de petróleo 40-60 95%, TEA 5%) para extrair o produto bruto (sólido laranja escuro). 85% de rendimento ^XH RMN (300MHz, CDC1₃) δ 4,18 (2H, s, Cp), 4,17 (2H, s, Cp), 4,13 (15H, s, Cp), 3,66 (4H, t, J = 6,25 Hz, CH₂) , 3,48 (2H, s, CH₂) , 2,20 (2H, t, J = 6, CH₂), 1,59 - 1,31 (6H, m, CH₂) . ¹³C RMN (75,5 Hz, CDCI3) δ 77,83, 77,40, 76,98, 70,58, 68,88,

63,36, 53,02, 52,17, 33,10, 27,43, 25,88. HRMS (ESI) calculado para C₂₈H₃₃NiOiFe₂ m/z 519,1430 encontrado 519,1438.

A eletroquimica do rótulo do composto A é mostrada no voltamograma da Fig. 2.

O do rótulo do produto possui um pontencial redox de

0,275 V.

EXEMPLO 2

Síntese de di((dimetilamino) metilferrocenilmetil)-6-aminohexanol (rótulo B) (a)

Síntese de

Dimetilamino)metil

Ferrocenocarboxaldeido (Diaminometil)metilferroceno (1 g, 5 mmol) foi dissolvido em Et₂O, n-butil lítio (2,51 mL, 6,25 mmol) foi adicionado lentamente e a mistura da reação foi agitada em temperatura ambiente por 16 horas.

Depois de 16 horas, a mistura da reação foi extinta com DMF (0,4 mL, 6,25 mmol) e agitada novamente em temperatura ambiente por 4 horas. Água (15mL) foi então adicionada à reação. A fase orgânica foi então extraída com éter (2 X 25 mL). As fases orgânicas combinadas foram secas com sulfato de magnésio, filtradas e o solvente foi

35/51 removido sob vácuo para gerar o produto em um rendimento de

72% (óleo vermelho/marrom escuro) . ^XH RMN (300 MHz, CDC1₃) δ 9,81 (1H, s, CHO) , 4,21(2H, s, Cp), 4,14 (5H, s, Cp),

3,64 (2H, s, CH₂), 2,08 (6H, s, NMe₂) ¹³C RMN (75,5 Hz,

CDCI3) δ 193,2, 86, 7, 83,4, 77,8, 77,5, 77,0, 76, 62, 75,8,

71,8, 70,3, 70,2, 70,0, 68,4, 68,0, 59,2, 56,6, 44,8, 44,7. HRMS (ESI) calculado para Ci₄Hi8NiOiFei m/z 272,0737 encontrado 272,0731

Ref: Biot, C., Glorian, G., Maciejewski, L. A., Brocard, J. S., Domarle, 0., Blampain, G., Millet, P., Georges, A. J. , Abessolo, H., Dive, D., Lebibi, J. J Med. Chem. 1997, 40,

3.715-3.718.

(b) Síntese de rótulo B

(Dimetilamino)metil ferrocenocarboxaldeído (1,1 g,

4,04	mmol) foi	dissolvido	em THF	seco	(30 mL) 6-aminohèxan-
l-ol	(0,25	g, 2,13	mmol)	foi	adicionado. Então
triacetoxiborohidreto de	sódio	(1,3	g, 6,16 mmol) foi

adicionado à mistura da reação. A solução foi agitada sob nitrogênio em temperatura ambiente de um dia para o outro. Acetato de etila (20 mL) e IN NaOH (sat; 20 mL) foram então adicionados e a camada orgânica foi então extraída com NaCO3 (2 5mL), Salmoura (25 mL) e água Milli Q filtrada (25 mL) então seca sobre MgSO₄ e o solvente removido in vácuo para gerar um óleo laranja (0,95, 75%). ¹H RMN (300MHz,

CDCI3) δ 4,18 (2H, s, Cp), 4,17 (2H, s, Cp), 4,13 (15H, s,

36/51

Cp),	3, 66	(4H, t, J	= 6,25 Hz, CH₂) , 3,48 (2H, s,	CH₂) ,
2,20	(2H,	t, J = 6,	CH₂), 2,17 (12H, s, CH₃) 1,59	-1,31
(6H,	m,	CH₂) . HRMS	(ESI) calc. para C₃₄H₄9N₃OiFe₂	m/z

627,3012 encontrado 627,3126.

A eletroquimica do composto do produto é mostrada no voltamograma na Fig. 3. O rótulo do produto B possui um potencial redox de 0,38 V.

EXEMPLO 3: Síntese de 2-((diferrocenilmetil) amino)-1-(4 (hidroximetil)piperidin-l-il)etanona (rótulo C) (a) Sintese de N,N-(diferrocenilmetil)glicina

Na(OAc)₃BH

THF, 12hrs, rt

Ferroceno carboboxaldeído (2,1 g) foi adicionado a um frasco de fundo redondo que contém THF seco (20 mL) Glicina (0,5 g) foi adicionada à solução e a reação foi agitada sob

N₂. Triacetoxiborohidreto de sódio (2,3 g) foi adicionado em porções à solução agitada. A reação foi agitada de um dia para o outro. A solução foi então dividida entre acetato de etila (40 mL) e 1M hidróxido de sódio aquoso (40 mL). A fração orgânica foi lavada com NaHCO₃ aquoso saturado (sat; 20 mL) , salmoura (40 mL) e água (40 mL) . A fração orgânica foi seca com o uso de MgSO₄ e o solvente foi removido. O produto bruto foi então colocado em coluna (solvente A: éter de petróleo 40-60: TEA 95:5, Solvente B:

acetato de etila: TEA 95:5). O produto foi um sólido laranja escuro (80%). ^XH RMN (250 MHz, CDC1₃) δ 4,099 (1H, s, CpH) , 4,052 (1H, s, CpH) , 4,022 (7H, s, FcCpH) , 3,549 (4H, t, J = 6,75, 2 x CH₂), 3,348 (2H, s, CH₂) , 1,979 (1H,

37/51

S,	OH) . ¹³C	RMN (7 5	,5 Hz, CDC1₃) δ 171,5,	78,0, 77,5,	77,1,
68,	9, 67,4,	61,1.	HRMS (ESI) calc. para	C₂₄H₂5NiO₂Fe₂	m/ z:
477	,3974 encontrado	477,4213
	(b)	Síntese	de rótulo C	a partir	de

diferrocenilglicina

Rótulo C

Cloreto de oxalila (0,87 mL) em DCM seco (2 mL) foi adicionado em gotas por meio de um funil de gotejamento de equalização de pressão a uma solução agitada do derivado de di-ferrocenil glicina obtido em 3(a) acima em DCM seco (100 mL) a 0°C sob N₂. Ά reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 2 horas. Então o solvente foi removido e o produto de cloreto ácido foi retido em DCM seco (75 mL). 6-amino hexan-l-ol (0,56 g) em DCM seco (75 mL) foi adicionado em gotas por meio de um funil de gotejamento a 0°C sob N₂. A reação foi então agitada por 2 horas com aquecimento até a temperatura ambiente. A solução foi então lavada com NaHCO₃ (sat; 100 mL) e l,0M HC1 (100 mL) a fração orgânica foi seca sobre MgSO₄ então o solvente foi removido para gerar o produto (85%). Um sólido laranja/amarelo. ¹H RMN (250MHz, CDC13) Ô 4,11 (12H, s, FcCp) , 3,65 (4H, t, J = 6,0 Hz, CH2) , 3,55 (2H, s, CH2) , 1,48 - 1,18 (5h, m, CH2) . ¹³C RMN (75,5 Hz, CDC13) δ 173, 32, 77,80, 77,39, 76,90, 62,10, 38,85; 35,45, 32,02, 30,67,

26,75, 25,54, 25,44. m/z: 576.

A eletroquimica do rótulo do composto de produto C é

38/51 mostrada na Tabela 3 abaixo e no voltamograma da Fig. 4

Tabela 3: Atividade eletroquimica de rótulo C

Posição do pico (mV)	Altura do pico
410	6, 79e^-6
425	8,47e^-6
415	8,56e^-6

EXEMPLO 4: Procedimento sintético geral para a anexação de grupo funcional de fosforamidita

derivado de ferrocenil mostrado como um material de partida no esquema de reação acima 5 é ilustrativo, e pode ser substituído por um equivalente molar de qualquer um dos compostos feitos nos Exemplos 1 a 3 acima ou Exemplos 9 a 13 abaixo.

N,N-diisopropiletilamina (0,4 mL, 8,4 mmol) foi adicionada a uma solução agitada do derivado de ferroceno (2,1 mmol) em THF seco (25 mL) sob uma . atmosfera de nitrogênio. 2-cianoetildiisopropilclorofosforamidita (0,2 mL, 3,15 mmol) foi adicionada em gotas e a mistura resultante foi agitada por 15 minutos. Água MilliQ filtrada (200 mL) foi adicionada e a solução foi agitada por mais 30 minutos. Acetato de etila - Trietilamina (1:1, 25 mL) foi adicionado, e um precipitado se formou. A mistura foi lavada com NaCHCO₃ saturado (25 mL) e água MilliQ filtrada (25 mL). A fração orgânica foi seca sobre MgSO₄ e o solvente foi removido sob vácuo. O produto bruto foi então purificado por cromatografia em síiica gel (éter de

39/51 petróleo: acetato de etila 9:1).

Com o uso do processo acima descrito com o rótulo C como o material de partida de ferrocenil, um composto funcionalizado de fosforamidita de Fórmula IX foi obtido, possuindo os dados característicos listados abaixo.

^XH RMN (500MHz, CDC1₃) ò 4,23 (2H, s, Cp), 4,18 (2H, s, Cp), 4,13 (15H, s, Cp), 3, 90-3,82 (2H, m, CH₂) , 3,713,54 (4H, m, CH₂) , 3,44 (4H, s, CH₂) , 2,64 (4H, t, J = 6, CH₂) , 2,35 (2H, t, J = 6,5, CH₂) , 1,69 - 1,35 (85H, m, CH₂, CH) , 1,23 (12H, t, J = 7, CH₃) . ³¹P RMN (DEC) (202,5 Hz,

CDC1₃) δ 147,23. HRMS (ESI) calculado para C₃9H₅₃N₄O₃Fe₂Pi m/z: 768,0973 encontrado 768,1254.

EXEMPLO 5 - Uso de rótulo A ligado à sonda de oligonucleotideo

A síntese de oligonucleotideo foi realizada com o uso de técnicas padrão de síntese de fase sólida de oligonucleotideo, os nucleotídeos sendo adicionados em etapas à extremidade 5' do filamento do oligonucleotideo. Cada adição à cadeia de oligonucleotideo envolve quatro reações que são as etapas de des-bloqueio, ligação, capping e oxidação. Uma vez que a sequência de oligonucleotídeos tenha sido completada ao comprimento desejado, o rótulo eletroquímico foi adicionado por meio de uma ligação de

40/51 fosforamidita.

Método

A sequência alvo foi amplificada a partir de um alvo de Chlamydia trachomatis por um método padrão de PCR que usa iniciadores específicos para alvos 5' e 3' e uma etapa de uracil-DNA glicosilase (UDG) . As condições de PCR são resumidas na Tabela 1 abaixo. Quando a reação PCR estiver completa, a sonda de oligonucleotideo (rotulada com rótulo eletroquímico A no terminal 5' ) complementar a uma sequência intermediária em posição no alvo entre os iniciadores 5' e 3' foi adicionada aos produtos da reação de PCR e anelaram a seu alvo no amplicon. T7 exonuclease (que é específica para ácido nucleico de filamento duplo) foi adicionada ao tubo e incubada para permitir que ela faça a digestão do dsRNA. A sonda foi digerida pela T7 exonuclease na extensão em que ela foi anelada ao amplicon de PCR. A detecção eletroquímica foi então realizada, mostrando um pico em um potencial redox caracter!stico de 0,2 V para o nucleotídeo de produto de digestão rotulado com rótulo A.

Tabela 4

Componente	Concentração
Tampão de PCR	IX
MgCl₂	5mM
Mistura de dUTP	IX
Iniciador direto	0,04 μΜ
Iniciador reverse	0,3 μΜ
Taq	2,5 U
UNG	0,5 U

Protocolo de UNG: 37°C x 10 minutos

41/51

94°C x 10 minutos

Protocolo de PCR:

°C x 30 segundos

58°C x 45 segundos

72°C x 60 segundos

Etapas de repetição x 39 ciclos (40 ciclos no total)

72°C x 7 minutos

Resultados

Fig. 5 mostra a altura do pico, como uma corrente, no potencial redox conhecido (específico para o rótulo) para uma amostra positiva para Chlamydia trachomatis (o pico forte) e amostra negativa (ausência de pico).

Fig. 6 mostra uma análise de espectrometria de massa de um mononucleotídeo e um dinucleotídeo sintetizado com o rótulo eletroquimico A. A Fig. 7 é uma análise de espectrometria de massa do produto do ensaio, que mostra correlação exata a um mononucleotídeo ligado ao rótulo eletroquimico de rótulo A, a porção eletroquímica detectada no ensaio.

A Fig. 8 mostra os resultados de um experimento em que o alvo de Chlamydia é adicionado diretamente a uma reação de PCR em uma faixa de concentrações. Éster é amplificado com o uso de PCR, então detectado com o uso de uma sonda de oligonucleotideo de rótulo A.

A Fig. 9 mostra o resultado para um experimento em que uma faixa de concentrações do alvo de Chlamydia foi adicionada a um processo de extração de DNA (ou seja, não adicionado diretamente a PCR) e o resultado do processo de extração é amplificado com o uso de PCR, então detectado com o uso de uma sonda de oligonucleotideo rotulada com o

42/51 rótulo A.

EXEMPLO 6 - Comparação de performance a qPCR

a) A Fig. 10 mostra uma comparação entre detecção eletroquimica com o uso da sonda de rótulo A e um ensaio qPCR baseado em SYBR Green para Norovírus. Os materiais e protocolos são como se segue:

Bioline SensiMix dU

Bioline IX SYBR Green

0,3 μΜ iniciador direto

0,3 μΜ iniciador reverso

0,5 U UNG

Protocolo de UNG:

37°C x 10 minutos

60°C x 2 minutos

Protocolo de qPCR:

°C x 10 minutos (etapa de ativação de taq)

95°C x 15 segundos

45°C x 10 segundos

72°C x 10 segundos (aquisição de SYBR)

Repetir as últimas 3 etapas x 39 ciclos (40 ciclos no total)

47°C - 95°C em aumentos de 1°C (fusão final para checar amplificação não especifica)

Uma decimalização inversa do valor Ct foi usada para os resultados de qPCR para fornecer uma comparação direta aos resultados eletroquimicos.

Os dados mostram o limite de detecção para o ensaio eletroquimico a ser 200ag. 0 limite de detecção para o ensaio qPCR é mostrado como entre 2 e 20fg. Abaixo deste nível o valor de Ct é maior que 40-ciclos de valor de

43/51 corte, mostrado pela linha horizontal como o inverso de um valor Ct de 40. Os negativos de qPCR não se elevaram acima do limiar. Isso demonstra a sensibilidade vantajosa do ensaio eletroquimico com o uso do rótulo A.

b) Fig. 11 mostra uma comparação entre a detecção eletroquímica que usa a sonda de rótulo A e um ensaio qPCR baseado em SYBR Green para Streptococcus equi.

Os dados mostram que tanto o ensaio eletroquimico quanto o ensaio de qPCR são capazes de detecção à menor concentração de DNA testada neste experimento (20fg). A proporção sinal:ruído para a detecção eletroquímica a 20fg foi 4:1 neste experimento. 20fg se igual a 8 cópias genômicas de DNA de S. equi.

EXEMPLO 7 - Rótulo A diretamente ligado à proteína

a) Fig. 12a é uma varredura voltamétrica que usa rótulo A ligado diretamente a uma amina primária de uma IgG anti-cabra comercialmente disponível, com o uso de um NHS éster ativo (N-hidroxissuccinimida éster).

O esquema de reação generalizado a seguir ilustra a anexação do rótulo a uma amina livre, por exemplo, de um resíduo de lisina na IgG anti-cabra.

R—NH₂ +

Amina livre

NHS éster ativo conjugado de amida

p.ex. lisina de ácido R' carboxílico

IgG de cabra biotinilatada comercialmente disponível foi imobilizada em uma cavidade de microtitulação revestida

44/51 com estr.eptavidina. A IgG anti-cabra de rótulo A foi então incubada na cavidade que contém a IgG de cabra imobilizada, essa foi então removida com lavagem. Uma solução de papaina foi adicionada à cavidade e incubada para permitir a digestão do anticorpo secundário, com a solução resultante lida eletroquimicamente. O controle neste experimento seguiu o mesmo procedimento, mas a incubação final foi realizada em tampão apenas, sem papaina.

Fig. 12a mostra que um sinal eletroquimico no potencial de oxidação conhecido para o rótulo A é liberado quando papaina está presente, mas não está presente na ausência de papaina. Isso mostra que o rótulo A é diretamente ligado ao anticorpo neste ensaio e o sinal é apenas observado quando este anticorpo é digerido, liberando o rótulo eletroquimico.

b) Os dados na Fig. 12b usam o mesmo ensaio modelo como no Exemplo 7a) acima, exceto por um experimento de duração de tempo de digestão com papaina ser mostrado. Neste experimento o controle foi anticorpo secundário de rótulo A (IgG anti-cabra) que foi adicionado a uma cavidade sem anticorpo IgG de cabra imobilizado.

EXEMPLO 8 - Rótulo A ligado a microparticulas

Uma molécula de biotina foi ligada ao rótulo A. A biotinilação pode ser realizada em um sintetizador automático de oligonucleotideo ou com o uso de condições laboratoriais padrão por reação de rótulo de ferrocenil fosforamidita com N-hidroxissuccinimida (NHS) ésteres de biotina. Partículas paramagnéticas de estreptavidina foram lavadas x 3 (tampão de fosfato) e misturadas com rótulo biotinilatado, seguido por incubação por 1 hora em

45/51 temperatura ambiente com . mistura. As partículas foram lavadas x 2 (tampão de fosfato) e lavadas x 1 (tampão de PCR) . Elas foram ressuspensas em tampão final (tampão de PCR) . Após cada etapa de lavagem, os sobrenadantes foram testados para sinal eletroquímico, e, se necessário, a lavagem foi repetida até que o sobrenadante não mostrasse qualquer indicação de rótulo eletroquímico livre.

Essas partículas foram analisadas em uma faixa de concentrações para validar que o sinal eletroquímico observado fosse atribuível ao rótulo A liqado às partículas maqnéticas. Isso envolveu captura magnética das partículas e ressuspensão e uma faixa de volumes de tampão. Os resultados são mostrados na Fig. 13.

EXEMPLO 9 - Síntese de (N,N-diferrocenilmetil-2-aminoetoxi) etanol (rótulo D)

Fe

NaíOAQsBH

7EA, THF, rt. 12hrs

9,81 mmol)

Ferroceno carboxaldeído (2,1 g, (aminoetoxi) etanol (0,5 g, 4,27 mmol) em THF seco (25 mL) foram adicionados a um frasco seco em forno. Triacetoxiborohidreto de sódio (2,3 g, 10,90 mmol) foi adicionado em porções à solução. A reação foi deixada em repouso de um dia para o outro. A reação foi retida em acetato de etila (40 mL), a camada orgânica foi lavada com NaCO₃ (sat; 20 mL), Salmoura (20 mL) e água MilliQ (20 mL). A fração orgânica foi então seca sobre sulfato de magnésio e o solvente removido in vácuo. O produto bruto é então colocado em coluna com o uso de solução B: solução A a 9:1

46/51 (solução A: acetato·de etila 95% TEA 5%, solução B: éter de petróleo 40-60 95%, TEA 5%) para extrair o produto bruto rótulo D (sólido laranja escuro). 85% de rendimento ^XH RMN

(300MHz, CDC1₃) δ 4	,18 (2H,	S,	Cp) ,	4,17	(2H,	s, Cp), 4,	13
(15H, s, Cp), 3,66	(4H, t,	J =	6,25	Hz,	ch₂) ,	3,48 (2Η,	s,
CH₂) , 2,20 (2H, t,	J = 6,	CH₂)	. ¹³C	RMN	(75,5	Hz, CDC1₃)	δ

77,83, 77,40, 76,98, 70,58, 68,88, 63,36, 53,02, 52,17,

33,10, 27,43, 25,88. HRMS (ESI) calculado para C₂6H₃₃NiO₂Fe₂ m/z 501,1430 encontrado 501,1438.

A eletroquimica do rótulo D é mostrada na tabela abaixo e no voltamograma na Fig. 14:

Tabela 5: Atividade eletroquimica de rótulo D

Posição do pico (mV)	Altura do pico
242	9,31e'⁶
245	9,38e'⁶
239	9, 76e’⁶

EXEMPLO 10 - Sintese de di-ferrocenil glicina amino álcool N,N-2-(diferrocenilmetilamino)acetil-6-aminohexanol também denominado N-(6-hidroxilhexil)-2-((diferrocenilmetil) amino)-acetamida (rótulo E)

Cloreto de oxalila (0,87 mL) em DCM seco (2 mL) foi adicionado em gotas via um funil de gotejamento de equalização de pressão a uma solução agitada de diferrocenil glicina (obtido como descrito no Exemplo 3a) em DCM seco (100 mL) a 0°C sob N₂. A reação aquecida até a temperatura ambiente e foi. agitada por 2 horas. Então o

47/51 solvente foi removido e o produto de cloreto ácido foi retido em DCM seco (75 mL) 6-aminohexan-l-ol (0,56 g) em DCM seco (75 mL) foi adicionado em gotas via um funil de gotejamento a 0°C sob N₂. A reação foi então agitada por 2 horas com aquecimento até a temperatura ambiente. A solução foi então lavada com NaHCCU (sat; 100 mL) e l,0M HC1 (100 mL) . A fração orgânica foi seca sobre MgSO₄ então o solvente foi removido para gerar o produto rótulo E (85%). Um sólido laran j a/amarelo. ¹H RMN (250 MHz, CDCI3) δ 4,11 (12H, s, FcCp), 3,55 (4H, t, J = 6,0Hz, CH₂) , 3,31 (2H, s, CH₂), 1,48 - 1,18 (12H, m, CH₂) . ¹³C RMN (75,5 Hz, CDCI3) δ 173,32, 77,80, 77,39, 76,90, 62,10, 38,85, 35,45, 32,02,

30,67, 26,75, 25,54, 25,44. HRMS (ESI) calculado para

C₂₄H₂₅NiO₂Fe₂ m/z: 576,0988 encontrado 576, 1264.

A eletroquímica do rótulo E é ilustrada nos dados na tabela below.

Tabela 6: Atividade eletroquímica de rótulo E

Posição do pico	Altura do pico
504	6, 61e“⁶
506	5,51e~⁶
507	3,28e“⁶

EXEMPLO 116-(bis((1'-vinilferrocenil)1-metilferrocenil)amino)hexan-Ιοί

48/51 foi dissolvido

THF seco de tratado com 6-

(122 mg, 0,5 mmol) aminohexanmmol) trisacetoxiborohidreto sódio (205 mg,

1,25 mmol) sucessivamente. Ά solução foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. Depois deste tempo a reação foi extinta por adição de 10 cm³ de NaHCO3 saturado.

A camada orgânica foi separada, então a camada aquosa foi extraída com acetato de etila (3 x 10 cm³) . Os extratos orgânicos combinados foram secos sobre sulfato de magnésio, filtrados então concentrados in vacuo para gerar um sólido vermelho. 0 produto foi purificado por cromatografia em sílica, eluindo com 1:1 (acetato de etila:hexano) + 1% hidróxido de amônio para gerar o produto desejado como um óleo laranja 72 mg, em 50% de rendimento.

^XH RMN (500 Mhz; CDC1₃) δ_Η 6,38 (2H, dd, J 17,6, 10,7 =CH) ,

5,30 (2H, dd, J 10,7, 1,5, =CH₂) , 5,03 (2H, dd, J 10,7,

1,5, =CH₂) , 4,25 (4H, t, J 1,8, CpH) , 4,15 (4H, t, J 1,8,

CpH) , 4,07 (8H, s, CpH), 3,59 (2H, t, J 6,6, OCH₂) , 3,32 (4H, s, 2 x FeCH₂) , 2,23, (2H, app t, J 7,4, NCH₂) , 1,49 - l, 55 (2H, m, CH₂) , 1,33-1,39 (2H, m, CH₂) , 1,22-1, 33 (4H, m, CH₂) ; ¹³C RMN (125 Mhz; CDC1₃) ô_c 134,3, 111,3, 83,7,

83,6, 71,4, 69,2, 69,0, 67,2, 62,8, 52,1, 32,7, 27,1, 25,5; HRMS, m/z (ESI) 566, 1825 (1, 8%, [M+H] , C₃₂H₃₉Fe₂NO requer

9/51 *>

566,1808

EXEMPLO

metilferrocenil)amino)hexan-l-ol l'-Bromo ferroceno foi dissolvido em THF trisacetoxiborohidreto aminohexan-l-ol

0,144 (25 mg, sódio (59,3 mg, foi deixada em com 60,36 mmol) sucessivamente. A solução temperatura ambiente de um tempo a reação foi saturado. A camada aquosa foi extraída extinta

0,29 mmol) mmol) agitação em dia para o outro.

Depois deste por adição de 5 cm³ de NaHCO₃ orgânica foi com acetato separada, então a camada de etila (3 x 10 cm³) . Os extratos orgânicos combinados foram secos magnésio, filtrados então um sólido vermelho. O cromatografia etila:hexano) desejado como (8H, s,

OCH₂) , em sílica, concentrados in +1% hidróxido produto foi eluindo com sobre sulfato de vacuo para gerar purificado por

1:1 (acetato de de amônio para gerar o produto um óleo amarelo 17 mg, em 17% (500 Mhz; CDC1₃) δ_Η 4,32, (4H, t, J

3,46 (4H, s, FcCH₂N) , 2,31 (2H,

1,45-1,58 (4H, m, CH₂) , 1,27-1,36 (4H, m,

Mhz; CDC1₃) ô_c 78,4, 72,9, 70,8, 70,5, de rendimento.

1,8, F_CH) , 4,21 t, J

CH₂) ;

68,6,

7,1, NCH₂), ¹³C RMN (125

67,9, 63, 1,

62,8, 52,1, 33,0, 27,3, 26,0; HRMS, m/z (ESI) 669,7929

50/51 (2,7%, [Μ+Η] , C₂₈H₃₄Fe₂BR²NO requer 669, 9705); Potencial do eletrodo: 437 mV.

EXEMPLO 13: 6-(bis((2-metxlferrocenil)metil)amino)hexan!-ol OH

Metilferrocenocarboxaldeído (1 g, 5 mmol) foi dissolvido em THF seco (30 cm³). 6-aminohexan-l-ol (0,25 g,. 2,13 mmol) foi adicionado. Então triacetoxiborohidreto de sódio (1,3 g, 6,16 mmol) foi adicionado à mistura da reação. A solução foi agitada sob nitrogênio em temperatura ambiente de um dia para o outro. Acetato de etila (20 cm³) e 1M NaOH (20 cm³) foram então adicionados e ã camada orgânica foi então extraída com NaHCO₃ saturado (25 cm³) , salmoura (25 cm³) e água filtrada Milli Q (25 cm³) então seca sobre sulfato de magnésio e o solvente removido in vacuo para gerar um óleo laranja. O produto bruto é então colocado em coluna com o uso de solução B: solução A a 9:1 (solução A: acetato de etila 95% TEA 5%, solução B: éter de petróleo 40-60 95%, TEA 5%) para extrair o produto bruto (óleo laranja). (0,95,

65%) .

^XH RMN (300MHz; CDC1₃) δ_Η 4,18 (2H, s, CpH) , 4,17 (2H, s,

CpH) , 4,13 (15H, s, CpH), 3,66 (4H, t,' J 6,25, CH₂) , 3,48 (2H, s, CH₂) , 2,36 (3H, s, CH₃) , 2,20 (2H, t, J 6,1, CH₂) , 1,59-1,31 (6H, m, CH₂) . ¹³C RMN (75,5 Hz; CDC1₃) ô_c 77,8, 77,4, 76,9, 70,5, 68,9, 63,3, 53,0, 52,1, 33,1, 27,4, 25,8, 12,4; HRMS, m/z (ESI) 539, 8156 (10%, [M+H] , C₃₀H₄₇NiOiFe₂

51/51 requer 539,8232); potencialdo eletrodo: 330 mV.

Tabela 7: Efeito sobre o potencial do eletrodo de substitulntes sobre porções ferrocenil de rótulo A

Exemplo	Substituinte de Fc	Potencial eletrodo	do
1	Nenhum	275 mV
2	Dimetilaminometil	380 mV
11	1'-vinil	298 mV
12	1'-bromo	437 mV
13	2-metil	330 mV

Os dados na tabela acima ilustram como a inclusão de um substituinte sobre as porções ferrocenil e a seleção daquele substituinte podem ser usados para influenciar o potencial do eletrodo. Isso permite a detecção eletroquimica dos compostos a ser realizada sob várias diferentes condições, por exemplo, seleção de um potencial 10 de medição ótimo ou evitando condições sob as quais a sensibilidade da medição pode ser comprometida por interferência com impurezas que podem estar presentes. Além disso, o uso de rótulos com diferentes potenciais de eletrodo permite o desenvolvimento de reações multiplex, em 15 que mais de uma determinação pode ser realizada na mesma amostra.

Claims

1. Uso como um rótulo em um ensaio eletroquímico de um composto de fórmula geral I:

Fc-(X)-N-(Y)-Fc’ i (Z)-R caracterizado pelo fato de que:

Fc é uma porção ferrocenil substituída ou não substituída,

X é uma cadeia Ci a C6 alquileno que é opcionalmente interrompida por -0-, -S-, ou -NR⁵ -, em que R⁵ representa hidrogênio ou Ci a C6 alquil;

Y é uma cadeia C_x a C₆ alquileno que é opcionalmente interrompida por -0-, -S-, ou -NR⁵ -, em que R⁵ representa hidrogênio ou Ci a C₆ alquil;

Z é uma cadeia Ci a C₁₂ alquileno que pode ser opcionalmente substituída e/ou pode ser opcionalmente interrompida por -0-, -S-, cicloalquil, -CO-, CONR¹-,

NR¹CO- ou -NR¹-, em que R¹ representa hidrogênio ou Ci a C₄alquil; e

R é um grupo encadeador.

2/11 interrompido por oxigênio.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que:

X representa Ci a interrompido por\oáigênio;

Y representa C_x a interrompido por oxigênio,

Z representa Ci a

Cg-alquileno opcionalmente Cg-alquileno opcionalmente C₈ alquileno opcionalmente

3/11 em que:

Fc é uma porção ferrocenil substituída ou não substituída,

X é uma cadeia Cl a Cê alquileno que é opcionalmente

interrompida por —0— , -S-, ou -NR -, em que R representa hidrogênio ou C_x a C₆ alquil; Y é uma cadeia Ci a Cê alquileno que é opcionalmente interrompida por —0— S -, ou -NR⁵ -, em que R⁵ representa hidrogênio ou C_x a Cê alquil;

A-L-F .

em que A representa

Fç-(X)-N-(Y)-Fc’

Z)em que Fc, Fc' , X, Y representa uma porção de uma porção encadeadora.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que:

X é -(CH₂)_x, - em que x é 1 ou 2; Y é - (CH₂) _y - em que y é 1 ou 2; z é (CH₂)_Z em que z é de 1 a 8. 4 . Uso, de acordo com qualquer uma das

reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que Fc e Fc' são o mesmo e X e Y são o mesmo.

4/11

A-L-F ' ΠΙ em que A, F e L são como definido na reivindicação 8; com um substrato para formar um substrato rotulado.

5 sob condições para permitir a hibridização entre a sonda e amplicon, seguido pela etapa de degradação seletiva da sonda hibridizada ou não hibridizada, em que a referida sonda é rotulada com um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 10 32, e em que o método fornece a etapa de medição de uma atividade eletroquimica do composto que rotula a sonda em que a referida atividade eletroquimica é dependente quantitativamente ou qualitativamente da extensão da degradação da sonda.

5/11 substituída, e pode ser a mesma ou diferente de Fc;

X é uma cadeia Ci a C₆ alquileno que é opcionalmente interrompida por -O-, -S-, ou -NR⁵ -, em que R⁵ representa hidrogênio ou Ci a C₆ alquil;

Y é uma cadeia Ci a C6 alquileno que é opcionalmente interrompida por -O-, -S-, ou -NR⁵ -, em que R⁵ representa hidrogênio ou C₄ a C₆ alquil;

Z é uma cadeia Cl a C_x2 alquileno que pode ser opcionalmente substituída e/ou pode ser opcionalmente interrompida por -O-, -S-, cicloalquil, -CO-, CONR¹-,

NR^XCO- ou -NR¹- em que R¹ representa hidrogênio ou Ci a C₄álquil;

L representa uma porção encadeadora;

e em que F representa uma porção de funcionalização para reação com um substrato para anexação da porção de rotulagem ao substrato.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o ensaio é para a detecção de um substrato

eletroquimicamente rotulado.

6/11 com qualquer uma das reivindicações 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a porção de funcionalização é derivada de uma porção fosforamidita.

17. Substrato rotulado para uso em um ensaio eletroquimico, o substrato rotulado caracterizado pelo fato de ser de fórmula geral Illa:

A-L-F~[S] Hla em que A representa

Fc-(X)-N-(Y)-Fc* | Ia (Z)em que:

Fc é uma porção ferrocenil substituída ou não substituída,

X é uma cadeia Ci a C₆ alquileno que é opcionalmente interrompida por -O-, -S-, ou -NR⁵ -, em que R⁵ representa hidrogênio ou Ci a Cê alquil;

Y é uma cadeia Ci a C₆ alquileno que é opcionalmente interrompida por -O- S -, ou -NR⁵ -, em que R⁵ representa hidrogênio ou Ci a C6 alquil;

Z é uma cadeia Ci a C12 alquileno que pode ser opcionalmente substituída e/ou pode ser opcionalmente interrompida por -O-, -S-, cicloalquil, -CO-, CONR¹-,

NR^XCO- ou -NR¹- em que R¹ representa hidrogênio ou C_x a C4 alquil;

L-F' representa uma porção de ligação; e [S] representa um substrato.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o ensaio é para a detecção um substrato biológico selecionado de nucleotideos, nucleosideos, oligonucleotídeos, e polinucleotídeos.

7/11

18. Substrato rotulado, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o substrato é selecionado de moléculas biológicas, microparticulas e nanoparticulas,..

19. Substrato rotulado, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o substrato é uma molécula biológica selecionada de aminoácidos, nucleotideos, nucleosideos, açúcares, peptideos, proteínas, oligonucleotideos, polinucleotideos, e carboidratos.

20. Substrato rotulado, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o substrato é selecionado de nucleotideos, nucleosideos, oligonucleotideos, polinucleotideos.

21. Substrato rotulado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17, 18, 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que o substrato é ou compreende um oligonucleotideo. 22. Substrato rotulado, de acordo com qualquer uma

das reivindicações 17, 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que o substrato é selecionado de aminoácidos, açúcares, peptideos, e proteínas.

23. Kit de ensaio para a determinação da presença de um alvo de ensaio, caracterizado pelo fato de que o kit de ensaio compreende um substrato rotulado de acordo com qualquer uma das reivindicações 17, 18, 19, 20, 21 ou 22.

24. Composto de acordo com fórmula geral I

Fc-(X)-N-(Y)-Fc’ i (Z)-R caracterizado pelo fato de que:

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o ensaio é para a detecção um substrato biológico selecionado de aminoácidos, peptideos, e proteínas.

8/11

Fc é uma porção ferrocenil substituída,

X é uma cadeia C_x a Cê alquileno que é opcionalmente interrompida por -O-, -S-, ou -NR⁵ -, em que R⁵ representa hidrogênio ou Ci a alquil;

Y é uma cadeia Ci a Cg alquileno que é opcionalmente interrompida por -0-, -S-, ou -NR⁵ -, em que R⁵ representa hidrogênio ou Ci a C₆ alquil;

Z é uma cadeia Ci a. C₁₂ alquileno que pode ser opcionalmente substituída e/ou pode ser opcionalmente interrompida por -O-, -S-, cicloalquil, -CO-, CONR¹-,

NR¹CO- ou -NR¹- em que R¹ representa hidrogênio ou Ci a C₄alquil; e R é um grupo encadeador.

25. Composto, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que cada porção ferrocenil é substituída por pelo menos um substituinte selecionado de halo, Ci a C₄-alquil, haloalquil, aril, C₄ a C₄ 25 alquenil, e ciano..

26. Composto de acordo com fórmula geral I

Fc-(X)-N-(Y)-Fc’ i

I (Z)-R caracterizado pelo fato de que:

Fc e Fc' são uma porção ferrocenil não substituída,

Y é é uma cadeia Ci a Cg alquileno que é opcionalmente interrompida por -0-, -S-, ou -NR⁵ -, em que R⁵ representa

8. Método para a fabricação de um composto de rotulagem funcionalizado que compreende uma porção de rótulo para uso em um ensaio eletroquimico, caracterizado pelo fato de que compreende a reação de um composto de fórmula geral I:

Fc-(X)-N-(Y) —Fc’ \ i (Z)-R ' ' '

9/11 hidrogênio ou Ci a C₆ alquil;

Z é é uma cadeia C₆ a C₁₂ alquileno ou é um Ci a C_i2alquileno que é substituído por um ou mais substituintes e/ou é interrompido por uma porção selecionada de -0-, -S-, cicloalquil, -CO-, CONR¹-, -NR¹CO- ou -NR¹- em que R¹representa hidrogênio ou Ci a C₄ alquil; e

R é um grupo encadeador.

27. Composto, de acordo com qualquer umadas reivindicações 24, 25 ou 26, caracterizado pelo fatode que: X representa -(CH₂)_X - em que x é de 1 a 6;e Y representa -(CH₂)_y - em que y é de 1 a 6.

28. Composto, de acordo com qualquer umadas reivindicações 24, 25, 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que Z representa C₆ a C₈ alquileno opcionalmente interrompido por oxigênio.

29. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,

9. Método Dara a

Z é uma cadeia C_x a C_x2 alquileno que pode ser opcionalmente substituída e/ou pode ser opcionalmente interrompida por -O-, -S-, cicloalquil, -CO-, CONR¹-,

NR¹CO- ou -NR¹- em que R¹ representa hidrogênio ou C_x a C₄alquil; e

III

Ia ' e Z são como acima definido, F funcionalização; e L representa manufatura de um substrato rotulado, caracterizado pelo fato de que compreende a reação de um composto de fórmula geral III:

10/11

⁰ M • R» l Fe/ o /5¾ ⁶ OH OH OH - ^-Br j—-·· ir-L .'Uj~Tit2~.

ou

31. N,N-diferrocenilmetil-6-aminohexanol um análogo deste, caracterizado pelo fato de que ambos os grupos ferrocenil são substituídos por um ou mais substituintes.

32. Substrato rotulado, caracterizado pelo fato de que compreende uma porção de rotulagem derivada de N,Ndiferrocenilmetil-6-aminohexanol ou de um análogo deste em que ambos os grupos ferrocenil são substituídos por um ou

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o substrato é selecionado de aminoácidos, 20 nucleotideos, nucleosideos, açúcares, peptideos, proteínas, oligonucleotídeos, polinucleotídeos, carboidratos, microparticulas e nanopartículas.

11/11 mais substituintes.

*

33. Métodos de detecção a ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende o contato do ácido nucleico com uma sonda de ácido nucleico complementar

11. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o substrato é um substrato biológico selecionado de nucleotideos, nucleosideos, oligonucleotídeos, e polinucleotídeos.

12, 13 ou

12. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o substrato é um substrato biológico selecionado de aminoácidos, peptideos, e proteínas.

13. Composto de rotulagem funcionalizado para uso nos métodos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9, 10, 11 ou 12, o composto de rotulagem funcionalizado caracterizado pelo fato de ter a fórmula geral III:

A-L-F. ΙΠ em que

A representa uma porção de rotulagem de fórmula geral Ia:

Fc-(X)-N-(Y)-Fc’ | Ia (Z)em que:

Fc é uma porção ferrocenil substituída ou não substituída, Fc' é uma porção ferrocenil substituída ou não

14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,24, 25, 26, 27 ou

28, caracterizado pelo fato de que o grupo encadeador R compreende um grupo capaz de reagir com um grupo compatível de uma porção de funcionalização ou de um substrato para anexar o composto à referida porção de funcionalização ou referido substrato.

30. Composto, caracterizado pelo fato de ser selecionado de:

Fe A

14, caracterizado pelo fato de que o grupo de funcionalização F é selecionado de grupos succinimidil éster, grupos fosforamidita, grupos maleimida, grupos biotina e azida.

16. Composto de rotulagem funcionalizado, de acordo

14. Composto de rotulagem funcionalizado, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que F representa uma porção de funcionalização para reação com um substrato selecionado de aminoácidos, nucleotídeos, nucleosídeos, açúcares, peptídeos, proteínas, olígonucleotídeos, polinucleotídeos, carboidratos, micropartículas e nanopartículas.

15. Composto de rotulagem funcionalizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9, 10, 11,

15 34. Métodos de detecção um aminoácido, peptideo ou proteína rotulados com um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de medição da atividade eletroquimica do composto.