EA026116B1 - Ферроценовые метки для электрохимического анализа и их применение в аналитических способах - Google Patents
Ферроценовые метки для электрохимического анализа и их применение в аналитических способах Download PDFInfo
- Publication number
- EA026116B1 EA026116B1 EA201390916A EA201390916A EA026116B1 EA 026116 B1 EA026116 B1 EA 026116B1 EA 201390916 A EA201390916 A EA 201390916A EA 201390916 A EA201390916 A EA 201390916A EA 026116 B1 EA026116 B1 EA 026116B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- alkyl
- substituted
- cyano
- halo
- groups
- Prior art date
Links
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims description 23
- 238000007812 electrochemical assay Methods 0.000 title abstract 2
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N ferrocene Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 15
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 91
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 90
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 36
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 36
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims abstract description 36
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 16
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 claims abstract description 11
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 64
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 claims description 60
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 46
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 46
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 claims description 43
- 125000004043 oxo group Chemical group O=* 0.000 claims description 43
- -1 succinimidyl Chemical group 0.000 claims description 40
- 150000002148 esters Chemical group 0.000 claims description 37
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 34
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 34
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 34
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 33
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 32
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 31
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 29
- 125000003161 (C1-C6) alkylene group Chemical group 0.000 claims description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 27
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 27
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical group CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 23
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 22
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 15
- 238000000840 electrochemical analysis Methods 0.000 claims description 14
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 14
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 claims description 14
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 14
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 14
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 13
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 13
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 13
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 12
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 11
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 claims description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 10
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 10
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- SXADIBFZNXBEGI-UHFFFAOYSA-N phosphoramidous acid Chemical group NP(O)O SXADIBFZNXBEGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 claims description 4
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 4
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide group Chemical group [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 claims 48
- 125000006656 (C2-C4) alkenyl group Chemical group 0.000 claims 25
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 claims 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 abstract description 14
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 abstract description 12
- 241000845077 Iare Species 0.000 abstract 1
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 33
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 238000000835 electrochemical detection Methods 0.000 description 15
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 14
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 13
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 11
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 9
- SUTWPJHCRAITLU-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexan-1-ol Chemical compound NCCCCCCO SUTWPJHCRAITLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 125000004399 C1-C4 alkenyl group Chemical group 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102100030817 Liver carboxylesterase 1 Human genes 0.000 description 7
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 7
- 101710169844 Sesquipedalian-1 Proteins 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 6
- 102100029721 DnaJ homolog subfamily B member 1 Human genes 0.000 description 5
- 101000866018 Homo sapiens DnaJ homolog subfamily B member 1 Proteins 0.000 description 5
- 235000019502 Orange oil Nutrition 0.000 description 5
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 5
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 5
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 description 5
- 239000010502 orange oil Substances 0.000 description 5
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 5
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 5
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 5
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 239000012321 sodium triacetoxyborohydride Substances 0.000 description 5
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 5
- MBVFRSJFKMJRHA-UHFFFAOYSA-N 4-fluoro-1-benzofuran-7-carbaldehyde Chemical compound FC1=CC=C(C=O)C2=C1C=CO2 MBVFRSJFKMJRHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001318 differential pulse voltammogram Methods 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 4
- CTSLXHKWHWQRSH-UHFFFAOYSA-N oxalyl chloride Chemical compound ClC(=O)C(Cl)=O CTSLXHKWHWQRSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 4
- 238000001075 voltammogram Methods 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 3
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 3
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 3
- 150000002332 glycine derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 125000001188 haloalkyl group Chemical group 0.000 description 3
- ZSIAUFGUXNUGDI-UHFFFAOYSA-N hexan-1-ol Chemical compound CCCCCCO ZSIAUFGUXNUGDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 2-[2,4-di(pentan-2-yl)phenoxy]acetyl chloride Chemical compound CCCC(C)C1=CC=C(OCC(Cl)=O)C(C(C)CCC)=C1 NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QWTBDIBOOIAZEF-UHFFFAOYSA-N 3-[chloro-[di(propan-2-yl)amino]phosphanyl]oxypropanenitrile Chemical compound CC(C)N(C(C)C)P(Cl)OCCC#N QWTBDIBOOIAZEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-diisopropylethylamine Substances CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MZRVEZGGRBJDDB-UHFFFAOYSA-N N-Butyllithium Chemical compound [Li]CCCC MZRVEZGGRBJDDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- VYZWHEDTCLLQQC-UHFFFAOYSA-N [C-]1(C=CC=C1)C([C-]1C=CC=C1)NCC(=O)N1CCC(CC1)CO.[CH-]1C=CC=C1.[Fe+2].[CH-]1C=CC=C1.[Fe+2] Chemical compound [C-]1(C=CC=C1)C([C-]1C=CC=C1)NCC(=O)N1CCC(CC1)CO.[CH-]1C=CC=C1.[Fe+2].[CH-]1C=CC=C1.[Fe+2] VYZWHEDTCLLQQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 125000003158 alcohol group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001414 amino alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 125000004103 aminoalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 2
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000001903 differential pulse voltammetry Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 125000003709 fluoroalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 2
- 108010055863 gene b exonuclease Proteins 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- 125000000592 heterocycloalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 2
- 238000004832 voltammetry Methods 0.000 description 2
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- JPIGSMKDJQPHJC-UHFFFAOYSA-N 1-(2-aminoethoxy)ethanol Chemical compound CC(O)OCCN JPIGSMKDJQPHJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical group OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- DRDVSWLNCPMDMD-UHFFFAOYSA-N 6-[bis(cyclopenta-1,4-dien-1-ylmethyl)amino]hexan-1-ol cyclopenta-1,3-diene iron(2+) Chemical compound [Fe++].[Fe++].c1cc[cH-]c1.c1cc[cH-]c1.OCCCCCCN(C[c-]1cccc1)C[c-]1cccc1 DRDVSWLNCPMDMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YYJDJRVFVIUUJC-UHFFFAOYSA-N 6-[bis[(2-methylcyclopenta-1,3-dien-1-yl)methyl]amino]hexan-1-ol cyclopenta-1,3-diene iron(2+) Chemical compound [Fe++].[Fe++].c1cc[cH-]c1.c1cc[cH-]c1.C[c-]1cccc1CN(CCCCCCO)Cc1ccc[c-]1C YYJDJRVFVIUUJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BEUBVGDJJXEUCW-UHFFFAOYSA-N Br[C-]1C=CC=C1.C(=O)[C-]1C=CC=C1.[Fe+2] Chemical compound Br[C-]1C=CC=C1.C(=O)[C-]1C=CC=C1.[Fe+2] BEUBVGDJJXEUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- MGYXAZCTCRPOSZ-UHFFFAOYSA-N CC=1[C-](C=CC1)C=O.[CH-]1C=CC=C1.[Fe+2] Chemical compound CC=1[C-](C=CC1)C=O.[CH-]1C=CC=C1.[Fe+2] MGYXAZCTCRPOSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150108928 CCC1 gene Proteins 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940122426 Nuclease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229910019567 Re Re Inorganic materials 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006943 Uracil-DNA Glycosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010072685 Uracil-DNA Glycosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 150000001615 biotins Chemical class 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- GPRSOIDYHMXAGW-UHFFFAOYSA-N cyclopenta-1,3-diene cyclopentanecarboxylic acid iron Chemical compound [CH-]1[CH-][CH-][C-]([CH-]1)C(=O)O.[CH-]1C=CC=C1.[Fe] GPRSOIDYHMXAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ISDNRMKSXGICTM-UHFFFAOYSA-N cyclopenta-1,3-diene;1-cyclopenta-2,4-dien-1-yl-n,n-dimethylmethanamine;iron(2+) Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.CN(C)CC1=CC=C[CH-]1 ISDNRMKSXGICTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGBAECKRTWHKHC-UHFFFAOYSA-N cyclopenta-1,3-diene;1-ethenylcyclopenta-1,3-diene;iron(2+) Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.[CH2-]C=C1C=CC=C1 VGBAECKRTWHKHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 125000006222 dimethylaminomethyl group Chemical group [H]C([H])([H])N(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 1
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- SRCZQMGIVIYBBJ-UHFFFAOYSA-N ethoxyethane;ethyl acetate Chemical compound CCOCC.CCOC(C)=O SRCZQMGIVIYBBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 125000002757 morpholinyl group Chemical group 0.000 description 1
- CSYNQJPENMOLHR-UHFFFAOYSA-N n,n-diethylethanamine;ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O.CCN(CC)CC CSYNQJPENMOLHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 125000003386 piperidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 229920000307 polymer substrate Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 125000006413 ring segment Chemical group 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000003335 steric effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 238000004073 vulcanization Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
- G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
- G01N27/3276—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a hybridisation with immobilised receptors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F17/00—Metallocenes
- C07F17/02—Metallocenes of metals of Groups 8, 9 or 10 of the Periodic Table
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
Abstract
Соединения общей формулы (I)применяются в качестве меток в электрохимическом анализе, где в формуле (I) Fc и Fc' представляют собой замещенные или незамещенные ферроценильные составляющие, X представляет собой С1-С6 алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается группами -О- или -NH-, Y представляет собой С1-С6 алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается группами -О- или -NH-, Z представляет собой С1-С12 алкиленовую цепь, которая может быть необязательно замещена и/или может необязательно прерываться группами -О-, -S-, циклоалкил, -СО-, -CONR-, -NRCO- или -NR-, в которой Rпредставляет собой водород или С1-С4 алкил и R представляет собой линкерную группу. Соединения (I) применяются для получения меченых субстратов, а также функционализированных соединений для получения меченых субстратов.
Description
Изобретение относится к электрохимическим способам обнаружения. Более конкретно, изобретение относится к электрохимическим анализам, к электрохимически активным меткам для применения в электрохимических способах обнаружения и к их применению.
Уровень техники
Обнаружение определенных биологических молекул играет важную роль во многих аспектах жизни. Например, в медицинской области,повсеместно имеется необходимость в обнаружении бактериальных или вирусных патогенов или биологических молекул. Другие области, в которых чувствительные анализы являются существенными, включают пищевую промышленность и производство напитков.
В \νϋ 03/074731 раскрывается способ зондирования нуклеиновой кислоты. Раствор нуклеиновой кислоты вводится в контакт с олигонуклеотидным зондом с электрохимически активным маркером. Происходит, по меньшей мере, частичная гибридизация зонда с любой комплементарной целевой последовательностью, которая может присутствовать в растворе нуклеиновой кислоты. После ферментативного разрушения зонда нуклеиновой кислоты электрохимически получают информацию относительно маркера. Соединения для применения в этом способе также раскрываются.
В νθ 2005/05657 раскрывается способ обнаружения протеазной активности, в котором раствор образца вводится в контакт с протеазным субстратом с электрохимически активным маркером, при обеспечении условий, при которых любая протеаза, которая может присутствовать в образце, может расщеплять протеазный субстрат, и электрохимически получат информацию относительно электрохимически активного маркера. Определенные новые соединения для применения в этом процессе также были раскрыты.
Все еще существует необходимость в разработке меток, которые способны обнаруживать присутствие в маленьких концентрациях биологических субстратов или индикаторов, например нуклеиновых кислот (в выделенной форме или в форме более крупных молекул, например природных или синтетических олигонуклеотидов), или аминокислот (в выделенной форме или в форме более крупных молекул, например, природных или синтетических пептидов). В частности, все еще существует необходимость в новых метках с различными окислительными потенциалами, таким образом, расширяя диапазон доступных возможных анализов и расширяя границы развития мультиплексных реакций.
Сущность изобретения
Изобретение обеспечивает применение соединения общей формулы I в качестве метки в электрохимическом анализе
Рс - (X)-Ν-(У)-Рс’
I (Ζ)-Κ 1; в которой Рс представляет собой замещенную или незамещенную ферроценильную составляющую,
Рс' представляет собой замещенную или незамещенную ферроценильную составляющую и может быть такой же как группа Рс или отличной от нее;
X представляет собой С1-С6 алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается группами -О-, -8- или -ΝΚ5-, в которой К5 представляет собой водород или С1-С6 алкил;
Υ представляет собой С1-С6 алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается группами -О-, -8- или -ΝΚ5-, в которой К5 представляет собой водород или С1-С6 алкил;
Ζ представляет собой С1-С12 алкиленовую цепь, которая может быть необязательно замещена и/или может необязательно прерываться группами -О-, -8-, циклоалкил, -СО-, -ΡΟΝΚ1-, -ΝΚ'ΡΟ- или -ΝΚ1-, в которой К1 представляет собой водород или С1-С4 алкил; и
К представляет собой линкерную группу.
Соединения, применяемые согласно настоящему изобретению, как было обнаружено, представляют собой эффективные метки для применения в электрохимическом анализе. В частности, соединения могут применяться для получения меченых субстратов. Молекулы, рассматриваемые в качестве субстратов, которые могут быть помечены, включают, но без ограничения к этому, аминокислоты, нуклеотиды, нуклеозиды, сахара, пептиды, белки, олигонуклеотиды, полинуклеотиды, углеводы и производные любой из этих молекул. Другие субстраты, которые могут быть помечены с применением соединений согласно настоящему изобретению включают латексные/парамагнитные микрочастицы и наночастицы. Обеспечивающие метку соединения общей формулы I и помеченые молекулы, включающие метки, полученные из обеспечивающих метки соединений, потенциально пригодны в электрохимических методиках, в которых их электрохимические характеристики могут применяться для получения информации о метках и их окружении. Например, соединения согласно настоящему изобретению могут найти применение в способе, как описано в νΟ 03/074731, или в способе, как описано в νΟ 2005/05657.
В соединениях, применяемых согласно настоящему изобретению, предпочтительно, когда X представляет собой С1-С6-алкилен, необязательно прерывающийся кислородом; Υ представляет собой С1-С6-алкилен, необязательно прерывающийся кислородом; и Ζ представляет собой С1-С8 алкилен, необязательно прерывающийся кислородом. X предпочтительно представляет собой группу -(СН2)Х-, в ко- 1 026116 торой х равно от 1 до 6, предпочтительно от 1 до 4, особенно предпочтительно от 1 до 2; или С1-С6алкилен, прерывающийся кислородом, например -(СН2)3-О-СН2-, -(СН2)2-О-(СН2)2- или -СН2-О-(СН2)3-. Υ предпочтительно представляет собой группу -(СН2)у -, в которой у равно от 1 до 6, предпочтительно от 1 до 4, особенно 1 или 2; или С1-С6-алкилен, прерывающийся кислородом, например -(СН2)3-О-СН2-, -(СН2)2-О-(СН2)2- или -СН2-О-(СН2)3-. Предпочтительно X и Υ являются одинаковыми. Предпочтительно Рс и Рс' являются одинаковыми, и X и Υ являются одинаковыми. Предпочтительно Ζ представляет собой -(СН2)2- группу, в которой ζ равно от 1 до 8, ζ предпочтительно равно от 1 до 6, особенно предпочтительно от 2 до 6; или представляет собой С1-С8 алкилен, прерывающийся кислородом, например, -((СН2)2-О-(СН2)3- или -(СН2)2-О-(СН2)3-. В одном предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения X представляет собой группу -(СН2)Х-, в которой х равно 1 или 2; Υ представляет собой группу -(СН2)у-, в которой у равно 1 или 2; и Ζ представляет собой группу (ΟΗ2)ζ-, в которой ζ равно от 1 до 8. Когда X и Υ представляют собой алкиленовую цепь, прерывающуюся -ΝΚ5-, К5 предпочтительно представляет собой водород или С1-С4 алкил, более предпочтительно водород.
В одном предпочтительном варианте выполнения настоящее изобретенее обеспечивает применение в качестве электрохимической метки соединения общей формулы II
Рс-(СН2)Х-N - (СН2)у - Рс' 1 тг (СН2)г - К и’ в которой Рс представляет собой замещенную или незамещенную ферроценильную составляющую,
Рс' представляет собой замещенную или незамещенную ферроценильную составляющую и может быть такой же как Рс или отличной от нее;
х равно 1 или 2; у равно 1 или 2; ζ равно от 1 до 8;
К представляет собой линкерную группу.
Предпочтительно х и у оба равны 1.
Ферроценильные составляющие в соединениях общей формулы I или общей формулы II могут представлять собой незамещенные ферроценилы или одна или обе могут быть замещены как раскрывается ниже. Ферроценильные составляющие предпочтительно являются одинаковыми, и поэтому предпочтительно, что когда Рс замещена одним или более заместителями, Рс' имеет такие же заместители в таких же положениях.
За исключением когда противное следует из контекста, термин субстрат, как применяется во всем описании настоящего изобретения, включает как субстраты природного происхождения, так и синтетические субстраты. Синтетические субстраты включают синтетические аналоги субстратов природного происхождения. Субстраты включают единичные нуклеотиды и единичные аминокислоты. В случае анализа на основе расщепления субстрата, например ферментом, единичная аминокислота может рассматриваться как субстрат, потому что, хотя у нее нет внутренней связи, способной расщепляться протеазным ферментом, такая связь может быть сформирована путем присоединения маркера.
Настоящее изобретение обеспечивает способ обнаружения химического объекта с применением соединения согласно настоящему изобретению. Применением в электрохимическом анализе согласно настоящему изобретению может быть, например, применение в анализе на обнаружение электрохимически меченого субстрата. Электрохимическим анализом может быть, например, анализ на обнаружение количества электрохимически меченого субстрата. Анализом может предпочтительно быть анализ на обнаружение или определение количества меченого субстрата, где меченый субстрат выбирается из аминокислот, нуклеотидов, нуклеозидов, сахаров, пептидов, белков, олигонуклеотидов, полинуклеотидов, углеводов, микрочастиц и наночастиц. В определенных предпочтительных вариантах выполнения настоящего изобретения анализом является обнаружение или определение количества меченого субстрата, в котором меченый субстрат выбирается из нуклеотидов, нуклеозидов, олигонуклеотидов и полинуклеотидов. В другом предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения анализом является аккау обнаружение или определение количества меченого субстрата, в котором меченый субстрат выбирается из аминокислот, пептидов и белков.
В целях присоединения к субстратам метка может быть функционализирована путем добавления функционализирующей группы. Таким образом, настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает функционализированные производные, содержащие составляющую, полученную из соединений согласно настоящему изобретению, присоединенных к функционализирующей группе, подходящей для усиления присоединения к субстрату.
- 2 026116
Настоящее изобретение также обеспечивает способ получения функционализированного вносящего метку соединения, содержащего обеспечивающую метку составляющую, для применения в электрохимическом анализе, включающий реакцию соединения общей формулы I
Рс-(X)-Ν-(Υ)-Рс’
I (Ζ)-κ 1; в которой Рс представляет собой замещенную или незамещенную ферроценильную составляющую,
Рс' представляет собой замещенную или незамещенную ферроценильную составляющую и может быть такой же как Рс или отличной от нее;
X представляет собой С1-С6 алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается группами -О- , -8- или -ΝΚ5-, в которой К5 представляет собой водород или С1-С6 алкил;
Υ представляет собой С1-С6 алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается группами -О-, -8- или -ΝΚ5-, в которой К5 представляет собой водород или С1-С6 алкил;
Ζ представляет собой С1-С12 алкиленовую цепь, которая может быть необязательно замещена и/или может необязательно прерываться группами -О-, -8-, циклоалкил, -СО-, -ΡΘΝ К1- , -ΝΚ'ΡΘ- или -ΝΚ1-, в которой К1 представляет собой водород или С1-С4 алкил; и
К представляет собой линкерную группу, содержащую атом кислорода,
С функционализирующим соединением, с получением функционализированного вносящего метку соединения общей формулы III
А-Е-Р III, в которой А представляет собой
Рс - (X) - N - (Υ) - Рс’ в которой Рс, Рс', X, Υ и Ζ определены выше со ссылкой на общую формулу I;
Р представляет собой функционализирующую составляющую, в частности функционализирующую составляющую для реакции с субстратом для присоединения обеспечивающую метку составляющей к субстрату; и
Ь представляет собой линкерную составляющую.
Линкерная составляющая Ь, как правило, будет линкерной составляющей, производной от линкерной группы К. Например, когда К представляет собой или содержит ОН группу, Ь, как правило, будет представлять собой или содержать -О-.
Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ получения субстрата, включающий реакцию соединения общей формулы III
А-Е-Р III, в которой А, Р и Ь имеют значения, определенные выше; с субстратом, с формированием меченого субстрата.
Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает функционализированное вносящее метку соединение для применения при получении субстрата, где функционализированное вносящее метку соединение имеет общую формулу III
А-Ь-Р III, в которой А, Ь и Р имеют определенные выше значения.
Настоящее изобретение также обеспечивает меченый субстрат для применения в электрохимическом анализе, где меченый субстрат имеет общую формулу Ша а Т,_Р’.[Я] ша в которой А представляет собой
Рс-(Х)-14-{У)-Рс’ в которой Рс представляет собой замещенную или незамещенную ферроценильную составляющую,
Рс' представляет собой замещенную или незамещенную ферроценильную составляющую и может быть такой же как Рс или отличной от нее;
X представляет собой С1-С6 алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается группами -О-, -8- или -ΝΒ.5-. в которой К5 представляет собой водород или С1-С6 алкил;
Υ представляет собой С1-С6 алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается группами -О-, -8- или -ХК5-, в которой К5 представляет собой водород или С1-С6 алкил;
Ζ представляет собой С1-С12 алкиленовую цепь, которая может быть необязательно замещена и/или может необязательно прерываться группами -О-, -8-, циклоалкил, -СО-, -СОХК1- , -ХК!СО- или -ХК1-, в которой К1 представляет собой водород или С1-С4 алкил;
Ь-Р' представляет собой связывающую составляющую;
[8] представляет собой субстрат.
- 3 026116
Связывающая составляющая -Ь-Р'- в общем представляет собой составляющую, производную от составляющей -Ь-Р- согласно общей формуле III.
Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает наборы для анализа, включающие субстраты согласно настоящему изобретению.
Подробное описание изобретения
Применение электрохимического обнаружения имеет ряд преимуществ по сравнению с флуоресцентным обнаружением. Электрохимическое обнаружение имеет потенциал к очень высоким уровням чувствительности и проявляет более широкий линейный динамический диапазон по сравнению с флюоресценцией. Нет требований к оптической чистоте образцов. Также меньше интерференции от фоновых загрязнителей (многие биологические образцы аутофлюоресцентны).
Электрохимическое обнаружение основано на наблюдении, что электрохимически активный маркер проявляет различные электрохимические характеристики в зависимости от того присоединяется он к субстрату или нет и в зависимости от природы субстрата. Например, в случае электрохимической метки, присоединенной к аминокислоте, проявляемые характеристики будут зависеть не только от идентичности аминокислоты, но также от того, включается аминокислотный остаток в пептид или белок или нет, и от длины любого такого пептида или белка. При соответствующих условиях электрохимическая активность маркера, присоединенного к аминокислотному остатку, может измениться на обнаруживаемую степень после потери присоединенного одного или очень немногих аминокислотных остатков.
Размер и характеристики молекулы, к которой присоединяется электрохимически активный маркер, влияют на наблюдаемые характеристики электрохимического маркера. Это может происходить, например, путем влияния скорости миграции маркера посредством диффузии или его скорости миграции в ответ на электрическое поле.
На электрохимическую активность маркера также могут влиять стерические эффекты, возникающие в результате присутствия молекулы, с которой он связан. Например, стерические затруднения могут мешать маркеру приближаться к электроду и принимать или отдавать электроны.
Если маркер присоединяется к пептиду, тогда вторичная структура пептида (как в значительной степени определяется первичной структурой) может влиять на физические свойства маркера. Например, если маркер присоединяется к аминокислотному остатку в пептиде, так что структура пептида стерически затрудняет электрохимическую активность маркера, тогда сигналы, получаемые вольтаметром, могут уменьшиться. Разрушение пептида может разрушить или высвободить элементы вторичной структуры и, таким образом, уменьшить или исключить влияние структуры пептида на маркер. Соответственно, расщепление пептида приводит к изменению, как правило увеличению, электрохимического сигнала, продуцируемой маркерной составляющей. При эксперименте с помощью дифференциальной импульсной вольтамперометрии ответ фарадеевского тока при конкретном приложенном напряжении может увеличиваться при расщеплении пептида.
Аналогично, если маркер присоединяется к нуклеотиду, на электрохимические характеристики будет оказываться влияние включается ли нуклеотид в олигонуклеотид или нет, по длине этого олигонуклеотида и по последовательности олигонуклеотида, особенно в районе точки присоединения.
Информация относительно электрохимической активности маркера может быть получена вольтаметрически или амперометрическим способом. Дифференциальная импульсная вольтамперометрия является особенно подходящей. Если желательно, стадия электрохимического обнаружения может осуществляться с применением одного или более электродов, покрытых мембраной, которая способна чувствительно исключать молекулы на основе одной или более характеристик, например, размера, заряда или гидрофобности. Это может способствовать уменьшению фоновых помех, например, от заряженных образцов в растворе.
В одном варианте выполнения настоящего изобретения соединения общей формулы I, применяемые в электрохимическом анализе, представляют собой М,М-ди(ферроценилалкил)аминоспирты, причем аминоспирт-составляющие предпочтительно имеют от 2 до 10 атомов углерода, предпочтительно от 2 до 8 атомов углерода, особенно от 3 до 6 атомов углерода. Предпочтительно спиртовая составляющая представляет собой неразветвленную спиртовую составляющую, которая является незамещенной или замещенной, и которая необязательно прерывается одним или более гетероатомами и/или одной или более группами. Иллюстративными гетероатомами являются, например, кислород, сера или азот. Группы, которые могут присутствовать, включают, без ограничения, -О-, -8-, циклоалкил, включая гетероциклоалкил, -СО-, -ΟΟΝΗ-, -ΝΗΟΘ - и -ΝΗ - и -ΝΚ1-, в котором К1 представляет собой С1-С4 алкил. Заместителями, когда они присутствуют, могут быть, например, С1-С4 алкил, который необязательно может быть замещен одной или более группами, выбранными из гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложный эфир или амидо; С1-С4 алкенил; С1-С4 алкенил, замещенный гидрокси, галогеном, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо; арил; или арил, замещенный гидрокси, галогеном, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо.
Предпочтительно алкиленовая составляющая диферроценилалкильной группы имеет от 1 до 4 атомов углерода, предпочтительно один или два атома углерода. Предпочтительно алкиленовая составляющая является одной и той же в обеих диферроценилалкильных группах. Таким образом, предпочтитель- 4 026116 но, диферроценилалкильной группой является диферроценилметил или диферроценилэтил, в которых ферроценильная составляющая может в каждом случае независимо быть незамещенной или быть замещена одним или более заместителями.
В соединениях (включая вносящие метку соединения, функционализированные вносящие метку соединения и меченые субстраты), применяемых согласно настоящему изобретению, включая соединения согласно общим формулам I, II и III и обеспечивающие метку составляющие согласно общей формуле 1а, две ферроценильные группы Рс и Рс' каждая предпочтительно независимо выбирается из незамещенных и замещенных ферроценильных групп. В одном варианте выполнения настоящего изобретения две ферроценильные группы в соединениях согласно общим формулам I, II и III и обеспечивающей метку составляющей согласно общей формуле Ы, каждая, представляют собой незамещенный ферроценил. В других вариантах выполнения настоящего изобретения один или оба пентадиенильных кольца одной из ферроценильных составляющих или каждой ферроценильной составляющей могут быть замещены одним или более заместителями, природа и расположение которых выбираются таким образом, чтобы влиять желательным образом на окислительно-восстановительные характеристики ферроценовой составляющей. Пентадиенильные кольца ферроценильной составляющей могут дополнительно или вместо быть замещены любыми заместителями в кольце, которые принципиально не уменьшают электрохимическую чувствительность метки. В одном варианте выполнения настоящего изобретения по меньшей мере одна или предпочтительно обе ферроценильные группы представляют собой замещенные ферроценильные составляющие, имеющие один или более заместителей, выбранных из галогена; С1-С4 алкила, который может быть необязательно замещен одной или более группами, выбранными из гидрокси, галогена, циано, оксо, амино, сложного эфира или амидо; С1-С4 алкенила; С1-С4 алкенила, замещенного гидрокси, галогеном, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо; арила; или арила, замещенного гидрокси, галогеном, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо. Предпочтительные заместители включают С1-С4 алкил, например, метил или этил; С1-С4 алкил, замещенный ΝΗ2, ΝΗΚ2, ΝΚ3Κ4, в котором К2, К3 и К4 каждый независимо выбирается из неразветвленного или разветвленного С1-С4 алкила; галогена, например, брома или фтора; или С1-С4 алкенила, например винила.
Например, в одном варианте выполнения настоящего изобретения каждая ферроценильная группа включает один заместитель в кольцевом положении, рядом с положением, в котором ферроценильная группа присоединяется к остатку молекулы. Иллюстрацией этого варианта выполнения настоящего изобретения является соединение бис-((2-(диметиламино)ферроценил)метил)-6-аминогексанол. В другом варианте выполнения настоящего изобретения обе ферроценильные группы являются незамещенными. Иллюстрацией этого варианта выполнения настоящего изобретения является соединение Х,Ы-ди(ферроценилметил)-6-аминогексанол. Другие иллюстративные ферроценильные группы включают 1'-метилферроценил; 2-метилферроценил; 1'-винилферроценил; 1'-бромферроценил и 2,3,4,5-тетраметил-1',2',3',4',5'-петаметилферроценил.
Ферроценильные составляющие предпочтительно являются идентичными. Таким образом, обеспечивается более сильный сигнал.
Составляющая Ζ может быть незамещенной или замещенной. Заместители, если присутствуют, могут представлять собой, например, один или более заместителей, выбранных из гидрокси, галогена, циано, амино и незамещенного или замещенного С1-С4 алкила, С1-С4 алкенила или арила; где в каждом случае необязатекльные заместители включают, без ограничения к этому, гидрокси, галоген, циано, оксо, амино, сложный эфир или амидо. Составляющая Ζ может, если желательно, прерываться одним или более чем одним атомом или составляющей, выбранными из -О-, -δ-, циклоалкил, включая гетероциклоалкил, -СО-, -ΟΘΝΗ -, -ΝΗΟΘ- и -ΝΗ- и -ΝΚ1-, в котором К1 представляет собой С1-С4 алкил. Иллюстративными циклоалкильными составляющими, которые могут быть включены внутри составляющей Ζ, являются циклоалкильные кольца с от 5 до 7 кольцевыми атомами, в частности 6 атомов в кольце, например, циклогексил, пиперидинил, морфолинил.
Составляющие X и Υ, которые предпочтительно являются одинаковыми, предпочтительно имеют длину цепи от 1 до 6, предпочтительно от 1 до 4 атомов углерода, в частности один или два атома углерода, и более конкретно один атом углерода. Составляющие X и Υ каждая может представлять собой алкиленовую цепь, необязательно прерывающуюся -О-, -δ-или -ΝΚ5-, например -ΝΗ-. Предпочтительные составляющие X и Υ включают, например, -СН2-, -СН2-СН2-, -(СН2)3-О-СН2-, -СН2-О-(СН2)3-, -(СН2)3-О(СН2)2- и -(СН2)2-О-(СН2)3-.
Связь с субстратом может осуществляться любой подходящей связью, как правило, связью с боковой цепью субстрата. Линкерная группа К в соединениях общей формулы I может представлять собой любую группу, подходящую для эффективной связи с субстратом, либо непосредственно, либо через функционализирующую группу, как описано в настоящей заявке. К предпочтительно представляет собой гидроксильную группу или защищенную гидроксильную группу или группу, содержащую гидроксильную группу или защищенную гидроксильную группу. Однако преимуществом является то, что любая другая подходящая линкерная группа К может быть выбрана по отношению к субстрату, к которому при применении соединение должно присоединяться. Были разработаны различные синтетические способы дериватизации белка, пептида или аминокислотных боковых цепей, или белка, пептида или аминокис- 5 026116 лотных концевых составляющих. Например, лизиновые остатки в белке могут быть дериватизованы реакцией с сукцинимидиловым сложным эфиром. Для дериватизации при других аминокислотных остатках могут применяться известные синтетические способы. Например, малеимидный реагент может применяться для дериватизации цистеиновых остатков или аминогруппы боковой цепи белка или пептида, или аминосоставляющей аминокислоты.
Подходящие способы дериватизации нуклеотидов хорошо известны, например, применяя фосфорамидитную составляющую.
Вышеуказанные способы дериватизации представляют собой иллюстративные способы, которые могут применяться для связи соединений согласно настоящему соединению с субстратом, хотя могут применяться другие способы.
Меченые субстраты согласно настоящему изобретению могут быть получены путем реакции соединения согласно настоящему соединению, при необходимости после функционализации с получением функционализированного вносящего метку соединения, с субстратом, например с субстратом, выбранным из аминокислот, нуклеотидов (например, олигодеоксирибонуклеотидов или олигорибонуклеотидов), нуклеозидов, сахаров, пептидов, белков, олигонуклеотидов, полинуклеотидов, углеводов и производных любой из этих молекул.
В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения субстратом является нуклеотид или олигонуклеотид. Нуклеотид может быть выбран из аденозина, тимидина, гуанозина, цитидина или уридина. Предпочтительно нуклеотид или нуклеотид олигонуклеотида присоединяется к метке через группу, присоединенную к рибозной или деоксирибозной группе нуклеотида, например, в положении 2', 3' или 5', например, через атом кислорода или азота. Наиболее предпочтительно, нуклеотид присоединяется в положении 3' или 5', например в положении 5'. Связывание в других положениях также возможно.
В случае нуклеотидов одним предпочтительным путем присоединения меток согласно настоящему изобретению является функционализация фосфорамидитом. Связь фосфорамидитных групп с олигонуклеотидами широко практикуется в олигонуклеотидном синтезе, и такие способы и условия присоединения к олигонуклеотиду меток, функционализированных фосфорамидитом, являются хорошо известными и обычными для специалистов в данной области техники. Кроме того, предпочтительно позволяет применение стандартных способов получения олигонуклеотидов.
Олигонуклеотиды для применения в анализе согласно настоящему изобретению предпочтительно представляют собой олигонуклеотиды, имеющие от 2 до 50 нуклеотидов, более предпочтительно от 2 до 40 нуклеотидов, особенно от 15 до 35 нуклеотидов, причем особенно предпочтительно от 18 нуклеотидов 30 нуклеотидов. Для некоторых применений могут быть полезными более короткие олигонуклеотиды, например олигонуклеотиды с 2-14 нуклеотидами, более предпочтительно 2-10 нуклеотидами.
Присоединение к белкам, например, через цистеин, лизин, может осуществляться в некоторых случаях путем инкубации белка и ферроценильной метки вместе при комнатной температуре в соответствующем буферном растворе. Если метка предпочтительно должна быть связана с цистеином или лизином, но последовательность субстрата не содержит цистеин или лизин в подходящем положении последовательности, последовательность может, если желательно, быть мутирована с добавлением одного или более цистеинового или лизинового остатка, либо в качестве дополнительного остатка, либо в виде замещения другого остатка. Альтернативный способ присоединения к белкам может включать биотинилирование меток и применение коммерческих стрептавидинированных белков (или наоборот). В качестве примера субстрат может быть биотинилированным любой стандартной методикой, например путем применения коммерчески доступного набора для биотинилирования. Биотинилированный субстрат будет связываться со стрептавидин- или авидин-конъюгированными соединениями, как, например, антитела (которые коммерчески и широко доступны).
Однако специалистам в данной области техники очевидно, что более маленькие метки могут присоединяться к субстрату в одном выбранном из ряда положений путем применения соответствующей вносящей метку функциональной группы.
В функционализированных вносящих метку соединениях общей формулы III А - Ь - Ρ III,
А-Ь предпочтительно представляет собой составляющую, полученную из соединения согласно общей формуле I, и Р представляет собой функционалиирующую группу. Предпочтительные функционализированные вносящие метку соединения общей формулы III включают соединения общей формулы ШЬ
А-О-Р ШЬ, где А-0 представляет собой составляющую, полученную из соединения согласно общей формуле I, предпочтительно путем потери гидрокси атома водорода или защитной группы, когда линкерная группа К общей формулы I представляет собой гидроксил или гидроксилсодержащую группу или защищена гидроксильной группой, и Р представляет собой функционализирующую группу.
Подходящие функционализирующие группы, которые могут применяться с метками согласно настоящему изобретению, включая в качестве функционализирующей группы Р в общей формуле III и общей формуле ШЬ, могут включать, без ограничения, сукцинимидиловые сложноэфирные группы, фос- 6 026116 форамидитные группы, малеимидные группы, биотиновые и азидные группы. Одна будет преимуществом то, что может применяться любая функционализирующая группа, которая способствует присоединению вносящего метку соединения к субстрату, который становится меченым.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ обнаружения нуклеиновой кислоты (например, РНК или ДНК) в образце, содержащий необязательную стадию амплификации нуклеиновой кислоты (например, путем ПНР или другой методики амплификации нуклеиновой кислоты), с последующей стадией контакта ампликона с зондом из комплементарной нуклеиновой кислоты в условиях, которые обеспечивают гибридизацию между зондом и ампликоном, с последующей стадией селективного разрушения либо гибридизованного, либо негибридизованного зонда (например, путем применения одно- или двухнитевых специфических нуклеаз), где в указанный зонд вносится метка с помощью электрохимически активного соединения согласно настоящему изобретению, и где способ обеспечивает стадию измерения электрохимической активности соединения, вносящего метку в зонд, где указанная электрохимическая активность зависит, либо количественно, либо качественно, от степени разрушения зонда.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ обнаружения антитела или производной (которые могут, например, быть связаны с целевым антигеном в анализе) электрохимически активным соединением согласно настоящему изобретению, включающий стадию измерения электрохимической активности соединения.
Настоящее изобретение также обеспечивает способы диагностики или мониторинга заболевания у субъекта, включающие применение способа согласно настоящему изобретению для обнаружения протеазы или протеазного ингибитора, связанных с заболеванием, в ткани или жидкости организма субъекта.
Настоящее изобретение также обеспечивает способы диагностики или мониторинга заболевания у субъекта, включающие применение способа согласно настоящему изобретению для обнаружения пептида или белка, связанных с заболеванием, в ткани или жидкости организма субъекта.
Настоящее изобретение также обеспечивает способы диагностики или мониторинга заболевания у субъекта, включающие применение способа согласно настоящему изобретению для обнаружения нуклеазы или нуклеазного ингибитора, связанных с заболеванием, в ткани или жидкости организма субъекта.
Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает применение способа согласно настоящему изобретению для обнаружения заболевания у субъекта.
Настоящее изобретение также обеспечивает способы обнаружения патогена или другого нежелательного организма, например, портящего пищу организма, включающие применение способа согласно настоящему изобретению.
Более того, настоящее изобретение обеспечивает применение М,М-ди(ферроценилалкил)глициновой производной, например М,М-ди(ферроценилалкил)глицинамидо производной, в качестве электрохимической метки в электрохимическом способе измерения.
Настоящее изобретение также обеспечивает набор для анализа, содержащий меченый субстрат согласно настоящему изобретению, при необходимости в комбинации с другими компонентами анализа, например сосудом для образца, контейнером, содержащим электроды для электрохимического обнаружения, ферментами для применения в анализе или стандартами и контролями. Указанный набор для анализа может содержать более одного отличного меченого субстрата согласно настоящему изобретению. В этом случае присутствие различных меченых субстратов может быть по-разному обнаружено с помощью электрохимических меток согласно настоящему изобретению, имеющих различные электрохимические характеристики (например, различные окислительные потенциалы), таким образом, делая анализ мультиплексным (например, дуплекс), в котором различные субстраты могут выделяться при присутствии в одном и том же сосуде для образцов.
Настоящее изобретение обеспечивает в дополнительном варианте выполнения настоящего изобретения соединение общей формулы I
Ρο-(Χ)-Ν-(Υ)-Γο’
I (Ζ)-κ в которой Рс представляет собой замещенную ферроценильную составляющую;
Рс' представляет собой замещенную ферроценильную составляющую и может быть такой же как Рс или отличной от нее;
X представляет собой С1-С6 алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается группами -О-, -8- или -ΝΚ5-, в которой К5 представляет собой водород или С1-С6 алкил;
Υ представляет собой С1-С6 алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается группами -О-, -8- или -ΝΒ5-, в которой К5 представляет собой водород или С1-С6 алкил;
Ζ представляет собой С1-С12 алкиленовую цепь, которая может быть необязательно замещена и/или может необязательно прерываться группами -О-, -8-, циклоалкил, -СО-, -ΟΌΝ^1-, -ΝΑΟΌ- или -ΝΡ1-, в которой К1 представляет собой водород или С1-С4 алкил; и
К представляет собой линкерную группы.
- 7 026116
В этом варианте выполнения настоящего изобретения предпочтительно каждая ферроценильная составляющая замещена по меньшей мере одним заместителем, выбранным из галогена, С1-С4-алкила, галоалкила, арила, С1-С4 алкенила и циано.
В еще одном дополнительном варите выполнения настоящее изобретение обеспечивает соединение общей формулы I
Рс - (X)-Ν-(Υ) - Рс’
I (Ζ)-Κ , в которой Рс и Ре', каждая, представляют собой незамещенную ферроценильную составляющую;
X представляет собой С1-С6 алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается группами -О-, -8- или -ΝΚ5-, в которой К5 представляет собой водород или С1-С6 алкил;
Υ представляет собой С1-С6 алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается группами -О-, -8- или -ΝΚ5-, в которой К5 представляет собой водород или С1-С6 алкил;
Ζ представляет собой С6-С12 алкиленовую цепь или представляет собой С1-С12 алкилен, который замещен одним или более заместителями и/или прерывается составляющей, выбранной из -О-, -8-, циклоалкила, -СО-, -ί'ΌΝΗ-, -ΝΗί'Ό- или -ΝΚ1-, в которой К1 представляет собой водород или С1-С4 алкил;
К представляет собой линкерную группу.
В этом еще одном варианте выполнения настоящего изобретения предпочтительно X представляет собой группу -(СН2)Х-, в которой х равно от 1 до 6; и Υ представляет собой группу -(СН2)у-, в которой у равно от 1 до 6.
В указанном дополнительном и другом дополнительном варианте выполнения настоящего изобретения Ζ предпочтительно представляет собой С6-С8 алкилен, необязательно прерывающийся кислородом. Предпочтительно линкерная группа К содержит группу, способную реагировать со совместимой группой функционализирующей составляющей или субстрата для присоединения соединения к указанной функционализирующей составляющей или указанному субстрату, например К может представлять собой гидроксигруппу, защищенную гидроксигруппу или составляющую, содержащую гидроксигруппу или защищенную гидроксигруппу.
В приведенной ниже таблице показаны некоторые предпочтительные соединения общих формул 1Уа, Уа, У!а, УПа и УШа согласно настоящему изобретению, которые могут применяться в качестве меток в электрохимических анализах согласно настоящему изобретению и которые могут применяться для получения функционализированных вносящих метку соединений и меченых субстратов согласно настоящему изобретению. В табл. 1 также приводятся выбранные из соединений общих формул 1УЬ, УЬ, У1Ь, У11Ь и УШЬ иллюстративные соответствующие функционализированные вносящие метку соединения согласно настоящему изобретению. В формулах в табл. 1, за исключением, когда рассмотрение стерических затруднений уменьшает это, каждый ферроценил может иметь более одного заместителя К, которые могут быть одинаковыми или различными, и в любом положении в конце. Когда имеется один или более заместителей при одной из ферроценильных групп, другая ферроценильная группа, как необходимо понимать, имеет такой же заместитель (заместители) в таких же положениях.
Таблица 1
Иллюстративные соединения и функционализированные вносящие метку соединения
| ГУа | Ν[ В которой К галоген, С1 фенил, С1 - О от 0 до 5, напр равно от 0 до например, С1 - | χχ^χΛ\χχ^χΟΗ 10, если присутствует, представляет собой С4-алкил, галоалкил, в частности фторалкил, алкенил, например, винил, или циано. Ц равно имер, 1, и XV представляет собой (СНДП, где η 6, О, 8 или ΝΚ20, где Я20 представляет алкил, С4 алкил | X?1 В которой Я10 отношение обп | хх АХ. Xх Ре η и Ψ имеют 1ей формулы Ка | чХ°\ хЧ/Х. ''р<' Ύν ΎΫ значения, приведенные в | 1УЬ | |
| Уа | I | -^х Ύ хх | УЬ | ||||
| Ре | Ау | (Р”)г | ΥΎ | ||||
| Ре | |||||||
| В которой Я11, | если присутствует, представляет собой алкил, | ||||||
| например, С1 | - С4-алкил, арил, например, фенил, или | ||||||
| аминоалкил, | особенно диалкил-замещенный аминоалкил, | В которой Я11 | г и XV имеют | значения, приведенные в | |||
| например, ди(С1-С4-алкил)аминометил-; г представляет | отношение обшей формулы Уа | ||||||
| собой от I до 4, например 1; и XV представляет собой (СН?),,, | |||||||
| где η равно от | 0 до 6, О, 8 или ΝΚ , где К представляет | ||||||
| собой алкил, например, С1 - С4 алкил |
- 8 026116
В которой К12, если присутствует, представляет собой галоген, С1 - С4-алкил, галоалкил, в частности фторалкил, фенил. С1 - С4 алкенил, например, винил, или циано; 4 равно от 0 до 5, например 1; и XV представляет собой (СНз)п < где η равно от 0 до 6, О, 5 или ΝΚ20, где К20 представляет собой алкил, например, С1 - С4 алкил
фенил, С1 - С4 алкенил, например, винил, или циано, г равно от 1 до 4, например 1, и XV представляет собой (СНз)п , где η равно от 0 до 6, О, 5 или ΝΚ20 , где К20 представляет собой алкил, например, С1 - С4 алкил
В общих формулах Жа, Уа, У!а, У!а и УШа и их функционализированных эквивалентах в табл. 1, когда один или более заместителей при кольце К11 или К13, если присутствуют при проксимальном пентадиенильном кольце каждого ферроценила, то есть кольце, которое непосредственно связано с остатком молекулы, предпочтительно имеется указанный заместитель в соседнем положении кольца, с которым он связан. Когда более одного заместителя при кольце К11, К13 присутствует при каждом проксимальном пентадиенильном кольце, эти заместители могут находиться в любом положении друг относительно друга. Когда более одного заместителя при кольце К10, К12 или К14 присутствует при каждом дистальном пентадиенильном кольце каждого ферроценила, то есть кольце, которое удалено от связи, которая связывает ферроценил с остатком молекулы, эти заместители могут находиться в любом положении друг относительно друга. Тогда как в общих формулах Жа, Уа, Ша, УПа и УШа и их функционализированных эквивалентах в табл. 1 показаны заместители при кольце либо при проксимальном, либо при дистальном кольце, оба пентадиенильных кольца обоих ферроценилов также могут нести один или более заместителей.
В особенно предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения соединением является N,N-ди(ферроценилметил)-6-аминогексанол (упоминаемый в приведенных ниже примерах как метка А). Другие предпочтительные метки, которые могут применяться согласно настоящему изобретению включают 2-((диферроценилметил)амино)-1-(4-(гидроксиметил)пиперидин-1-ил)этанон и N,N-ди-(ферроценилметил)-2-аминоэтокси)этанол, в котором ферроценильная составляющая или каждая ферроценильная составляющая может быть замещена или незамещена одним или более заместителями. Соединение N,N-диферроценилметил-6-аминогексанол, в котором ферроценильные группы обе незамещены, как было обнаружено, имеют хорошие электрохимические свойства. Как проиллюстрировано в приведенных здесь примерах, включение одного или более заместителей при каждой из ферроценильных групп (заместители при каждом ферроцениле являются одинаковыми) в этом соединение может применяться для получения соединений с модифицированными электрохимическими характеристиками, обеспечивая посредством соответствующего заместителя выбор ряда соединений, из которых два или более могут выбираться в целях мультиплексных реакций.
Определенные иллюстративные соединения согласно настоящему изобретению, которые, как было обнаружено, имеют хорошие электрохимические свойства, приведены в табл. 2.
- 9 026116
Таблица 2
Иллюстративные вносящие метку соединения согласно изобретению
| Ре | Υ) Ре |
| ° Ре | Ре '''Ν''' 1 |
| —°и Ре | 5? О -Ά рАдл? ΎΥ |
| •φ γ ° Ре | он ре Ре |
| он - ι-ί-— Ре ':?ΐί^'Βι | он Ре Ре |
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 схематически показан гальванический элемент, применяемый при измерениях с помощью дифференциальной импульсной вольтамперометрии, как описано в настоящем документе;
на фиг. 2 показана дифференциальная импульсная вольтаммограмма метки А, как получены в приведенном ниже примере 1;
на фиг. 3 - дифференциальная импульсная вольтаммограмма метки В, как получены в приведенном ниже примере 2;
на фиг. 4 - дифференциальная импульсная вольтаммограмма метки С, как получены в приведенном ниже примере 3;
на фиг. 5 - вольтаметрические сканограммы как для СЫатуФа положительных, так и отрицательных образцов согласно примеру 5(а), приведенному ниже;
на фиг. 6 - масс-спектрометрический анализ мононуклеотида и динуклеотида, синтезированных с электрохимической меткой А, как описано в приведенном ниже примере 5(а);
на фиг. 7 - масс-спектрометрический анализ продукта по примеру 5(а);
на фиг. 8 приведена столбчатая диаграмма, показывающая измерения тока, когда СЫатуФа мишень добавляется непосредственно в ПЦР реакцию, в диапазоне концентраций и обнаруживается с применением олигонуклеотидного зонда, как в приведенном ниже примере 5(Ь);
на фиг. 9 приведена столбчатая диаграмма, показывающая максимальный ток в диапазоне концентраций, когда СЫатуФа мишень добавляется в процесс экстракции ДНК, где продукт процесс экстракции амплифицируется с применением ПЦР, а затем обнаруживается с применением олигонуклеотидного зонда, помеченного меткой А, как в приведенном ниже примере 5(с);
на фиг. 10 - сравнение между электрохимическим обнаружением с применением зонда метки А и 8УВР Стееи на основе количественного ПЦР анализа для ΝοΓονίπικ;
- 10 026116 фиг. 11 - сравнение между электрохимическим обнаружением с применением зонда метки А и δΎΒΚ Сгееи на основе количественного ПЦР анализа для 31гер1ососси8 есцй;
на фиг. 12а - вольтаметрическая сканограмма с применением метки А, соединенной с коммерчески доступным антикозьим 1дС;
на фиг. 12Ь - вольтаметрические сканограммы, получаемые через интервалы времени, с применением метки А, соединенной с коммерчески доступным антикозьим 1дС;
на фиг. 13 - вольтаметрические сканограммы микрочастиц согласно примеру 8 при различных концентрациях;
на фиг. 14 - различные дифференциальные импульсные вольтаммограммы метки Ό, как получено в примере 9, приведенном ниже;
Подробное описание определенных предпочтительных вариантов выполнения изобретения
Со ссылкой на фиг. 1 схематически показан гальванический элемент 1, подходящий для применения в циклических вольтаметрических экспериментах, описанных в настоящей заявке. Элемент содержит сосуд 2, содержащий раствор фонового электролита 3, которым является 100 мМ раствор хлорида натрия. Погруженным в раствор 3 является отпечатанный углеродный рабочий электрод 5, отпечатанный углеродный противоэлектрод 6 и электрод сравнения на основе серебра/хлорида серебра 7, все с серебряными контактами. Образец распыляется на поверхность рабочего электрода, вольтаметрия осуществляется путем соединения серебряных контактов с соответствующими метками на потенциометре. В качестве иллюстрации образец может быть получен следующим образом. Предшественник ферроценильной метки (2 нг) растворяется в ΌΜδΟ (1мл). Аликвота 10 мкл отбирается из этого раствора и затем разбавляется буфером (500 мкл). Затем аликвоту (20 мкл) наносят на отпечатанный экранирующий электрод для электрохимического сканирования.
Следующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение.
Материалы и способы - синтез и анализ меток.
Ферроценкарбоновая кислота была приобретена у Зщта-АИпсй Ферроценкарбоксальдегид был приобретен у Зщта-АИпск
6-Аминогексанол был приобретен у Зщша-АИпсН.
Глицин был приобретен у Зщша-АИпсН.
Ν,Ν-диизопропилэтиламин был приобретен у Зщша-АИпсН.
2-цианоэтилдиизопропилхлорфосфорамидит был приобретен у Зщша-АИпск Раствор папаина с концентрацией 1 мг/мл был приобретен у Зщша-АИпсН.
Антикозий 1дС и биотинилированный козлиный 1дС были приобретены у 31дта.
Способы ПЦР осуществляли с применением РТС-100 или РТС-200 программированного термального контролера (ΜΙ Кекеагсй 1пс.) или термоциклера РецЬаЬ Да! Ьеб.
Покрытые стрептавидином микротитровальные лунки представляли собой лунки высокой плотности Зщша Зсгееп™.
Материалы и способы - электрохимическое обнаружение.
Электроды основываются на чернилах и представляют собой экраны, отпечатанные на полимерном субстрате (например, Му1аг), с последующей тепловой вулканизацией, производимой с помощью пластины СМ Ν;ιη« (Зеай1е, ©А)
Пример 1. Синтез Ν,Ν-диферроценилметил-б-аминогексанола [метка А]
Ферроценкарбоксальдегид (2.1 г, 9.81 ммоль) и 6-аминогексан-1-ол (0.5 г, 4.27 ммоль) в сухом ТНР (25 мл) добавили в высушенную в печи колбу. Натрия триацетоксиборгидрид (2.3 г, 10.90 ммоль) порционно добавили в раствор. Реакционную смесь оставили на всю ночь. Реакционную смесь растворили в этилацетате (40 мл), органический слой промыли с помощью Ν;·ιί'.Ό3 (насыщенный; 20 мл), соляного раствора (20 мл) и МИНЦ воды (20 мл). Органическую фракцию затем высушили над сульфатом магния и растворитель удалили в вакууме. Неочищенный продукт затем колоночно очистили, применяя 9:1 раствор В: раствор А (раствор А: этилацетат 95% ТЕА 5%, раствор В: петролейный простой эфир 40-60 95%, ТЕА 5%) с выделением чистого продукта (твердое вещество темно-оранжевого цвета).
Выход: 85%.
Ή ЯМР (300МГц, СЭС13) δ 4.18 (2Н, с, Ср), 4.17 (2Н, с, Ср), 4.13 (15Н, с, Ср), 3.66 (4Н, т, 1=6.25 Гц, СН2), 3.48 (2Н, с, СН2), 2.20 (2Н, т, 1=6 Гц, СН2), 1.59-1.31 (6Н, м, СН2).
- 11 026116 13С ЯМР (75.5 Гц, СЭС1;) δ 77.83, 77.40, 76.98, 70.58, 68.88, 63.36, 53.02, 52.17, 33.10, 27.43, 25.88.
ΗΡΜδ (ΕδΙ) вычислили для С28Н33Ы1О1Ре2 т/ζ 519.1430, нашли 519.1438.
Электрохимия соединения; метка А показана на вольтамограмме на фиг. 2.
Полученная метка, как было обнаружено, обладает окислительно-восстановительным потенциалом 0.275 В.
Пример 2. Синтез ди((диметиламино)метилферроценилметил)-6-аминогексанол (метка В).
(а) Синтез (диметиламино)метилферроценкарбоксальдегида.
(Диметиламино)метилферроцен (1 г, 5 ммоль) растворили в ЕьО. н-бутиллитий (2.51 мл, 6.25 ммоль) медленно добавили и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч.
Через 16 ч реакцию погасили с помощью ΌΜΡ (0.4 мл, 6.25 ммоль) и снова перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. К реакционной смеси добавили воду (15 мл). Органическую фазу затем экстрагировали простым эфиром (2x25 мл). Объединенные органические фазы высушили над сульфатом магния, отфильтровали и растворитель удалили под вакуумом с получением продукта с выходом 72% (масло темно-красного/коричневого цвета).
1Н ЯМР (300 МГц, СЭС1;) δ 9.81 (1Н, с, СНО), 4.21 (2Н, с, Ср), 4.14 (5Н, с, Ср), 3.64 (2Н, с, СН2), 2.08 (6Н, с, ИМе2).
13С ЯМР (75.5 Гц, СЭС1;) δ 193.2, 86.7, 83.4, 77.8, 77.5, 77.0, 76.62, 75.8, 71.8, 70.3, 70.2, 70.0, 68.4, 68.0, 59.2, 56.6, 44.8, 44.7.
ΗΡΜδ (ΕδΙ) вычислили для С14Н18К1О1Ре1 т/ζ 272.0737 , нашли 272.0731.
Ке£: Βίοι, С., О1опаи, О., Мае1с]е\У5кк Ь.А., Вгосагй, Ι.δ., Эотаг1е, О., В1атраш, О., МШе1, Р., Оеогдез, АЛ., АЬе55о1о, Н., Эгее, Ό., ЬеЫЫ, 1.1. Мей. Скет. 1997, 40, 3715-3718.
(к) Синтез метки В
(Диметиламино)метилферроценкарбоксальдегид (1.1 г, 4.04 ммоль) растворили в сухом ТНР (30 мл) 6 аминогексан-1-ол (0.25 г, 2.13 ммоль), затем натрия триацетоксиборгидрид (1.3 г, 6.16 ммоль) добавили в реакционную смесь. Раствор перемешивали в атмосфере азота при комнатной температуре всю ночь. Затем добавили этилацетат (20 мл) и 1н. ЫаОН (насыщенный, 20 мл) и органический слой экстрагировали с помощью ЫаСО3 (25 мл), соляного раствора (25 мл) и Μί11ί О отфильтрованной воды (25 мл), затем высушили над ΜдδО4 и растворитель удалили в вакууме с получением масла оранжевого цвета (0.95, 75%).
Ή ЯМР (300МГц, СЭСТ) δ 4.18 (2Н, с, Ср), 4.17 (2Н, с, Ср), 4.13 (15Н, с, Ср), 3.66 (4Н, т, 1=6,25 Гц, СН2), 3.48 (2Н, с, СН2), 2.20 (2Н, т, 1=6М, СН2), 2.17 (12Н, с, СН3) 1.59-1.31 (6Н, м, СН2).
ΗΚΜδ (ΕδΙ) вычислили для С34Н49Ы3О1ре2 т/ζ 627.3012, нашли 627.3126.
Электрохимия полученного соединения показана на вольтамограмме на фиг. 3 Полученная метка, как было обнаружено, обладает окислительно-восстановительным потенциалом 0 38.В.
Пример 3. Синтез 2-((диферроценилметил)амино)-1-(4-(гидроксиметил)пиперидин-1-ил)этанон (метка С).
(а) Синтез М,Ы-(диферроценилметил)глицина
Ферроценкарбоксальдегид (2.1 г) добавили в круглодонную колбу, содержащую сухой ТНР (20 мл) Глицин (0.5 г), добавили к раствору и реакционную смесь перемешивали в атмосфере Ν2. Натрия триацетоксиборгидрид (2.3 г) порционно добавили в перемешиваемый раствор Реакционную смесь перемешивали всю ночь. Затем раствор разделили посредством этилацетата (40 мл) и 1 М водного гидроксида натрия (40 мл). Органическую фракцию промыли насыщенным водным NаΗСО3 (насыщенный; 20 мл), соляным раствором (40 мл) и водой (40 мл). Органическую фракцию высушили с помощью ΜдδО4 и растворитель удалили. Неочищенный продукт колоночно очистили (растворитель А: петролейный простой эфир 40-60:ТЕА 95:5, растворитель В: этилацетат:ТЕА 95:5). Продукт представлял собой твердое веще- 12 026116 ство темно-оранжевого цвета (80%).
Ή ЯМР (250 МГц, СНС13) δ 4.099 (1Η, с, СрН), 4.052 (1Η, с, СрН), 4.022 (7Н, с, РсСрН), 3.549 (4Н, т, 1=6.75 Гц, 2 х СН2), 3.348 (2Н, с, СН2), 1.979 (1Η, с, ОН).
13С ЯМР (75.5Гц, СНС13) δ 171.5, 78.0, 77.5, 77.1, 68.9, 67.4, 61.1.
НКМ8 (ЕШ) вычислили для С34Н35ЦО3Ре3 т/ζ: 477.3974, нашли 477.4213.
(Ь) Синтез метки С из диферроценилглицина
Оксалилхлорид (0.87 мл) в сухом ЭСМ (2 мл) добавили по каплям с помощью капельной воронки с выравниванием давления к перемешанному раствору производного диферроценилглицина, полученного в п.3(а), приведенном выше, в сухом ЭСМ (100 мл) при 0°С в атмосфере Ν2. Реакционную смесь нагрели до комнатной температуры и перемешивали в течение двух часов. Затем растворитель удалили и кислотный хлоридный продукт растворили в сухом ЭСМ (75 мл). 6-аминогексан-1-ол (0.56 г) в сухом ЭСМ (75 мл) добавили по каплям с помощью капельной воронки 0°С в атмосфере Ν2. Реакционную смесь затем перемешивали в течение двух часов при нагревании до комнатной температуры. Раствор затем промыли с помощью №НСО3, (насыщенный; 100 мл) и 1.0 М НС1 (100 мл). Органическую фракцию высушили над Мд§О4, затем растворитель удалили с получением продукта (85%). Твердое вещество оранжевого/желтого цвета.
Ή ЯМР (250 МГц, СНС13) δ 4.11 (12Н, с, РсСр), 3.65 (4Н, т, 1=6.0 Гц, СН2), 3.55 (2Н, с, СН2), 1.481.18 (5Ь, м, СН2).
13С ЯМР (75.5 Гц, СНС13) δ 173.32, 77.80, 77.39, 76.90, 62.10, 38.85, 35.45, 32.02, 30.67, 26.75, 25.54, 25.44. т/ζ: 576.
Электрохимия полученного соединения метки С показана в табл. 3, приведенной ниже, и на вольтамограмме на фиг. 4.
Таблица 3
Электрохимическая активность метки С
| Положение пика (мВ) | Высота пика |
| 410 | 6 7<Ж' |
| 425 | 8.47^ |
| 415 | 8.56е |
Пример 4. Общая синтетическая методика присоединения фосфорамидитной функциональной группы
Ферроценильная производная, показанная как исходный материал в вышеприведенной схеме реакции, является иллюстративной и может быть замещена мольным эквивалентом любого из соединений, полученных в примерах 1-3, приведенных выше, или примерах 9-13, приведенных ниже.
Ν,Ν-диизопропилэтиламин (0.4 мл, 8.4 ммоль) добавили в перемешанный раствор ферроценового производного (2.1 ммоль) в сухом ТНР (25 мл) в атмосфере азота. 2-цианоэтилдиизопропилхлорфосфорамидит (0.2 мл, 3.15 ммоль) добавили по каплям, и полученную смесь перемешивали в течение 15 мин. Μί11ίβ отфильтрованную воду (200 мл) добавили и раствор перемешивали еще 30 мин. Добавили этилацетат-триэтиламин (1.1, 25 мл), сформировался осадок. Смесь промыли насыщенным №СНСО3 (25 мл) и Μί11ίβ отфильтрованной водой (25 мл) Органическую фракцию высушили над Мд§О4, и растворитель удалили в вакууме. Неочищенный продукт затем очистили с помощью хроматографии на силикагеле (петролейный простой эфир этилацетат 9.1).
Применяя вышеописанный способ с меткой С в качестве ферроценильного исходного материала, получили фосфорамидит-функционализированное соединение формулы IX, имеющее характеристики, приведенные ниже
- 13 026116
'ίί ЯМР (500 МГц, ССС1;) δ 4.23 (2Н, с, Ср), 4.18 (2Н, с, Ср), 4.13 (15Н, с, Ср), 3.90-3.82 (2Н, м, СН2), 3.71-3.54 (4Н, м, СН2), 3.44 (4Н, с, СН2), 2.64 (2Н, т, 1=6 Гц, СН2), 2.35 (2Н, т, 1=6.5 Гц, СН2), 1.691.35 (85Н, м, СН2, СН), 1.23 (12Н, т, 1=7 Гц, СН3).
31Р ЯМР (ПЕС) (202.5 Гц, ССС1;) δ 147.23.
ΗΡΜδ (ΕδΙ) вычислили для С39Н53Н4О3Ре2Р1 т/ζ 768.0973, нашли 768.1254.
Пример 5. Применение метки А, связанной с олигонуклеотидным зондом.
Синтез олигонуклеотида осуществляли, применяя стандартную методику твердофазного олигонуклеотидного синтеза, причем нуклеотиды добавляли пошагово к 5'-концу олигонуклеотидной нити. Каждое добавление к олигонуклеотидной цепи включает четыре реакции, которыми являются стадии разблокирования, соединения, кэппинга и окисления. Как только олигонуклеотидная последовательность достигает желательной длины, добавляется электрохимическая метка с помощью фосфорамидитной связи.
Способ.
Целевая последовательность амплифицируется из СЫатуФа 1тасЬота118 мишени с помощью стандартного ПЦР способа, применяя 5' и 3' целевые специфические прайсмеры и урацил-ДНК гликозилазу (υϋΟ). Условия ПЦР показаны в табл. 4, приведенной ниже. Когда реакция ПЦР завершает, олигонуклеотидный зонд (меченный электрохимической меткой А на 5'-конце), комплементарный последовательности в промежуточном положении на мишени между 5' и 3' праймерами, добавляется к продуктам ПЦР реакции и обеспечивает отжиг с его мишенью на ампликоне. Т7 экзонуклеаза (которая специфичная для двухнитевой нуклеиновой кислоты) добавляется в пробирку и инкубируется, обеспечивая расщепление άδΡΗΚ. Зонд расщепляется Т7 экзонуклеазой до степени, которая подверглась отжигу с ПЦР ампликоном. Затем провели электрохимическое обнаружение, показывающее пик при характеристике окислительно-восстановительного потенциала 0.2 В для расщепленного нуклеотидного продукта, помеченного меткой А.
Таблица 4
| Соединение | Концентрация |
| ПЦР буфер | IX |
| М&С12 | 5мМ |
| остр ιηίχ | IX |
| Прямой праймер | 0.04мкМ |
| Обратный праймер | О.ЗмкМ |
| Тац | 2.5 и |
| ияо | о.5 и |
υΝΟ протокол:
37°С х 10 мин;
94°С х 10 мин.
ПЦР протокол:
94°С х 30 с;
58°С х 45 с;
72°С х 60 с.
Повторные стадии х 39 циклов (всего 40 циклов):
72°С х 7 мин
Результаты.
На фиг. 5 показана высота пика, в виде тока, при известном (метка-специфичном) окислительновосстановительном потенциале как для СЫатуФа 1гасЬотаЙ8 положительного образца (сильный пик), так и для отрицательного образца (отсутствие пика).
На фиг. 6 показан масс-спектрометрический анализ мононуклеотида и динуклеотида, синтезированных с электрохимической меткой А.
На фиг. 7 показан масс-спектрометрический анализ продукта, который показывает точное соотношение с мононуклеотидом, соединенным с электрохимической меткой А, электрохимическая составляющая обнаруживается в анализе.
На фиг. 8 показаны результаты эксперимента, где СЫатуФа мишень добавляется непосредственно в ПЦР реакцию в диапазоне концентраций. Она амплифицируется с применением ПЦР, затем обнаруживается с применением олигонуклеотидного зонда с меткой А.
На фиг. 9 показаны результаты эксперимента, где диапазон концентраций мишени СЫатуФа до- 14 026116 бавляется в процесс экстракции ДНК (то есть не добавляется непосредственно в ПЦР), и продукт процесса экстракции амплифицируется с применением ПЦР, затем обнаруживается с применением олигонуклеотидного зонда, помеченного меткой А.
Пример 6. Сравнение эффективности по количественной ПЦР.
а) На фиг. 10 показано сравнение между электрохимическим обнаружением с применением зонда с меткой А и §УБК Сгееи на основе количественного анализа ПЦР для ΝοΓονίπίδ. Материалы и протоколы были следующими:
Вюйие §еи81М1х 6И;
Вюйие IX §УВК Сгееи;
0.3 мкМ прямой праймер;
0.3 мкМ обратный праймер;
0.5 и ДОС.
ДОС протокол:
37°С х 10 мин;
60°С х 2 мин. цРСР протокол:
°С х 10 мин (1ац стадия активации);
95°С х 15 с;
45°С х 10 с;
72°С х 10 с (8УВК обнаружение).
Повтор последних трех стадий х 39 цикла (всего 40 циклов).
47-95°С при увеличении 1°С (конец-точка плавления для проверки на неспецифическую амплификацию).
Переведенная в десятичную систему обратная пропорциональность значения С1 применялась для результатов количественной ПЦР для обеспечения прямого сравнения с электрохимическими результатами.
Данные показывают ограничение обнаружения для электрохимического анализа 200ад. Ограничение обнаружения для количественного ПЦР анализа, как показано, составляет от 2 до 20Гд. Ниже этого уровня значение С1 больше, чем 40-цикличный отрезок, как показано горизонтальной линией в виде обратной пропорциональности значения С1 40. Отрицательные значения количественной ПЦР не поднимались выше порога. Это демонстрирует преимущественную чувствительность электрохимического анализа с применением метки А.
Ь) На фиг. 11 показано сравнение между электрохимическим обнаружением с применением зонда с меткой А и §УВК Сгееи на основе количественного ПЦР анализа для §1гер1ососси8 есцй.
Данные показывают, что как электрохимический анализ, так и количественный ПЦР анализ, способны обнаруживать ниже самой низкой концентрации ДНК, протестированной в этом эксперименте (20Гд). Отношение сигнал:шум для электрохимического обнаружения при 20Гд было 4:1 в этом эксперименте. 20Гд приравнивается к 8 геномным копиям ДНК 8. есцй.
Пример 7. Метка А, непосредственно связанная с белком.
а) На фиг. 12а показана вольтаметрическая сканограмма с применением метки А, соединенной с первичным амином коммерчески доступного антикозьего 1дС, применяя активный ΝΗ8 сложный эфир (Ν-гидроксисукцинимидный сложный эфир).
Следующая обобщающая схеме реакции иллюстрирует присоединение метки к свободному амину, например остатку лизина, в антикозьем 1дС.
Коммерчески доступный биотинилированный 1дС козла был иммобилизован на покрытую стрептавидином микротитровальную лунку. Метку А и антикозий 1дС затем инкубировали в лунке, содержащей иммобилизованный 1дС козла, затем удалили промыванием. В лунку добавили раствор папаина и инкубировали с обеспечение расщепления вторичного антитела, затем полученный раствор электрохимически анализировали. Контроль в этом эксперименте получили таким же образом, но конечную инкубацию осуществляли в буфере без папаина.
На фиг. 12а показано, что электрохимический сигнал при известном окислительном потенциале для метки А достигается, когда присутствует папаин, но не возникает в отсутствии папаина. Это показывает, что метка А непосредственно связана с антителом в этом анализе, и сигнал наблюдается только, когда
- 15 026116 антитело расщепляется, высвобождая электрохимическую метку.
Ь) Данные на фиг. 12Ь используют ту же модель анализа, что и в примере 7а), приведенном выше, за исключением того, что временное течение эксперимента по расщеплению папаина. В этом эксперименте контролем было вторичное антитело (антикозий !дС) с меткой А, которое было добавлено в лунку без иммобилизованного ЦС козьего антитела.
Пример 8. Метка А, связанная с микрочастицами.
Молекулу биотина связали с меткой А. Биотинилирование может быть осуществлено в автоматическом олигонуклеотидном синтезаторе или с применением стандартных лабораторных условий путем реакции ферроценилфосфорамидитной метки с Ν-гидроксисукцинимидными (ΝΗ8) сложными эфирами биотина.
Парамагнитные частицы трептавидина трижды промыли (фосфатным буфером) и смешали с биотинилированной меткой, с последующей инкубацией в течение 1 ч при комнатной температуре со смешиванием. Частицы дважды промыли (фосфатный буфер) и промыли один раз (РСК буфер). Их ресуспендировали в последнем буфере (РСК буфер).
После каждой стадии промывки супернатанты протестировали на электрохимический сигнал, и если необходимо повторно промыли, пока супернатанты не показали никакого указания на свободную электрохимическую метку.
Эти частицы проанализировали при диапазоне концентраций, чтобы подтвердить, что наблюдаемый электрохиимческий сигнал относится к метке А, связанной с магнитными частицами. Это включает магнитные захватчики частиц и повторную суспензию в диапазоне объемов буфера. Результаты показаны на фиг. 13.
Пример 9. Синтез (У^диферроценилметил-2-аминоэтокси) этанола (метка И)
Ферроценкарбоксальдегид (2.1 г, 9.81 ммоль) и (аминоэтокси) этанол (0.5 г, 4.27 ммоль) в сухом ТНР (25 мл) добавили в колбу, высушенную в печи. Натрия триацетоксиборгидрид (2.3 г, 10.90 ммоль) порционно добавили в раствор. Реакционную смесь оставили на всю ночь. Реакционную смесь растворили в этилацетате (40 мл), органический слой промыли с помощью Ναί'Ό3, (насыщенный; 20 мл), соляным раствором (20 мл) и МИНЦ водой (20 мл). Органическую фракцию затем высушили над сульфатом магния и растворитель удалили в вакууме. Неочищенный продукт затем колоночно очистили с помощью 9:1 раствора В: раствора А (раствор А: этилацетат 95% ТЕА 5%, раствор В: петролейный простой эфир 40-60 95%, ТЕА 5%) с получением чистого продукта - метки Ό (твердое вещество темно-оранжевого цвета). 85% УхеМ.
Ή ЯМР (300 МГц, СИС13) δ 4.18 (2Н, с, Ср), 4.17 (2Н, с, Ср), 4.13 (15Н, с, Ср), 3.66 (4Н, т, 1=6.25 Гц, СН2), 3.48 (2Н, с, СН2), 2.20 (2Н, т, 1=6 Гц, СН2).
13С ЯМР (75.5 Гц, СИС13) δ 77.83, 77.40, 76.98, 70.58, 68.88, 63.36, 53.02, 52.17, 33.10, 27.43, 25.88.
НКМ8 (ЕЦ), вычислено для С26Н3у02Ре2 т/ζ 501.1430, обнаружено 501.1438.
Электрохимия метки Ό показана в приведенной ниже таблице и на вольтамограмме на фиг. 14.
Таблица 5
Электрохимическая активность метки Ό
| Положение пика (мВ) | Высота пика |
| 242 | 9.3 Ιβ* |
| 245 | УзУ |
| 239 | 9.706-6 |
Пример 10. Синтез диферроцениламиноспирт НЧ2-(диферроценилметиламино)ацетил-6аминогексанол, также называемый ^(6-гидроксигексил)-2-((диферроценилметил)амино)ацетамид (метка Е) ,_/~-он
Оксалилхлорид (0.87 мл) в сухом ИСМ (2 мл) добавили по каплям с помощью капельной воронки с выравниванием давления к перемешанному раствору производного диферроценилглицина, полученного в п.3(а), приведенном выше, в сухом ИСМ (100 мл) при 0°С в атмосфере Ν2. Реакционную смесь нагрели до комнатной температуры и перемешивали в течение двух часов. Затем растворитель удалили и кислот- 16 026116 ный хлоридный продукт растворили в сухом ЭСМ (75 мл). 6-Аминогексан-1-ол (0.56 г) в сухом ЭСМ (75 мл) добавили по каплям с помощью капельной воронки 0°С в атмосфере Ν2. Реакционную смесь затем перемешивали в течение двух часов при нагревании до комнатной температуры. Раствор затем промыли с помощью Ν;·ιΗί'.Ό3 (насыщенный; 100 мл) и 1.0 М НС1 (100 мл). Органическую фракцию высушили над М§§04, затем растворитель удалили с получением продукта-метки Е (85%). Твердое вещество оранжевого/желтого.
Ή ЯМР (250 МГц, СЭСТ) δ 4.11 (12Н, с, РсСр), 3.55 (4Н, т, 1=6.0Гц, СН2), 3.31 (2Н, с, СН2), 1.481.18 (12 ч, м, СН2).
13С ЯМР (75.5Гц, СЭСТ) δ 173.32, 77.80, 77.39, 76.90, 62.10, 38.85, 35.45, 32.02, 30.67, 26.75, 25.54, 25.44.
НКМ8 (Εδ^, вычислили для С24Н25М102Ре1 т/ζ: 576.0988, нашли 576.1264.
Электрохимия метки Е проиллюстрирована на данных в таблице, показанной ниже.
Таблица 6
Электрохимическая активность метки Е
| Положение пика | Высота пика |
| 504 | 6.61А |
| 506 | 5.51е* |
| 507 | 3.28е* |
Пример 11. 6-(бис-((1'-Винилферроценил)1-метилферроценил)амино)гексан-1-ол он <+5^-Ре не
Α Αι
1'-Винилферроценкарбоксальдегид (122 мг, 0.5 ммоль) растворили в сухом ТНР (5 см3) и обработали с помощью 6-аминогексан-1-ола (29 мг, 0.25 ммоль) и натрия трисацетоксиборгидрида (205 мг, 1.25 ммоль) последовательно. Раствор перемешивали при комнатной температуре всю ночь. После этого реакцию погасили с помощью 10 см3 насыщенного ЫаНС03. Органический слой отделили, затем водный слой экстрагировали этилацетатом (3x10 см3). Объединенные органические экстракты высушили над сульфатом магния, отфильтровали, затем концентрировали в вакууме с получением твердого вещества красного цвета. Продукт очистили с помощью хроматографии на силикагеле, элюировали с помощью 1:1 (этилацетат:гексан) + 1% аммония гидроксид с получением желательного продукта в виде масла оранжевого цвета, 72 мг, выход 50%.
Ή ЯМР (500 МГц; СЭС1;) δυ 6.38 (2Н, дд, 1=17.6, 10.7 Гц, СН), 5.30 (2Н, дд, 1=10.7, 1.5 Гц, СН2), 5.03 (2Н, дд, 1=10.7, 1.5 Гц, СН2), 4.25 (4Н, т, 1=1.8 Гц, СрН), 4.15 (4Н, т, 1=1.8 Гц, СрН), 4.07 (8Н, с, СрН), 3.59 (2Н, т, 1=6.6 Гц, 0СН2), 3.32 (4Н, с, 2 х РССН2), 2.23, (2Н, арр т, 1=7.4 Гц, ЫСН2), 1.49-1.55 (2Н, м, СН2), 1.33-1.39 (2Н, м, СН2), 1.22-1.33 (4Н, м, СН2).
13С ЯМР (125 МГц; СЭС1;) 8С 134.3, 111.3, 83.7, 83.6, 71.4, 69.2, 69.0, 67.2, 62.8, 52.1, 32.7, 27.1, 25.5.
НКМ8, т/ζ (Е8Ц 566.1825 (1.8%, [М+Н], С32Н39Ре2Ы0 требует 566.1808).
Электродный потенциал: 298 мВ.
Пример 12. 6-(бис-((1 '-Бромферроценил) -1 -метилферроценил)амино)гексан- 1-о л
1'-Бромферроценкарбоксальдегид (85 мг, 0.29 ммоль) растворили в сухом ТНР (3 см3) и обработали с помощью 6-аминогексан-1-ола (25 мг, 0.144 ммоль) и натрия трисацетоксиборгидрида (59.3 мг, 0.36 ммоль), последовательно. Раствор перемешивали при комнатной температуре всю ночь. После этого реакцию погасили с помощью 5 см3 насыщенного ЫаНС03. Органический слой отделили, затем водный слой экстрагировали этилацетатом (3x10 см3). Объединенные органические экстракты высушили над сульфатом магния, отфильтровали, затем концентрировали в вакууме с получением твердого вещества красного цвета. Продукт очистили с помощью хроматографии на силикагеле, элюировали с помощью 1:1 (этилацетат:гексан) +1% аммония гидроксид с получением желательного продукта в виде масла оранжевого цвета, 17 мг, выход 17%.
Ή ЯМР (500 МГц; СЭС1;) δυ 4.32, (4Н, т, I 1.8, РсН), 4.21 (8Н, с, РсН), 4.05 (4Н, т, 1=1.8 Гц, РсН), 3.63 (2Н, т, 1=6.5 Гц, 0СН2), 3.46 (4Н, с, РССН2Ы), 2.31 (2Н, т, 1=7.1 Гц, ЫСН2), 1.45-1.58 (4Н, м, СН2),
- 17 026116
1.27-1.36 (4Н, м, СН2).
13С ЯМР (125 МГц; СИС13) 5С 78.4, 72.9, 70.8, 70.5, 68.6, 67.9, 63.1, 62.8, 52.1, 33.0, 27.3, 26.0. НКМ8, т/ζ (Ε8Ι) 669.7929 (2.7%, [М+Н], С28Н34Ре2Вг2МО требует 669.9705).
Электродный потенциал: 437 мВ.
Пример 13. 6-(бис-((2-Метилферроценил)метил)амино)гексан-1-ол
Метилферроценкарбоксальдегид (1 г, 5 ммоль) растворили в сухом ТНР (30 см3). Добавили 6-аминогексан-1-ол (0.25 г, 2.13 ммоль). Натрия триацетоксиборгидрид (1.3 г, 6.16 ммоль) добавили в реакционную смесь. Раствор перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре всю ночь. Этилацетат (20 см3) и 1 М ЫаОН (20 см3) затем добавили и органический слой затем экстрагировали с помощью насыщенного ЫаНСО3 (25 см3), соляного раствора (25 см3) и Μίΐΐί О отфильтрованной воды (25 см3), высушили над сульфатом магния, и растворитель удалили в вакууме с получением масла оранжевого цвета. Неочищенный продукт затем колоночно очистили с помощью 9:1 раствор В: раствор А (раствор А: этилацетат 95% ТЕА 5%, раствор В: петролейный простой эфир 40-60 95%, ТЕА 5%),с получением чистого продукта (масло оранжевого цвета). (0.95, 65%).
'II ЯМР (300МГц; СИС13) 5Н 4.18 (2Н, с, СрН), 4.17 (2Н, с, СрН), 4.13 (15Н, с, СрН), 3.66 (4Н, т, 1=6.25 Гц, СН2), 3.48 (2Н, с, СН2), 2.36 (3Н, с, СН3), 2.20 (2Н, т, 1=6.1 Гц, СН2), 1.59-1.31 (6Н, м, СН2).
13С ЯМР (75.5 Гц; СИС13) 5с 77.8, 77.4, 76.9, 70.5, 68.9, 63.3, 53.0, 52.1, 33.1, 27.4, 25.8, 12.4.
НКМ8, т/ζ (Ε8Ι) 539.8156 (10%, [М+Н], С30Н47М1О1ре2 требует 539.8232).
Электродный потенциал: 330 мВ.
Таблица 7
Влияние на электродный потенциал заместителей при ферроценильных составляющих метки А
| Пример | Рс заместитель | Электродный потенциал |
| 1 | нет | 275мВ |
| 2 | диметиламинометил | ЗЗОмВ |
| 11 | Ι’-винил | 298мВ |
| 12 | Т-бром | 437мВ |
| 13 | 2-метил | ЗЗОмВ |
Данные, приведенные в таблице выше, иллюстрируют как включение заместителя в ферроценильные составляющие и выбор этого заместителя могут применяться для влияния на электродный потенциал. Это делает возможным электрохимическое обнаружение соединений, осуществляемое при множестве различных условий, например выборе оптимального измерительного потенциала или избегании условий, при которых чувствительность измерения может ухудшаться под влиянием примесей, которые могут присутствовать. Кроме того, применение меток с различными электродными потенциалами обеспечивает развитие мультиплексных реакций, в которых на одном образце может осуществляться более чем одно определение.
Claims (28)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Применение в качестве метки в электрохимическом анализе соединения общей формулы I Ρο-(Χ)-Ν-(Υ)-Ρο’I (ζ)-κ , в которой Рс представляет собой незамещенный ферроценил или ферроценил, замещенный одним или более заместителями, выбранными из гало; С1-С4 алкила; С1-С4 алкила, замещенного одной или более группами, выбранными из гидрокси, гало, циано, оксо, ИН2, ΝΉΚ , ΝΚ К , где К , К и К , каждый независимо, представляют собой неразветвленный или разветвленный С1-С4 алкил, сложного эфира или амидо; циано; С2-С4 алкенила; С2-С4 алкенила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо; арила или арила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо,Рс' представляет собой незамещенный ферроценил или ферроценил, замещенный одним или более заместителями, выбранными из гало; С1-С4 алкила; С1-С4 алкила, замещенного одной или более груп2 3 4 2 3 4 пами, выбранными из гидрокси, гало, циано, оксо, ΝΉ2, ΝΉΚ , ΝΚ К , где К , К и К , каждый независимо, представляют собой неразветвленный или разветвленный С1-С4 алкил, сложного эфира или амидо;- 18 026116 циано; С2-С4 алкенила; С2-С4 алкенила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо; арила или арила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо, и может быть такой же, как Рс, или отличной от нее;X представляет собой С1-С6 алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается группами -О-, -8- или -ΝΠ5-, в которой К5 представляет собой водород или С1-С6 алкил;Υ представляет собой С1-С6 алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается группами -О-, -8- или -ΝΠ5-, в которой К5 представляет собой водород или С1-С6 алкил;Ζ представляет собой С1-С12 алкиленовую цепь, которая может быть необязательно замещена и/или может необязательно прерываться группами -О-, -8-, циклоалкил, -СО-, -СОИК1-, -ЫК1СО- или -ΝΠ1-, в которой К1 представляет собой водород или С1-С4 алкил; иК представляет собой гидроксигруппу или защищенную гидроксигруппу, где электрохимический анализ предназначен для обнаружения электрохимически меченого субстрата и где субстрат выбирается из аминокислот, нуклеотидов, нуклеозидов, сахаров, пептидов, белков, олигонуклеотидов, полинуклеотидов и углеводов.
- 2. Применение по п.1, отличающееся тем, чтоX представляет собой С1-С6 алкилен, необязательно прерывающийся кислородом;Υ представляет собой С1-С6 алкилен, необязательно прерывающийся кислородом,Ζ представляет собой С1-С8 алкилен, необязательно прерывающийся кислородом.
- 3. Применение по п.1, отличающееся тем, чтоX представляет собой группу -(СН2)Х-, в которой х равно 1 или 2;Υ представляет собой группу -(СН2)У-, в которой у равно 1 или 2;Ζ представляет собой группу (СН2)а в которой ζ равно от 1 до 8.
- 4. Применение по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что Рс и Рс' являются одинаковыми и X и Υ являются одинаковыми.
- 5. Применение по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что анализ предназначен для обнаружения биологического субстрата, выбранного из нуклеотидов, нуклеозидов, олигонуклеотидов и полинуклеотидов.
- 6. Применение по любому из пп.1-5, отличающееся тем, что анализ предназначен для обнаружения биологического субстрата, выбранного из аминокислот, пептидов и белков.
- 7. Способ получения функционализированного, вносящего метку соединения, содержащего обеспечивающую метку составляющую, для применения в электрохимическом анализе, включающий реакцию соединения общей формулы IРс - (X) - N - (Υ) - Рс’I (Ζ)-Κ , в которой Рс представляет собой незамещенный ферроценил или ферроценил, замещенный одним или более заместителями, выбранными из гало; С1-С4 алкила; С1-С4 алкила, замещенного одной или более группами, выбранными из гидрокси, гало, циано, оксо, ΝΗ2, ХНК , ΝΠ К , где К , К и К , каждый независимо, представляют собой неразветвленный или разветвленный С1-С4 алкил, сложного эфира или амидо; циано; С2-С4 алкенила; С2-С4 алкенила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо; арила или арила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо,Рс' представляет собой незамещенный ферроценил или ферроценил, замещенный одним или более заместителями, выбранными из гало; С1-С4 алкила; С1-С4 алкила, замещенного одной или более груп2 3 4 2 3 4 пами, выбранными из гидрокси, гало, циано, оксо, ΝΗ2, ХНК , ΝΠ К , где К , К и К , каждый независимо, представляют собой неразветвленный или разветвленный С1-С4 алкил, сложного эфира или амидо; циано; С2-С4 алкенила; С2-С4 алкенила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо; арила или арила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо, и может быть такой же, как Рс, или отличной от нее;X представляет собой С1-С6 алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается группами -О-, -8- или -ΝΕ5-, в которой К5 представляет собой водород или С1-С6 алкил;Υ представляет собой С1-С6 алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается группами -О-, -8- или -ΝΒ5-, в которой К5 представляет собой водород или С1-С6 алкил;Ζ представляет собой С1-С12 алкиленовую цепь, которая может быть необязательно замещена и/или может необязательно прерываться группами -О-, -8-, циклоалкил, -СО-, -СОХК1-, -ЫК1СО- или -ΝΒ1-, в которой К1 представляет собой водород или С1-С4 алкил; иК представляет собой гидроксигруппу или защищенную гидроксигруппу, с функционализирующим соединением, с получением функционализированного вносящего метку соединения общей формулы IIIА-Ь-Р III, в которой А представляет собой- 19 026116 где Рс, Рс', X, Υ и Ζ являются такими, как определено выше,Р представляет собой функционализирующую группу для реакции с субстратом, выбранным из аминокислот, нуклеотидов, нуклеозидов, сахаров, пептидов, белков, олигонуклеотидов, полинуклеотидов и углеводов, где функционализирующая группа Р выбирается из сукцинимидиловых сложноэфирных групп, фосфорамидитных групп, малеимидных групп, биотиновых и азидных групп; иЬ представляет собой -О-.
- 8. Способ получения меченого субстрата, включающий реакцию соединения общей формулы III а - ь - Р III, в которой А, Р и Ь являются таким, как заявлено в п.7;с субстратом, с формированием меченого субстрата, где субстрат выбирается из аминокислот, нуклеотидов, нуклеозидов, сахаров, пептидов, белков, олигонуклеотидов, полинуклеотидов и углеводов.
- 9. Способ по п.8, в котором субстратом является биологический субстрат, выбранный из нуклеотидов, нуклеозидов, олигонуклеотидов и полинуклеотидов.
- 10. Способ по п.8, в котором субстратом является биологический субстрат, выбранный из аминокислот, пептидов и белков.
- 11. Функционализированное, вносящее метку соединение для применения в способе по любому из пп.8-10, отличающееся тем, что функционализированное вносящее метку соединение имеет общую формулу IIIА-Ь-Р III, в которой А представляет собой обеспечивающую метку составляющую общей формулы !а в которой Рс представляет собой незамещенный ферроценил или ферроценил, замещенный одним или более заместителями, выбранными из гало; С1-С4 алкила; С1-С4 алкила, замещенного одной или более группами, выбранными из гидрокси, гало, циано, оксо, ΝΗ2, ΝΗΒ , ΝΒ К , где К , К и К , каждый независимо, представляют собой неразветвленный или разветвленный С1-С4 алкил, сложного эфира или амидо; циано; С2-С4 алкенила; С2-С4 алкенила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо; арила или арила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо,Рс' представляет собой незамещенный ферроценил или ферроценил, замещенный одним или более заместителями, выбранными из гало; С1-С4 алкила; С1-С4 алкила, замещенного одной или более груп2 3 4 2 3 4 пами, выбранными из гидрокси, гало, циано, оксо, ΝΗ2, ΝΗΒ , ΝΒ К , где К , К и К , каждый независимо, представляют собой неразветвленный или разветвленный С1-С4 алкил, сложного эфира или амидо; циано; С2-С4 алкенила; С2-С4 алкенила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо; арила или арила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо, и может быть такой же, как Рс, или отличной от нее;X представляет собой С1-С6 алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается группами -О-, -8- или -ΝΒ5-, в которой К5 представляет собой водород или С1-С6 алкил;Υ представляет собой С1-С6 алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается группами -О-, -8- или -ΝΒ5-, в которой К5 представляет собой водород или С1-С6 алкил;Ζ представляет собой С1-С12 алкиленовую цепь, которая может быть необязательно замещена и/или может необязательно прерываться группами -О-, -8-, циклоалкил, -СО-, -ΟΟΝΗ1-, -ΧΑΡΟ- или -ΝΗ1-, в которой К1 представляет собой водород или С1-С4 алкил;Ь представляет собой -О-;и в которой Р представляет собой функционализирующую группу для реакции с субстратом, выбранным из аминокислот, нуклеотидов, нуклеозидов, сахаров, пептидов, белков, олигонуклеотидов, полинуклеотидов и углеводов, где функционализирующая группа Р выбирается из сукцинимидиловых сложноэфирных групп, фосфорамидитных групп, малеимидных групп, биотиновых и азидных групп, для присоединения обеспечивающей метку составляющей к субстрату.
- 12. Функционализированное, вносящее метку соединение по п.11, в котором функционализирующая группа представляет собой фосфорамидитную составляющую.
- 13. Меченый субстрат для применения в электрохимическом анализе, отличающийся тем, что меченый субстрат имеет общую формулу ШаА-Ь-Р’-[8] Ша, в которой А представляет собой- 20 026116Рс _ (X) _ Ν - (Υ) - Рс’ в которой Рс представляет собой незамещенный ферроценил или ферроценил, замещенный одним или более заместителями, выбранными из гало; С1-С4 алкила; С1-С4 алкила, замещенного одной или более группами, выбранными из гидрокси, гало, циано, оксо, ΝΗ2, ΝΗΚ , ΝΚ К , где К , К и К , каждый независимо, представляют собой неразветвленный или разветвленный С1-С4 алкил, сложного эфира или амидо; циано; С2-С4 алкенила; С2-С4 алкенила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо; арила или арила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо,Рс' представляет собой незамещенный ферроценил или ферроценил, замещенный одним или более заместителями, выбранными из гало; С1-С4 алкила; С1-С4 алкила, замещенного одной или более груп2 3 4 2 3 4 пами, выбранными из гидрокси, гало, циано, оксо, ΝΗ2, ΝΗΚ , ΝΚ К , где К , К и К , каждый независимо, представляют собой неразветвленный или разветвленный С1-С4 алкил, сложного эфира или амидо; циано; С2-С4 алкенила; С2-С4 алкенила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо; арила или арила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо, и может быть такой же, как Рс, или отличной от нее;X представляет собой С1-С6 алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается группами -О-, -8- или -ΝΡ5-. в которой К5 представляет собой водород или С1-С6 алкил;Υ представляет собой С1-С6 алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается группами -О-, -8- или -ΝΗ5-, в которой К5 представляет собой водород или С1-С6 алкил;Ζ представляет собой С1-С12 алкиленовую цепь, которая может быть необязательно замещена и/или может необязательно прерываться группами -О-, -8-, циклоалкил, -СО-, -СОХК1-, -ЫК1СО- или -Ν^1-, в которой К1 представляет собой водород или С1-С4 алкил;Ь-Р' представляет собой связывающую составляющую, производную от -О-Р-, где Р представляет собой функционализирующую группу для реакции с субстратом для присоединения вносящей метку составляющей к субстрату, где функционализирующая группа Р выбирается из сукцинимидиловых сложноэфирных групп, фосфорамидитных групп, малеимидных групп, биотиновых и азидных групп; и [8] представляет собой субстрат, выбранный из аминокислот, нуклеотидов, нуклеозидов, сахаров, пептидов, белков, олигонуклеотидов, полинуклеотидов и углеводов.
- 14. Меченый субстрат по п.13, отличающийся тем, что субстрат представляет собой биологическую молекулу, выбранную из аминокислот, нуклеотидов, нуклеозидов, сахаров, пептидов, белков, олигонуклеотидов, полинуклеотидов и углеводов.
- 15. Меченый субстрат по п.13 или 14, отличающийся тем, что субстрат выбирается из нуклеотидов, нуклеозидов, олигонуклеотидов и полинуклеотидов.
- 16. Меченый субстрат по любому из пп.13-15, отличающийся тем, что субстрат представляет собой или содержит олигонуклеотид.
- 17. Меченый субстрат по п.13 или 14, отличающийся тем, что субстрат выбирается из аминокислот, сахаров, пептидов и белков.
- 18. Набор для анализа для обнаружения присутствия аналитической мишени, отличающийся тем, что он содержит меченый субстрат по любому из пп.13-17.
- 19. Соединение общей формулы IРс _ (X) _ N - (Υ) - Рс’ (Ζ)-Κ в которой Рс представляет собой незамещенный ферроценил или ферроценил, замещенный одним или более заместителями, выбранными из гало; С1-С4 алкила; С1-С4 алкила, замещенного одной или более группами, выбранными из гидрокси, гало, циано, оксо, ΝΗ2, ΝΗΒ , ΝΒ К , где К , К и К , каждый независимо, представляют собой неразветвленный или разветвленный С1-С4 алкил, сложного эфира или амидо; циано; С2-С4 алкенила; С2-С4 алкенила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо; арила или арила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо;Рс' представляет собой незамещенный ферроценил или ферроценил, замещенный одним или более заместителями, выбранными из гало; С1-С4 алкила; С1-С4 алкила, замещенного одной или более груп2 3 4 2 3 4 пами, выбранными из гидрокси, гало, циано, оксо, ΝΗ2, ΝΗΒ , ΝΒ К , где К , К и К , каждый независимо, представляют собой неразветвленный или разветвленный С1-С4 алкил, сложного эфира или амидо; циано; С2-С4 алкенила; С2-С4 алкенила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо; арила или арила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо, и может быть такой же, как Рс, или отличной от нее;X представляет собой С1-С6 алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается группами -О-, -8- или -№К5-, в которой К5 представляет собой водород или С1-С6 алкил;- 21 026116Υ представляет собой С1-С6 алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается группами -О-, -8- или -ΝΚ5-, в которой К5 представляет собой водород или С1-С6 алкил;Ζ представляет собой С1-С12 алкиленовую цепь, которая может быть необязательно замещена и/или может необязательно прерываться группами -О-, -8-, циклоалкил, -СО-, -СОМК1-, -ЧК'СО- или -ΝΚ1-, в которой Κ1 представляет собой водород или С1-С4 алкил; иΚ представляет собой гидроксигруппу или защищенную гидроксигруппу.
- 20. Соединение по п.19, отличающееся тем, что каждая ферроценильная составляющая имеет по меньшей мере один заместитель, выбранный из галогена, С1-С4-алкила, гало(С1-С4)алкила, арила, С2-С4 алкенила и циано.
- 21. Соединение общей формулы IΡο-(Χ)-Ν-(Υ)-Ρο’I (г)-к , в которой Рс и Рс', каждая, представляют собой незамещенный ферроценил,X представляет собой С1-С6 алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается группами -О-, -8- или -ΝΚ5-, в которой Κ5 представляет собой водород или С1-С6 алкил;Υ представляет собой С1-С6 алкиленовую цепь, которая необязательно прерывается группами -О-, -8- или -ΝΚ5-, в которой Κ5 представляет собой водород или С1-С6 алкил;Ζ представляет собой С6-С12 алкиленовую цепь или представляет собой С1-С12 алкилен, который замещен одним или более заместителями и/или прерывается составляющей, выбранной из -О-, -8-, циклоалкил, -СО-, -СОЫК1-, -ΝΚΧ,Ό- или -ΝΚ1-, в которой К1 представляет собой водород или С1-С4 алкил; иΚ представляет собой гидроксигруппу или защищенную гидроксигруппу.
- 22. Соединение по любому из пп.19-21, отличающееся тем, чтоX представляет собой группу -(СН2)Х-, в которой х равно от 1 до 6; и Υ представляет собой группу -(СН2)У-, в которой у равно от 1 до 6.
- 23. Соединение по любому из пп.19-22, в котором Ζ представляет собой С6-С8 алкилен, необязательно прерывающийся кислородом.
- 24. Соединение, выбранное изΝ,Ν-диферроценилметил-баминогексансл (К,Ъ}-диферроценилметил-2амнноэтокси)этанол- 22 026116
- 25. Ν,Ν-Диферроценилметил-б-аминогексанол или его производное, в котором обе ферроценильные группы замещены одним или более заместителями, выбранными из гало; С1-С4 алкила; С1-С4 алкила, замещенного одной или более группами, выбранными из гидрокси, гало, циано, оксо, ΝΗ2, ΝΗΚ , ΝΚ К , где К , К и К , каждый независимо, представляют собой неразветвленный или разветвленный С1-С4 алкил, сложного эфира или амидо; циано; С2-С4 алкенила; С2-С4 алкенила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо; арила или арила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо.
- 26. Меченый субстрат, содержащий обеспечивающую метку составляющую, полученную из Ν,Ν-диферроценилметил-б-аминогексанола или из его производного, в котором обе ферроценильные группы замещены одним или более заместителями, выбранными из гало; С1-С4 алкила; С1-С4 алкила, замещенного одной или более группами, выбранными из гидрокси, гало, циано, оксо, ΝΗ2, ΝΗΚ , ΝΚ К , где К , К и К , каждый независимо, представляют собой неразветвленный или разветвленный С1-С4 алкил, сложного эфира или амидо; циано; С2-С4 алкенила; С2-С4 алкенила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложным эфиром- 23 026116 или амидо; арила или арила, замещенного гидрокси, гало, циано, оксо, амино, сложным эфиром или амидо, где субстрат выбирается из аминокислот, нуклеотидов, нуклеозидов, сахаров, пептидов, белков, олигонуклеотидов, полинуклеотидов и углеводов.
- 27. Способ обнаружения нуклеиновой кислоты, включающий контакт нуклеиновой кислоты с зондом из комплементарной нуклеиновой кислоты в условиях, которые обеспечивают гибридизацию между зондом и ампликоном, с последующей стадией селективного разрушения либо гибридизованного, либо негибридизованного зонда, где указанный зонд помечен соединением по любому из пп.19-26 и где способ обеспечивает стадию измерения электрохимической активности соединения, вносящего метку в зонд, где указанная электрохимическая активность либо количественно, либо качественно зависит от степени разрушения зонда.
- 28. Способ обнаружения аминокислоты, пептида или белка, помеченных соединением по любому их пп.19-26, включающий стадию измерения электрохимической активности соединения.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB1021896.4A GB201021896D0 (en) | 2010-12-22 | 2010-12-22 | Novel compounds and their use in analytical methods |
| PCT/GB2011/052573 WO2012085591A1 (en) | 2010-12-22 | 2011-12-22 | Novel ferrocene labels for electrochemical assay and their use in analytical methods |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201390916A1 EA201390916A1 (ru) | 2014-01-30 |
| EA026116B1 true EA026116B1 (ru) | 2017-03-31 |
Family
ID=43598931
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201390916A EA026116B1 (ru) | 2010-12-22 | 2011-12-22 | Ферроценовые метки для электрохимического анализа и их применение в аналитических способах |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US20140051080A1 (ru) |
| EP (1) | EP2655387B1 (ru) |
| JP (1) | JP5898693B2 (ru) |
| CN (1) | CN103459407B (ru) |
| AU (1) | AU2011346861B2 (ru) |
| BR (1) | BR112013016240B1 (ru) |
| CA (1) | CA2822477C (ru) |
| DK (1) | DK2655387T3 (ru) |
| EA (1) | EA026116B1 (ru) |
| ES (1) | ES2528700T3 (ru) |
| GB (1) | GB201021896D0 (ru) |
| HK (1) | HK1191015A1 (ru) |
| WO (1) | WO2012085591A1 (ru) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB201021896D0 (en) | 2010-12-22 | 2011-02-02 | Atlas Genetics Ltd | Novel compounds and their use in analytical methods |
| GB201211157D0 (en) | 2012-06-22 | 2012-08-08 | Atlas Genetics Ltd | Novel compounds and their use in analytical methods |
| GB201312995D0 (en) * | 2013-07-19 | 2013-09-04 | Atlas Genetics Ltd | Methods and kits for specific nucleic acid amplification and detection |
| GB2516666B (en) | 2013-07-29 | 2015-09-09 | Atlas Genetics Ltd | Fluidic cartridge for nucleic acid amplification and detection |
| GB2516669B (en) | 2013-07-29 | 2015-09-09 | Atlas Genetics Ltd | A method for processing a liquid sample in a fluidic cartridge |
| GB2516672B (en) | 2013-07-29 | 2015-05-20 | Atlas Genetics Ltd | A system and method for expelling liquid from a fluidic cartridge |
| GB2516675A (en) | 2013-07-29 | 2015-02-04 | Atlas Genetics Ltd | A valve which depressurises, and a valve system |
| GB2516667A (en) | 2013-07-29 | 2015-02-04 | Atlas Genetics Ltd | An improved cartridge, cartridge reader and method for preventing reuse |
| US9822398B2 (en) | 2013-10-08 | 2017-11-21 | Atlas Genetics Limited | Labelling compounds and their use in assays |
| GB201416459D0 (en) | 2014-09-17 | 2014-10-29 | Atlas Genetics Ltd | Detection method |
| GB201501705D0 (en) | 2015-02-02 | 2015-03-18 | Atlas Genetics Ltd | Instrument for performing a diagnostic test on a fluidic cartridge |
| GB2531615B (en) | 2015-02-02 | 2017-11-22 | Atlas Genetics Ltd | Instrument for performing a diagnostic test on a fluidic cartridge |
| GB2531616B (en) | 2015-02-02 | 2017-11-22 | Atlas Genetics Ltd | Instrument for performing a diagnostic test on a fluidic cartridge |
| EP3419989A4 (en) * | 2016-02-26 | 2019-11-06 | Alere San Diego, Inc. | OXIDIZED REDUCED OLIGONUCLEOTIDE PROBES AND USE THEREOF |
| GB2556879A (en) * | 2016-11-22 | 2018-06-13 | Mahle Engine Systems Uk Ltd | Sliding component, material and method |
| CN106866748B (zh) * | 2017-03-29 | 2018-05-15 | 厦门云凡医药科技有限公司 | 化合物的制备方法 |
| JP2018203652A (ja) * | 2017-05-31 | 2018-12-27 | 島根県 | フェロセン化ナフタレンジイミド誘導体、テロメラーゼ活性検出キット、およびテロメラーゼ活性検出方法 |
| CN109827898B (zh) * | 2019-03-29 | 2021-09-17 | 河海大学 | 一种金属腐蚀试验装置 |
| CN114113252B (zh) * | 2021-11-22 | 2024-02-09 | 常州大学 | 一种手性介孔二氧化硅微球的制备方法及其应用方法 |
| CN114349800B (zh) * | 2021-12-08 | 2023-08-15 | 深圳清华大学研究院 | 一种二茂铁衍生物及其合成方法和应用 |
| CN114891836A (zh) * | 2022-05-31 | 2022-08-12 | 重庆张邦医药科技有限责任公司 | 一种手性二茂铁衍生物的制备方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003074731A2 (en) * | 2002-03-07 | 2003-09-12 | Molecular Sensing Plc | Nucleic acid probes, their synthesis and use |
| WO2005005657A1 (en) * | 2003-07-09 | 2005-01-20 | Molecular Sensing Plc | Protease detection assay |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003125798A (ja) * | 2001-08-28 | 2003-05-07 | Fuji Photo Film Co Ltd | 試料遺伝子中の塩基配列の確認方法 |
| JP2006098342A (ja) * | 2004-09-30 | 2006-04-13 | Kyushu Univ | 異常プリオンの電気化学的検出方法 |
| GB0504851D0 (en) * | 2005-03-09 | 2005-04-13 | E2V Tech Uk Ltd | Biosensor labelling groups |
| JP4561478B2 (ja) * | 2005-05-26 | 2010-10-13 | セイコーエプソン株式会社 | 多型検出方法、多型検出用キット |
| GB201021896D0 (en) * | 2010-12-22 | 2011-02-02 | Atlas Genetics Ltd | Novel compounds and their use in analytical methods |
| GB201211157D0 (en) * | 2012-06-22 | 2012-08-08 | Atlas Genetics Ltd | Novel compounds and their use in analytical methods |
| US9822398B2 (en) * | 2013-10-08 | 2017-11-21 | Atlas Genetics Limited | Labelling compounds and their use in assays |
-
2010
- 2010-12-22 GB GBGB1021896.4A patent/GB201021896D0/en not_active Ceased
-
2011
- 2011-12-22 WO PCT/GB2011/052573 patent/WO2012085591A1/en active Application Filing
- 2011-12-22 US US13/996,748 patent/US20140051080A1/en not_active Abandoned
- 2011-12-22 CA CA2822477A patent/CA2822477C/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-12-22 CN CN201180067208.XA patent/CN103459407B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2011-12-22 AU AU2011346861A patent/AU2011346861B2/en active Active
- 2011-12-22 ES ES11805925.2T patent/ES2528700T3/es active Active
- 2011-12-22 JP JP2013545508A patent/JP5898693B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2011-12-22 EA EA201390916A patent/EA026116B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2011-12-22 BR BR112013016240-6A patent/BR112013016240B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2011-12-22 DK DK11805925.2T patent/DK2655387T3/en active
- 2011-12-22 EP EP11805925.2A patent/EP2655387B1/en active Active
-
2014
- 2014-04-29 HK HK14104069.2A patent/HK1191015A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2018
- 2018-02-28 US US15/908,133 patent/US10495600B2/en active Active
-
2019
- 2019-10-29 US US16/666,750 patent/US10830728B2/en active Active
-
2020
- 2020-11-10 US US17/094,473 patent/US11768167B2/en active Active
-
2023
- 2023-08-15 US US18/449,936 patent/US20230393089A1/en active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003074731A2 (en) * | 2002-03-07 | 2003-09-12 | Molecular Sensing Plc | Nucleic acid probes, their synthesis and use |
| WO2005005657A1 (en) * | 2003-07-09 | 2005-01-20 | Molecular Sensing Plc | Protease detection assay |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CLARA BALDOLI, CLARA RIGAMONTI, STEFANO MAIORANA, EMANUELA LICANDRO, LUIGI FALCIOLA, PATRIZIA ROMANA MUSSINI: "A new triferrocenyl-tris(hydroxymethyl)aminomethane derivative as a highly sensitive electrochemical marker of biomolecules: Application to the labelling of PNA monomers and their electrochemical characterization", CHEMISTRY - A EUROPEAN JOURNAL, vol. 12, no. 15, 15 May 2006 (2006-05-15), pages 4091 - 4100, XP002670228, ISSN: 0947-6539, DOI: DOI:10.1002/CHEM.200501466 * |
| JULIO ALVAREZ, ANGEL E. KAIFER: "Structural and pH Control on the Electronic Communication between Two Identical Ferrocene Sites", ORGANOMETALLICS, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 18, no. 26, 1 January 1999 (1999-01-01), US, pages 5733 - 5734, XP002670227, ISSN: 0276-7333, DOI: 10.1021/OM990678R * |
| PAUL D. BEER, DAVID K. SMITH: "Tunable bis(ferrocenyl) receptors for the solution-phase electrochemical sensing of transition-metal cations", JOURNAL OF THE CHEMICAL SOCIETY, DALTON TRANSACTIONS., CHEMICAL SOCIETY. LETCHWORTH., GB, no. 3, 1 January 1998 (1998-01-01), GB, pages 417 - 423, XP002670230, ISSN: 1472-7773, DOI: 10.1039/A707278C * |
| SATO S, ET AL: "ELECTROCHEMICAL DETECTION OF TELOMERIC QUADRUPLEX DNA USING FERROCENYL NAPHTHALENE DIIMIDE", NUCLEIC ACIDS SYMPOSIUM SERIES, OXFORD UNIVERSITY PRESS, GB, vol. 49, 1 January 2005 (2005-01-01), GB, pages 237 - 238, XP002670229, ISSN: 0261-3166, DOI: 10.1093/nass/49.1.237 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2822477A1 (en) | 2012-06-28 |
| US20210116409A1 (en) | 2021-04-22 |
| US20140051080A1 (en) | 2014-02-20 |
| US20180252664A1 (en) | 2018-09-06 |
| JP5898693B2 (ja) | 2016-04-06 |
| US10495600B2 (en) | 2019-12-03 |
| EP2655387B1 (en) | 2014-10-29 |
| JP2014501925A (ja) | 2014-01-23 |
| AU2011346861B2 (en) | 2015-05-21 |
| EA201390916A1 (ru) | 2014-01-30 |
| US11768167B2 (en) | 2023-09-26 |
| HK1191015A1 (en) | 2014-07-18 |
| US10830728B2 (en) | 2020-11-10 |
| BR112013016240B1 (pt) | 2019-05-21 |
| CN103459407A (zh) | 2013-12-18 |
| WO2012085591A1 (en) | 2012-06-28 |
| EP2655387A1 (en) | 2013-10-30 |
| AU2011346861A1 (en) | 2013-07-18 |
| CN103459407B (zh) | 2016-05-04 |
| BR112013016240A2 (pt) | 2016-09-27 |
| CA2822477C (en) | 2016-09-13 |
| DK2655387T3 (en) | 2014-12-15 |
| ES2528700T3 (es) | 2015-02-11 |
| GB201021896D0 (en) | 2011-02-02 |
| US20200064299A1 (en) | 2020-02-27 |
| US20230393089A1 (en) | 2023-12-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA026116B1 (ru) | Ферроценовые метки для электрохимического анализа и их применение в аналитических способах | |
| US12111320B2 (en) | 1,1′-[(substituted alkyl)imino]bis(alkylene)]bis-ferrocenes and their use in electrochemical assays by labelling substrates of interest | |
| JP2009148284A (ja) | 電気化学的に活性な化合物 | |
| US11572592B2 (en) | Labelling compounds and their use in assays | |
| Yi et al. | Aptamer-aided target capturing with biocatalytic metal deposition: An electrochemical platform for sensitive detection of cancer cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |