CN103954618A - 一种利用比色法测定葡萄糖浓度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种利用比色法测定葡萄糖浓度的方法，其包括以下步骤：采用葡萄糖氧化酶催化样品中的葡萄糖，使之释放出过氧化氢；同时向样品中添加辣根过氧化物酶与金纳米棒，辣根过氧化物酶催化过氧化氢对金纳米棒的蚀刻，待金纳米棒的颜色稳定后，采用比色法确定样品中葡萄糖浓度。本发明特别采用辣根过氧化物酶催化过氧化氢对金纳米棒的蚀刻反应，使之能够在温和的反应条件下进行，操作简便且对样品的损伤小，能够被广泛应用于食品、制药、医疗行业中进行葡萄糖浓度的检测。

Description

一种利用比色法测定葡萄糖浓度的方法
技术领域
本发明涉及生物小分子有机物浓度测定的技术领域，具体涉及一种利用比色法测定葡萄糖浓度的方法。
背景技术
贵金属纳米粒子对其自身大小、形状及组成具有非常敏感的物理性质。尤其是金纳米粒子在可见光及远红外环境下，其纵横比的变化可以可以特别地表导致强烈的局部表面等离子共振（LSPRs）大的表面积和良好的生物兼容性等优点,广泛应用于化学和生物传感载体。
在生物技术领域，通常需要对样品中的葡萄糖浓度进行测定。由于葡萄牙被氧化后可产生过氧化氢，现有采用将葡萄糖分解出过氧化氢去蚀刻金纳米棒，由于在这一蚀刻反应中金纳米棒各个方向上的蚀刻效率不一致，最终可改变金纳米棒的纵横比后，使金纳米棒产生颜色变化，以比色法便确定样品葡萄糖的浓度。但现有的大部分纳米金属颗粒其对过氧化氢的敏感度降低，上述的蚀刻反应需在低pH、高温、高过氧化氢的环境下方可进行。而样品中的葡萄糖往往难以提供足量的过氧化氢，故上述的检测方法敏感度低。且在这种剧烈的反应条件下，样品常常会发生变质。因此现有的金纳米棒作为传感器测定葡萄糖浓度的方法实质上并无真正的实用价值。现有采用铁离子或铜离子等金属离子来做催化剂催化上述蚀刻反应的，但这种催化剂的特异性较低，对反应活化能的降低效果不明显，且其反应条件仍然较为剧烈，致使其无法被实际应用。
发明内容
有鉴于此，本发明公开一种对低浓度葡萄糖敏感的、特异性高、反应条件温和的利用比色法测定葡萄糖浓度的方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：一种利用比色法测定葡萄糖浓度的方法，其包括以下步骤：
采用葡萄糖氧化酶催化样品中的葡萄糖，使之释放出过氧化氢；同时向样品中添加辣根过氧化物酶与金纳米棒，辣根过氧化物酶催化过氧化氢对金纳米棒的蚀刻，待金纳米棒的颜色稳定后，采用比色法确定样品中葡萄糖浓度。
所述辣根氧化酶可采用市售产品实现，其由具有308个氨基酸残基的糖蛋白以及作为活性中心的血红素组成，并且能催化各种电子供体底物，包括2,3 - 二甲氧基苯酚，邻甲氧基苯酚，5 - 氨基-2,3 - 二氢-1，4的氧化 - 二氮杂萘二酮（鲁米诺），2,2' - 连氮基 - 双（3 - 乙基苯并噻唑-6 - 磺酸）（ABTS），3,3'，5,5' - 四甲基联苯胺（TMB）。该催化反应具有三个步骤。第一步，具有蛋白质外壳的复合氯化血红素被过氧化氢氧化，在氯化血红素和过氧化氢的一个氧原子间形成共价双键，获得具有氧化高价铁基(FeIV=O)的氯化血红素衍生物——化合物I。上述衍生物可通过单电子转移氧化第一底物分子，释放出π-正离子自由基。得到的的仍然具有氧化高价铁基的中间产物，即化合物II。第二底物分子通过单电子转移到含有Fe3+的三价血红素，从而使化合物II含量下降。在这一过程中，氧获得两个质子形成水分子，从而从所述氧化高价铁基中释放出来。如下面的方程所示，在上述的HRP反应循环中，两个底物分子(AH)被转化为两个自由基（A.）。
Native HRP+H2O2→Compound I.+
Compound I.+ +AH→Compound II++ A.
Compound II++AH→ Native HRP+H2O+ A.
本发明中，采用了辣根过氧化物酶催化过氧化氢对金纳米棒的蚀刻反应，辣根过氧化物酶能够有效降低上述蚀刻反应的活化能，使反应能够在温和的条件下进行。同时，由于反应的活化能降低，微量的过氧化氢也能够与金纳米棒发生反应，从而有效提高了本发明检测方法的灵敏度。同时，作为活性中心的血红素只能与特异性的底物——即过氧化氢和金纳米棒——结合，因此本发明的方法也具有良好的特异性。所述的比色法可以采用现有的比色法实现，具体而言，即首先配置一个浓度梯度的葡萄糖标准溶液，按照上述的检测方法，使之与金纳米棒反应，当金纳米棒不再变色后，根据金纳米棒最终的色度制作不同浓度的比色卡。
进一步的，还包括在辣根过氧化物酶催化过氧化氢对金纳米棒蚀刻前，添加卤化物。
金纳米棒的在制备过程中可能会用到含有卤元素的表面活性剂。通常而言，在使用金纳米棒前，会采用离心法对金纳米棒进行纯化，以除去上述含有卤元素的表面活性剂。但设计人在设计本发明技术方案中意外地发现，若金纳米棒上仍有卤化物残存时，上述的蚀刻反应更加容易进行。为排除其他影响因子。设计人还对纯化后的金纳米棒另外加入卤化物，与未加卤化物的对照组相比，最终验证得在卤化物对蚀刻反应的促进效果。
更进一步的，所述卤化物可选自十六烷基三甲基溴化铵或碘化钠或溴化钠或溴化铵的任一种。
本发明还提供一种葡萄糖检测反应体系，其组分包含：葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、金纳米棒、卤化物与硅胶。
由于辣根过氧化物酶与其他生物酶有较好的相容性，可以将葡萄糖氧化酶与之络合，以提高检测的效率。采用本发明提供的葡萄糖检测反应体系进行检测时，只需将待测样品滴加到上述的体系中，便可直接通过肉眼采用比色法完成对样品中葡萄糖浓度的确定，这一操作简便、快捷，无需经过专业的训练，特别有利于本技术的大规模推广。
进一步的，所述葡萄糖检测反应体系中葡萄糖氧化酶的浓度为30—60nM，辣根过氧化物酶浓度为0.5—2μM，卤化物浓度为1-10mM，金纳米棒的浓度按金单质计为0.10—0.20mM，以及余量的硅胶。
更进一步的，所述葡萄糖检测反应体系中还包含有20mM的柠檬酸盐缓冲液；所述葡萄糖检测反应体系的pH为3.8—4.1。
辣根氧化物酶及葡萄糖氧化酶在pH为3.8—4.1，具有较高的反应活性。超出此范围，有可能导致两种酶的失活。柠檬酸盐缓冲液则能够使体系的pH处于较为稳定的状态。
本发明还提供一种上述葡萄糖检测反应体系的制备方法，包括以下工序：a.制备金纳米棒；b.制备硅酸盐前体；c.向硅酸盐前体中添加葡萄糖氧化酶、金纳米棒、辣根过氧化物酶、卤化物及柠檬酸盐缓冲液；d.固化葡萄糖检测反应体系。
进一步的，葡萄糖检测反应体系的制备方法，其特征在于所述金纳米棒的制备是指将浓度为0.05 M的氯金酸溶液0.025-0.030毫升和浓度为0.1 M十六烷基三甲基溴化铵3-5毫升加入新鲜配制的浓度为0.01M硼氢化钠溶液0.3毫升形成的晶核后，加入生长溶液所制成的；所述生长溶液其原料包括浓度0.1M抗坏血酸0.05-0.10毫升、浓度0.05M的氯金酸0.1-0.3毫升、浓度0.01M硝酸银0.10-0.15毫升、浓度1M的盐酸溶液0.15-0.20 毫升和0.1M 的十六烷基三甲基溴化铵10-20mL。
进一步的，还需除去金纳米棒中的卤素，具体为将制得的金纳米棒以7000rpm下离心处理20分钟，弃去上清液。
除去金纳米棒上残存的卤素，有利于实现对体系中卤化物浓度的精确控制。
更进一步的，制备硅酸盐前体是指按重量份计，将1-5份的硅酸钠与10—20份的去离子水混合成硅酸钠溶液，然后向其加入按重量份计3—8份的阳离子交换树脂，以除去过酸钠溶液中的钠离子和氢离子，直至所述硅酸钠溶液的pH为3.8—4.1，即获得所述硅酸盐前体；所述固化葡萄糖检测反应体系是指将葡萄糖反应体系置于微孔板中，在4℃下静置48小时。
在进行检测前的48小时制备本发明的体系，能够使葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶均处于较为活跃的状态，提高本发明体系的灵敏度及检测效率。
本发明相对于现有技术，具有如下有益效果：
1.本发明特别采用辣根过氧化物酶催化过氧化氢对金纳米棒的蚀刻反应，使之能够在温和的反应条件下进行，操作简便且对样品的损伤小，能够被广泛应用于食品、制药、医疗行业中进行葡萄糖浓度的检测。
2.本发明采用辣根过氧化物酶催化过氧化氢对金纳米棒的蚀刻反应，在过氧化氢浓度极低的条件下仍能进行对金纳米棒的蚀刻，最终使得本发明的检测方法对样品中低浓度的葡萄糖具有较高的灵敏度。经验证，本发明的检测方法对葡萄糖的灵敏度达到μM级。
3.本发明构建了葡萄糖检测反应体系，采用硅胶将各组分进行固定；采用本发明体系时采用肉眼进行比色法便可完成对葡萄糖浓度的检测，整个检测过程简便且效率较高而成本低廉，特别有利于大规模的推广应用。
附图说明
图1是不同过氧化氢浓度下辣根过氧化物酶对金纳米棒的蚀刻效果的投射电子显微镜图。
图2是辣根过氧化酶存在时不同过氧化氢浓度下金纳米棒的长度和宽度。0a指示的是长度，0b指示的是宽度。
图3是过氧化氢浓度为50μM，辣根过氧化物酶浓度为1μM时，加入不同浓度的溴化钠后金纳米棒的可见近红外光谱图。其中，1是0mM NaBr，2是1mM NaBr，3是2mM NaBr，4是3mM NaBr,5是4mM NaBr，6是6mM NaBr。
图4是实施例1-6和对比例中金纳米棒的可见红外光谱图。其中，7是对比例,8是实施例1,9是实施例2，10是实施例3,11是实施例4,12是实施例5,13是实施例6。
具体实施方式
将不同浓度的过氧化氢加入含有金纳米棒0.12mM、辣根过氧化物酶1.5μM、柠檬酸盐缓冲液20mM、pH为4.0的溶液中。其透射电镜形貌图如图1所示。透射电子显微镜的统计分析（TEM）图像来分析氧化前后的AuNRs的长度和宽度。最初，金纳米棒大约60纳米长，15纳米厚。在加入过氧化氢和辣根过氧化物酶后，纳米棒的长度逐渐下降宽度保持不变。如图2所示。当溶液中加入足量的过氧化氢​，金纳米棒则可能失去其棒状的结构，转化为球形颗粒。当金纳米棒形状发生变化时，其颜色也会相应地发生不同程度的变化。
设计人同时发现卤化物，尤其是溴化物的存在对辣根过氧化物酶催化过氧化氢蚀刻金纳米棒的反应有正相关。当反应体系中无卤化物存在时，上述的催化反应并不会发生。以溴化物为例，伴随着加入辣根过氧化物酶催化反应体系中溴离子浓度的上升，金纳米棒的长度缩短越明显。图3是当反应体系中过氧化氢浓度为50μM，辣根过氧化物酶浓度为1μM时，加入不同浓度的溴化钠后金纳米棒的可见近红外光谱。很明显的可以看出，体系中添加的溴化钠浓度越高，金纳米棒的氧化速率越高。除溴化物外，其他的卤化物诸如氯化物、碘化物也对上述催化反应中金纳米棒氧化速率的提升有一定的促进作用。
实施例1
本实施例提供一种利用比色法测定葡萄糖浓度的方法，其反应体系中葡萄糖浓度为80μM，葡萄糖氧化酶的浓度为50nM，辣根过氧化物酶浓度为0.5μM，溴化钠浓度为6mM，金纳米棒的浓度按金单质计为0.20mM，20mM的柠檬酸盐缓冲液，以及余量的硅胶。本实施例葡萄糖检测反应体系的pH为4 。
实施例2
本实施例提供一种利用比色法测定葡萄糖浓度的方法，其反应体系中辣根过氧化物酶浓度为0.8μM，其余与实施例1一致。
实施例3
本实施例提供一种利用比色法测定葡萄糖浓度的方法，其反应体系中辣根过氧化物酶浓度为1.1μM，其余与实施例1一致。
实施例4
本实施例提供一种利用比色法测定葡萄糖浓度的方法，其反应体系中辣根过氧化物酶浓度为1.4μM，其余与实施例1一致。
实施例5
本实施例提供一种利用比色法测定葡萄糖浓度的方法，其反应体系中辣根过氧化物酶浓度为1.7μM，其余与实施例1一致。
实施例6
本实施例提供一种利用比色法测定葡萄糖浓度的方法，其反应体系中辣根过氧化物酶浓度为2μM，其余与实施例1一致。
实施例7
本实施例提供一种葡萄糖检测反应体系的制备方法a.制备金纳米棒；b.制备硅酸盐前体；c.向硅酸盐前体中添加葡萄糖氧化酶、金纳米棒、辣根过氧化物酶、卤化物及柠檬酸盐缓冲液；d.固化葡萄糖检测反应体系。
所述金纳米棒的制备是指将浓度为0.05 M的氯金酸溶液0.028毫升和浓度为0.1 M十六烷基三甲基溴化铵3毫升加入新鲜配制的浓度为0.01M硼氢化钠溶液0.3毫升形成的晶核后，加入生长溶液所制成的；所述生长溶液其原料包括浓度0.1M抗坏血酸0.07毫升、浓度0.05M的氯金酸0.2毫升、浓度0.01M硝酸银0.12毫升、浓度1M的盐酸溶液0.19 毫升和0.1M 的十六烷基三甲基溴化铵11mL。
还需除去金纳米棒中的卤素，具体为将制得的金纳米棒以7000rpm下离心处理20分钟，弃去上清液。
制备硅酸盐前体是指按重量份计，将2份的硅酸钠与14份的去离子水混合成硅酸钠溶液，然后向其加入按重量份计5份的阳离子交换树脂，以除去过酸钠溶液中的钠离子和氢离子，直至所述硅酸钠溶液的pH为4，即获得所述硅酸盐前体；所述固化葡萄糖检测反应体系是指将葡萄糖反应体系置于微孔板中，在4℃下静置48小时。
对照例
本对照例提供一种利用比色法测定葡萄糖浓度的方法，其反应体系中辣根过氧化物酶浓度为2μM，其余与实施例1一致。
经实施例1-6、对比例处理后，各反应体系中金纳米棒的可见近红外光谱图如图4。
采用比色法测定金纳米棒时，可设置不同浓度梯度的葡萄糖标准溶液，采用本发明的方法，获得不同浓度下金纳米棒的颜色，制得标准比色卡。
由上述数据可知，本发明所提供的一种利用比色法测定葡萄糖浓度的方法及体系可在较为温和的条件下，对样品中较低浓度的葡萄糖进行定量。
以上为本发明的其中具体实现方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些显而易见的替换形式均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种利用比色法测定葡萄糖浓度的方法，其包括以下步骤：
采用葡萄糖氧化酶催化样品中的葡萄糖，使之释放出过氧化氢；同时向样品中添加辣根过氧化物酶与金纳米棒，辣根过氧化物酶催化过氧化氢对金纳米棒的蚀刻，待金纳米棒的颜色稳定后，采用比色法确定样品中葡萄糖浓度。
2.根据权利要求1所述的测定葡萄糖浓度的方法，其特征在于：还包括在辣根过氧化物酶催化过氧化氢对金纳米棒蚀刻前，添加卤化物。
3.根据权利要求2所述的测定葡萄糖浓度的方法，其特征在于：所述卤化物可选自十六烷基三甲基溴化铵或碘化钠或溴化钠或溴化铵的任一种。
4.一种葡萄糖检测反应体系，其组分包含：葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、金纳米棒、卤化物与硅胶。
5.根据权利要求4所述的葡萄糖检测反应体系，其特征在于：所述葡萄糖检测反应体系中葡萄糖氧化酶的浓度为30—60nM，辣根过氧化物酶浓度为0.5—2μM，卤化物浓度为1-10mM，金纳米棒的浓度按金单质计为0.10—0.20mM，以及余量的硅胶。
6.根据权利要求5所述的葡萄糖检测反应体系，其特征在于：所述葡萄糖检测反应体系中还包含有20mM的柠檬酸盐缓冲液；所述葡萄糖检测反应体系的pH为3.8—4.1。
7.根据权利要求6所述的葡萄糖检测反应体系的制备方法，包括以下工序：a.制备金纳米棒；b.制备硅酸盐前体；c.向硅酸盐前体中添加葡萄糖氧化酶、金纳米棒、辣根过氧化物酶、卤化物及柠檬酸盐缓冲液；d.固化葡萄糖检测反应体系。
8.根据权利要求7所述的葡萄糖检测反应体系的制备方法，其特征在于：所述金纳米棒的制备是指将浓度为0.05 M的氯金酸溶液0.025-0.030毫升和浓度为0.1 M十六烷基三甲基溴化铵3-5毫升加入新鲜配制的浓度为0.01M硼氢化钠溶液0.3毫升形成的晶核后，加入生长溶液所制成的；所述生长溶液其原料包括浓度0.1M抗坏血酸0.05-0.10毫升、浓度0.05M的氯金酸0.1-0.3毫升、浓度0.01M硝酸银0.10-0.15毫升、浓度1M的盐酸溶液0.15-0.20 毫升和0.1M 的十六烷基三甲基溴化铵10-20mL。
9.根据权利要求8所述的葡萄糖检测反应体系的制备方法，其特征在于：还需除去金纳米棒中的卤素，具体为将制得的金纳米棒以7000rpm下离心处理20分钟，弃去上清液。
10.根据权利要求9所述的葡萄糖检测反应体系的制备方法，其特征在于：制备硅酸盐前体是指按重量份计，将1-5份的硅酸钠与10—20份的去离子水混合成硅酸钠溶液，然后向其加入按重量份计3—8份的阳离子交换树脂，以除去过酸钠溶液中的钠离子和氢离子，直至所述硅酸钠溶液的pH为3.8—4.1，即获得所述硅酸盐前体；所述固化葡萄糖检测反应体系是指将葡萄糖反应体系置于微孔板中，在4℃下静置48小时。
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