CN103951089B - 酿酒酵母基因缺失菌株在清除环境水质中重金属的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种酿酒酵母基因缺失菌株的应用，属于环境治理技术领域。其提供的三个基因的缺失菌株可以应用于摇瓶和发酵罐或其它培养器里，为构建用于镉污染环境治理的高效吸收和去除镉离子的环境工程应用奠定基础。这种筛选过程规模大，效率高，筛选出的菌株切实提高了重金属镉的吸收能力。
Description
技术领域
本发明涉及一种酿酒酵母基因缺失菌株的应用，属于环境治理技术领域。
背景技术
镉是一种有毒的重金属环境污染物。空气中的镉主要来自家庭或工业产生的废气、汽车尾气、金属加工行业、电池或油漆制造业以及废物的处理过程。镉可以从污染源地随着空气传播，污染食物或水质。烟叶本身可以积累较高浓度的镉，因而吸烟是镉污染的重要来源之一。近来的流行病学案例研究进一步证实镉具备致癌性。肺癌、前列腺癌、胰腺癌和肾癌的发生都与长期接触镉有关。随着我国工业的发展，近年来发生了多次大面积的镉污染事件，包括2005年的广东北江镉污染，2009年的湖南浏阳镉污染，2011年的云南曲靖镉污染和2012年的广西龙江镉污染事件。这给我国环境造成了极大的压力。
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是重要的发酵工业微生物，且被认定为GRAS（Generally Regarded as Safe）生物，因此被广泛研究用于重金属生物吸附材料。通过功能基因组学手段，我们筛选到酿酒酵母基因组中与镉离子耐受性相关的基因，阐明参与镉主动吸收和代谢的途径及其调控机理，为构建用于镉污染环境治理的高效吸收和去除镉离子的酵母工程菌株奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酿酒酵母缺失菌株，在清除环境水质中镉方面的应用，还公开了一种大规模高效筛选耐受镉基因的方法，并得到了三个对镉离子敏感而且对镉离子吸收能力显著增加的基因缺失菌株，为构建用于镉污染环境治理的高效吸收和去除镉离子的酵母工程菌株奠定基础。
按照本发明提供的技术方案，酿酒酵母基因缺失菌株在清除环境水质中重金属的应用，三株酿酒酵母基因缺失菌株，应用于去除环境水质中的重金属。
所述重金属为重金属镉。
所述三株酿酒酵母基因缺失菌株分别缺失MID1、CYS3和CYS4三个基因；其中MID1基因缺失菌株，其分类命名为Saccharomyces cerevisae，对应缺失的基因序列如SEQ ID NO.1所示，CYS3基因缺失菌株，其分类命名为Saccharomyces cerevisae，对应缺失的基因序列如SEQ ID NO.2所示，CYS4基因缺失菌株，其分类命名为Saccharomyces cerevisae，对应缺失的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
从美国Invitrogen Inc公司购买同源的以BY4743为母菌株的4600个单基因缺失菌株出发，进行筛选：在添加100mM镉的YPD固体培养基上对菌株进行培养24-48小时，发现mid1、cys3、cys4三株菌株对镉敏感。进而对它们吸收镉能力进行测定，发现这三株菌株对镉的吸收能力提高。
本发明的有益效果：本发明提供的三个缺失菌株可以应用于摇瓶和发酵罐里，用于水质中镉的高效吸收和去除镉离子的环境工程。这种筛选过程规模大，效率高，筛选结果切实获得了镉的吸收能力增加的菌株。
附图说明
图1 实施例2中各基因缺失菌株和野生型酿酒酵母菌株细胞内镉离子含量测定图。A：野生型菌株BY4743、did4、gcn4和MID1基因缺失菌株；B：野生型菌株BY4743、CYS3和CYS4基因缺失菌株。
具体实施方式
实施例1 菌株的筛选
a、初步筛选。用已灭菌的384针接菌器将酿酒酵母缺失株文库（从美国Invitrogen Inc公司购买）中的菌株影印到YPD+100 mM CdCl2的培养基上，同时在YPD培养基上影印一次（作为对照）。平板在30℃生化培养箱中培养2-3天后，拍照记录结果。通过与YPD培养基上菌株的生长结果对比，找出YPD+100 mM CdCl2培养基上有生长缺陷的菌株，既为镉离子敏感候选菌株。
YPD培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。
b、通过倍比稀释（梯度稀释）方法对镉离子敏感候选菌株进行验证。从酿酒酵母缺失株文库中挑取镉离子敏感候选菌株，在YPD平板上活化后，接种到YPD液体培养基中过夜培养。将菌株过夜培养物用无菌水按10倍依次稀释至10的-4次方，然后从每个稀释浓度中取3mL分别点在YPD+100mM CdCl2和YPD平板上，30℃培养2天后观察生长情况，拍照，记录实验结果。与YPD平板上菌株的生长情况相比，确定对100 mM CdCl2敏感的基因缺失菌株。
最终，从酿酒酵母缺失株文库中共发现106个基因缺失菌株对镉离子敏感，其中包括MID1、CYS3和CYS4三个基因的缺失菌株。
实施例2 原子吸收法测定酿酒酵母缺失株胞内镉离子浓度
a、活化菌株。在YPD平板上活化菌株（MID1、CYS3和CYS4）。
b、挑取单菌落（2mm直径的菌落一个）接于YPD液体培养基中过夜培养24h，基本达到饱和。
c、将过夜培养物分别转接到新的50 mL液体YPD+CdCl2（50 μM）液体培养基中，使初始OD吸光度值达到0.2，30℃培养4h。
d、样品处理：
（1）将步骤c的最终培养物2000g离心2 min。
（2）用冰上预冷的10 mM MgCl2溶液（含1M sorbitol山梨糖醇）洗细胞三次，用重悬和离心的方法。
（3）洗好的细胞重悬于5 mL 10 mM MgCl2溶液中（不含sorbitol）。
（4）取0.3mL步骤（3）所得的细胞重悬液加入步骤（2）所得的2.7 mL 10mM的MgCl2溶液中，混匀后测OD 660nm吸光度值；10 mM MgCl2溶液做空白对照。
（5）加入浓H2SO4（10M）至终浓度0.5% (50 mM), 95℃水浴放置10min。
（6）离心，取上清，用原子吸收光谱法测定相应金属离子浓度。
经原子吸收法检测，结果表明MID1、CYS3和CYS4基因的缺失菌株吸收镉的能力和野生型酿酒酵母菌株相比分别提高了11倍、9倍和7倍以上，而其它两个对照基因缺失菌株（did4和gcn4菌株，来自以上从美国Invitrogen Inc公司购买的酿酒酵母缺失株文库）没有区别，如图1所示。Y坐标为各个菌株细胞胞内镉离子含量。BY4743为野生型菌株对照，cys3和cys4为镉吸收能力和野生型菌株没有显著差异的两株基因缺失菌株。
<210> SEQ ID NO.1
<211> 1647
<212> DNA
<213> （Saccharomyces cerevisae） MID1
<400>1
ATGATAGTGT GGCAAGCACT ATTCGTGGTT TACTGCCTAT TTACCACTTC TATTCACGGT 60
TTATTCCAAG ACTTCAATCC TTTCGCAAAT AAGAATATTT CCTTAAAGTTT CCCAGCCTA 120
AATAGATGGG AGAAAAACGT TATGGCTACT GGTCAACAAA CAATCATCAAT TCGGATAGC 180
ATTTATGAAT GGACCCCGAT CTTATCTAAC ATAACAGCGG GCAAAAAAGA CAGTTTTGTA 240
TTTACCATTG ACGCAGAAGC CTCCGGTTAT GGGTTTGCTC CCACGTATGA AGTGTTAATG 300
TTTATTAGCG GCAATATATG CCAAATGCCC ATGAATAGAT CAGATGTGGA TTTAACAATA 360
TACTACTCTT TTAATGAAAC GGTTTTAGAG AACCCAAATA TAGGTCAAAG TGCAGTTTTT 420
CAGGATGGCT ACATCCAAGC ATTAGCCATC AGTCCAGTGC AGTCTTCTAG CTCGAACGCT 480
ACCTCCACGT ATTCAAATCT TTATGTGGTC GCTGAGCTAG TGAATTCCAC TACGGAGCAA 540
CCTCTGTCCA GTTCCGACGC CTCTGAAAAT TGGGAATATA GACTGAGTAT CTCTGAGAAC 600
GATTTGGTTT TTCAGTGGGA TGTAAGGCCT TGGGTAGAGG TCCTGGACAC TGATATGAAT 660
TCTGCATTAC TATCAACGGG GAATGTCACC GCAGACGCCA AAGTTTATCA CAATTATTCA 720
ATATATGATC CATCCTTGTA CGATCTGTAT GTTTACTCGT ACGAAGATTC TGTTCAACTA 780
AACCAAAACT ATAATTTATC TCTTTGTGCT GTGAAAAATG GACCATATTT AGTGTCTTCC 840
CAAAATACAT CAAATGCAAC AGTTACGTCA AATAGTACAA ATCCTTTAGA GCGTACTGAC 900
TTGGCGATTC AAAAAAAAAT TACAGAATAT GGTGGTAGCG TGACAGAAAT GTTTTACGTG 960
ACAGGACTGA ATGCCTCAAC AACTTATGTA GCGTACCTGA CAAAGAAAAT CAGTAATGGT 1020
GATGGGTTGT CAAGTGTGGG CGGCATTTTA TTTTCACATG TTTATTTTAC CACAAGAAGT 1080
ACCGATGTCT GCTCTTTGAT CTTTGGTTTG GACTTCTGCA GTGACGTCGC TTACTCTGTT 1140
CCTACATCCT CATTTTCTGT GGGTAATAAA ACTCTCATGG CGCAGACATA TGACCACATT 1200
GCAGAGGCAC TATATGCAAA TTTTAGCAAA GCTCTACAGT TAATATCCTG TGACGCAGAC 1260
AAAGACGCAA GATATTCTCC GGTCATGACT TGTGACGATT GTGCCGAAGC TTATCGTGAT 1320
TGGGTATGTG CAGTATCAAT TCCGAGATGC ACCACGACGT CTTCCCAATA CTACATCCAC 1380
AGAGATAAAA GTCACAACCG TAATGATTAT TTGAATAAAT TTATTAAACC TTTGGATGAC 1440
TATTACGAAA TTCTACCTTG TATTGACATG TGCTATACAT TAGTACGAAA TTGCCCAAGC 1500
GATTTTCAAT TTTCCTGTCC GAATGATCTT ACTACGGAAG ATCTTCTTTA TCAAAGTTAC 1560
AATTTCTATA TGGACACTGA CTACTCAACC TGTAATTATA TAGGTAACTC ATCCTTGATG 1620
GTAATTCATC CATTGGACGA TACGTAG 1647
<210> SEQ ID NO.2
<211> 1185
<212> DNA
<213> （Saccharomyces cerevisae） CYS3
<400>2
ATGACTCTAC AAGAATCTGA TAAATTTGCT ACCAAGGCCA TTCATGCCGG TGAACATGTG 60
GACGTTCACG GTTCCGTGAT CGAACCCATT TCTTTGTCCA CCACTTTCAA ACAATCTTCT 120
CCAGCTAACC CTATCGGTAC TTACGAATAC TCCAGATCTC AAAATCCTAA CAGAGAGAAC 180
TTGGAAAGAG CAGTTGCCGC TTTAGAGAAC GCTCAATACG GGTTGGCTTT CTCCTCTGGT 240
TCTGCCACCA CCGCCACAAT CTTGCAATCG CTTCCTCAGG GCTCCCATGC GGTCTCTATC 300
GGTGATGTGT ACGGTGGTAC CCACAGATAC TTCACCAAAG TCGCCAACGC TCACGGTGTG 360
GAAACCTCCT TCACTAACGA TTTGTTGAAC GATCTACCTC AATTGATAAA GGAAAACACC 420
AAATTGGTCT GGATCGAAAC CCCAACCAAC CCAACTTTGA AGGTCACCGA CATCCAAAAG 480
GTGGCAGACC TTATCAAGAA GCACGCTGCC GGCCAAGACG TGATCTTGGT TGTCGACAAC 540
ACCTTCTTGT CCCCATATAT CTCCAATCCA TTGAACTTCG GTGCAGACAT CGTTGTCCAC 600
TCCGCTACAA AGTACATCAA CGGTCACTCA GACGTTGTGC TCGGTGTCCT GGCCACTAAT 660
AACAAGCCAT TGTACGAGCG TCTGCAGTTC TTACAAAACG CCATTGGTGC TATCCCATCT 720
CCTTTCGATG CTTGGTTGAC CCACAGAGGT TTGAAGACTT TGCATCTACG TGTCAGACAA 780
GCTGCCCTCA GCGCCAACAA AATCGCTGAA TTCTTGGCAG CAGACAAGGA AAACGTTGTC 840
GCAGTCAACT ACCCAGGTTT GAAGACACAC CCTAACTACG ACGTAGTGTT AAAGCAACAC 900
CGTGATGCCC TTGGTGGTGG TATGATCTCC TTCAGAATCA AGGGTGGTGC TGAAGCTGCT 960
TCCAAGTTCG CCTCCTCCAC AAGACTGTTC ACATTGGCCG AATCCCTTGG TGGTATCGAA 1020
TCTCTATTGG AAGTGCCCGC TGTGATGACC CACGGTGGTA TCCCAAAGGA GGCCAGAGAG 1080
GCCTCTGGTG TTTTTGACGA CTTGGTTAGA ATCTCTGTCG GTATTGAAGA CACTGACGAT 1140
CTTTTGGAAG ACATCAAGCA AGCCTTGAAA CAAGCCACCA ACTAA 1185
<210> SEQ ID NO.3
<211> 1524
<212> DNA
<213> （Saccharomyces cerevisae） CYS4
<400>3
ATGACTAAAT CTGAGCAGCA AGCCGATTCA AGACATAACG TTATCGACTT AGTTGGTAAC 60
ACCCCATTGA TCGCACTGAA AAAATTGCCT AAGGCTTTGG GTATCAAACC ACAAATTTAT 120
GCTAAGCTGG AACTATACAA TCCAGGTGGT TCCATCAAAG ACAGAATTGC CAAGTCTATG 180
GTGGAAGAAG CTGAAGCTTC CGGTAGAATT CATCCTTCCA GATCTACTCT GATCGAACCT 240
ACTTCTGGTA ACACCGGTAT CGGTCTAGCT TTAATCGGCG CCATCAAAGG TTACAGAACT 300
ATCATCACCT TGCCGGAAAA AATGTCTAAC GAGAAAGTTT CTGTCCTAAA GGCTCTGGGT 360
GCTGAAATCA TCAGAACTCC AACTGCTGCT GCCTGGGATT CTCCAGAATC ACATATTGGT 420
GTTGCTAAGA AGTTGGAAAA AGAGATTCCT GGTGCTGTTA TACTTGACCA ATATAACAAT 480
ATGATGAACC CAGAAGCTCA TTACTTTGGT ACTGGTCGCG AAATCCAAAG ACAGCTAGAA 540
GACTTGAATT TATTTGATAA TCTACGCGCT GTTGTTGCTG GTGCTGGTAC TGGTGGGACT 600
ATTAGCGGTA TTTCCAAGTA CTTGAAAGAA CAGAATGATA AGATCCAAAT CGTTGGTGCT 660
GACCCATTCG GTTCAATTTT AGCCCAACCT GAAAACTTGA ATAAGACTGA TATCACTGAC 720
TACAAAGTTG AGGGTATTGG TTATGATTTT GTTCCTCAGG TTTTGGACAG AAAATTAATT 780
GATGTTTGGT ATAAGACAGA CGACAAGCCT TCTTTCAAAT ACGCCAGACA ATTGATTTCT 840
AACGAAGGTG TCTTGGTGGG TGGTTCTTCC GGTTCTGCCT TCACTGCGGT TGTGAAATAC 900
TGTGAAGACC ACCCTGAACT GACTGAAGAT GATGTCATTG TTGCCATATT CCCAGATTCC 960
ATCAGGTCGT ACCTAACCAA ATTCGTCGAT GACGAATGGT TGAAAAAGAA CAATTTGTGG 1020
GATGATGACG TGTTGGCCCG TTTTGACTCT TCAAAGCTGG AGGCTTCGAC GACAAAATAC 1080
GCTGATGTGT TTGGTAACGC TACTGTAAAG GATCTTCACT TGAAACCGGT TGTTTCCGTT 1140
AAGGAAACCG CTAAGGTCAC TGATGTTATC AAGATATTAA AAGACAATGG CTTTGACCAA 1200
TTGCCTGTGT TGACTGAAGA CGGCAAGTTG TCTGGTTTAG TTACTCTCTC TGAGCTTCTA 1260
AGAAAACTAT CAATCAATAA TTCAAACAAC GACAACACTA TAAAGGGTAA ATACTTGGAC 1320
TTCAAGAAAT TAAACAATTT CAATGATGTT TCCTCTTACA ACGAAAATAA ATCCGGTAAG 1380
AAGAAGTTTA TTAAATTCGA TGAAAACTCA AAGCTATCTG ACTTGAATCG TTTCTTTGAA 1440
AAAAACTCAT CTGCCGTTAT CACTGATGGC TTGAAACCAA TCCATATCGT TACTAAGATG 1500
GATTTACTGA GCTACTTAGC ATAA 1524
Claims (1)
1.酿酒酵母基因的缺失菌株在清除环境水质中重金属的应用，其特征是：三株酿酒酵母基因缺失菌株，经培养后应用于去除环境水质中的重金属；
所述重金属为重金属镉；
所述三株酿酒酵母基因缺失菌株分别缺失MID1、CYS3和CYS4三个基因；其中MID1基因缺失菌株对应缺失的基因序列如SEQ ID NO.1所示，CYS3基因缺失菌株对应缺失的基因序列如SEQ ID NO.2所示，CYS4基因缺失菌株对应缺失的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
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| CN201410199132.1A CN103951089B (zh) | 2014-05-12 | 2014-05-12 | 酿酒酵母基因缺失菌株在清除环境水质中重金属的应用 |
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