CN103937862A - 一种具有防治骨质疏松症作用的磷酸化磷虾肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种磷酸化磷虾肽，制备方法包括：（1）磷虾粉脱脂后，加入NaOH溶液搅拌，离心取上清，调节上清pH值至蛋白质等电点，离心取沉淀；（2）将磷虾蛋白沉淀配成水溶液，加入磷酸盐，调节溶液pH值，溶液经喷雾干燥得磷虾蛋白粉，将其置于高温下得磷酸化磷虾蛋白；（3）磷酸化磷虾蛋白用蒸馏水反复洗涤、离心，（4）将磷酸化磷虾蛋白配成水溶液，加入2M NaOH，调节溶液pH值，溶液加入蛋白酶，在适宜的温度下水解3-6h，加热至100℃终止酶反应，离心取上清，上清经喷雾干燥得磷酸化磷虾肽。动物实验证明，本发明制备的磷酸化磷虾肽可以显著调节骨质疏松症模型大鼠的骨代谢水平，增加骨密度，提高骨生物力学性能，对骨质疏松症具有显著的防治作用。

Description

一种具有防治骨质疏松症作用的磷酸化磷虾肽的制备方法

技术领域

本发明涉及一种具有防治骨质疏松作用的磷酸化磷虾肽的制备方法及其在食品、功能食品和药品领域的应用。

背景技术

骨质疏松症是一种因骨强度下降导致骨折风险增加的骨骼系统疾病，已成为一个世界范围内越发严重的社会健康问题。据估计目前全世界患者人数已超过2亿，其中60-70岁的发病率为58%，70岁以上的发病率几乎是100%，尤其是绝经后妇女的发病率更高。目前，市场上用于预防和治疗骨质疏松症的药物主要包括雌激素受体调节剂、双膦酸盐类、降钙素、氟制剂和维生素D及其活性代谢物类药物等。但长期服用这些药物具有较强的毒副作用，因此寻找安全有效的防治骨质疏松症的生物活性物质已成为目前的研究热点。

有关磷酸化蛋白肽的应用，酪蛋白磷酸肽是目前食品领域研究最为广泛的磷酸化蛋白肽。研究已证明酪蛋白及其酶解产物具有高效结合钙离子并促进肠道钙吸收的作用，能显著促进成长期及健康大鼠的股骨生长（Bioscience,Biotechnology,Biochemistry,2004,68,2388-2390），但对骨质疏松模型大鼠的干预作用不显著（中国骨质疏松杂志,2001,3：235-237）。新近研究报道，酪蛋白磷酸肽与蛋壳的复配物，能显著提高骨质疏松症模型大鼠对钙的吸收率，增加股骨重量和股骨中的钙含量，减少骨流失，其效果优于单一的钙补充剂，可作为绝经后骨质疏松症患者的钙补充剂，但该报道没有进一步阐明酪蛋白磷酸肽的作用（Laboratory Animal Research,2013,29,70-76）。

磷虾是一类海洋无脊椎动物，广泛分布于世界各海洋。据统计，南极磷虾的蕴藏量为6.5-10亿吨，是人类巨大的蛋白资源宝库。磷虾干重中蛋白质含量约65-75%，其氨基酸组成合理、必需氨基酸含量高，是进行蛋白质高值化利用的重要原料。目前，南极磷虾的应用开发主要集中在虾油、虾青素和甲壳素方面，其蛋白质主要用于渔业饵料。采用化学衍生法对磷虾蛋白质进行改性，进而制备磷酸化磷虾肽，是对磷虾蛋白高值化利用的有效途径之一。

有关磷酸化磷虾肽在防治骨质疏松症中的应用研究，经过专利和非专利检索，均未检索到。蔡维望等曾报道，低剂量的南极磷虾粉对骨质疏松模型大鼠的病症具有改善作用，其中氟起主要作用（中国生物制品学杂志,2013,5,643-647）；Gigliotti,et al.报道南极磷虾粗蛋白可有效缓解早期肾损伤模型大鼠的骨钙沉积和骨密度流失症状，对骨质量和骨强度无显著影响，但未报道受试物中起作用的功效成分（Urological Research,2011,39,59-67）。目前，尚未见关于磷酸化磷虾肽防治骨质疏松症的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有防治骨质疏松作用的磷酸化磷虾肽的制备方法，该类磷虾肽在生产食品、功能食品和药品领域具有广泛的应用。

一种磷酸化磷虾肽的制备方法，其特征在于：（1）磷虾粉经乙醇脱脂后，加入NaOH溶液搅拌提取蛋白，离心取上清。向上清中加入6M HCl，调节上清pH值至蛋白质等电点，静置一段时间，离心取沉淀，所得沉淀即磷虾蛋白；（2）将磷虾蛋白沉淀配成水溶液，向溶液中加入磷酸盐，同时加入2M HCl，调节溶液pH值，溶液经喷雾干燥得磷虾蛋白粉，将其置于高温下进行磷酸化衍生，得磷酸化磷虾蛋白；（3）磷酸化磷虾蛋白用蒸馏水反复洗涤、离心，去除其中的氟和盐；（4）将磷酸化磷虾蛋白配成水溶液，向溶液中加入2MNaOH，调节溶液pH值后，向溶液中加入蛋白酶，在适宜的温度下水解3-6h，加热至100℃终止酶反应，离心取上清，上清经喷雾干燥得磷酸化磷虾肽。

所述磷酸化磷虾肽的制备方法，其特征在于：所述磷虾为南极磷虾、太平洋磷虾或北方磷虾等海洋加工品种；所述NaOH溶液提取蛋白的条件为：反应温度为30-60℃，反应时间为40-100min，固液比为1:5-1:12；所述磷酸盐为正磷酸盐、焦磷酸盐或偏磷酸盐；所述磷酸盐的添加量为0.02-2.0M，添加后应将溶液pH值调节为2.0-4.0；所述磷酸化衍生条件为70-90℃下加热12-72h；所述蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶中的一种或几种，其中胰蛋白酶为最优，添加量0.5-2.0%，水解温度为45-60℃。

本发明采用的原料丰富易得，蛋白质含量高；制备方法具有工艺步骤简单、设备投资少、无环境污染、产品得率高等优点，适于工业化生产；所得磷酸化磷虾肽，蛋白质含量高于85%，产品纯度高；磷含量为1.5-2.5%，生物活性高；氟含量低于5ppm，产品安全性高。动物实验证明，该产品具有显著的防治大鼠骨质疏松症的作用。

附图说明

图1：磷酸化的磷虾肽和未经磷酸化磷虾肽的红外光谱图。其中：黑线代表磷酸化磷虾肽；蓝线代表未磷酸化的磷虾肽。

图2：采用双能X射线检测本发明的磷酸化磷虾肽对骨质疏松症大鼠股骨骨密度的影响。其中，A为正常对照组；B为模型对照组；C为阳性对照组；D为磷酸化磷虾肽低剂量组；E为磷酸化磷虾肽高剂量组。

图3：采用双能X射线检测本发明的磷酸化磷虾肽对骨质疏松症大鼠胫骨骨密度的影响。其中，A为正常对照组；B为模型对照组；C为阳性对照组；D为磷酸化磷虾肽低剂量组；E为磷酸化磷虾肽高剂量组。

具体实施方式

实施例1

（1）取南极磷虾粉10kg，加入95%乙醇100L，在反应釜中搅拌6h，离心取沉淀，真空干燥得脱脂磷虾粉；

（2）向脱脂磷虾粉中加入80L NaOH溶液，于60℃下搅拌浸提40min，离心，得上清A；

（3）向上清A中加入6M HCl，调节上清A的pH值至等电点，静置20min，离心，得沉淀B，向沉淀B中加入5倍体积水和0.2M焦磷酸钾，向溶液中加入2M HCl，调节溶液pH值至2.5，喷雾干燥得磷虾蛋白粉；

（4）磷虾蛋白粉在80℃下加热48h进行磷酸化衍生，得磷酸化磷虾蛋白粉；

（5）向磷酸化蛋白粉中加入5倍体积水，混匀，离心得沉淀C；向沉淀C中加入5倍体积水，混匀，离心得沉淀D；向沉淀D中加入5倍体积水，混匀，离心得沉淀E；

（6）向沉淀E中加入5倍体积水，升温至50℃，向溶液中加入2M NaOH，调节溶液pH值至8.0，加入1.0%（酶底比）碱性蛋白酶，恒温水解4h，离心取上清，喷雾干燥得磷酸化磷虾肽。

实施例2

（1）取南极磷虾粉10kg，加入95%乙醇80L，在反应釜中搅拌7h，分离取沉淀，真空干燥得脱脂磷虾粉；

（2）向脱脂磷虾粉中加入70L NaOH溶液，于50℃下搅拌浸提60min，离心，得上清A；

（3）向上清A中加入4M HCl，调节上清A的pH值至等电点，静置30min，离心，得沉淀B，向沉淀B中加入6倍体积水和0.15M偏磷酸钠，向溶液中加入2M HCl，调节溶液pH值至3.5，喷雾干燥得磷虾蛋白粉；

（4）磷虾蛋白粉在85℃下加热24h进行磷酸化衍生，得磷酸化磷虾蛋白粉；

（5）向磷酸化磷虾蛋白粉中加入6倍体积水，混匀，离心得沉淀C；向沉淀C中加入6倍体积水，混匀，离心得沉淀D；向沉淀D中加入6倍体积水，混匀，离心得沉淀E；

（6）向沉淀E中加入6倍体积水，升温至50℃，向溶液中加入2M NaOH，调节溶液pH值至8.0，加入1.5%（酶底比）胰蛋白酶，恒温水解3h，离心取上清，喷雾干燥得磷酸化磷虾肽。

本实施例中，所述南极磷虾粉可为南极磷虾、北极磷虾或太平洋磷虾等海洋加工品种；所述脱脂条件可为：时间6-12h，固液比为1:6-1:12；所述NaOH溶液提取蛋白的条件可为：反应温度为30-60℃，反应时间为40-100min，固液比为1:5-1:12；所述磷酸化衍生条件可为：添加0.02-2.0M磷酸盐（正磷酸盐、焦磷酸盐或偏磷酸盐），调节溶液pH值为2.0-4.0，75-85℃下加热衍生12-72h；所述蛋白酶水解条件可为：添加碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶中的一种或几种，添加量为0.5-1.5%，反应温度为45-60℃。本发明制备的磷酸化磷虾肽，磷含量为1.5-2.5%，氟含量低于5ppm。

下面对本发明制得的磷酸化磷虾肽的化学性质和抗骨质疏松症的作用进行说明：

一、磷酸化磷虾肽的化学性质：

本发明制备的磷酸化磷虾肽中，蛋白含量高于85%，磷含量为1.5-2.5%，氟含量低于5ppm。

二、抗骨质疏松症作用研究：

采用摘除双侧卵巢的方法建立骨质疏松症大鼠模型，将SD大鼠随机分为5组：正常对照组、模型对照组、阿仑膦酸钠阳性对照组（1mg/kg.bw）、磷酸化磷虾肽低、高剂量组（400mg/kg.bw、800mg/kg.bw），每组10只。每天灌胃1次，连续灌胃90d。实验期间大鼠自由饮水和进食，每3d称量大鼠体重。于实验结束前5d，将大鼠放入代谢笼，收集尿液，测定尿钙（Ca）和尿磷（P）含量。于末次灌胃后，大鼠禁食不禁水12h，经乙醚麻醉后腹主动脉采血，处死大鼠，常规分离血清，测定血清抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）、骨源性碱性磷酸酶（NBAP）活性和Ⅰ型前胶原羧基端前肽（PICP）含量；分别剥离股骨及胫骨，采用双能X射线骨密度仪测定大鼠股骨和胫骨骨密度。采用小动物骨骼强度仪进行三点弯曲试验，记录股骨和胫骨最大载荷值。

结果表明，磷酸化磷虾肽能显著降低骨质疏松症模型大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶活性，降低尿钙和尿磷含量。与模型对照组相比，血清抗酒石酸酸性磷酸酶活性、尿钙和尿磷含量分别降低了49.18%、42.47%和39.87%（P<0.01，见表1），优于阳性对照组药物作用效果。TRACP是由破骨细胞合成并直接分泌进入血液循环的，反映破骨细胞活性和骨吸收状况，尿液Ca、P指标反映骨盐丢失情况。结果证明了磷酸化磷虾肽可显著抑制骨质疏松症模型大鼠骨吸收，防止骨矿盐丢失。

磷酸化磷虾肽能显著降低骨质疏松症模型大鼠骨源性碱性磷酸酶活性、Ⅰ型前胶原羧基端前肽含量。与模型对照组相比，分别平均降低了45.78%和25.05%（P<0.01，见表1）。骨源性碱性磷酸是成骨细胞分泌的胞外酶，可反映成骨细胞活性，是评价骨矿化障碍的最佳指标。Ⅰ型胶原是骨基质的重要组成成分，Ⅰ型前胶原羧基端前肽与Ⅰ型胶原的合成呈正相关。骨质疏松症模型大鼠因骨吸收亢进而出现代偿性骨形成增加，机体处于高骨转换状态。结果证明磷酸化磷虾肽能有效抑制骨质疏松症模型大鼠的骨转换速率，防止骨丢失。磷酸化磷虾肽能显著增加骨质疏松症模型大鼠股骨和胫骨的骨密度及最大力学载荷值。与模型对照组比较，骨密度平均增加了29.14%，骨力学载荷值平均增加了21.55%（见图2、图3和表2），与阳性对照药物的效果相近。骨密度指平均每平方厘米的骨矿物质含量，是目前诊断骨质疏松的金指标。生物力学是研究骨组织在外力作用下的力学特性和受力后的生物效应，可直接反映骨组织的抗骨折能力，是评价骨质量不可缺少的指标。结果证明了磷酸化磷虾肽可显著提高模型大鼠的骨密度，改善生物力学性能。

综上所述，磷酸化磷虾肽能显著调节骨代谢，增加骨质疏松症大鼠骨密度和生物力学性能，对骨质疏松症具有显著的防治作用。

表1磷酸化磷虾肽对骨质疏松症大鼠骨代谢指标的影响

注： ^##P<0.01与正常对照组相比；^*P<0.05，^**P<0.01与模型对照组相比。

表2磷酸化磷虾肽对骨质疏松症大鼠的骨密度和生物力学的影响

注：^##P<0.01与正常对照组相比；^*P<0.05，^**P<0.01与模型对照组相比。

Claims (8)

1.一种磷酸化磷虾肽的制备方法，其特征在于：

（1）磷虾粉经乙醇脱脂后，加入NaOH溶液搅拌提取蛋白，离心取上清。向上清中加入6M HCl，调节上清pH值至蛋白质等电点，静置一段时间，离心取沉淀，所得沉淀即磷虾蛋白；

（2）将磷虾蛋白沉淀配成水溶液，向溶液中加入磷酸盐，同时加入2M HCl，调节溶液pH值，溶液经喷雾干燥得磷虾蛋白粉，将其置于高温下进行磷酸化衍生，得磷酸化磷虾蛋白；

（3）磷酸化磷虾蛋白用蒸馏水反复洗涤、离心，去除其中的氟和盐；

（4）将磷酸化磷虾蛋白配成水溶液，向溶液中加入2M NaOH，调节溶液pH值后，向溶液中加入蛋白酶，在适宜的温度下水解3-6h，加热至100℃终止酶反应，离心取上清，上清经喷雾干燥得磷酸化磷虾肽。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的磷虾为南极磷虾、太平洋磷虾或北方磷虾等海洋加工品种。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述NaOH溶液提取蛋白的条件为：反应温度为30-60℃，反应时间为40-100min，固液比为1:5-1:12。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述磷酸盐为正磷酸盐、焦磷酸盐或偏磷酸盐。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于磷酸盐的添加量为0.02-2.0M，添加后应将溶液pH值调节为2.0-4.0。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述磷酸化衍生条件为70-90℃下加热12-72h。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所用蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶中的一种或几种，其中胰蛋白酶为最优，添加量0.5-2.0%，水解温度为45-60℃。

8.根据权利要求1所述的磷酸化磷虾肽，其特征在于在制备抗骨质疏松症的食品、功能食品和药品领域中的应用。