CN103933572B - 治疗疼痛和瘙痒的方法、组合物和试剂盒 - Google Patents

治疗疼痛和瘙痒的方法、组合物和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及治疗疼痛和瘙痒的方法、组合物和试剂盒。本发明的特征在于一种通过将细胞与以下物质接触来抑制细胞中的一个或多个电压门控离子通道电压门控性离子通道的方法：(i)第一化合物，其激活存在于伤害感受器和／或瘙痒感受器上的通道形成受体；和(ii)第二化合物，其施加于一个或多个电压门控性离子通道的内表面时抑制所述离子通道，但施加于所述通道的外表面时基本上不抑制所述通道，其中，当所述受体被激活时，所述第二化合物能够通过所述通道形成受体进入伤害感受器或瘙痒感受器。本发明的特征还在于化合物的季胺衍生物或其他永久带电或瞬时带电的衍生物，所述化合物施加于一个或多个电压门控性离子通道的内表面时抑制所述离子通道，但施加于所述通道的外表面时基本上不抑制所述通道。

Description

治疗疼痛和瘙痒的方法、组合物和试剂盒
本申请是申请号为200780050131.9(国际申请号为PCT／US2007／024174)、申请日为2007年11月19日、发明名称为“治疗疼痛和瘙痒的方法、组合物和试剂盒”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及通过小分子量药物分子选择性抑制疼痛-和痒感(itch)感觉神经元(sensing neuron)(伤害感受器(nociceptors)和瘙痒感受器(pruriceptors))，同时将对非疼痛(non-pain)感觉神经元或其它类型细胞的影响最小化的方法、组合物和试剂盒。根据本发明方法，小的亲水性药物分子通过进入穿过存在于疼痛-和痒感-感觉神经元但在其他类型神经元或其它类型组织中存在较少或根本不存在的受体而进入到疼痛-感觉神经元的细胞内隔室中。
背景技术
局部麻醉药(例如利多卡因和阿替卡因)通过抑制神经元中的电压依赖性(voltage-dependent)钠通道而发挥作用。这些麻醉药阻滞钠通道并由此阻滞所有神经元的兴奋性，而不仅仅是疼痛感觉神经元(伤害感受器)。因此，虽然局部或区域麻醉的目的是阻滞伤害感受器中的信号传递以防止疼痛，但施用局部麻醉药还会产生不希望有的或不良的(deletrious)影响，例如由低阈压和触觉感受器的阻滞造成的全身麻木、由运动轴突(motor axons)的阻滞造成的运动缺陷以及由自主纤维的阻滞造成的其他并发症。局部麻醉药是相对疏水性的分子，通过扩散进入或扩散透过细胞膜而进入它们在钠通道上的阻滞位点。这些化合物的永久带电(Permanently-charged)衍生物(例如QX-314，利多卡因的季氮(quaternary nitrogen)衍生物)不可透过细胞膜，当施用于神经膜的外表面时对神经元钠通道无影响，但如果以某种方式(例如通过用于对分离的神经元进行全细胞电生理学记录的微量移液管)将其引入细胞内部则可阻滞钠通道。疼痛感觉神经元在受到痛苦的热或辣椒素(辣椒中的刺激性成分)激活而表达(大多数情况下)TRPV1受体／ 通道方面与其他类型的神经元不同。在多种类型的疼痛感觉和瘙痒感觉(瘙痒感受器)神经元中选择性表达的其它类型的受体包括但不限于TRPA1、TRPM8和P2X(2／3)受体。
神经病性疼痛、炎性疼痛和伤害感受性(nociceptive)疼痛在病因学、病理生理学、诊断和治疗方面均不同。响应于强烈的或伤害性的刺激物对特定亚组(subset)的外周感觉神经元(伤害感受器)的激活而出现伤害感受性疼痛。这种疼痛一般是急性和自我限制性的，通过警告可能的或正在进行的组织损害来发挥保护性生物学功能。通常这种疼痛限于局部(well-localized)。伤害感受性疼痛的例子包括但不限于创伤(traumatic)或手术疼痛、分娩痛、扭伤、骨折、烧伤、撞击痛(bumps)、挫伤(bruises)、注射造成的疼痛(injections)、牙科程序造成的疼痛(dental procedures)、皮肤活检造成的疼痛(skinbiopsies)和阻塞造成的疼痛(obstructions)。
炎性疼痛是存在组织损伤或炎症时发生的疼痛，包括手术后疼痛、创伤后疼痛、关节炎(类风湿性或骨关节炎)疼痛和与关节、肌肉和肌腱的损伤相关的疼痛(例如轴向下腰痛(axial low back pain)。
神经病性疼痛是一种常见的慢性、非恶性疼痛，其是由外周或中枢神经系统中的损伤或功能障碍造成的，这种疼痛没有保护性生物学功能。据估计，这种疼痛在美国影响超过160万人。神经病性疼痛有多种不同的病因学，并可以由于以下原因而发生这种疼痛，例如创伤、手术、椎间盘突出、脊髓损伤、糖尿病、带状疱疹感染、HIV／AIDS、晚期癌症、切断术(包括乳房切除术)、腕管综合征、长期饮酒(chronic alcohol use)、暴露于辐射，也可能是毒害神经的治疗药剂(例如某些抗-HIV的药物和化疗药物)的非有意的(unintended)副作用。
与伤害感受性疼痛相反，神经病性疼痛常常被描述为性质上有“灼烧感(burning)”、“电击感(electric)”、“麻刺感”或“刺痛感(shooting)”。其特征常常是慢性的异常性疼痛(定义为由通常不引起疼痛反应的刺激(例如轻触)引起的疼痛)和痛觉过敏(定义为对正常的疼痛刺激的敏感性增加)，在任何受损组织外观痊愈之后还可持续数月或数年。
由于多种原因，疼痛可发生在癌症患者中：炎症、压迫(compression)、侵袭、转移性扩散到骨或其它组织中。
有一些病症，在没有有害刺激物、组织损伤或神经系统损害的情况下发生疼痛，这些病症称为功能障碍性(dysfunctional)疼痛，包括但不限于纤维肌痛、压力型头痛、肠易激紊乱(irritable bowel disorders)和红斑性肢痛。
偏头痛是与支配脑膜活动(innervating the meninges of the brain)的感觉纤维活化相关的头疼。
痒感(瘙痒)是一种皮肤学病症，其可以是局部或全身性的，可与皮肤损害(皮疹、特应性湿疹、风团)相关。痒感伴随着多种病症，包括但不限于，应激、焦虑、阳光紫外辐射、代谢和内分泌紊乱(例如，肝脏或肾脏疾病，甲状腺功能亢进)、癌症(例如淋巴瘤)、对药物或食品的反应、寄生虫和真菌感染、过敏性反应、血液疾病(例如真性红细胞增多症)和皮肤学病症。痒感是由一亚组小直径初级感觉神经元(瘙痒感受器)介导的，这些神经元具有伤害感受器神经元的很多特点，包括但不限于表达TRPV1通道。某些痒感介质(mediators)-例如花生酸类物质、组胺、缓激肽、ATP和各种神经营养蛋白具有内源性香草素(endovanilloid)功能。局部施用辣椒素抑制组胺诱导的痒感。因此，像伤害感受器一样，瘙痒感受器是递送离子通道阻断剂的本方法的合适靶标。
尽管已开展了针对疼痛和痒感的多种疗法，仍然需要另外的药剂。
发明内容
第一方面，本发明的特征是通过给予患者第一化合物和任选的第二化合物治疗患者的疼痛和痒感(itch)(例如神经病性疼痛、炎性疼痛、伤害感受性疼痛、特发性疼痛、癌症疼痛、偏头痛、功能障碍性疼痛或操作性疼痛(procedural pain)(例如由牙科操作、注射、骨折固定(setting fractures)、活检造成的疼痛))以及瘙痒的方法，所述第一化合物施加于一个或多个电压门控性离子通道的内表面(internal face)时抑制所述离子通道，但施加于所述通道的外表面(external face)时基本上不抑制所述通道，其中当受体被激活时，第一化合物能够通过膜结合受体／离子通道进入神经元；所述第二化合物激活所述第一化合物可通过的受体。某些实施方式中，第二化合物激活选自TRPV1、P2X(2／3)、TRPA1和TRPM8的受体，所述第一化合物可通过这些受体。可使用任何标准疼痛或痒症指标(例如本文描述的那些)来确定疼痛或痒症的治疗，或可基于患者的主观疼痛或痒感评价来确定疼痛 或痒症的治疗。如果报告疼痛减少、或对能引起疼痛的刺激的反应减少以及痒感减少，则认为患者得到了“治疗”。某些实施方式中，希望给予第二化合物以确保受体(例如TRPV1、P2X(2／3)、TRPA1和／或TRPM8受体)被激活，从而允许第一化合物进入。其它实施方式中，由于受体(例如TRPV1、P2X(2／3)、TRPA1和／或TRPM8受体)已经被激活，不给予第二化合物。因此，第一化合物仅进入具有内源性激活的受体的神经元。其它实施方式中，受体(例如TRPV1、P2X(2／3)、TRPA1和／或TRPM8受体)通过感应激活这些受体的生理状态而被激活，从而允许第一化合物进入。
如果需要，可使用激活TRPV1、P2X(2／3)、TRPA1和／或TRPM8受体的两种或更多种化合物，也可使用抑制一个或多个电压门控性离子通道的两种或更多种化合物。理想地，第一化合物(一种或多种)和第二化合物(一种或多种)可在彼此(间隔)4小时内、2小时内、1小时内、30分钟内或15分钟内给予患者，或基本上同时给药。重要的是，这两种化合物中的每一种均可首先给药。因此，一种实施方式中，首先给予激活TRPV1、P2X(2／3)、TRPA1和／或TRPM8受体的一种或多种化合物，而另一种实施方式中，首先给予当施加于一个或多个电压门控性离子通道的内表面时抑制所述通道，但施加于所述通道的外表面时基本上不抑制所述通道的一种或多种化合物。这些化合物可共同配制入单一组合物中或可分别配制。可通过例如以下方式给予各化合物：口服给药、胃肠外给药、静脉内给药、肌内给药、直肠给药、皮肤(cutaneous)给药、皮下给药、局部给药、透皮给药、舌下给药、经鼻给药、阴道给药、鞘内给药、硬膜外给药、或眼部给药，或通过注射、吸入或与鼻粘膜或口腔粘膜直接接触。
TRPV1受体的激活剂包括但不限于辣椒素(capsaicin)、丁香酚、arvanil(N-花生四烯酰香草胺(arachidonoylvanillamine))、花生四烯乙醇胺(anandamide)、2-氨基乙氧基二苯基硼酸酯(aminoethoxydiphenyl borate)(2APB)、AM404、树脂毒素(resiniferatoxin)、佛波醇12-苯基乙酸酯13-乙酸酯20-高香草酸酯(phorbol12-phenylacetate13-acetate20-homovanillate)(PPAHV)、奥伐尼(NE19550)、OLDA(N-油酰多巴胺)、N-花生四烯酸基多巴胺(arachidonyldopamine)(NADA)、6′-碘代树脂毒素(iodoresiniferatoxin)(6′-IRTX)、C18N-酰基乙醇胺 (acylethanolamines)、脂氧合酶衍生物例如12-氢过氧化廿碳四烯酸(hydroperoxyeicosatetraenoic acid)、抑制剂半胱氨酸结(inhibitor cysteine knot)(ICK)肽(香草毒素(vanillotoxins))、胡椒碱、MSK195(N-[2-(3，4-二甲基苄基-3-(新戊酰氧基(pivaloyloxy))丙基]-2-[4-(2-氨基乙氧基)-3-甲氧苯基]乙酰胺)、JYL79(N-[2-(3，4-二甲基苄基-3-(新戊酰氧基)丙基]-N′-(4-羟基-3-甲氧苄基)硫脲)、羟基-α-山椒素(sanshool)、2-氨基乙氧基二苯基硼酸酯、10-姜烯酚(shogaol)、油烯基姜辣素(oleylgingerol)、油烯基姜烯酚(oleylshogaol)和SU200(N-(4-叔丁基苄基)-N′-(4-羟基-3-甲氧苄基)硫脲)。TRPV1受体的其他激活剂描述于O′Dell等，Bioorg Med Chem(2007)15：6164-6149和Sexton等，FASEB J(2007)21：2695-2703中。
TRPA1受体的激活剂包括但不限于肉桂醛、异硫氰酸烯丙酯、二硫化二烯丙基、icilin、肉桂油、冬青油、丁香油、丙烯醛、羟基-α-山椒素、2-氨基乙氧基二苯基硼酸酯、4-羟基壬烯醛(hydroxynonenal)、对羟基苯甲酸甲酯、芥子油和3′-氨基甲酰联苯-3-基环己基氨基甲酸酯(URB597)。TRPA1受体的其它激活剂描述于Taylor-Clark等，Mol Pharmacol(2007)PMID：18000030；Macpherson等，Nature(2007)445：541-545；和Hill等，JBiol Chem(2007)282：7145-7153中。
P2X受体的激活剂包括但不限于ATP、2-甲硫基-ATP、2′和3′-O-(4-苯甲酰基苯甲酰基)-ATP以及ATP5′-O-(3-硫代三磷酸盐(thiotriphosphate))。
TRPM8受体的激活剂包括但不限于薄荷醇、icilin、桉树脑、芳樟醇、香叶醇和羟基香茅醛。
某些实施方式中，第一化合物抑制电压门控性钠通道。该类的示例性抑制剂是QX-314、N-甲基-普鲁卡因、QX-222、N-辛基-胍、9-氨基吖啶和泮库溴铵(pancuronium)。
其它实施方式中，第一化合物抑制电压门控性钙通道。该类的示例性抑制剂是D-890(季甲氧维拉帕米(quaternary methoxyverapamil))和CERM11888(季苄普地尔(quaternary bepridil))。
其它实施方式中，第一化合物是选自以下的化合物的季胺(quarternary amine)衍生物或其他带电衍生物：利鲁唑、美西律(mexilitine)、苯妥英、 卡马西平、普鲁卡因、阿替卡因、布比卡因(bupivicaine)、甲哌卡因(mepivicaine)、妥卡尼、丙胺卡因、双异丙吡胺(diisopyramide)、苄环烷、奎尼丁、溴苄铵(bretylium)、利法利嗪、拉莫三嗪、氟桂利嗪(flunarizine)和氟司必林(fluspirilene)。本文描述了示例性衍生物。
本发明的特征还在于选自以下的化合物的季胺衍生物或其他带电衍生物：利鲁唑、美西律、苯妥英、卡马西平、普鲁卡因、阿替卡因、布比卡因、甲哌卡因、妥卡尼、丙胺卡因、双异丙吡胺、苄环烷、奎尼丁、溴苄铵、利法利嗪、拉莫三嗪、氟桂利嗪和氟司必林。
在相关方面，本发明的特征是药物组合物，其包含药学上可接受的赋形剂和选自以下的化合物的季铵衍生物或其他带电衍生物：利鲁唑、美西律、苯妥英、卡马西平、普鲁卡因、阿替卡因、布比卡因、甲哌卡因、妥卡尼、丙胺卡因、双异丙吡胺、苄环烷、奎尼丁、溴苄铵、利法利嗪、拉莫三嗪、氟桂利嗪和氟司必林。
本发明的特征还在于组合物，其包含：(i)第一化合物，其激活选自TRPV1、P2X(2／3)、TRPA1和TRPM8的受体；和(ii)第二化合物，其施加于一个或多个电压门控性离子通道的内表面时抑制这些离子通道，但施加于所述通道的外表面时基本上不抑制所述通道，其中，当TRPV1、P2X(2／3)、TRPA1和／或TRPM8受体被激活时，第二化合物能够通过这些受体进入疼痛感觉神经元。一种实施方式中，所述第二化合物在施加于外表面时活性或部分活性降低，但在施加于内表面时活性更大。可配制组合物以用于例如：口服给药、静脉内给药、肌内给药、直肠给药、皮肤给药、皮下给药、局部给药、透皮给药、舌下给药、经鼻给药、阴道给药、鞘内给药、硬膜外给药、或眼部给药，或通过注射、吸入或与鼻粘膜或口腔粘膜直接接触给药。如果需要，该组合物可含有激活TRPV1、P2X(2／3)、TRPA1和／或TRPM8受体的两种或更多种化合物，和／或抑制一个或多个电压门控性离子通道的两种或更多种化合物。
本发明的特征还在于通过将细胞与以下物质接触来抑制该细胞中的一个或多个电压门控性离子通道的方法：(i)第一化合物，其激活选自TRPV1、P2X(2／3)、TRPA1和TRPM8的受体；和(ii)第二化合物，其施加于一个或多个电压门控性离子通道的内表面时抑制所述离子通道，但施加于所述通道 的外表面时基本上不抑制所述通道，其中，当所述受体被激活时，所述第二化合物能够通过所述受体进入疼痛感觉神经元。上文提供了合适的化合物。
本发明的特征还在于鉴定有用于治疗疼痛和痒感的化合物的方法。该方法包括以下步骤：(a)使表达TRPV1、TRPA1、TRPM8和／或P2X(2／3)的神经元的外表面接触：(i)第一化合物，其激活TRPV1、TRPA1、TRPM8或P2X(2／3)受体；和(ii)第二化合物，其施加于一个或多个电压门控性离子通道的内表面时抑制所述离子通道，但施加于所述通道的外表面时基本上不抑制所述通道，以及(b)确定所述第二化合物是否抑制这些神经元中的电压门控性离子通道。第二化合物对电压门控性离子通道的抑制将所述第二化合物鉴定为有用于治疗疼痛和／或痒症的化合物。
这些方法、组合物和试剂盒还可用来选择性阻滞表达TRPV、TRPA、TRPM和P2X受体家族中的不同成员的其它类型神经元中的神经元活性，其中第一化合物是存在于那些类型的神经元中的具体TRPV、TRPA、TRPM和P2X受体的激动剂，第二化合物是正常情况下不可透过膜的钠或钙通道阻断剂。
应理解，可存在其他受体，其允许化合物进入(神经元细胞)，如果没有该受体则所述化合物不能进入。激活这些受体中的一种或多种的化合物联合施加于一个或多个电压门控性离子通道的内表面时抑制所述通道但施加于所述通道的外表面时基本上不抑制所述通道的一种或多种化合物的共同给药也是本发明的一个方面。
本发明的方法、组合物和试剂盒能够阻抑疼痛或痒感而不改变轻触或运动控制。例如，接受硬膜外给药的患者将不会完全丧失感觉输入。
术语“疼痛”在本文使用其广义含义，指所有类型的疼痛，包括急性和慢性疼痛，例如伤害感受性疼痛，如躯体疼痛(somatic)和内脏疼痛；炎性疼痛；功能障碍性疼痛；特发性疼痛；神经病性疼痛，例如中枢产生的疼痛和外围产生的疼痛，偏头痛和癌症疼痛。
术语“伤害感受性疼痛”用于包括所有由威胁或实际伤害身体组织的有害刺激引起的疼痛，所述有害刺激包括但不限于割伤(cut)、擦伤、骨折、挤压伤害(crush injury)、烧伤等等。组织伤害的疼痛受体(伤害感受器)主要位于皮肤、肌骨胳系统或内脏中。
术语“躯体疼痛”用于指骨、关节、肌肉、皮肤或结缔组织产生的疼痛。通常这类疼痛限于局部(well-localized)。
术语“内脏疼痛”在本文用于指内脏器官(例如呼吸器官、胃肠道和胰腺、泌尿道和生殖器官)产生的疼痛。内脏疼痛包括由器官囊(capsule)的肿瘤牵涉(tumorinvolvement)而引起的疼痛。通常由中空内脏的阻塞引起的另一种类型的内脏疼痛，其特征为间歇痉挛性(cramping)并且不太限于局部的(poorly localized)疼痛。内脏疼痛可与炎症相关，如在膀胱炎或反流性食管炎中那样。
术语炎性疼痛包括与活动性炎症相关的疼痛，所述炎症可由创伤、手术、感染和自身免疫疾病引起。
术语“神经病性疼痛”在本文用于指源自外周或中枢神经系统对由对这些系统的损害所引起的感觉输入的异常加工的疼痛。
术语“操作性疼痛”在本文用于指由医疗(medical)、牙科或手术操作引起的疼痛，其中所述操作通常预期有急性创伤或与急性创伤相关。
术语“痒感”在本文用其广义含义，指所有类型的局部和全身(generalized)性、急性间歇性和持久性的痒和刺痛(stinging)的感觉。痒感可以是由于肝病、肾病或癌症而引起的原发性、过敏性、代谢性、传染性、药物诱导性痒感。“瘙痒(pruritus)”是严重的痒感。
“患者”指任何动物。一种实施方式中，患者是人。可使用本发明的方法、组合物和试剂盒治疗的其他动物包括但不限于非人灵长类动物(例如，猴子、大猩猩、黑猩猩)、家畜(例如马、猪、山羊、兔、绵羊、牛、羊驼)和伴侣动物(例如豚鼠、大鼠、小鼠、蜥蜴、蛇、狗、猫、鱼、仓鼠和鸟)。
有用于本发明的化合物包括但不限于任何药学上可接受形式的本文所述化合物，所述药学上可接受的形式包括本文所述化合物的异构体(例如非对映体和对映体)、盐、酯、酰胺、硫酯、溶剂合物和多晶形，以及外消旋混合物和纯的异构体。
“低分子量”指小于约500道尔顿。
术语“药学上可接受的盐”表示在合理的医学判断范围内，适合用于与人和较低等动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应等并与合理的利益／风险比相称的盐。药学上可接受的盐是本领域熟知的。可在本发明化合 物的最后分离和纯化期间原位制备所述盐，或通过将游离碱官能团与合适的有机酸反应来单独制备所述盐。代表性的酸加成盐包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐(camphorate)、樟脑磺酸盐(camphersulfonate)、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐(digluconate)、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐(hemisulfate)、庚酸盐(heptonate)、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、羟乙基磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐(mesylate)、甲磺酸盐(methanesulfonate)、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐(pamoate)、果胶酯酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等等。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括但不限于钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等等。
在本发明化合物的一般描述中，取代基中具体类型的原子的数目通常以某一范围给出，例如，含有1-4个碳原子的烷基或C1-4烷基。提及此类范围时，意在包括具体提及具有指定范围内的各整数原子的基团。例如，1-4个碳原子的烷基包括C1、C2、C3和C4中的每一个。C1-12杂烷基例如包括1-12个碳原予以及一个或多个杂原子。可以按类似方式表示原子和其他类型原子的其他数目。
本文所用的术语“烷基”和前缀“烷(alk-)”包括直链和支链基团以及环状基团，即环烷基。环状基团可以是单环或多环的，优选具有3-6(包括3和6在内)个环碳原子。示例性环状基团包括环丙基、环丁基、环戊基、和环己基。
“C1-4烷基”指具有1-4个碳原子的支链或直链的烃基。C1-4烷基可以是取代或未取代的。示例性的取代基包括烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、卤素(halide)、羟基、氟代烷基、全氟烷基、氨基、氨基烷基、二取代的氨基、季氨基(quaternary amino)、羟烷基、羧基烷基和羧基。C1-4 烷基包括但不限于甲基、乙基、正-丙基、异丙基、环丙基、环丙基甲基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基和环丁基。
“C2-4烯基”指含有一个或多个双键并具有2-4个碳原子的支链或直链的烃基。C2-4烯基可任选地包括单环或多环，其中各环理想地为3-6元。C2-4烯基可以是取代或未取代的。示例性的取代基包括烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、卤素、羟基、氟代烷基、全氟烷基、氨基、氨基烷基、二取代的氨基、季氨基、羟烷基、羧基烷基和羧基。C2-4烯基包括但不限于乙烯基、烯丙基、2-环丙基-1-乙烯基、1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-甲基-1-丙烯基和2-甲基-2-丙烯基。
“C2-4炔基”指含有一个或多个三键并具有2-4个碳原子的支链或直链的烃基。C2-4炔基可任选地包括单环、二环或三环，其中各环理想地为5或6元。C2-4炔基可以是取代或未取代的。示例性的取代基包括烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、卤素、羟基、氟代烷基、全氟烷基、氨基、氨基烷基、二取代的氨基、季氨基、羟烷基、羧基烷基和羧基。C2-4炔基包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基和3-丁炔基。
“C2-6杂环基”指稳定的5-7元单环或7-14元双环杂环，其为饱和、部分不饱和或不饱和(芳族)的，由2-6个碳原子和独立地选自N、O和S的1、2、3或4个杂原子组成，包括其中任何以上定义的杂环与苯环融合的任何二环基团。杂环基可以是取代或未取代的。示例性的取代基包括烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、卤素、羟基、氟代烷基、全氟烷基、氨基、氨基烷基、二取代的氨基、季氨基、羟烷基、羧基烷基和羧基。氮和硫杂原子可任选地被氧化。杂环可经由产生稳定结构的任何杂原子或碳原子而共价连接，例如，咪唑啉基环可在环碳原子位置或氮原子处连接。杂环中的氮原子可任选地季铵化。优选当杂环中S和O原子的总数超过1时，这些杂原子不彼此毗邻。杂环包括但不限于1H-吲唑、2-吡咯烷酮基、2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、2H-吡咯基、3H-吲哚基、4-哌啶酮基、4aH-咔唑、4H-喹嗪基、6H-1，2，5-噻二嗪基(thiadiazinyl)、吖啶基、吖辛因基(azocinyl)、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基(benzothiofuranyl)、苯并苯硫基(benzothiophenyl)、苯并唑基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并四唑基、苯并异唑基、苯并异噻唑基、苯并咪唑酮基(benzimidazalonyl)、咔唑基、4aH-咔唑基、b-咔啉基(carbolinyl)、苯并二氢吡喃基、苯并吡喃基、噌啉基、十氢喹啉基、2H，6H-1，5，2--二噻嗪基、二氢呋喃并[2，3-b]四氢呋喃、呋喃基、呋咱基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、亚吲哚基(indolenyl)、二氢吲哚基、中氮茚基、吲哚基、异苯并呋喃基(isobenzofuranyl)、异苯并二氢吡喃基、异吲唑基、异二氢氮杂茚基(isoindolinyl)、异氮杂茚基(isoindolyl)、异喹啉基、异噻唑基、异唑基、吗啉基、1，5二氮杂萘基、八氢异喹啉基(octahydroisoquinolinyl)、 二唑基、1，2，3-二唑基、1，2，4-二唑基、1，2，5-二唑基、1，3，4-二唑基、唑烷基、唑基、唑烷基萘嵌间二氮杂苯基(oxazolidinylperimidinyl)、菲啶基、菲咯啉基、吩砒嗪基、吩嗪基、吩噻嗪基、phenoxathiinyl、吩嗪基、2，3--二氮杂萘基、哌嗪基、哌啶基、蝶啶基(pteridinyl)、哌啶酮基、4-哌啶酮基、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并唑基(pyridooxazole)、吡啶并咪唑基、吡啶并噻唑基、吡啶基(pyridinyl)、吡啶基(pyridyl)、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹喔啉基、奎宁环基、咔啉基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、6H-1，2，5-噻二嗪基、1，2，3-噻二唑基、1，2，4-噻二唑基、1，2，5-噻二唑基、1，3，4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、噻吩基、噻吩并噻唑基、噻吩并唑基、噻吩并咪唑基、苯硫基、三嗪基、1，2，3-三唑基、1，2，4-三唑基、1，2，5-三唑基、1，3，4-三唑基、呫吨基。优选的5-10元杂环包括但不限于吡啶基、嘧啶基、三嗪基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、唑基、异唑基、四唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、苯并咪唑基、1H-吲唑基、 唑烷基、异唑烷基、苯并三唑基、苯并异唑基、羟吲哚基(oxindolyl)、苯并唑啉基、喹啉基和异喹啉基。优选的5-6元杂环包括但不限于吡啶基、嘧啶基、三嗪基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡咯基、哌嗪基、哌啶基、吡唑基、咪唑基、唑基、异唑基和四唑基。
“C6-12芳基”指具有由带有共轭π电子的碳原子组成的环状系统的芳基(例如苯基)。芳基具有6-12个碳原子。芳基可任选地包括单环、二环或三环，其中各环理想地具有5或6个成员。芳基可以是取代或未取代的。示例性的取代基包括烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、 卤素、氟代烷基、羧基、羟烷基、羧基烷基、氨基、氨基烷基、单取代的氨基、二取代的氨基和季氨基。
“C7-14烷芳基”指被芳基(例如苄基、苯乙基或3，4--二氯苯乙基)取代的烷基，其具有7-14个碳原子。
“C3-10烷杂环基”指被杂环基取代的烷基，其具有3-10个碳原予以及一个或多个杂原子(例如3-呋喃基甲基、2-呋喃基甲基、3-四氢呋喃基甲基或2-四氢呋喃基甲基)。
“C1-7杂烷基”指支链或直链的烷基、烯基或炔基基团，其具有1-7个碳原予以及1、2、3或4个独立地选自N、O、S和P的杂原子。杂烷基包括但不限于叔胺、仲胺、醚、硫醚、酰胺、硫代酰胺、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、腙、亚胺、磷酸二酯、氨基磷酸酯(phosphoramidates)、氨磺酰和二硫化物。杂烷基可任选地包括单环、二环或三环，其中各环理想地具有3-6个成员。杂烷基可以是取代或未取代的。示例性的取代基包括烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、卤素、羟基、氟代烷基、全氟烷基、氨基、氨基烷基、二取代的氨基、季氨基、羟烷基、羟烷基、羧基烷基和羧基。C1-7杂烷基的例子包括但不限于甲氧基甲基和乙氧基乙基。
“卤素”指溴、氯、碘或氟。
“氟代烷基”指被氟原子取代的烷基。
“全氟烷基”指仅由碳和氟原子组成的烷基。
“羧基烷基”指具有式-(R)-COOH的化学部分，其中R选自C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基或C1-7杂烷基。
“羟基烷基”指具有式-(R)-OH的化学部分，其中R选自C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基或C1-7杂烷基。
“烷氧基”指具有式-OR的化学取代基，其中R选自C1-7烷基、C2-7烯基、C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基或C1-7杂烷基。
“芳氧基”指式-OR的化学取代基，其中R是C6-12芳基。
“烷硫基”指式-SR的化学取代基，其中R选自C1-7烷基、C2-7烯基、 C2-7炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基或C1-7杂烷基。
“芳硫基”指式-SR的化学取代基，其中R是C6-12芳基。
“季氨基”指式-(R)-N(R’)(R”)(R”’)+的化学取代基，其中R、R’、R”和R”’各自独立地是烷基、烯基、炔基或芳基基团。R可以是烷基，其将作为取代基的季氨基氮原子与另一部分连接。氮原子N共价连接于烷基、杂烷基、杂芳基和／或芳基基团的四个碳原子，导致氮原子处带一个正电荷。
“带电部分”指在生理pH下获得质子从而变为带正电荷的部分(例如铵、胍(guanidinium)或脒(amidinium))或包含净正电荷形式(net formal positive charge)而无质子化的部分(例如季铵)。所述带电部分可以是永久带电的或瞬时带电的。
本文所用和术语“母体(parent)”指通道阻断化合物，其可通过存在于母体化合物中的胺氮原子的季铵化或鸟苷酸化(guanylation)作用而被修饰。季铵化和鸟苷酸化的化合物是母体化合物的衍生物。本文所述的胍基衍生物以它们的不带电的碱形式存在。这些化合物可作为盐(即，酸加成盐)施用，或以其不带电的碱形式(经原位质子化而形成带电部分)施用。
通过下文的发明详述和权利要求书，本发明的其它特征和优点将非常明显。
附图说明
图1.共同给予胞外QX-314(5mM)和辣椒素(1μM)来选择性阻断辣椒素响应性(capsaicin-responsive)背根神经节(DRG)感觉神经元中的钠电流。(a)左栏：在培养的小的(24μm)辣椒素-敏感性成人(adult)DRG神经元中，单独的5mM QX-314、单独的1μM辣椒素以及共同施用的5mM QX-314和1μM辣椒素的10分钟洗进(wash-in)对钠电流(通过-70至-5mV的步骤来引发)的影响。上栏(top panel)：短暂(brief)施用辣椒素在该神经元中诱导了延长的向内电流(保持电压-70mV)。右栏：相同系列的药物施用对大的(52μm)辣椒素-不敏感性神经元的钠电流的影响。(b)作为试验脉冲的函数的峰值向内电流，所述试验脉冲在对照(■方块)、仅存在5mM QX-314(●圆)、仅1μM辣椒素(▲正三角形)和共同施用的5mMQX-314和1μM辣椒素(倒三角形)中记录。符号显示对25个小的辣椒素敏感性神经元的试验的平均值±SEM。通过20ms去 极化步骤，即以5mV增量从-70mV的保持电位(holdingpotential)(变化)至测试电位范围，引发电流。(c)辣椒素和QX-314的组合对峰值钠电流影响的时间过程。柱形代表相对于对照归一化的峰值钠电流的平均值±SEM(n=25)。
图2.共同施用QX-314和辣椒素阻断伤害感受样(nociceptive-like)DRG神经元的兴奋性。(a)施加于小的(23μm)DRG神经元的去极化电流步骤(250pA，4ms)引发伤害感受器样宽泛动作电位，在下降阶段有突出的偏转(deflection)(箭头)。QX-314(5mM)的2分钟洗进没有影响(第二栏)。辣椒素(1μM)减少了动作电位振幅(第三栏)，这可能是如图1中所示的辣椒素对钠电流的适度降低和辣椒素产生的去极化作用继发的钠电流钝化的组合的结果(probably due to a combination of the modest reduction of sodium currentproduced by capsaicin as in Figure1and inactivation of sodium currentsecondary to the depolarization produced by capsaicin)。即使用大得多的刺激电流注入，共同施用的QX-314和辣椒素仍然完全消除了动作电位的产生。(b)动作电位振幅的平均值±SEM(对QX-314而言，n=25；对辣椒素和辣椒素+QX-314而言，n=15)。
图3.足底内注射辣椒素(10μg／10μL)连通QX-314(2％，10μL)导致对机械(vonFrey丝(von Frey filaments))和热有害刺激的延长的局部麻醉。(a)足底内仅注射QX-314(2％，10μL；绿色符号)、仅注射辣椒素(10μg／10μL；黑色符号)或QX-314和辣椒素一起施用(红色符号)之后，响应于增加强度的von Frey丝(hairs)的缩爪机械阈。对最大效果时间点示出了对最高值(57g，箭头)根本不应答的动物数目。(*=p<0.05，各组n=6)。(b)与(a)中相同组别的缩爪热(辐射热)阈值(Same for thermal(radiant heat)threshold for pawwithdrawal)。箭头指示截断值(cutoff)，对最大效果时间点示出了对最强刺激不应答的动物数目。(*=p<0.05，各组n=6)。
图4.邻近坐骨神经注射QX-314然后注射辣椒素麻醉了动物的后肢对有害机械和热刺激(的反应)而没有产生任何运动缺陷。(a)对坐骨神经仅注射QX-314(0.2％，100μL)、仅注射辣椒素(0.5μg／μL，100μL)或在注射辣椒素之前10分钟注射QX-314之后，响应于增加强度的von Frey 丝的缩爪机械阈。对最大效果时间点示出了对最高值(57g，箭头)根本不应答的动物数目。(*=p<0.05，**=p<0.01，各组n=6)。(b)与(a)中相同组别的缩爪热(辐射热)阈值。(c)坐骨神经注射利多卡因(2％；0.2％)、QX-314(0.2％)、辣椒素(5μg／10μL)和注射QX-314然后注射辣椒素之后评价的运动功能变化(评分：2=完全麻痹；1=部分麻痹；0=没有损害)。各柱上示出了受注射影响的动物数目。
图5.小的背根神经节神经元中钠通道电流的电压钳(Voltage clamp)记录。数据说明，单独的丁香酚对钠电流有适度的抑制效果(10-20％抑制)。共同施用丁香酚和QX-314产生累进性阻断，可在7分钟后完成。示出了两个例子，其代表结果类似的10个试验。
图6.共同施用TRPA激动剂芥子油(MO)(50μM)和QX-314(5mM)。单独的MO使钠电流减少了20-30％，约在3分钟后达到平台期(plateau)。共同施用MO和QX-314显著减少了钠电流。
具体实施方式
目前在开发治疗疼痛的药物中对疼痛感觉神经元中的电压依赖性离子通道十分感兴趣。阻断疼痛感觉神经元中的电压依赖性钠通道可通过妨碍动作电位的起始和传送来阻断疼痛信号，阻断钙通道可阻止疼痛信号神经传递至脊髓中的二级(the second order)神经元。迄今，设计阻断钠通道或钙通道的小有机分子的局限是当这些分子外部施加于靶细胞时必须有活性。这些外部施加的分子绝大多数是疏水性的并可穿过膜。因此，它们将进入所有细胞并因此没有仅影响疼痛感觉神经元这种选择性。然而，已知一些阻断剂，例如QX-314，仅当存在于细胞内时有效。迄今为止，主要用电生理学记录技术(例如通过以机械方式使膜破裂而允许细胞内部透析的完整细胞膜片钳技术)来研究此类阻断剂。机械破裂而不杀死细胞的难度以及后续将阻断剂可逆性施加于细胞内部的难度排除了发展对可能在细胞内发挥作用的药物分子的高通量筛选试验(的可能性)。
我们已发现了将电压门控性离子通道的抑制剂递送入伤害感受性神经元的方法。通过为这些抑制剂提供进入伤害感受性神经元的手段，本发明允许在筛选和治疗中使用在细胞内部有活性作为药物阻断剂，但不必可透过膜的所有类型的分子。此外，限制此类阻断剂仅进入到处于治疗状况下的疼痛感觉神经元中，允许使用未必对疼痛感觉神经元(相对于其他类型的细胞)中的离子通道具有固有选择性的药物，而是通过允许这些阻断剂相对于神经和心血管系统中的其他细胞优先进入疼痛感觉神经元，来获得对疼痛感觉神经元的选择性作用。另外，由于特别是TRPV1受体往往在与疼痛(例如炎症)相关的组织状况中活性更大，因此更有利于进入与产生疼痛的组织最为相关的特定感觉神经元中。痒感敏感性初级感觉神经元也表达TRP通道，特别是TRPV1，也可适应于本方法。
下文更详细地描述了本发明。
电压门控性离子通道的抑制剂
适合用于本发明的方法、组合物和试剂盒的电压门控性离子通道的抑制剂理想地是带正电荷的亲水性化合物。一种实施方式中，所述化合物是永久性带电的(即，带有的电荷不是瞬时的)。另一种实施方式中，所述化合物是瞬时带电的。电压门控性钠通道的合适抑制剂包括但不限于QX-314、N-甲基-普鲁卡因、QX-222、N-辛基-胍、9-氨基吖啶和泮库溴铵。电压门控性钙通道的合适抑制剂包括但不限于D-890(季甲氧维拉帕米)和CERM 11888(季苄普地尔)。
另外，有多种大小适用于本发明方法(例如约100-4,000Da、100-3,000Da、100-2,000Da、150-1,500Da、或甚至200-1,200Da)并具有胺基团或可被修饰以具有胺基团的电压门控性离子通道的已知抑制剂，所述胺基团容易被修饰而带电荷(例如带正电的季胺，或瞬时带电的鸟苷酸化化合物)。此类抑制剂包括但不限于利鲁唑、美西律、苯妥英、卡马西平、普鲁卡因、妥卡尼、丙胺卡因、双异丙吡胺、苄环烷、奎尼丁、溴苄铵、利法利嗪、拉莫三嗪、氟桂利嗪、阿替卡因、布比卡因、甲哌卡因和氟司必林。
可用于本发明组合物、试剂盒和方法中的化合物包括如下式I-X的化合物。
式I中，R1A、R1B和R1C各自独立地选自H、卤素、C1–4烷基、C2–4烯基、C2–4炔基、OR1H、NR1IR1J、NR1KC(O)R1L、S(O)R1M、SO2R1NR1O、 SO2NR1PR1Q、SO3R1R、CO2R1S、C(O)R1T和C(O)NR1UR1V；R1H、R11、R1J、R1K、R1L、R1M、R1N、R1O、R1P、R1Q、R1R、R1s、R1T、R1U和R1V各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基；X1选自-CR1WR1X-、-NR1YC(O)-、-OC(O)-、-SC(O)-、-C(O)NR1Z-、-CO2-和-OC(S)-；R1W、R1X、R1Y和R1Z各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基；R1D选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基；R1E、R1F和R1G各自独立地选自C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基；或R1D和R1G一起形成具有至少一个氮原子的杂环。优选实施方案中，X1是-NHC(O)-。示例性的式I化合物包括麻醉药的甲基化季铵衍生物，例如N-甲基利多卡因、N，N-二甲基丙胺卡因、N，N，N-三甲基妥卡尼、N-甲基依替卡因、N-甲基罗哌卡因、N-甲基布比卡因、N-甲基左旋布比卡因(levobupivacaine)、N-甲基甲哌卡因。可使用与方案1中所述方法类似的方法制备这些衍生物。式I化合物包括QX-314(CAS21306-56-9)和QX-222(CAS21236-55-5)(如下)。
式II中，R2A、R2B和R2C各自独立地选自H、卤素、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、OR2I、NR2JR2K、NR2LC(O)R2M、S(O)R2N、SO2R2OR2P、SO2NR2QR2R、SO3R2S、CO2R2T、C(O)R2U和C(O)NR2VR2W；R2I、R2J、R2K、R2L、R2M、R2N、R2O、R2P、R2Q、R2R、R2s、R2T、R2U、R2V、R2W各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基；X2选自-CR2XR2Y-、-NR2ZC(O)-、-OC(O)-、-SC(O)-、-C(O)NR2AA-、-CO2-和-OC(S)-；R2X、R2Y、R2Z和R2AA各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基 和C2-4杂烷基；R2D选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基；R2E是H或C1-4烷基；R2F、R2G和R2H各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基；或R2F和R2G一起形成具有两个氮原子的杂环。当R2F和R2G形成具有两个氮原子的杂环时，所得的胍基理想地选自
其中R2H是H或CH3。理想地，R2F和R2G结合形成2-4个碳原子的亚烷基或亚烯基，例如5、6和7-元环的环系统。优选实施方式中，X2是-NHC(O)-。示例性的式II化合物包括麻醉药的N-胍基衍生物(例如-C(NH)NH2衍生物)，例如，脱乙基(desethyl)-N-胍基利多卡因、N-胍基丙胺卡因、N-胍基妥卡尼、脱乙基-N-胍基依替卡因、脱丁基(desbutyl)-N-胍基罗哌卡因、脱丁基-N-胍基布比卡因、脱丁基-N-胍基左旋布比卡因、脱甲基(desmethyl)-N-胍基甲哌卡因。可使用与方案2-5中所述方法类似的方法制备这些衍生物。
本文所描述的胍基衍生物(例如式II化合物)以其不带电的碱形式存在。这些化合物可作为盐(即，酸加成盐)施用，或以其不带电的碱形式(经原位质子化而形成带电部分)施用。
式I和式II的母体药物的合成描述在文献中。参见，例如美国专利No.2,441,498(利多卡因的合成)、美国专利No.3，160,662(丙胺卡因的合成)、德国专利No.2235745(妥卡尼的合成)、德国专利No.2162744(依替卡因的合成)、PCT公开号WO85／00599(罗哌卡因的合成)，美国专利No.2,955,111(布比卡因和左旋布比卡因的合成)和美国专利No.2,799,679(甲哌卡因的合成)。
式III中，n=0-3，m=0-3，且(n+m)=0-6；R3A、R3B和R3C各自独立地选自H、卤素、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C2-4杂烷基、OR3L、NR3MR3N、NR3OC(O)R3P、S(O)R3Q、SO2R3RR3S、SO2NR3TR3U、SO3R3V、CO2R3W、C(O)R3X 和C(O)NR3YR3Z；R3L、R3M、R3N、R3O、R3P、R3Q、R3R、R3S、R3T、R3U、R3V、R3W、R3X、R3Y、R3Z各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基；Y3选自-CR3AAR3AB-、-NR3ACC(O)-、-OC(O)-、-SC(O)-、-C(O)NR3AD-、-CO2-和-OC(S)-；R3AA、R3AB、R3AC和R3AD各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基；R3D、R3E、R3F和R3G各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C2-4杂烷基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基和C3-10烷杂环基；R3H、R3J和R3K各自独立地选自C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基。式III中的季氮在本文识别为N′。示例性的式III化合物包括麻醉药的甲基化季铵衍生物，例如N’-甲基普鲁卡因、N’-甲基丙美卡因、N’-甲基阿罗卡因(allocain)、N’-甲基恩卡尼(encainide)、N’-甲基普鲁卡因胺、N’-甲基甲氧氯普胺、N’-甲基斯妥乏因(stovaine)、N’-甲基丙氧卡因(propoxycaine)、N’-甲基氯普鲁卡因、N’，N’-二甲基氟卡尼(flecainide)和N’-甲基丁卡因。可使用与方案1中所述方法类似的方法制备这些衍生物。
式IV中，n=0-3，m=0-3，且(n+m)=0-6；R4A和R4B各自独立地选自H、卤素、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C2-4杂烷基、OR4L、NR4MR4N、NR4OC(O)R4P、S(O)R4Q、SO2R4RR4S、SO2NR4TR4U、SO3R4V、CO2R4W、C(O)R4X和C(O)NR4YR4Z；R4L、R4MR4N、R4O、R4P、R4Q、R4R、R4S、R4T、R4U、R4V、R4W、R4X、R4Y和R4Z各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基；Y4选自-CR4AAR4AB-、-NR4ACC(O)-、-OC(O)-、-SC(O)-、-C(O)NR4AD-、-CO2-和-OC(S)-；R4AA、R4AB、R4AC和R4AD各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基；R4C、R4D、R4E和R4F各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C2-4杂烷基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基和C3-10烷杂环基；X4选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和NR4JR4K；R4J和R4K各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基；R4G、R4H和R4I各自独立地选自C1-4烷基、 C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基。式IV中的季氮在本文中识别为N″。示例性的式III化合物包括麻醉药的甲基化季铵衍生物，例如N”，N”，N”-三甲基普鲁卡因、N”，N”，N”-三甲基丙美卡因、N”，N”，N”-三甲基普鲁卡因胺、N”，N”，N”-三甲基甲氧氯普胺、N”，N”，N”-三甲基丙氧卡因、N”，N”，N”-三甲基氯普鲁卡因、N”，N”-二甲基丁卡因、N”，N”，N”-三甲基苯佐卡因和N”，N”，N”-三甲基氨苯丁酯。可使用与方案1中所述方法类似的方法制备这此衍生物。
式V中，n=0-3，m=0-3，且(n+m)=0-6；R5A、R5B和R5C各自独立地选自H、卤素、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C2-4杂烷基、OR5M、NR5NR5O、NR5PC(O)R5Q、S(O)R5R、SO2R5SR5T、SO2NR5UR5V、SO3R5W、CO2R5X、C(O)R5Y和C(O)NR5ZR5AA；R5M、R5N、R5O、R5P、R5Q、R5R、R5S、R5T、R5U、R5V、R5W、R5X、R5Y、R5Z和R5AA各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基；Y5选自-CR5ABR5AC-、-NR5ADC(O)-、-OC(O)-、-SC(O)-、-C(O)NR5AE-、-CO2-和-OC(S)-；R5AB、R5AC、R5AD和R5AE各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基；R5D、R5E、R5F和R5G各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C2-4杂烷基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基和C3-10烷杂环基；R5H是H或C1-4烷基；R5J、R5K和R5L各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基；或R5J和R5K一起形成具有两个氮原子的杂环。当R5J和R5K形成具有两个氮原子的杂环时，所得的胍基理想地选自
其中R5L是H或CH3。理想地，R5J和R5K结合形成2-4个碳原子的亚烷基或亚烯基，例如5、6和7-元环的环系统。式V中的鸟苷酸化(guanylated) 氮在本文识别为N′。示例性的式V化合物包括麻醉药的N-胍基衍生物(例如-C(NH)NH2衍生物)，例如，脱乙基-N’-胍基普鲁卡因、脱乙基-N’-胍基丙美卡因、脱乙基-N’-胍基阿罗卡因、脱甲基-N’-胍基恩卡尼、脱乙基-N’-胍基普鲁卡因胺、脱乙基-N’-胍基甲氧氯普胺、脱甲基-N’-胍基斯妥伐因、脱乙基-N’-胍基丙氧卡因、脱乙基-N’-胍基氯普鲁卡因、N’-胍基氟卡尼和脱乙基-N’-胍基丁卡因。可使用与方案2-5中所述方法类似的方法制备这些衍生物。
VI中，n=0-3，m=0-3，且(n+m)=0-6；R6A和R6B各自独立地选自H、卤素、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C2-4杂烷基、OR6K、NR6LR6M、NR6NC(O)R6O、S(O)R6P、SO2R6QR6R、SO2NR6SR6T、SO3R6U、CO2R6V、C(O)R6W和C(O)NR6XR6Y；R6K、R6L、R6M、R6N、R6O、R6P、R6Q、R6R、R6S、R6T、R6U、R6V、R6W、R6X和R6Y各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基；Y6选自-CR6ZR6AA-、-NR6ABC(O)-、-OC(O)-、-SC(O)-、-C(O)NR6AC-、-CO2-和-OC(S)-；R6Z、R6AA、R6AB和R6AC各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基；R6C、R6D、R6E和R6F各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C2-4杂烷基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基和C3-10烷杂环基；X6选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和NR6ADR6AE；R6AD和R6AE各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基；R6G是H或C1-4烷基；R6H、R6I和R6J各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基；或R6H和R6I一起形成具有两个氮原子的杂环。当R6H和R6I形成具有两个氮原子的杂环时，所得的胍基理想地选自
其中R6J是H或CH3。理想地，R6H和R6I结合形成2-4个碳原子的亚烷基或亚烯基，例如5、6和7-元环的环系统。式V中的鸟苷酸化氮在本文识别为N″。示例性的式VI化合物包括麻醉药的N-胍基衍生物(例如-C(NH)NH2衍生物)，例如，N”-胍基普鲁卡因、N”-胍基丙美卡因、N”-胍基普鲁卡因胺、N”-胍基甲氧氯普胺、N”-胍基丙氧卡因、N”-胍基氯普鲁卡因、N”-胍基丁卡因、N”-胍基苯佐卡因和N”-胍基氨苯丁酯。可使用与方案2-5中所述方法类似的方法制备这些衍生物。
式III-VI的母体药物的合成描述在文献中。参见，例如，美国专利No.812，554(普鲁卡因的合成)、Clinton等，J.Am.Chem.Soc.74：592(1952)(丙美卡因的合成)、美国专利No.2，689，248(丙氧卡因的合成)、Hadicke等，Pharm.Zentralh.94：384(1955)(氯普鲁卡因的合成)、美国专利No.1，889，645(丁卡因的合成)、Salkows ki等，Ber.28：1921(1895)(苯佐卡因的合成)、Brill等，J.4m.Chem.Soc.43：1322(1921)(氨苯丁酯的合成)、美国专利No.3，931，195(恩卡尼的合成)、Yamaza ki等，J.Pharm.Soc.Japan73：294(1953)(普鲁卡因胺的合成)、美国专利No.3，177，252(甲氧氯普胺的合成)、美国专利No.3，900，481(氟卡尼的合成)和Fourheau等，Bull.Sci.Pharmacol.35：273(1928)(斯妥乏因的合成)。
式VII中，n=0-3，m=0-3，且(n+m)=0-6；R7A、RTM和R7C各自独立地选自H、卤素、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C2-4杂烷基、OR7L、NR7MRTM、NR7OC(O)R7P、S(O)R7Q、SO2R7RR7S、SO2NR7TR7U、SO3RTM、CO2R7W、C(O)RTM和C(O)NR7YR7Z；R7L、RTM、RTM、R7O、R7P、R7Q、RTM、R7S、R7T、RTM、RTM、R7W、RTM、RTM和R7Z各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基；X7选自-CR7AAR7AB-、-NR7ACC(O)-、-OC(O)-、-SC(O)-、-C(O)NR7AD-、-CO2-和-OC(S)-；R7AA、R7AB、R7AC和R7AD各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基；RTM、R7E、R7F和R7G各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C2-4杂烷基、C2-6杂环 基、C6-12芳基、C7-14烷芳基和C3-10烷杂环基；R7H、R7J和R7K各自独立地选自C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基。优选实施方式中，X7是-C(O)NH-。示例性的式VII化合物包括麻醉药的甲基化季铵衍生物，例如N′-甲基辛可卡因(dibucaine)。可使用与方案1中所述方法类似的方法制备这些衍生物。
式VIII中，n=0-3，m=0-3，且(n+m)=0-6；R8A、R8B和R8C各自独立地选自H、卤素、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C2-4杂烷基、OR8L、NR8MR8N、NR8OC(O)R8P、S(O)R8Q、SO2R8RR8S、SO2NR8TR8U、SO3R8V、CO2R8W、C(O)R8X和C(O)NR8YR8Z；R8L、R8M、R8N、R8O、R8P、R8Q、R8R、R8S、R8T、R8U、R8V、R8W、R8X、R8Y和R8Z各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基；X8选自一CR8AAR8AB-、-NR8ACC(O)-、-OC(O)-、-SC(O)-、-C(O)NR8AD-、-CO2-和-OC(S)-；R8AA、R8AB、R8AC和R8AD各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基；R8D、R8E、R8F和R8G各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C2-4杂烷基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基和C3-10烷杂环基；R8H是H或C1-4烷基；R8I、R8J和R8K各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基；或R8I和R8J一起形成具有两个氮原子的杂环。当R8I和R8J形成具有两个氮原子的杂环时，所得的胍基理想地选自
其中R8K是H或CH3。理想地，R8I和R8J结合形成2-4个碳原子的亚烷基或亚烯基，例如5、6和7-元环的环系统。式V中的鸟苷酸化氮在本文识别为N′。优选实施方式中，X8是-C(O)NH-。示例性的式VIII化合物包括麻醉药的N-胍基衍生物(例如-C(NH)NH2衍生物)，例如脱乙基-N-胍基辛可卡因。可使用与方案2-5中所述方法类似的方法制备这些衍生物。
式IX中，n＝0-6；R9A、R9B、R9C、R9D和R9E各自独立地选自H、卤素、C1–4烷基、C2–4烯基、C2–4炔基、OR9I、NR9JR9K、NR9LC(O)R9M、S(O)R9N、SO2R9OR9P、SO2NR9QR9R、SO3R9S、CO2R9T、C(O)R9U和C(O)NR9VR9W；R9I、R9J、R9K、R9L、R9M、R9N、R9O、R9P、R9Q、R9R、R9S、R9T、R9U、R9V和R9W各自独立地选自H、C1–4烷基、C2–4烯基、C2–4炔基和C2–4杂烷基；X9选自-CR9XR9Y-、-O-、-S-和-NR9Z-；R9X、R9Y和R9Z各自独立地选自H、C1–4烷基、C2–4烯基、C2–4炔基和C2–4杂烷基；Y9是NR9AAR9ABR9AC或NR9ADZ9；R9AA、R9AB和R9AC各自独立地选自H、C1–4烷基、C2–4烯基和C2–4炔基；R9AD是H或C1–4烷基；Z9是R9F、R9G和R9H各自独立地选自H、C1–4烷基、C2–4烯基和C2–4炔基；或R9F和R9G一起形成具有两个氮原子的杂环。当R9F和R9G形成具有两个氮原子的杂环时，所得的胍基理想地选自
其中R9H是H或CH3。理想地，R9F和R9G结合形成2-4个碳原子的亚烷基或亚烯基，例如5、6和7-元环的环系统。优选实施方式中，X9＝-O-。示例性的式IX化合物包括N-胍基衍生物(例如-C(NH)NH2衍生物)(例如N-胍基氟西汀)以及甲基化季铵衍生物(例如N,N-二甲基氟西汀)。可使用与方案1-5中所述方法类似的方法制备这些衍生物。
式X中，W3是O、NH、NCH2R10J、NC(O)CH2R10J、CHCH2R10J、C＝CHR10J或C＝CHR10K；W1-W2是S、O、OCHR10K、SCHR10K、N＝CR10K、 CHR10L-CHR10K或CR10L=CR10K；R10A、R10B、R10C、R10D、R10E、R10F、R10G、和R10H各自独立地选自H、OH、卤素、C1-4烷基和C2-4杂烷基；R10J是CH2CH2X10A或CH(CH3)CH2X10A；R10L是H或OH；R10K是H、OH或基团 X10A是NR10MR10NR10p或NR10QX10C；X10B是NR10RR10s或NX10C；R10M、R10N、R10P、R10R和R10S各自独立地选自C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基和C2-4杂烷基，或R10R和R10S一起形成具有至少一个氮原子的杂环；R10Q是H或C1-4烷基；X10C是R10T、R10U和R10V各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基和C2-4炔基，或R10T和R10V一起形成具有两个氮原子的杂环。当R10T和R10V形成具有两个氮原子的杂环时，所得的胍基理想地选自
其中R10U是H或CH3。理想地，R10T和R10V结合形成2-4个碳原子的亚烷基或亚烯基，例如5、6和7-元环的环系统。示例性的式X化合物包括N-胍基衍生物(例如-C(NH)NH2衍生物)和甲基化季铵衍生物。式X的N-胍基衍生物包括但不限于N-胍基阿莫沙平、脱甲基-N-胍基曲米帕明、脱甲基-N-胍基度硫平、脱甲基-N-胍基多塞平(doxepin)、脱甲基-N-胍基阿米替林、N-胍基普罗替林、N-胍基地昔帕明、脱甲基-N-胍基氯米帕明、脱甲基-N-胍基氯氮平、脱甲基-N-胍基洛沙平、N-胍基去甲替林、脱甲基-N-胍基环苯扎林、脱甲基-N-胍基赛庚啶、脱甲基-N-胍基奥洛他定(olopatadine)、脱甲基-N-胍基异丙嗪、脱甲基-N-胍基阿利马嗪(trimeprazine)、脱甲基-N-胍基氯普噻吨、脱甲基-N-胍基氯丙嗪、脱甲基-N-胍基丙酰马嗪、脱甲基-N-胍基丙氯拉嗪(prochlorperazine)、脱甲基-N-胍基硫乙拉嗪(thiethylperazine)、脱甲基-N-胍基三氟拉嗪、脱乙基-N-胍基乙胺噻嗪(ethacizine)和脱甲基-N-胍基丙米嗪。式X的甲基化季铵衍生物包括但不限于N，N-二甲基阿莫沙平、N-甲基曲米帕明、N-甲基度硫平、N-甲基多塞平、N-甲基阿米替林、N，N-二甲基普罗替林、N，N-二甲基地昔帕明、N-甲基氯米帕明、N-甲基氯氮平、N-甲基洛沙平、N，N-二甲基去甲替林、N-甲基 环苯扎林、N-甲基赛庚啶、N-甲基奥洛他定、N-甲基异丙嗪、N-甲基阿利马嗪、N-甲基氯普噻吨、N-甲基氯丙嗪、N-甲基丙酰马嗪、N-甲基莫雷西嗪(moricizine)、N-甲基丙氯拉嗪、N-甲基硫乙拉嗪、N-甲基氟奋乃静(fluphenazine)、N-甲基奋乃静(perphenazine)、N-甲基氟哌噻吨(flupenthix0l)、N-甲基乙酰奋乃静(acetophenazine)、N-甲基三氟拉嗪、N-甲基乙胺噻嗪和N-甲基丙米嗪。可使用与方案1-5中所述方法类似的方法制备这些衍生物。
可含有可如本文所述被鸟苷酸化或季铵化的胺氮的其它离子通道阻断剂包括但不限于奥芬那君、安妥根(phenbenzamine)、苄普地尔、匹莫齐特、五氟利多、氟桂利嗪、氟司必林、丙哌维林、丙吡胺、美沙酮、托特罗定、tridihexethyl盐、曲吡那敏(tripelennamine)、美吡拉敏、溴苯那敏、氯苯那敏、右氯苯那敏、卡比沙明、左醋美沙朵(levomethadyl acetate)、戈洛帕米、维拉帕米、地伐帕米、噻帕米、依莫帕米、达克罗宁、普莫卡因(pramoxine)、拉莫三嗪、米贝拉地尔、加巴喷丁、阿米洛利(amiloride)、地尔硫(diltiazem)、硝苯地平、尼莫地平、尼群地平、可卡因、美西律、普罗帕酮、奎尼丁、奥昔卡因、阿替卡因、利鲁唑、苄环烷、利法利嗪和士的宁。其它离子通道阻断剂可经修饰，以并入适于季铵化或鸟苷酸化的氮原子。这些离子通道阻断剂包括但不限于磷苯妥英、乙苯妥英(ethotoin)、苯妥英、卡马西平、奥卡西平、托吡酯(topiramate)、唑尼沙胺和丙戊酸的盐。
合成
电荷修饰(charge-modified)的离子通道阻断剂的合成可涉及对母体离子通道阻断剂的醇、胺、酮、巯基或羧基官能团、接头(linker)、巨大的基团(bulky group)和／或带电基团进行选择性保护和脱保护。例如，用于胺的常用保护基包括氨基甲酸酯(carbamates)，例如叔丁基、苄基、2，2，2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、9-芴基甲基、烯丙基和间硝基苯基。用于胺的其它常用保护基包括酰胺，例如甲酰胺、乙酰胺、三氟乙酰胺、磺酰胺、三氟甲磺酰胺(trifluoromethanesulfonyl amides)、三甲基甲硅烷基乙磺酰胺(trimethylsilylethanesulfonamides)和叔丁基磺酰胺。用于羧基的常用保护基的例子包括酯，例如甲基、乙基、叔丁基、9-芴基甲基、2-(三甲 基甲硅烷基)乙氧基甲基、苄基、二苯基甲基、O-硝基苄基、原酸酯(ortho-esters)以及卤代酯(halo-esters)。用于醇类的常用保护基的例子包括醚，例如，甲基、甲氧基甲基、甲氧基乙氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、四氢吡喃基、乙氧基乙基、苄基、2-萘基(napthyl)甲基、O-硝基苄基、P-硝基苄基、P-甲氧基苄基、9-苯基呫吨基、三苯甲基(包括甲氧基-三苯甲基)和甲硅烷基醚。用于巯基的常用保护基的例子包括很多用于羟基的相同保护基。此外，巯基可以其还原形式(例如，作为二硫化物)或氧化形式(例如，作为磺酸、磺酸酯或磺酰胺)被保护。可选择保护基从而实现脱除分子中的每一种保护基而不去除其他保护基所需要的选择性条件(例如酸性条件、碱性条件、通过亲核试剂催化、通过路易斯酸催化、或氢化)。向胺、醇、巯基和羧基官能团上添加保护基所需要的条件以及脱除这些保护基所需要的条件详细提供于T.W.Green和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis(第2版)，John Wiley&Sons，1991以及P.J.Kocienski，Protecting Groups，Georg Thieme Verlag，1994中。
可用本领域技术人员熟知的技术来制备电荷修饰的离子通道阻断剂。例如可使用以下文献中描述的技术通过使母体离子通道阻断剂烷基化来产生修饰：J.March，AdvancedOrganicChemistry：Reactions，Mechanisms and Structure，John Wiley&Sons，Inc.，1992，617页。可使用标准的合成规程来实现氨基向胍基的转化。例如，Mosher描述了通过氨基亚氨基甲磺酸(aminoiminomethanesulfonic acid)和胺的反应制备单取代胍的一般方法(Kim等，Tetrahedron Lett.29：3183(1988))。Bernatowicz开发了一种使伯胺和仲胺鸟苷酸化的更方便的方法，其中使用1H-吡唑-1-甲脒(carboxamidine)盐酸盐、1-H-吡唑-1-(N，N′-双(叔丁氧羰基))甲脒、或1-H-吡唑-1-(N，N′-双(苄氧基羰基))甲脒。这些试剂与胺反应产生单取代胍(参见Bernatowicz等，J.Org.Chem.57：2497(1992)；Bernatowicz等，Tetrahedron Lett.34：3389(1993))。此外，已显示硫脲和S-烷基-异硫脲在取代胍的合成中是有用的中间体(PoSS等，Tetrahedron Lett.33：5933(1992))。某些实施方式中，胍是具有两个氮原子的杂环的一部分(参见例如以下结构)。环系统可包括亚烷基或
2-4个碳原子的亚烯基，例如5、6和7-元环的环系统。例如可通过Schlama等，J.Org.Chem.，62：4200(1997)公开的方法制备此类环系统。
可通过母体化合物中胺氮的烷基化来制备电荷修饰的离子通道阻断剂，如方案1所示。
方案1
或者，可通过引入胍基来制备电荷修饰的离子通道阻断剂。母体化合物可与氰胺(cynamide)(例如甲基氰胺)反应(如方案2所示)或与吡唑-l-甲脒衍生物反应(如方案3所示，其中Z是H或合适的保护基)。或者，母体化合物可与溴化氰反应，然后与甲基氯化铝胺(methylchloroaluminum amide)反应(如方案4所示)。也可用诸如2-(甲硫基)-2-咪唑啉的试剂制备合适官能化的衍生物(方案5)。
方案2
方案3
方案4
方案5
可如方案1-5所示修饰含有胺氮原子的任何离子通道阻断剂。
TRPV1激动剂
可用于本发明方法、组合物和试剂盒中的TRPV1激动剂包括但不限于激活伤害感受器上的TRPV1受体并允许至少一种电压门控性离子通道抑制剂进入的任何物质。合适的TRPV1激动剂包括但不限于辣椒素、丁香酚、arvanil(N-花生四烯酰香草胺)、花生四烯乙醇胺、2-氨基乙氧基二苯基硼酸酯(2APB)、AM404、树脂毒素、佛波醇12-苯基乙酸酯13-乙酸酯20- 高香草酸酯(PPAHV)、奥伐尼(NE19550)、OLDA(N-油酰多巴胺)、N-花生四烯酸基多巴胺(NADA)、6′-碘代树脂毒素(6′-IRTX)、C18N-酰基乙醇胺、脂氧合酶衍生物例如12-氢过氧化廿碳四烯酸、抑制剂半胱氨酸结(ICK)肽(香草毒素)、胡椒碱、MSK195(N-[2-(3，4--二甲基苄基-3-(新戊酰氧基)丙基]-2-[4-(2-氨基乙氧基)-3-甲氧苯基]乙酰胺)、JYL79(N-[2-(3，4-二甲基苄基-3-(新戊酰氧基)丙基]-N′-(4-羟基-3-甲氧苄基)硫脲)、羟基-α-山椒素、2-氨基乙氧基二苯基硼酸酯、10-姜烯酚、油烯基姜辣素、油烯基姜烯酚和SU200(N-(4-叔丁基苄基)-N′-(4-羟基-3-甲氧苄基)硫脲)。
TRP1A激动剂
可用于本发明方法、组合物和试剂盒中的TRP1A激动剂包括激活伤害感受器或瘙痒感受器上的TRP1A受体并允许至少一种电压门控性离子通道抑制剂进入的任何物质。合适的TRP1A激动剂包括但不限于肉桂醛、异硫氰酸烯丙酯、二硫化二烯丙基、icilin、肉桂油、冬青油、丁香油、丙烯醛、羟基-α-山椒素、2-氨基乙氧基二苯基硼酸酯、4-羟基壬烯醛、对羟基苯甲酸甲酯、芥子油和3′-氨基甲酰联苯-3-基环己基氨基甲酸酯(URB597)。
P2X激动剂
可用于本发明方法、组合物和试剂盒中的P2X激动剂包括激活伤害感受器或瘙痒感受器上的P2X受体并允许至少一种电压门控性离子通道抑制剂进入的任何物质。合适的P2X激动剂包括但不限于2-甲硫基-ATP、2′和3′-O-(4-苯甲酰基苯甲酰基)-ATP以及ATP5′-O-(3-硫代三磷酸盐)。
TRPM8激动剂
可用于本发明方法、组合物和试剂盒中的TRPM8激动剂包括激活伤害感受器或瘙痒感受器上的TRPM8受体并允许至少一种电压门控性离子通道抑制剂进入的任何物质。合适的TRPM8激动剂包括但不限于薄荷醇、icilin、桉树脑、芳樟醇、香叶醇和羟基香茅醛。
另外的药剂
本发明的方法、组合物和试剂盒可用于治疗疼痛(例如，神经病性疼痛、伤害感受性疼痛、特发性疼痛、炎性疼痛、功能障碍性疼痛、偏头痛或操作 性疼痛)和痒感(例如，皮肤病症例如特应性湿疹或牛皮癣、寄生虫和真菌感染中的瘙痒、药物引发的痒感、过敏性痒感、代谢性痒感、癌症或肝脏和肾衰竭中的痒感)。如果需要，在本文所述的方法、组合物和试剂盒中，通常用于治疗疼痛的一种或多种其他药剂可与本发明联用。此类药剂包括但不限于NSAIDs、阿片样物质、三环类抗忧郁药、胺转运蛋白抑制剂、抗惊厥药。如果需要，在本文所述的方法、组合物和试剂盒中，通常用于治疗痒感的一种或多种其他药剂可与本发明联用。此类药剂包括局部用或口服的类固醇和抗组胺药。
组合物制剂
可通过导致目标区域的痛觉降低的任何合适方法给予本发明的组合。电压门控性离子通道的抑制剂(一种或多种)和TRPV1／TRPA1／P2X／TRPM8受体激动剂(一种或多种)可以任何合适的量含于任何合适的载体物质中，其总存在量通常是组合物总重量的1-95重量％。可通过适于以下方式的剂型提供本发明组合物：口服给药、胃肠外给药(例如静脉内给药、肌内给药)、直肠给药、皮肤给药、皮下给药、局部给药、透皮给药、舌下给药、经鼻给药、阴道给药、鞘内给药、硬膜外给药或眼部给药，或通过注射、吸入或与鼻粘膜或口腔粘膜直接接触给药。
因此，所述组合物可以是例如以下形式：片剂、胶囊、丸剂、散剂、颗粒、混悬剂、乳液、溶液、凝胶(包括水凝胶)、糊剂、软膏剂、霜剂、膏药、兽用顿服药(drenches)、渗透递送装置、栓剂、灌肠剂、注射剂、植入物、喷雾剂或气溶胶。可根据常规药学实践来配制所述组合物(参见，例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，2000，A.R.Gennaro编，Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，以及Encyclopedia ofPharmaceutical Technology，J.Swarbrick和J.C.Boylan编，1988-1999，Marcel Dekker，纽约)。
可用本领域已知的各种方式配制所述组合中的各化合物。例如，所述第一药剂和第二药剂可配制在一起或单独配制。理想地，所述第一药剂和第二药剂配制在一起用于同时给予或近乎同时给予这些药剂。
可将分别或单独配制的药剂包装在一起作为试剂盒。非限制性例子包括但不限于容纳例如两种丸剂、丸剂和散剂、栓剂和小瓶中的液体、两种局部 用霜剂等的试剂盒。试剂盒可包含有助于将单位剂量给予患者的任选组分，例如用于重建粉末形式的小瓶、用于注射的注射器、定制的IV递送系统、吸入器等等。另外，单位剂量试剂盒可容纳关于所述组合物的制备和给药的说明书。
试剂盒可制造为针对一个患者的单次使用的单位剂量；针对具体患者的多次使用剂量(恒定剂量，或其中各化合物的效力随着治疗的进展而变化)；或试剂盒可容纳适于多个患者给药的多剂量(大包装(“bulk packaging”))。试剂盒组分可组装在纸盒(cartons)、泡罩包装(blister packs)、瓶、管等等中。
用于口服使用的固体剂型
用于口服使用的制剂包括片剂，其含有与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以是例如，惰性稀释剂或填充剂(例如蔗糖和山梨糖醇)、润滑剂、助流剂和抗粘着剂(例如硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石)。
两种或更多种化合物可以在片剂、胶囊或其它载体中混合在一起，或可以是分开的。一个实例中，第一化合物含在片剂内侧上，第二化合物在片剂外侧上，从而在第一化合物释放之前释放大部分的第二化合物。
口服使用的制剂还可作为咀嚼片，或作为硬明胶胶囊(其中活性成分与惰性固体稀释剂混合)，或作为软明胶胶囊(其中活性成分与水或油介质混合)提供。
通常，给予人时，本发明组合中的任何化合物的口服剂量将取决于该化合物的性质，并可由本领域技术人员容易地确定。通常，此类剂量一般是约0.001mg-2000mg／天，理想地约1mg-1000mg／天，更理想地是约5mg-500mg／天。多达200mg／天的剂量可能是必要的。给予激活TRPV1／TRPA1／P2X／TRPM8受体所需的最小治疗剂量可能是有用的，可用标准技术确定该剂量。
本发明组合中各药物的给药可独立地是每天1次至4次，持续1天-1年，甚至可持续患者终生。很多情况下将需要不断地(chronic)、长期给药。
局部制剂
也可用含有0.0001％-25％(w／w)或更多的活性成分的局部用载体使组合物适合于局部使用。
优选组合中，活性成分优选各自为0.0001％-10％(w／w)，更优选是0.0005％-4％(w／w)活性剂。霜剂可每天施用1-4次，或根据需要施用。例如，对于适合局部施用的泼尼松龙，局部载体将含有0.01％-5％(w／w)，优选0.01％-2％(w／w)，更优选0.01％-1％(w／w)。
实施本文所述的方法时，优选将含有本发明组合的载体施用于对象的不适部位。例如，可将霜剂施用于对象的手指罹患关节炎的手上。
偶联物(conjugates)
如果需要，本文所述的任何组合中所用的药物可彼此共价连接以形成式(XI)的偶联物。
(A)-(L)-(B) (XI)
式(XI)中，(A)是化合物，其激活存在于伤害感受器和／或瘙痒感受器上的通道形成(channel-forming)受体；(L)是接头；和(B)是化合物，其施加于一个或多个电压门控性离子通道的内表面时抑制所述离子通道，但施加于所述通道的外表面时基本上不抑制所述通道，且其在所述受体被激活时能够通过所述通道形成受体进入伤害感受器或瘙痒感受器。
本发明的偶联物可以是前药，该偶联物例如被细胞内酶和细胞外酶(例)如，酰胺酶、酯酶和磷酸酶)裂解时，释放药物(A)和药物(B)。还可将本发明的偶联物设计，使其在体内很大程度上保持完整，抵抗细胞内和细胞外酶的裂解作用，只要当通道形成受体被激活时该偶联物能够通过这些受体进入伤害感受器或瘙痒感受器。可通过设计接头(L)和在偶联物合成期间与化合物(A)和化合物(B)形成的共价键来控制偶联物的体内降解。可用本领域技术人员熟知的技术制备所述偶联物。
可使用本领域技术人员熟悉的技术制备偶联物。例如，可使用G.Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，Inc.，1996中公开的方法制备所述偶联物。偶联物的合成可涉及药物（A)、接头和／或药物(B)的醇、胺、酮、巯基或羧基官能团的造反性保护和脱保护。例如，用于胺的常用保护基包括氨基甲酸酯，例如叔丁基、苄基、2，2，2-三氯乙基、2-三甲基甲硅 烷基乙基、9-芴基甲基、烯丙基和间硝基苯基。用于胺的其他常用保护基包括酰胺，例如甲酰胺、乙酰胺、三氟乙酰胺、磺酰胺、三氟甲磺酰胺、三甲基甲硅烷基乙磺酰胺和叔丁基磺酰胺。用于羧基的常用保护基的例子包括酯，例如甲基、乙基、叔丁基、9-芴基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、苄基、二苯基甲基、O-硝基苄基、原酸酯以及卤代酯。用于醇类的常用保护基的例子包括醚，例如甲基、甲氧基甲基、甲氧基乙氧基甲基、甲基硫代甲基、苄氧基甲基、四氢吡喃基、乙氧基乙基、苄基、2-萘基甲基、O-硝基苄基、P-硝基苄基、P-甲氧基苄基、9-苯基呫吨基、三苯甲基(包括甲氧基-三苯甲基)和甲硅烷基醚。用于巯基的常用保护基的例子包括很多用于保护羟基的相同的保护基。此外，巯基可以其还原形式(例如，作为二硫化物)或氧化形式(例如，作为磺酸、磺酸酯或磺酰胺)被保护。可选择保护基从而实现脱除分子中的每一种保护基而不去除其他保护基所需要的选择性条件(例如酸性条件、碱性条件、通过亲核试剂催化、通过路易斯酸催化、或氢化)。向胺、醇、巯基和羧基官能团上添加保护基所需要的条件以及脱除这些保护基所需要的条件详细提供于T.W.Green和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis(第2版)，JohnWiley&Sons，1991以及P.J.Kocienski，Protecting G roups，Georg Thieme Verlag，1994中。以下提供另外的合成细节。
接头
最简单形式的本发明的接头成分是化合物(A)和化合物(B)之间的键，但接头通常提供线形、环状或分支的分子骨架，该骨架具有侧基(pendant groups)，将化合物(A)共价连接于化合物(B)。因此，通过共价方式(包括与位于化合物(A)和化合物(B)上的一种或多种官能团形成键)来实现将化合物(A)连接于化合物(B)。可用于该目的的化学反应性官能团的例子包括但不限于氨基、羟基、巯基、羧基、羰基、烃基(carbohydrate groups)、邻二醇(vicinal diols)、硫醚、2-氨基醇、2-氨基硫醇、胍基、咪唑基和酚基。
可用接头实现化合物(A)和化合物(B)的共价连接，所述接头含有能够与化合物(A)和化合物(B)中存在的这些官能团反应的反应性部分。例如，化合物(A)的胺基可与接头的羧基或其活化衍生物反应，生成连接该两者的酰胺。
能够与巯基反应的部分的例子包括XCH2CO-型(其中X是Br、Cl或I) 的α-卤代乙酰基化合物，其对巯基显示出特别的反应性，但也可用于修饰咪唑基、硫醚、酚和氨基，如Gurd，Methods Enzymol，11：532(1967)所述。N-马来酰亚胺衍生物也被认为对巯基有选择性，但还可另外用于在在一定条件下与氨基偶联。例如2-亚氨基硫烷(iminothiolane)(Traut等，Biochemistry12：3266(1973))的试剂，通过氨基的转化而引入硫醇基，如果通过形成二硫桥而发生连接，则其可被认为是巯基试剂(sulfhydryl reagent)。
能够与氨基反应的反应性部分的例子包括例如烷化剂和酰化剂。代表性的烷化剂包括：
(i)α-卤代乙酰基化合物，其在不存在反应性硫醇基的情况下显示出对氨基的特异性，其为XCH2CO-型(其中X是Cl、Br或I)，例如Wong Biochemistry24：5337(1979)所述；
(ii)N-马来酰亚胺衍生物，其可通过迈克尔型反应或通过加成到环羰基的酰化作用(acylation by addition to the ring carbonyl group)与氨基反应，例如Smyth等J.Am.Chem.Soc.82：4600(1960)和Biochem.J.91：589(1964)所述；
(iii)芳基卤，例如反应性硝基卤代芳族化合物；
(iV)烷基卤，例如McKenzie等，J.Protein Chem.7：581(1988)所述；
(v)能够与氨基形成希夫碱的醛和酮，所形成的加合物通常通过还原以得到稳定的胺而稳定。
(vi)环氧化物衍生物，例如环氧氯丙烷和bisoxiranes，其可与氨基、巯基或酚羟基反应；
(vii)s-三嗪的含氯衍生物，其对亲核体例如氨基、巯基和羟基有很大反应性；
(viii)基于以上详述的s-三嗪化合物的氮丙啶(aziridines)，例如如Ross，J.Adv.Cancer Res.2：1(1954)所述，其可通过开环与亲核体(例如氨基)反应；
(ix)方形酸(squaric acid)二乙酯，如Tietze，Chem.Ber.124：1215(1991)所述；和
(x)α-卤代烷基酯，由于醚氧原子导致的活化，它们是比通常的烷基卤反应性更大的烷化剂，如Benneche等，Eur.J.Med.Chem.28：463(1993)所 述。
代表性的氨基反应性酰化剂包括：
(i)异氰酸酯和异硫氰酸酯，特别是芳族衍生物，其分别形成稳定的脲和硫脲衍生物；
(ii)磺酰氯，已由Herzig等Biopolymers2：349(1964)记载；
(iii)酰基卤；
(iv)活性酯，例如硝基苯基酯或N-羟基琥珀酰亚胺基酯；
(v)酸酐，例如混合的、对称的(symmetrical)或N-羧酸酐(carboxyanhydrides)；
(vi)用于形成酰胺键的其他有用试剂，例如M.Bodansky，Principles of PeptideSynthesis，Springer-Verlag，1984所述；
(vii)酰叠氮(acylazides)，例如，其中从使用亚硝酸钠预先形成的酰肼衍生物产生叠氮基，如Wetz等，Anal. Biochem.58：347(1974)所述；和
(viii)亚氨酸酯(imidoesters)，与氨基反应形成稳定的脒，例如Hunter和Ludwig，J.Am.Chem.Soc.84：3491(1962)所述。
醛和酮可与胺反应形成希夫碱，可通过还原性胺化来有利地使其稳定。烷氧基氨基部分容易与酮和醛反应产生稳定的烷氧基胺，例如，Webb等，Bioconjugate Chem.1：96(1990)所述。
能够与羧基反应的反应性部分的例子包括重氮化合物，例如重氮基乙酸酯和重氮基乙酰胺，其高度专一性反应产生酯基，例如Herriot，Adv.Protein Chem.3：169(1947)所述。还可使用羧基修饰试剂(例如碳二亚胺)，其通过形成O-酰基脲然后形成酰胺键来进行反应。
应理解，如果需要，化合物(A)和／或化合物(B)中的官能团可在反应前转化为其他官能团，以例如赋予其另外的反应性或选择性。用于该目的的方法的例子包括使用诸如二羧基酸酐的试剂将胺转化为羧基；使用诸如N-乙酰基高半胱氨酸硫代内酯(N-acetylhomocysteine thiolactone)、S-乙酰基巯基琥珀酸酐(acetylmercaptosuccinicanhydride)、2-亚胺基硫烷(imino-thiolane)或含有硫醇的琥珀酰亚胺基衍生物的试剂将胺转化为硫醇；使用诸如α-卤代乙酸酯的试剂将硫醇转化为羧基；使用诸如氮丙啶或2-溴乙胺的试剂将硫醇转化为胺；使用试剂例如碳二亚胺然后用二胺将羧基转化为 胺；使用例如甲苯磺酰氯的试剂，然后用硫代乙酸酯进行酯交换并用乙酸钠水解为硫醇来将醇转化为硫醇。
如果需要，可根据本发明使用所谓的零长度接头，所述接头涉及将化合物(A)的反应性化学基团与化合物(B)的反应性化学基团直接共价连接而不引入另外的连接材料。
然而，最普遍地，所述接头将包括通过间隔基元素(spacer element)连接的两个或更多个反应性部分(如上所述)。此类间隔基(spacer)的存在允许双官能接头与化合物(A)和化合物(B)中的特定官能团反应，导致在两者之间形成共价键。接头中的反应性部分可相同(同基双功能接头)或不同(异基双功能接头，或其中存在几种不相似的(dissimilar)反应性部分，即异基多功能接头)，提供多种可能的试剂，所述试剂可在化合物(A)和化合物(B)之间形成共价连接。
接头中的间隔基元素通常由直链或支链组成，可包括C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基或C1-10杂烷基。
某些情况下，接头由式(XII)表示：
G1-(Z1)o-(Y1)u-(Z2)s-(R30)-(Z3)t-(Y2)v-(Z4)p-G2 (XII)
式(XII)中，G1是化合物(A)和接头之间的键；G2是接头和化合物(B)之间的键；Z1、Z2、Z3和Z4各自独立地选自O、S和NR31；R31是氢、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基或C1-7杂烷基；Y1和Y2各自独立地选自羰基、硫代羰基、磺酰基或磷酰基；o、p、s、t、u和v各自独立地选自0或1；R30是C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C2-6杂环基、C6-12芳基、C7-14烷芳基、C3-10烷杂环基或C1-10杂烷基、或连接G1-(Z1)o-(Y1)u-(Z2)s-与-(Z3)t-(Y2)v-(Z4)p-G2的化学键。
有用于制备本发明偶联物的同基双功能接头的例子包括但不限于二胺和二醇，它们选自：乙二胺、丙二胺和己二胺，乙二醇、二甘醇、丙二醇、1，4-丁二醇、1，6-己二醇、环己二醇和聚己内酯二醇。
示例性应用
本发明的方法、组合物和试剂盒可用于治疗与多种病症中的任一种相关 的疼痛，包括背部和颈部疼痛、癌症疼痛、妇科疼痛和分娩疼痛、纤维肌痛、关节炎及其他风湿病疼痛、矫形疼痛、疱疹后神经痛及其他神经病性疼痛、镰状细胞危象(sickle cell crises)、间质性膀胱炎、尿道炎及其他泌尿疼痛、牙痛、头痛、手术后疼痛和操作性疼痛(即，与注射、囊肿导液(draining an abcess)、手术、牙科操作、眼科操作、关节镜检查和使用其他医疗仪器、美容手术操作、皮肤学操作、骨折固定(setting fractures)、活检等有关的疼痛)。
因为一个亚类的伤害感受器介导痒感，本发明的方法、组合物和试剂盒还可用来治疗患者的痒感，所述患者患有例如以下的病症：皮炎、感染、寄生虫、虫咬、怀孕、代谢失调、肝脏或肾衰竭、药物反应、过敏性反应、湿疹和癌症。
疼痛与功能指标
为了检测本发明方法、组合物或试剂盒中任何一种的效力，可使用检测指标。用于本发明方法、组合物和试剂盒并用来检测与肌肉骨骼性(muSCuloskeletal)、免疫炎性和神经病性紊乱相关的疼痛的指标包括视觉模拟评分(visual analog scale)(VAS)、Likert评分、分类(categorical)疼痛评分、描述信息(descriptors)、Lequesne指数、WOMAC指数和AUSCAN指数，这些指标均是本领域公知的。这些指标可用于检测疼痛、痒感、功能、僵硬或其它变量。
视觉模拟评分(VAS)提供一维数量的检测。VAS通常利用距离表示，例如，一副图，画有线，线上有规律间隔(例如10个1cm间隔)的散列符号。例如，可要求患者通过选择线上与其疼痛或痒的感觉最相应的点来对其疼痛或痒感分级，其中线的一端对应于“无疼痛”(评分为0cm)或“无痒感”，线的另一端对应于“不能忍受的疼痛”或“不能忍受的痒感”(评分为10cm)。该程序为获得关于患者如何经历疼痛或痒感的定量信息提供了一种简单而快速的方法。VAS评分及其应用描述于例如美国专利6,709,406和6,432,937中。
类似地，Likert评分提供一维数量的检测。通常，Likert评分具有从低值(例如，0，表示没有疼痛)到高值(例如，7，表示极端疼痛)的离散整数值。要求正经历疼痛的患者选择低值和高值之间的数值以代表所经历的疼 痛程度。Likert评分及其应用描述于例如美国专利6,623,040和6,766,319中。
Leq uesne指数和Western Ontario以及McMaster Universities(WOMAC)骨关节炎指数利用自制的(self-administered)问卷来评价OA患者的膝盖和臀部的疼痛、功能和僵硬。WOMAC中涵盖了膝盖和臀部，而一种Lequesne问卷关于膝盖，另一种单独的Lequesne问卷关于臀部。因为这些问卷与VAS或Likert相比包括了更多的信息量，所以这些问卷是有用的。WOMAC指数和Lequesne指数问卷两者均已在OA包括手术处理(settings)(例如膝盖和臀部关节成形术)中得到了广泛验证。它们的度量特征没有显著差别。
AUSCAN(澳大利亚人-加拿大人手关节炎)指数使用有效的、可靠的和响应的(responsive)患者自我报告问卷。一种情况中，该问卷包括三维空间中的15个问题(疼痛，5个问题；僵硬，1个问题；和躯体功能，9个问题)。AUSCAN指数可利用例如Likert或VAS评分。
有用于本发明方法、组合物和试剂盒并用来检测疼痛的指标包括疼痛描述信息评分(Pain Descriptor Scale)(PDS)、视觉模拟评分(VAS)、口头描述信息评分(VerbalDescriptor Scales)(VDS)、数字疼痛强度评分(Numeric Pain Intensity Scale)(NPIS)、神经病性疼痛评分(Neuropathic Pain Scale)(NPS)、神经病性疼痛症状测验表(Neuropathic Pain Symptom Inventory)(NPSI)、当前疼痛测验表(Present PainInventory)(PPI)、老人病学疼痛检测(Geriatric Pain Measure)(GPM)、McGill疼痛问卷(McGill Pain Questionnaire)(MPQ)、平均疼痛强度(描述信息差异评分(DescriptorDifferential Scale))、数字疼痛评分(NPS)总体评价评分(global evaluation score)(GES)、简短的McGill疼痛问卷(Short-Form McGill Pain Questionnaire)、明尼苏达多元个性测验表(Minnesota Multiphasic Personality Inventory)、疼痛特征谱和多维疼痛测验表(Pain Profile and Multidimensional Pain Inventory)、儿童健康问卷(ChildHeath Questionnaire)和儿童评价问卷(Child Assessment Questionnaire)。
可通过主观检测(VAS、Lickert、描述信息)来检测痒感。另一种方法是用振动传感器(vibration transducer)或运动敏感计量器来检测抓挠，抓 挠是痒感的客观关联。
筛选
我们的发现(伤害感受器和瘙痒感受器上表达并存在的某些通道允许抑制电压门控性离子通道的化合物进入靶细胞中)提供了用于鉴定有用于治疗疼痛和痒感的化合物的方法。一个实例中，使伤害感受器或瘙痒感受器与激活TRPV1、TRPA1、TRPM8和／或P2X(2／3)受体的一种、两种或更多种化合物接触。还使同样的伤害感受器或瘙痒感受器与第二化合物接触，所述第二化合物当施加于伤害感受器内表面时(例如，用完整细胞膜片钳技术通过微量移液器将其施加于细胞内)抑制一个或多个电压门控性离子通道，但当施加于所述细胞外表面时不抑制(因为该化合物不能跨过细胞膜)。伤害感受器或瘙痒感受器中离子通道的抑制将抑制细胞产生动作电位和／或抑制向二级神经元的信号传递，两种情况中都阻断了疼痛信号的传递，因此，第二化合物抑制伤害感受器中电压门控性离子通道的能力将该化合物鉴定为可与激活TRPV1、TRPA1、TRPM8和／或P2X(2／3)受体的化合物联用以治疗疼痛或痒感的化合物。
以下实施例意在说明本发明而无意限制本发明。
实施例1
我们使用完整细胞电压钳(voltage clamp)记录技术记录了成年大鼠DRG神经元中通过电压依赖性钠通道的电流。为选择伤害感受器，我们记录了小(24±5μm；n=25)神经元并通过短时(1秒)施用1μm辣椒素测试了这些神经元中TRPV1受体的表达。在所测试的25／25小神经元中，辣椒素产生了延长的(10±3秒)向内电流(图1A，上栏)，与作为伤害感受器的神经元一致。通过保持电位为-70mV的去极化步骤引发钠电流。单独浸泡(Bath)施用5mMQX-314对钠电流的影响最小(5分钟施用后，减少3±0.5％，n=25)(图1A，左栏；b)。单独施用辣椒素(1μm，1-10分钟)使钠电流适度减少(31±9％抑制(n=25))。然而，QX-314与辣椒素一起施用时，几乎完全消除了钠电流(抑制98±0.4％，n=25)(图1A，左栏；b)。如所预期，如果钠电流的阻断是QX-314通过TRPV1受体逐渐进入造成的，则抑制在几分钟内发展并在15分钟后接近完成(图1C)。
为测试共同施用辣椒素和QX-314来抑制钠电流的能力是否对表达TRPV1受体的细胞有选择性，我们还记录了大DRG神经元(细胞体(soma)直径>40μm)(图1A，右栏)。这些神经元中，辣椒素不引发向内电流(10／10)。对小直径神经元而言，单独施用QX-314对钠电流影响极小或没没有影响(10分钟施用之后，电流增加8±4％，n=10)。与小直径神经元不同，辣椒素对大直径神经元中的钠电流没有影响(10分钟施用后平均增加3±2％，n=10。更值得注意的是，共同施用QX-314和辣椒素对大直径神经元中的钠电流影响极小或没有影响(10分钟施用后减少9±5％，n=10)。因此，如所预期，如果QX-314通过TRPV1受体进入神经元，则共同施用的QX-314和辣椒素抑制钠电流的能力对表达TRPV1受体的神经元具有高度选择性。
我们还使用生理内部和外部溶液在电流钳中检测了共同施用的QX-314和辣椒素的效果。如从电压钳结果所预期的那样，QX-314和辣椒素的共同施用抑制了小直径神经元的兴奋性，完全阻断了动作电位的产生(图2，15／15个神经元)。
下一步，我们检测了辣椒素和QX-314的组合是否能在体内减少疼痛行为(painbehavior)。如VonFrey丝所测定，将QX-314单独(10μL的2％溶液)注射入成年大鼠的后爪中对引发缩爪反应的机械阈无显著影响(p=0.33)(图3A)。如所预期，单独的辣椒素(10μg／10μL)引发了自发退缩(5分钟内40±6次退缩)，反映出辣椒素对伤害感受器的直接刺激作用，15和30分钟后显著降低了机械阈(p<0.05)(图3a)。注射后头5分钟内，辣椒素和QX-314一起注射未显著改变退缩数目(30±7，p=0.24)。然而，这种组合后来完全消除了正常情况下单独的辣椒素对机械阈的降低(p=0.14，15分钟时检测)。而且，辣椒素和QX-314联合注射后60分钟，实际上机械阈增加到两倍于基线值，注射后2小时(46±5g vs.24±3g，p<0.05)。三只动物中，爪子甚至对最高值的Von Frey丝(57g)都不敏感。增加的机械阈持续约3小时，然后通过4小时逐渐回归到基础水平(图3A)。
在检测对归一化的有害辐射热刺激的敏感性时观察到相似的影响。出乎意料地，注射后30分钟，单独的QX-314短暂地减少了热响应潜伏期(30分钟时，p<0.01；所有其他时间点，p>0.05)(图3B)。如所预期，单独 的辣椒素(10μg／10μL)也减少了热响应潜伏期(15和30分钟，p<0.01)(图3B)。然而，虽然单独的QX-314和单独的辣椒素均增加了热敏感性，但共同施用QX-314和辣椒素一起逐渐麻醉了动物对有害热刺激的反应，从而在注射后2小时，没有动物对施加25秒的辐射有害热做出反应。这种效果在注射后持续4小时(图3B)。
然后，我们测试了共同施用辣椒素和QX-314是否可用于产生区域性神经阻断，而没有用利多卡因进行局部麻醉时观察到的运动效应(motor effects)。根据0(无效果；正常步态和肢体放置)、1(肢体运动，但肢体放置和运动异常)或2(完全丧失肢体运动)的量表(scale)对运动效应进行评分。在非常靠近坐骨神经的位置注射2％利多卡因(用于局部神经阻断的标准浓度)，15分钟检测时，造成下肢完全麻痹(6只动物中的6只)，30分钟检测时，完全或部分麻痹依然存在(平均运动评分1.67±0.2，p<0.01；图4C)。在所有动物中，触觉刺激引起的位置反射的完全丧失持续了至少30分钟，通过45分钟这些感觉和运动缺陷完全恢复(图4)。在麻痹期间，不可能检测感觉灵敏度。在用QX-314进行的现场实验(pilotexperiment)中，很明显的是，当与辣椒素一起施用时，可用比利多卡因浓度低得多的QX-314来产生有效的局部麻醉。单独注射QX-314(0.2％，100μL)对运动功能无影响(6只动物中的6只；图4C)，且对机械阈(p=0.7)或热反应潜伏期(p=0.66)也没有显著影响(图4A、4B)。在靠近该神经处单独注射辣椒素(0.5μg／μL，100μL)，注射后30分钟内，减少了机械阈(p<0.05)和热潜伏期(p<0.05)两者(图4A、4B)。这期间，6只动物中的4只显示，经注射的肢体持续弯曲(sustained flexion)，导致对运动力的轻微损害(平均运动评分0.7±0.2，p<0.01)，但膝盖和臀部的运动以及位置反射未改变。我们将灵敏度和运动的改变解释为伤害感受器轴突的反射性活化产生了持续的弯曲反射。对于共同施用QX-314和辣椒素入坐骨神经旁侧(para-sciatic nerve)区域而言，我们首先注射QX-314，10分钟后注射辣椒素，我们的想法是，QX-314将存在于细胞外，一旦TRPV1通道被激活，QX-314即可进入TRPV1通道。实际上，当先注射QX-314再注射辣椒素时，对辣椒素没有或几乎没有行为反应，所述行为反应表示对有害刺激的有效麻醉。机械阈非常显著地增加，以至于所有动物对最硬的von Frey丝没有反 应(yon Frey丝57g；vs.注射前对刺激的缩爪反应为平均15.2±3.4；p<0.01，n=6)，热反应潜伏期也显著增加(22.3±2.3s vs.14.9±0.4s，p<0.05，n=6)。对机械刺激而言，这些改变在注射辣椒素后15分钟是明显的，对热刺激而言，这些改变在注射辣椒素后30分钟是明显的，这些改变持续90分钟(图4A、4B)。6只动物中的5只没有任何运动缺陷(平均运动评分0.17±0.17，p=0.34)(图4C)，位置反射无变化。一只动物表现出与单独注射辣椒素时观察到的类似的持续弯曲，但更加短暂。
方法
电生理学
取出6-8周龄Sprague-Dawley大鼠的背根神经节，置入含有1％青霉素-链霉素(Sigma)的Dulbecco极限必需培养基(Dulbecco′s Minimum Essential Medium)中，然后用5mg／mi胶原酶、1mg／ml分散酶(Dispase)II(Roche，Indianapolis，IN)处理90分钟，用0.25％胰蛋白酶处理7分钟，然后加2.5％胰蛋白酶抑制剂。在DNA酶I抑制剂(50U)的存在下研碎细胞，通过15％BSA(Sigma)离心，在1ml神经基础(Neurobasal)培养基(Sigma)、10μMAraC、NGF(50ng／ml)和GDNF(2ng／ml)中重悬浮，涂布在涂敷有聚赖氨酸(500μg／m1)和层粘连蛋白(5mg／ml)的35mm组织培养皿(Becton Dickinson)上，8000-9000／孔。培养物在37℃、5％二氧化碳中培养。涂板后48小时内进行记录。选作可能的伤害感受器的小神经元的平均大小是23±6μm(n=50)，大神经元的是48±8μm(n=10)。
使用Axopatch200A放大器(amplifier)(Axon Instruments，Union City，CA)和电阻为1-2MΩ的膜片移液管(patch pipettes)进行全细胞电压钳或电流钳记录。对电压钳记录而言，通过用石蜡膜(Parafilm)包裹胫(shank)或用Sylgard(Dow Corning，Midland，MI)涂敷胫来降低移液管电容。用放大器线路抵偿细胞电容，用P／4程序减去线性渗漏电流(Cell capacitance was compensated for using the amplifier circuitry，andlinear leakage currents subtracted using a P／4procedure)。串联电阻(通常3-7MΩ，总是小于10MΩ)补偿约80％。电压钳记录中使用的溶液设计为通过阻断钾和钙电流来分离钠电流，并减少外部的钠来改善电压钳。移液管溶液(Pipette solution)是110mM CsCl、1mM CaCl2、2mM MgCl2、11mM EGTA和10mM HEPES，用约25mM CsOH将pH调节至7.4。外部溶液是60mM NaCl、60mM氯化胆碱、4mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、0.1mM CdCl2、15mM四乙基氯化铵、5mM4-氨基吡啶、10mM葡萄糖和10mM HEPES，用NaOH调pH至7.4。对于小的液体接界电位(-2.2mV)未进行修正。
用Axopatch200A放大器的快速电流钳模式进行电流钳记录。移液管溶液是135mM葡糖酸钾(K gluconate)；2mM MgCl2；6mM KCl；10mMHEPES；5mM Mg ATP；0.5mM Li2GTP；(用KOH调节pH=7.4)。外部溶液是145mM NaCl；5mM KCl；1mM MgCl2；2mM CaCl2；10mM HEPES；10mM葡萄糖；(用NaOH调节pH至7.4)。用-15mV的液体接界电位修正膜电位。
使用带有pCLAMP8.2软件的Digidata1200A／D界面(Axon Instruments，UnionCity，CA)产生命令规程(Command protocols)并将数据数字化(digitized)。电压钳电流记录在2kHz低通滤过(low pass filtered)，电流钳记录为10kHz(-3dB，4电极贝塞耳滤波器(4pole Bessel filter))。
用专门设计的多管式快速药物递送系统在离神经元约200-250μm处施加QX-314(5mM)、辣椒素(1μM或500nM)或它们的组合。少于1秒钟之内完成溶液交换。
行为
对于足底内注射而言，首先使大鼠习惯于实验者进行的处理和测试，实验者不知道所进行的治疗。足底内注射载体(20％乙醇，盐水中的5％吐温20，10μL)、辣椒素(1μg／μL)、QX-314(2％)或辣椒素和QX-314的混合物至左后爪，分别用von Frey丝和辐射热测定机械和热敏感性。
对于坐骨神经注射，首先用10天时间使动物习惯于处理。注射利多卡因(0.2％或2％，100μL)；单独的QX-314(0.2％，100μL)；单独的辣椒素(50μg，在100μL中)；或QX-314，然后注射辣椒素(10分钟间隔)至髋关节下面的坐骨神经区。用von Frey丝和辐射热确定机械阈和热阈。使用以下评分每隔15分钟评价经注射的腿的运动功能：0=没有；1=部分阻断；2=完全阻断。检查走、爬高、在竿上走和位置反射。当步态正常，无可见的肢体衰弱时，运动阻断的等级为“无”；当肢体可以动但运动异常并且不能 支持正常的姿势时，运动阻断的等级为“部分阻断”；当肢体瘫软、对肢体伸展无抵抗时，运动阻断等级为“完全阻断”。实验者在不知情的情况下进行所有试验。
统计分析
用学生t检验(Students t test)或单向ANOVA进行统计分析，然后根据情况进行杜奈特(Dunnett’s)检验。对于运动评分，注射0.2％利多卡因后获得的数据用作杜奈特检验的对照。数据表示为平均值±SEM。
实施例2
我们还显示，丁香酚(C10H12O2)，一种烯丙基链取代的愈创木酚(guaiacol)、2-甲氧基-4-(2-丙烯基)苯酚(丁香油中的活性成分，TRPV1受体的非刺激性激动剂)，通过激活TRPV1通道而促进QX-314进入背根神经节神经元中。图5示出了小的背根神经节神经元中钠通道电流的电压钳记录。数据说明，单独的丁香酚对钠电流有适度的抑制效果(10-20％抑制)。共同施用丁香酚和QX-314产生累进性阻断，可在7分钟后完成。示出了两个例子，其是结果类似的10个试验的代表。如上文所示，单独的外部QX-314没有作用，而内部QX-314阻断了钠通道。因此，这些实验表明，丁香酚通过激活TRPV1通道来促进QX-314进入背根神经节神经元中。
实施例3
图6显示共同施用TRPA激动剂芥子油(MO)(50μM)和QX-314(5mM)的结果。单独的MO使钠电流减少了20-30％，约在3分钟后达到平台期。共同施用MO和QX-314显著减少了钠电流。
其它实施方式
对本发明所述方法和系统的各种改进和变化对本领域技术人员是显而易见的而未脱离本发明的范围和精神。虽然结合具体的所需实施方式描述了本发明，但应理解，所主张的本发明并不过分限于这些具体实施方式。实际上，对医学、免疫学、药理学、内分泌学领域或相关领域的技术人员而言显而易见的、对本发明实施方式的各种改变均包括在本发明范围内。
本说明书中提及的所有出版物均通过参考纳入本文，如同各独立的出版物具体地和单独地通过参考纳入本文一样。

Claims (4)

1.化合物在制备用于治疗患者的痒感的药物中的用途，其中所述化合物施加于一个或多个电压门控性离子通道的内表面时抑制所述通道，但施加于所述通道的外表面时基本上不抑制所述通道，其中，当TRPV1受体被激活时，所述化合物能够通过所述受体进入伤害感受器或瘙痒感受器，其中所述化合物是N-甲基依替卡因、N-甲基利多卡因、N,N-二甲基丙胺卡因、N,N,N-三甲基妥卡尼、N-甲基罗哌卡因、N-甲基布比卡因、N-甲基左旋布比卡因、N-甲基甲哌卡因、QX-314、N-甲基-普鲁卡因或QX-222。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述化合物是QX-314。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述化合物是N-甲基依替卡因。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述药物是配制用于局部给药的组合物。
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