KR101188945B1

KR101188945B1 - 설포라판 및 이의 유사체를 포함하는 통증치료제

Info

Publication number: KR101188945B1
Application number: KR1020090007041A
Authority: KR
Inventors: 이성중; 김동훈
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2009-01-29
Filing date: 2009-01-29
Publication date: 2012-10-08
Also published as: KR20100087955A

Abstract

본 발명은 설포라판 및 이의 유사체를 포함하는 통증치료제, 식품조성물 및 이들을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 설포라판 또는 이의 유사체를 유효성분으로 포함하는 신경병증성 통증완화제는 신경교세포의 활성화를 저해시키며, 척수강 내 혹은 복강내로 주입됨으로써 신경병증성 통증을 감소시킬 수 있다.

설포라판, 신경병증성 통증

Description

설포라판 및 이의 유사체를 포함하는 통증치료제{Composition containing sulforaphane and its analog for treating pain}

설포라판(Sulforaphane)은 양귀비목 겨자과 식물인 브로콜리나 양배추, 케일 등의 십자화과 채소에 많이 함유되어 있으며 항산화능이 우수한 것으로 알려져 있다. 최근에는 항암 및 헬리코박터 파이로리 억제 효과 이외에 여러 염증 유발인자들을 저해하는 것으로도 잘 알려져 있다. 설포라판의 화학식은 C₆H₁₁NOS₂ 이고, 분자량은 177.29 이다. 이소티오시아네이트 (isothiocyanate)의 화학 구조를 갖는 물질로서 1992년 미국 존스 홉킨스 의과대학의 연구진들에 의해서 강력한 항산화 효과를 갖는다는 사실이 밝혀졌다. 설포라판을 함유한 브로콜리 추출물은 항산화 효소의 발현 유도로 산화적 손상에 의한 유전자 변형을 억제하며, 위암의 발병의 한 원인으로 알려져 있는 헬리코박터 파이로리균의 성장을 억제하고, 동물실험에서 발암물질에 의한 위암의 생성을 저해하였다. 설포라판은 위와 같은 항암 효과 외에도 염증 유발 인자의 활성을 저해하는 것으로도 알려져 있다. 펜에틸 이소티오시아네이트(phenethyl isothiocyanate PEITC) 및 설포라판 같은 이소티오사아네이트는 암발생 및 종양발생을 억제하는 것으로 알려져 왔고, 암의 전파나 발달에 유용한 치 료제로서 알려져 왔다. 이들은 여러 단계에서 작동하는데, 가장 주목할 만한 것은 시토크롬 P450의 억제를 통해서 암발생을 억제하는 것으로 알려졌다. 페닐이소티오시아네이트는 특정한 암 세포주에서 세포자살을 유도하는 것으로 보고되었다.

일반적으로 신체 조직이 손상을 받으면 통증이 발생한다. 통증은 외부의 위험에서 신체를 보호하고 손상 받은 조직의 회복에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 하지만 때로는 이로운 목적과 다르게 중추신경계, 말초신경계에 비 이상적인 변화를 초래하여 신경병증성 통증이 발병하기도 한다. 신경병증성 통증은 말초신경의 손상이나 종양, 대상포진, 당뇨병과 같은 다양한 원인에 의해서 발생할 수 있다. 최근 연구결과에 의하면 신경병증성 통증의 발병기전에 신경교세포의 활성화가 중요한 역할을 한다는 사실이 밝혀졌다. 말초신경 손상에 의한 신경병증성 통증 동물모델을 사용한 연구에서 이러한 신경교세포 활성화에 의한 염증반응시에 발생하는 다양한 사이토카인(cytokine), 키모카인(chemokine)과 같은 인자들에 의해서 신경병증성 통증이 발생 및 조절된다는 가설이 대두되었고, 이에 대한 여러 증거들이 나오고 있다. 이러한 결과들에 의하면 신경교세포의 염증반응을 조절하는 물질을 찾으면 신경병증성 통증의 예방이나 치료에 중요한 돌파구를 마련할 수 있다.

이에 본 발명자들은 설포라판이 가진 강력한 항산화 효과와 염증 반응 억제 효과가 실제 쥐의 척수에서 배양한 일차 신경교세포의 염증반응을 조절할 수 있는지를 확인하고, 신경병증성 통증모델에 설포라판을 주입함으로써 신경병증성 통증 의 발병 및 유지 기작에 설포라판이 영향을 줄 수 있는지를 확인하였다.

본 발명은 신규한 신경병증성 통증치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 설포라판 또는 이의 유사체를 유효성분으로 포함하는 신경병증성 통증치료제를 제공한다.

본 발명에 따른 설포라판 또는 이의 유사체를 포함하는 통증치료용 조성물은 그동안 신경병증성 통증에 대한 치료제 및 예방약, 진통제 등이 거의 없는 현실에서 새로운 치료, 예방, 진통법으로 사용될 수 있다.

본 발명의 제 1 실현 형태는 설포라판 또는 이의 유사체를 유효성분으로 포함하는 통증치료제 조성물이다. 설포라판(sulforaphane)의 분자식은 C₆H₁₁NOS₂이며, IUPAC 명칭은 1-이소티오시아나토-4-메틸설피닐부탄 (1-Isothiocyanato-4-methylsulfinylbutane) 이다. 구조식은 다음과 같다.

(구조식 1)

상기 설포라판은 싹양배추(brussel sprouts), 브로콜리, 양배추, 콜리플라워, 케일 등과 같은 십자화과 채소에서 얻을 수 있으며, 미로사나제(myrosinase)는 글루코라파닌(glucoraphanin)을 설포라판으로 변환시킨다.

설포라판을 제조하는 여러가지 합성 방법이 당업계에 알려져 있다. 설포라판은 쉬임드 및 카러(Schimd H. and Karrer, P.; Helvetica Chimica Acta. 1948; 31; 6: 1497-1 505)에 의하여 1948년에 합성되었다. 쉬임드의 합성은 라세믹 혼합물을 만들었고, 설포라판은 불안정한 오일로 알려졌다. 설포라판의 불안정성 때문에 제조 및 배포에 어려움이 있었다. 이에 사이클로덱스트린을 이용하여 설포라판을 안정화시키는 방법이 개발되었다(2007년 1월 23일, US2007000881875P).

설포라판의 유사체는 이에 제한되는 것은 아니지만 6-이소티오시아네이토-2-헥사논(6-isothiocyanato-2-hexanone), 엑소-2-아세틸-6-이소티오시아네이토노르보만(exo-2-acetyl-6-isothiocyanatonorbomane), 엑소-2-이소티오시아네이토-6-메틸설포닐노르보만(exo-2-isothiocyanato-6- methylsulfonylnorbornane), 6-이소티오시아네이토-2-헥사놀(6-isothiocyanato-2-hexanol), 1-이소티오시아네이토-4-디메틸포스포닐부탄(1-isothiocyanato-4-dimethylphosphonylbutane), 엑소-2-(1'-히드록시에틸)-5-이소티오시아네이토노르보란(exo-2-(1 '-hydroxyethyl)-5- isothiocyanatonorborane), 엑소-아세틸-이소티오시아노아토노르보만(exo-acetyl-isothiocyanoatonorbomane), 1-이소티오시아네이토-5-메틸설포닐펜텐(1-isothiocyanato-5-methylsulfonylpentane), 및 시스- 또는 트랜스-3-(메틸설포닐)시클로헥실메틸이소티오시아네이트(cis- or trans-3- (methylsulfonyl)cyclohexylmethylisothiocyanate) 및 이들의 혼합물이다.

본 발명의 신경병증성 통증치료제는 해당 용도에 따라 허용 가능한 담체와 함께 독립적으로 또는 약품 첨가제로 사용되거나, 사람에게 투여하기 적합한 기타 모든 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 저해제에 함유될 수 있는 담체로는 증량제, 고섬유 첨가제, 캡슐화제, 지질 등이 포함될 수 있으며, 이러한 담체들의 예는 당업계에 충분히 공지되어 있다. 일반적으로 본 발명에 따른 통증 치료용 조성물은 임상투여시에 경구 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 통증 치료용 조성물은 실제 임상투여시에 경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명에 따른 통증 치료용 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제,보존제 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 억제제는 신경병증성 통증의 진행 정도, 나이, 성별, 신체 상태, 투여기간, 투여방법, 환자의 체중, 식사, 배출 속도 등에 따라 용량을 달리하여 투 여될 수 있다.

본 발명의 제 2 실현 형태는 설포라판 또는 이의 유사체를 포함하는 통증 치료를 위한 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 통증 치료용 조성물을 식품으로 사용할 경우, 본 발명에 따른 통증 치료용 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 통증 치료용 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 비타민 복합제, 츄잉껌이 있고, 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 제 3 실현 형태는 양귀비목 겨자과 식물 또는 십자화과 채소로부터 설포라판 또는 이의 유사체를 추출하는 것을 특징으로 하는 통증치료제 생산 방법을 제공한다. 보다 상세하게는 상기 식물 또는 채소는 브로콜리, 양배추, 케일 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 추출 방법은 이에 제한되는 것은 아니지만, 열수추출, 유기용매 추출 또는 초임계추출 방법을 사용할 수 있다. 유효성분인 설포라판 또는 이의 유사체의 안정성에 영향을 미치지 않는 종래의 설포라판 추출방법이 모두 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예 는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 설포라판의 염증저해효과

본 발명자들은 신경병증성 통증에 대한 연구를 위해서 척수 신경교세포 1차 배양법을 확립하였다. 7일된 쥐의 척수 신경교세포를 일차 배양한 후 설포라판을 같이 처리하여 설포라판의 염증저해효과를 검증하였다(도 1). 척수 신경교세포를 활성화시키기 위해서 척수 후 신경절의 신경세포에서 만들어진 F11 세포주를 네크로시스시켜서 척수신경교세포에 처리하였으며 설포라판의 염증반응 저해효과를 확인하기 위하여 설포라판 1 μM, 10 μM, 100 μM을 1시간 전처리 하였다 (도 1A). 위 약물을 처리한 신경교세포를 사용하여 RNA를 뽑은 후에 cDNA를 합성해서 IL-1β 유전자의 양을 실시간 RT-PCR 기법을 사용하여 측정하였다. 그 결과 10 μM, 100 μM을 전처리 하였을 경우에 IL-1β 유전자의 발현이 저해되는 것으로 확인되었다. IL-1β와 같은 염증성 사이토카인은 염증반응의 정도를 객관적으로 나타내 줄 수 있는 유전자로서 이를 통해서 설포라판의 염증반응 저해효과가 강하게 나타난다는 것을 확인하였다. 다음 실험을 위해서 다른 연구자들이 공통적으로 많이 사용하고 있는 농도로 10 μM을 사용하기로 결정하였다. (도 1B)를 통해서 설포라판이 다양한 염증성 사이토카인인 TNF-α, Il-1β, IL-6 및 염증시 생성되어 세포에 다양한 영향을 주는 것으로 알려져 있는 NO의 생성에 영향을 주는 iNOS의 유전자 양도 감 소시키는 것을 확인하였다.

실시예 2. 설포라판의 척수 또는 복강 내 주입이 신경병증성 통증에 미치는 영향

설포라판의 신경교세포 활성화 저해현상을 확인하였기 때문에, 그 다음 실험으로 설포라판을 직접 생쥐의 척수 또는 복강 내로 적정량을 주입하고 신경병증성 통증모델을 적용해서 신경병증성 통증에 설포라판이 영향을 주는지를 확인하였다. 신경병증성 통증을 만들어 내기 위해서 척수신경(spinal nerve)의 L5 영역을 수술을 통해서 잘라주면 시간이 경과할수록 통증이 생기기 시작해서 7일경부터 통증을 느끼는 정도가 최대가 되어 여러 주 이상이 유지가 된다. 이 모델을 C57BL/6 마우스에 적용한 후 수술 10분 전에 설포라판을 척수내로 주입하였다. 설포라판을 주입 후 신경병증성 모델을 만드는 수술을 수행하고 1, 3, 7, 14 일에서 통증의 정도를 측정하여 아래와 같은 그래프를 얻었다 (도 2).

도 2를 살펴보면, 도 2A의 경우 설포라판을 주입하고 통증수술을 한 그룹은 설포라판 대신 운반체(vehicle)만 주입한 후 수술을 한 그룹보다 통증이 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있으며, 특히 3, 7, 14일에서 유의성 있는 차이를 확인할 수 있다. 또한 2B의 경우 같은 방법으로 수술 및 설포라판 주입을 한 후 열에 이한 통증을 측정하는 장비로 뒷발바닥에 열자극을 준 후 회피하는 시간을 측정한 경우 설포라판을 주입한 후 수술을 시행한 그룹에서 1, 3, 7, 14일에서 유의성 있게 통증이 감소했음을 확인할 수 있었다.

이러한 설포라판의 신경병증성 통증 감소효과가 척수강 내로의 직접 주입 이외에도 약물로서의 편의성을 확인하기 위해서 복강내 주입을 통해서 설포라판을 처리하였다. 이를 확인하기 위해서 신경병증성 통증 모델을 C57BL/6 마우스에 적용한 후 설포라판을 복강주사를 통해서 복강 내로 주입했다. 설포라판을 주입한 후 날짜에 따라서 행동실험을 수행하고 이를 그래프로 나타내었다. 실험결과 도 3A 에서는 설포라판을 신경병증성 통증 수술 1시간 후에 주입했을 경우에는 신경병증성 통증을 감소시키는 효과를 확인할 수 있었고 도 3B 에서는 신경병증성 통증 수술 후 7일째에서 신경병증성 통증이 최대치가 되었을 경우에는 설포라판을 주입한다고 하여도 신경병증성 통증을 감소시킬 수 없음을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 설포라판에 의한 신경교세포 활성화 감소

도 3 까지의 실험을 통해서 설포라판이 신경교세포의 활성화를 저해시킬 수 있으며, 수술을 통해서 신경병증성 통증 모델을 만들었을 경우에 설포라판을 척수강 내 혹은 복강내로 주입함으로써 신경병증성 통증을 감소시킬 수 있다는 것을 알았다. 또한 복강 내로 주입한 경우 중 신경병증성 통증이 최대치가 되는 7일 이후에 주입하였을 경우에는 신경병증성 통증이 그래도 유지되는 것을 확인하였다. 이를 통해서 설포라판에 의한 신경병증성 통증 감소효과가 7일 이전에 척수 내에서 일어나는 어떠한 효과를 방해한다는 것과 이러한 영향을 주는 세포가 신경교세포일 수 있다는 가설을 세워볼 수 있다. 이를 확인하기 위해서 신경교세포의 활성화를 실시간 RT-PCR과 면역염색법을 통해서 확인하였다.

실험결과를 보면, 시험관내(in vitro) 실험에서 설포라판이 신경교세포 활성화를 저해시키는 것과 같이, 생체 내(in vivo) 실험에서도 신경교세포의 활성화를 저해시킨다는 것을 확인할 수 있다. 소교세포의 활성화 마커인 cd-11b의 경우 3, 7일 조직샘플에서 모두 설포라판을 주입한 그룹에서 그 발현양이 크게 감소되어 있는 것을 확인할 수 있었으며, 성상세포(astrocyte) 마커인 GFAP의 경우에도 7일 조직샘플에서 설포라판을 주입한 그룹의 경우 그 발현양이 현저하게 감소되어 있는 것을 확인할 수 있다.

도 5를 통해서 면역염색에서도 실시간 RT-PCR에서처럼 신경병증성 통증 모델에서 설포라판을 주입하였을 경우 신경교세포의 활성화가 현저하게 줄어든다는 것을 확인하였다.

도 1. A. 농도별로 처리된 설포라판의 신경교세포 활성화 저해효과. B. 설포라판의 의한 염증성 사이토가인인 TNF-α, IL-1β, IL-6 유전자 및 iNOS 유전자의 저해효과.

도 2. 설포라판을 척수에 주입한 후 말초신경을 자르는 수술을 통해서 신경병증성 통증을 일으키고 이를 행동실험을 통해서 객관화하였다. (A)는 물리적 자극에 대해서 느끼는 통증이고, (B)는 열에 의해서 느껴지는 통증을 측정하여 그래프화 한 그림이다.

도 3. C57BL/6 마우스를 사용해서 신경병증성 통증 모델을 만든 후 설포라판을 복강주사를 통해서 복강내로 주입했다. 이후에 통증에 대한 행동실험을 통해서 물리적 감각에 의한 통증을 측정한 후 그래프화하였다. (A)는 신경병증성 통증 수술 1시간 후에 설포라판을 복강내로 주입했을 때의 그래프고 (B)는 신경병증성 통증 수술 후 신경병증성 통증이 완전히 발생한 7일 후에 설포라판을 복강내로 주입한 실험의 그래프다.

도 4. 동물 실험에서의 신경교세포의 활성화를 측정하기 위해서 신경교세포의 일종인 소교세포(microglia)의 마커인 cd-11b와 성상세포(astrocyte)의 마커인 GFAP의 유전자를 실시간 RT-PCR 기법을 사용해서 측정하였다. A. cd-11b 유전자 발현, B. GFAP 유전자 발현.

도 5. 면역염색법을 사용한 설포라판의 신경교세포 활성화 억제효과. A. 설포라판을 주입한 그룹과 운반체(vehicle)를 주입한 그룹에서 신경병증성 통증 수술 을 한 후 3일과 7일에서 조직을 채취해서 마이크로 글리아에 대한 마커인 Iba-1과 성상세포(astrocyte)에 대한 마커인 GFAP을 사용하여 면역염색을 수행하였다. 이 후에 이를 정량하여 B와 C의 그래프로 표현하였다.

Claims

설포라판을 유효성분으로 포함하는 통증 치료제 약학적 조성물.
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제 1 항에 있어서, 상기 통증은 신경병증성 통증인 것을 특징으로 하는 통증 치료제 약학적 조성물.
양귀비목 겨자과 식물 또는 십자화과 채소로부터 설포라판을 추출하는 단계를 포함하는 통증치료제 제조방법.
제 5 항에 있어서, 상기 식물 또는 채소는 브로콜리, 양배추, 케일 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 통증치료제 제조방법.
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