CN103930784B - 含聚偏氟乙烯纳米纤维的蛋白质印迹复合膜的制备方法 - Google Patents
含聚偏氟乙烯纳米纤维的蛋白质印迹复合膜的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种蛋白质印迹用复合膜，其呈由聚偏氟乙烯(PVdF)纳米纤维网与无纺布进行复合化的形态形成，形成于无纺布上的纳米纤维的克重为1gsm至50gsm且纳米纤维的平均微孔大小为0.1μm至1μm。在本发明中，由纳米纤维形成的蛋白质印迹用复合膜具有如下有用的优点，即，节减生产成本，且响应特性优秀，即使存在少量的蛋白质的特定物质的情况下，也能够容易地进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及含有聚偏氟乙烯(PVdF，polyvinilidenflouride)纳米纤维的蛋白质印迹(westernblot)用复合膜及其制备方法，具体地涉及以通过电纺丝制成的纳米纤维网与无纺布进行复合化的形态降低生产成本，且响应特性优秀，即使存在少量的蛋白质的特定物质的情况下，也能够容易地进行检测的蛋白质印迹用复合膜及其制备方法。
背景技术
蛋白质印迹(westernblot)是从多个蛋白质混合物中找出某种特定蛋白质的技术，若将从细胞或组织中提取的蛋白质与样品缓冲液(samplebuffer)相混合而放置在由丙烯酰胺(acrylamide)制成的分子筛(molecularsieve)上并进行电泳，则样品缓冲液中的被称为十二烷基硫酸钠(SDS，sodiumdodecylsulfate，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-page，sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis))的物质使整个蛋白质带有阴电(-)，从而使蛋白质吸引到阳电(+)侧。此时，分子筛妨碍蛋白质的进行，使得小分子移动较快，大分子移动较慢，从而形成多个大小的带(band)，此时，若在根据大小分离的凝胶(gel)上放置膜使其带电，则蛋白质以分离的状态转移到膜。在这里，上述蛋白质印迹是用X射线(X-ray)将使对要检测的特定蛋白质的抗体(antibody)结合，再次在上述抗体结合特异性的第二抗体，从而通过发色和荧光来显现的反应进行图像化的方法。
此时所使用的膜将容易与蛋白质进行疏水性结合(hydrophobicinteraction)的硝酸纤维素(nitrocellulose)、尼龙(nylon)、聚偏氟乙烯(PVdF，polyvinilidenflouride)等用作原料，且平均微孔大小为0.2μm和0.45μm。这种膜通过如同基于在水等非溶剂中倒入溶剂和高分子来制备的相分离法(phaseseparation)的干式(dry)、湿式(wet)、干湿式(dry-wetcasting)等方法制成，但因参与到相转化工序中的复杂的因子的影响，很难控制相分离方法，从而很难获得具有均匀的微孔分布的膜。并且，也有因微孔的形态在相分离过程中形成，从而形成无法从表面连接至背面的二维的关闭结构(closedpore)，导致难以期待高的气孔度及比表面积的问题。
最近，膜的制备方法之一的电纺丝法是在高分子溶液中利用高电压的电场来获得三维无纺布上的纳米纤维的方法。这种纳米纤维具有可控制基于纤维直径和后处理的微孔结构，且可提供高的气孔度及比表面积的优点。
到目前为止，作为利用纳米纤维的蛋白质印迹用膜的制备方法，本发明人提出了韩国公开特许第10-2011-0035454号“蛋白质印迹用纳米纤维膜及其制备方法 ”、韩国公开特许第10-2011-0058957号“蛋白质印迹用一体型膜及其制备方法 ”等。
但是，所提出的上述膜都是由纳米纤维单独制成或者将纳米纤维与纸贴合来制成的，当执行蛋白质印迹法时，就由纳米纤维单独制成的膜而言，在膜与蛋白质分离的凝胶之间产生气泡时，由于纳米纤维膜的僵硬度弱，因而不仅很难去除气泡，而且为了当将纳米纤维膜放置在凝胶上时，可以防止因纳米纤维的柔性及静电力而产生的纳米纤维相互之间的附着或重叠现象，而有需要规定程度的厚度的情况，因此导致存在工序费用上涨的问题。
并且，在纳米纤维与纸贴合的情况下，在甲醇预处理过程中，在因基于甲醇的聚偏氟乙烯纳米纤维和纸的膨胀率不同而产生纳米纤维从纸游离的现象，且与纳米纤维相比纸的僵硬度太大，导致在凝胶与膜的接触面产生气泡的情况下，很难去除上述气泡，从而很难执行蛋白质印迹法。
因此，需要具有均匀的微孔分布和高的气孔度，且容易去除气泡，并具有适当的柔性的蛋白质印迹用膜。本发明人对此进行了反复研究，其结果得知，将纳米纤维网与无纺布接合并进行复合化，就可以解决上述问题，从而完成了本发明。
发明内容
技术问题
因此，本发明的目的在于，将纳米纤维网与无纺布进行复合化，来提供更低廉、容易处理，且检测灵敏度得到提高的蛋白质印迹用复合膜及其制备方法。
解决问题的手段
为了达成这种目的，根据本发明，提供蛋白质印迹用复合膜的制备方法，包括：将聚偏氟乙烯类高分子物质溶解于溶剂中，来制备纺丝溶液的步骤；通过电纺丝方法来从上述纺丝溶液中获得聚偏氟乙烯类高分子纳米纤维网的步骤；以及将获得的上述聚偏氟乙烯类高分子纳米纤维网与无纺布进行复合化，来获得蛋白质印迹用复合膜的步骤。
并且，例如，可单独利用由均聚物(homopolymer)组成的聚偏氟乙烯及由共聚物(copolymer)组成的聚偏氟乙烯等的氟类高分子来形成上述聚偏氟乙烯类高分子物质，或者将它们进行复合化来形成聚偏氟乙烯类高分子物质，但不受这些的特别限制。
并且，本发明的特征在于，优选地，上述纳米纤维的含量在1gsm至50gsm的范围内，上述纳米纤维的平均微孔的大小在0.1μm至1.0μm的范围内。
并且，根据本发明，上述纳米纤维网与无纺布的复合化将纳米纤维网与无纺布贴合，或者在上述无纺布上直接纺丝纳米纤维来将上述纳米纤维网与无纺布进行复合化。并且，本发明的特征在于，上述纳米纤维网与无纺布的复合化是通过选自压接、加压、压延、轧制、热接合以及超声波接合中的某一种方法来执行的。
此时，上述纳米纤维网与无纺布的复合化也可以伴随有60至200℃温度下的热处理。
并且，根据本发明，提供蛋白质印迹用复合膜，其特征在于，将通过电纺丝方法制成的纳米纤维网与无纺布进行复合化，使得纳米纤维的含量在1gsm至50gsm的范围内，纳米纤维的平均微孔的大小在0.1μm至1.0μm的范围内。
本发明的特征在于，可在本发明中使用的溶剂为选自包含二甲基甲酰胺(DMF，di-methylformamide)、二甲基乙酰胺(DMAc，di-methylacetamide)、四氢呋喃(THF，tetrahydrofuran)、丙酮(Acetone)、乙醇(Alcohol)类、氯仿(Chloroform)、二甲基亚砜(DMSO，dimethylsulfoxide)、二氯甲烷(dichloromethane)、醋酸(aceticacid)、蚁酸(formicacid)、N-甲基吡咯烷酮(NMP，N-Methylpyrrolidone)以及氟乙醇类的组中的一种以上。
本发明的特征在于，上述纺丝方法为选自包含电纺丝(electrospinning)、电喷射(electrospray)、电吹制纺丝(electrobrownspinning)、离心电纺丝(centrifugalelectrospinning)、闪蒸电纺丝(flash-electrospinning)等的组中的一种。
本发明的特征在于，上述无纺布为选自包含聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET，Polyethyleneterephthalate)、聚丙烯(PP，polyprophylene)以及聚酯(PE，polyester)类的组中的一种以上，上述无纺布的厚度或纤维直径不受特别的限制。
发明的效果
根据本发明，能够提供降低生产成本，且蛋白质的检测灵敏度优秀的蛋白质印迹用复合膜，从而能够有用地利用于蛋白质分离、分析用以及多种检测。
附图说明
图1为通过本发明制成的聚偏氟乙烯纳米纤维网的扫描电子显微镜照片；(a)7gsm、(b)9gsm、(c)14gsm。
图2为通过本发明制成的聚偏氟乙烯纳米纤维网与聚对苯二甲酸乙二醇酯无纺布贴合的截面的扫描电子显微镜照片；(a)7gsm、(b)9gsm、(c)14gsm。
图3为本发明中所使用的聚对苯二甲酸乙二醇酯无纺布的扫描电子显微镜照片(a)和通过本发明制成的聚偏氟乙烯纳米纤维网与聚对苯二甲酸乙二醇酯无纺布贴合的扫描电子显微镜照片(b)。
图4为表示通过本发明制成的复合膜的由多孔材料有限公司(PMI)提供的结果的图表。
图5为表示利用通过本发明制成的复合膜的蛋白质印迹结果的照片。
图6为表示利用本发明和比较例的膜的蛋白质印迹结果的照片。
具体实施方式
就本发明的蛋白质印迹用复合膜而言，首先，将聚偏氟乙烯类高分子溶解于适当的溶剂中，来以可纺丝的浓度制备溶液，在向纺丝口移送之后，向喷嘴施加高电压，从而通过利用电纺丝(electrospinning)等方法来进行纺丝而与无纺布层叠并制备的方法和在无纺布上直接将聚偏氟乙烯类纳米纤维进行电纺丝来制备的方法，制备无纺布上的纳米纤维的克重为1gsm至50gsm，纳米纤维的平均微孔的大小为0.1至1.0μm的蛋白质印迹用复合膜。
以下，按照各个步骤详细说明。
聚偏氟乙烯类纳米纤维纺丝溶液的制备
本发明中，例如，可单独利用由均聚物(homopolymer)组成的聚偏氟乙烯及由共聚物(copolymer)组成的聚偏氟乙烯等的氟类高分子来形成聚偏氟乙烯类高分子物质，或者将它们进行复合化来形成聚偏氟乙烯类高分子物质，利用具有相容性的溶剂来制备可纺丝的浓度的纺丝溶液而使用。
在制备上述纺丝溶液的过程中，聚偏氟乙烯高分子物质的含量适当为5至50重量％，在聚偏氟乙烯高分子物质的含量小于5重量％的情况下，相比于形成纳米纤维，喷射成珠(bead)状，导致难以形成膜，在聚偏氟乙烯高分子物质的含量大于50重量％的情况下，具有由于粘度高，使得纺丝性不良，导致难以形成纤维的情况。因此，优选地，使纺丝溶液具有容易形成纤维状结构的浓度，来控制纤维的形状(形态学，morphology)。
高分子纳米纤维网的形成
使用定量泵，来将制成的纺丝溶液移送到纺丝组件(spinpack)，此时，使用高电压调节装置来向纺丝组件施加电压，从而实施电纺丝。可将此时所使用的电压调节至0.5kV至100kV，集电板可接地或者带有阴极而使用，优选地，由导电性金属、剥离纸、无纺布等构成。集电板的情况下，优选地，当纺丝时，为了使纤维的集束顺畅，附着捕集装置(suctioncollector)来使用。
并且，优选地，将纺丝组件到集电板的距离调节为5至50cm而使用。优选地，对于纺丝时排出量，使用定量泵来以每个孔0.01至5cc/孔.分钟(hole.min)排出并纺丝，当纺丝时，在可调节温度及湿度的腔室(chamber)内在相对湿度为30至80％的环境下进行纺丝。
高分子纳米纤维网与无纺布的复合化
如此制成的聚偏氟乙烯纳米纤维网与聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚丙烯、聚酯等的无纺布实现一体化，并通过压接、轧制、热接合、超声波接合、压延等多种方法来进行层叠并制备复合体膜。
此时，可将纳米纤维的克重多样地制备为1gsm至50gsm。在本发明中，“克重”为表示纳米纤维的含量的单位，用每平方米的重量(克)(gsm，grampersquaremeter)表示。在纳米纤维的含量小于1gsm的情况下，存在由于聚偏氟乙烯纳米纤维的量太少，导致不能以高灵敏度检测蛋白质的缺点，在纳米纤维的含量大于50gsm的情况下，存在因高价的材料费上涨，而使工序费用增加的问题。
并且，纳米纤维的平均微孔大小适当为0.1至1.0μm，在纳米纤维的平均微孔大小小于0.1μm的情况下，后处理工序费用上涨，转移(transfer)时间延迟，在纳米纤维的平均微孔大小大于1.0μm的情况下，转移的蛋白质的浓度低而使检测灵敏度下降，因而存在无法准确分析的缺点。
另一方面，在本发明中，当将纳米纤维网与无纺布进行复合化时，可根据需要伴随有热处理，优选地，热处理在不使高分子熔融的范围，即在60至200℃的温度范围内实施。在热处理温度小于60℃的情况下，由于热处理温度太低，因而纳米纤维之间的熔敷处于不稳定状态，从而当进行蛋白质印迹之前的甲醇(methanol)预处理时，进行纳米纤维之间的分离，导致难以执行适当的蛋白质印迹。并且，有如下情况，当热处理温度大于200℃时，组成纳米纤维的聚偏氟乙烯类高分子的一部分进行熔融，使得微孔结构被堵塞，从而无法适当地进行从十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-page)实现的蛋白质转移(transfer)，导致难以进行准确的分析。
以下，通过实施例对本发明进行更为详细的说明。这些实施例仅用于例示本发明，不应解释为本发明的范围受这些实施例的限制，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
(实施例1)
将20重量％的由作为疏水性高分子的均聚物组成的聚偏氟乙烯(Kynar761)溶解在溶剂二甲基乙酰胺(DMAc，Dimethylacetamide)中。利用定量泵来将制成的纺丝溶液移送到纺丝喷嘴，并在施加电压为25kV、纺丝口与集电体的距离为20cm、且每分钟排出量为0.01cc/g·holl的条件下，在常温及常压条件下实施了电纺丝，使得聚偏氟乙烯纳米纤维网的克重分别为7gsm、9gsm、14gsm。
图1示出了通过本实施例进行电纺丝的聚偏氟乙烯纳米纤维网的扫描电子显微镜照片。如图1所示，可以确认，组成聚偏氟乙烯纳米纤维网的大部分纤维呈现300nm至400nm范围的直径分布，且纳米纤维与无纺布之间的微孔为三维的打开微孔(3-Dopenpore)结构，从表面均匀地打开至背面。
在140℃温度下，将如此制成的聚偏氟乙烯纳米纤维网与聚对苯二甲酸乙二醇酯无纺布一起进行压延并复合化，将利用扫描电子显微镜来分析聚偏氟乙烯纳米纤维网与聚对苯二甲酸乙二醇酯无纺布的复合体的截面形状的结果显示在图2中。如图2所示，可以确认在聚对苯二甲酸乙二醇酯无纺布上复合化有聚偏氟乙烯纳米纤维网。
图3示出了本发明中所使用的聚对苯二甲酸乙二醇酯无纺布的扫描电子显微镜照片(a)和可确认已电纺丝的纳米纤维网与无纺布纤维的直径差的电子显微镜照片(b)。由此可知，聚对苯二甲酸乙二醇酯无纺布的情况下，具有纳米纤维的500倍的直径，即，直径为20μm。
图4示出了使用毛细管流气孔计(CapillaryFlowporometer，多孔材料有限公司(PMI))装备来分析根据本发明贴合的复合膜的气孔分布的结果。如图4所示，可知纳米纤维的克重越从7gsm增加至14gsm，平均微孔大小就越减少，而这是因为纳米纤维的重量增加。
(实施例2)
除了在聚对苯二甲酸乙二醇酯无纺布上直接实施电纺丝，来形成在聚对苯二甲酸乙二醇酯无纺布上电纺丝的聚偏氟乙烯纳米纤维网之外，通过与实施例1的方法相同的方法，来获得聚偏氟乙烯纳米纤维网与聚对苯二甲酸乙二醇酯无纺布的复合体之后，通过以140℃加热的辊对上述复合体实施压延，来制备了蛋白质印迹用复合膜。此时确认到，所制成的纳米纤维也与实施例1相似地，平均直径为400nm至500nm，并且可以确认压延后纳米纤维以无断开或脱离的方式均匀地进行复合化。
(比较例)
为了比较，使用仅由克重为70gsm的聚偏氟乙烯纳米纤维网形成的膜，来将蛋白质印迹与实施例1相同地实施。
蛋白质印迹试验
利用实施例1和实施例2的样品，来实施了蛋白质印迹。
首先，将实施例1中制成的样品以长×宽分别为8cm×9cm的方式预先切割，并以在凝胶(gel)内蛋白质与膜进行疏水性结合(hydrophobicinteraction)的方式浸渍于100％的甲醇约1分钟来进行活性化。
将如此进行活性化的膜移到转移缓冲溶液(1×transferbuffer)之后，放置了10分钟。此时，上述转移缓冲溶液由3.03g/L的三羟甲基氨基甲烷(trisma-base)、14.4g/L的甘氨酸(Glycine)、20％甲醇(200ml/L)组成。将要转移的凝胶稍微浸湿在转移缓冲溶液中，并以注意防止在膜上产生气泡并放在上面。使凝胶与膜紧贴之后，在双面贴预先用转移缓冲溶液浸湿的3M纸(3Mpaper)，并安装于转移试剂盒(transferkit)。
使用微型凝胶(Mini-gel)转移试剂盒来在100V条件下实施了1小时的转移，为了阻断此时产生的热，将转移容器(transfertank)放置在冰中而实施该转移。转移结束后，拆卸装置，分离膜，并稍微沾上1×TBST(0.05％与20％之间的三羟甲基氨基甲烷缓冲生理盐水(tris-bufferedsaline))。此时，TBST的结构由0.2M的TrispH8(24.2g的三羟甲基氨基甲烷(trismabase))、1.37MNaCl(80gNaCl)以及调整成pH7.6的浓HCl(AdjustpH7.6byconcHCl)来组成。
此时，从口腔上皮细胞肿瘤KB细胞株提取的总蛋白质浓度为20μg、10μg、5μg、2.5μg以及1μg，并利用了10％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳凝胶(SDS-pagegel)。整个转移时间(transfertime)约为1小时40分钟，阻断时间为(blockingtime)为1小时30分钟。
检测对象蛋白质为β-肌动蛋白(β-actin)，第一抗体(firstAntibody)为从小鼠获得的β-肌动蛋白抗体(圣克鲁兹(santacruz)，sc-47778)，以1:5000将这些稀释，从而在4℃温度下与转移膜反应一天左右。之后，与作为结合有辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase)(从辣根提取的过氧化氢分解酶)的第二抗体(secondaryAntibody)的山羊抗小鼠IgG-HRP(goatanti-mouseIgG-HRP(圣克鲁兹(santacruz)，sc-2005，将小鼠免疫球蛋白注入于山羊而制成的抗体))进行反应，再放入作为对于辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase)的基质的过氧化氢溶液(peroxidesolution)和鲁米诺增强剂溶液(LuminolEnhancerSolution)(借助过氧化氢分解酶分解的氧自由基使鲁米诺(Luminol)氧化，并发出荧光；LF-QC1010、阿博福伦泰尔(ABFRONTIER)公司、韩国(Korea))并使它们反应1分钟。与基质进行反应的转移膜在X射线(X-ray)膜露出2分钟，来确认了β-肌动蛋白蛋白质的表达。
图5示出了使用本发明的实施例1中制成的复合体膜来施行蛋白质印迹的结果。如图5所示，在本发明的实施例1中，即使纳米纤维的克重分别变为7gsm、9gsm以及14gsm，蛋白质印迹结果没有太大的变化，且所有样品中明确又突出地出现了带。只是，在纳米纤维的克重为7gsm的情况下，即使在蛋白质浓度(proteinconcentration)比较低的2.5μg中，也较弱，但由于出现检测带，因而可以确认检测灵敏度稍微优秀的事实。
从这种结果可知，即使在根据本发明将纳米纤维网与无纺布接合而进行复合化来使纳米纤维的克重少的情况下，当进行蛋白质印迹法时，也不引起处理性恶化的问题，反而，若纳米纤维的克重变少，则膜的气孔度增加，使得蛋白质的检测灵敏度提高。由此，根据本发明，可提供降低工序费用，且检测灵敏度优秀的蛋白质印迹用复合膜。
图6示出了使用本发明的实施例1的7gsm与比较例的样品来实施蛋白质印迹的比较结果。如图6所示，与由纳米纤维单独形成的膜(比较例)的情况相比，在本发明的情况下，出现了相对更大更清晰的印迹大小。从这种结果可知，与比较例相比，在本发明的情况下，还可以仅用更少量的蛋白质来进行检测，因而对于蛋白质的检测灵敏度更优秀。
以上，例举特定的优选的实施例来图示并说明了本发明，但本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明的精神的范围内，能够由本发明所属技术领域的普通技术人员进行各种变更和修改。
产业上的可利用性
存在少量的蛋白质的特定物质的情况下，本发明也能够适用于可容易地进行检测的蛋白质印迹用复合膜。
Claims (5)
1.一种蛋白质印迹用复合膜的制备方法，其特征在于，包括：
将聚偏氟乙烯类高分子物质溶解于溶剂中，来制备纺丝溶液的步骤；
通过电纺丝方法来从上述纺丝溶液中获得聚偏氟乙烯类高分子纳米纤维网的步骤；以及
将获得的上述聚偏氟乙烯类高分子纳米纤维网与无纺布进行复合化，来获得蛋白质印迹用复合膜的步骤，
上述聚偏氟乙烯类高分子纳米纤维网与无纺布的复合化是在上述无纺布上直接纺丝聚偏氟乙烯类高分子纳米纤维来进行复合化的。
2.根据权利要求1所述的蛋白质印迹用复合膜的制备方法，其特征在于，与上述聚偏氟乙烯类高分子纳米纤维网进行复合化的无纺布为选自包含聚酯以及聚丙烯类的组中的一种以上。
3.根据权利要求1所述的蛋白质印迹用复合膜的制备方法，其特征在于，上述纳米纤维的含量在1gsm至50gsm的范围内，上述纳米纤维的平均微孔的大小在0.1μm至1.0μm的范围内。
4.根据权利要求1所述的蛋白质印迹用复合膜的制备方法，其特征在于，上述聚偏氟乙烯类高分子纳米纤维网与无纺布的复合化是通过选自压接、加压、压延、轧制、热接合以及超声波接合中的一种方法来执行的。
5.根据权利要求1所述的蛋白质印迹用复合膜的制备方法，其特征在于，上述聚偏氟乙烯类高分子纳米纤维网与无纺布的复合化伴随有60至200℃温度下的热处理。
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