CN109338598A - 一种形成薄膜的方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种形成薄膜的方法，包括如下步骤：(1)在具有孔的基底表面形成网状结构层或多孔结构层；(2)形成薄膜。所述形成薄膜的方法可用来制备一种用于测序的薄膜，制备用于测序的薄膜可节约时间，降低成本，大大提高生产效率。本发明还公开了所述薄膜在生物测序和/或检测中的用途。

Description

一种形成薄膜的方法和应用
技术领域
本发明属于生物材料领域，具体涉及一种形成薄膜的方法和应用。
背景技术
1996年，Branton小组第一次演示当电流驱使单链DNA穿过镶嵌在磷脂双分子层上的α-溶血素蛋白时会使电流瞬时下降，证明纳米孔蛋白可以用于DNA的检测。生物纳米通道是利用跨膜通道最为天然的纳米器件，其孔径一般仅为1～10纳米，只能容纳一个分子(如DNA、Micro-RNA、多肽、糖等)穿过孔道，因此，能够在水溶液体系实现对单个分子的实时、高通量、无标记超灵敏分析。目前，应用较多的生物纳米通道为α-溶血素、MspA纳米通道、Csgg纳米通道和SP1纳米通道。这些纳米通道能够实现对待测分子的超灵敏分析。在制备纳米通道过程中，磷脂双分子层的制备是一个非常重要的步骤，而现有技术中磷脂双分子层的制备方法各异，各有利弊。
专利文献CN104651500A公开了一种气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法，其中包括用聚缩醛树脂检测池作为载体制备磷脂双分子层，聚缩醛树脂检测池含有检测池I和检测池II，所述检测池II嵌入所述检测池I中；在磷脂双分子层形成后将所述聚缩醛树脂检测池分为两个区域：在所述检测池II上有直径为50μm的小孔，用于形成磷脂双分子层；在检测池I的侧边有与池体连通的提拉孔，用于插入注射器对内部溶液进行提拉。此方法制备磷脂双分子层工序复杂、耗费资源，不利于转化为规模生产。
现有的方式多采用涂膜的方式制备磷脂双分子层，先涂一层油相，再涂磷脂层，经过移液枪吹打气泡的方式制备磷脂双分子层，虽然此方法工序简单、经济节约，但容易吹破，力度很难控制，会耗费工作人员大量的时间。专利文献CN105637081A公开了一种形成用于纳米孔感测装置的脂质双层的方法，专利文献WO2008102121A1公开了一种穿过孔形成脂质双层的方法，上述两种方法均是借助特定的设备来制备磷脂双分子层，此法虽然实现了机械化制备，但膜稳定性较差，质量标准把控较困难，而且资源消耗过大。
为了克服此方法的缺陷，本申请中发明人采用先在具有孔的基底材料上形成网状结构层或多孔结构层，磷脂的气液或者油/水界面刷过基底，制备磷脂双分子层。结果表明，本发明所提供的方法制备磷脂双分子层的时间大大缩短，高效便捷，节省资源，膜稳定性增加。
发明内容
本发明的目的是提供一种形成薄膜的方法及薄膜的用途。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种形成薄膜的方法，包括如下步骤：
(1)在具有孔的基底表面形成网状结构层或多孔结构层，
(2)形成薄膜。
优选的，所述步骤(1)为在具有孔的基底表面形成悬浮在孔上的网状结构层或多孔结构层。
所述的基底可以为任何可形成孔的基底，例如具有孔的平板、具有孔的圆柱体、具有孔的管道等，所述的基底可以为本领域熟知的材料制备，例如选金属材料、无机非金属材料、高分子材料中的一种或两种以上的组合。优选的，所述基底的材料选自：硅基材料、塑料材料、金属氧化物材料中的一种或两种以上的组合。
所述硅基材料选自：Si、SiO2、SiN、玻璃、硼硅酸盐等。
所述塑料材料选自：聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚醚醚酮、聚甲基丙烯酸酯、聚氨基甲酸乙酯等。
所述金属氧化物材料选自：氧化钛、氧化铝、氧化锌等。
所述的孔为圆形、椭圆形、方形、三角形或任意不规则形状。优选的，所述的孔为圆形或椭圆形。更优选的，所述孔为圆形。
所述孔的直径为1-500μm。优选的，所述孔的直径为25-100μm。在本发明的优选实施方式中，所述孔的直径为25-64μm。
所述的孔可以为一个或多个，例如是2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、1000或10000个。
所述的网状结构层或多孔结构层为纤维材料制备而成，所述的纤维材料选自：天然纤维或高分子聚合物材料。
所述纤维材料选自：胶原、蚕丝蛋白、透明质酸、聚酸胺纤维、聚酯纤维、聚乙烯纤维、聚丙烯纤维、聚乙烯酸纤维、聚氯乙烯纤维、壳聚糖纤维、聚氧乙烯纤维、聚乳酸纤维、聚甲基丙烯酸甲酯纤维、聚苯乙烯纤维、聚碳酸酯纤维、聚己内酯纤维、聚丙烯腈纤维、聚乙烯醇纤维、聚氨酯纤维、聚乙烯纤维、聚丙烯纤维、粘胶纤维、棉纤维、竹纤维、竹炭纤维、麻纤维、醋酸纤维素纤维、尼龙纤维、聚氧化乙烯纤维、聚乙烯醇纤维、聚偏氟乙烯纤维、丝素纤维、聚对苯二甲酸乙二醇酯纤维、聚酰亚胺纤维、聚乙烯醇缩丁醛纤维、聚乙烯吡咯烷酮纤维、聚丙烯酰胺纤维、聚苯并咪唑纤维、聚醚酰亚胺纤维、聚氧化乙烯纤维中的一种或两种以上的组合。优选的，所述的纤维材料为聚苯乙烯纤维和聚偏二氟乙烯纤维。
优选的，所述纤维材料为纳米纤维材料。
所述的网状结构层、多孔结构层的孔隙为可以为规则或不规则形状，例如所述的孔隙为圆形、方形，所述孔隙面积为0.1-10000μm2。
所述的网状结构层或多孔结构层采用纺丝方法制备而成，优选的采用静电纺丝方法制备而成。
所述静电纺丝方法包括：(1)将静电纺丝原料分散至溶剂中，制备电纺原料溶液；(2)将电纺原料溶液在电场下喷射进行纺丝。
所述静电纺丝原料选自天然纤维或高分子聚合物材料，优选的，所述静电纺丝原料选自：胶原、蚕丝蛋白、透明质酸、聚酸胺、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙烯酸、聚氯乙烯、壳聚糖、聚氧乙烯、聚乳酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚己内酯、聚丙烯腈、聚乙烯醇、聚氨酯、聚乙烯、粘胶、棉纤维、竹纤维、竹炭纤维、麻纤维、醋酸纤维素、尼龙、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、聚偏氟乙烯、丝素纤维、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚酰亚胺、聚乙烯醇缩丁醛、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚苯并咪唑、聚醚酰亚胺、聚氧化乙烯中的一种或两种以上的组合。优选的，所述静电纺丝原料选自聚苯乙烯和聚偏二氟乙烯。
优选的，所述静电纺丝原料为纳米纤维。所述溶剂选自：N,N-二甲基甲酰胺、甲酰胺、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮、氯仿、N,N-二甲基乙酰胺、甲醇、乙醇、水、丙酮、二氯甲烷、甲酸、乙酸、二甲基亚砜、乙醚、三氯乙酸、三氟乙酸以及吡啶中的一种或两种以上的组合。优选的，所述的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。
在本发明的实施方式中，所述的电纺原料溶液为10％-30wt.％PS溶液，更优选的，所述的10％-30wt.％PS溶液溶剂为DMF。在本发明的一个实施方式中，所述的静电纺丝原料中还包括0.01-10wt.％的CTAB，优选的，所述的静电纺丝原料中还包括0.1-1wt.％的CTAB。在本发明的一个具体实施方式中，所述的电纺原料溶液包括10％PS和0.1％CTAB的组合物。
优选的，所述的静电纺丝方法的包括：
(a)将静电纺丝原料分散至溶剂中，制备电纺原料溶液；
(b)在电场作用下，在有孔的基底上喷射纺丝。
所述步骤(a)中搅拌2.5-3.5h，放置12h以上，优选的，搅拌3h，放置24h。
所述步骤(b)中所述的电场为正电压20KV，负电压2.5KV。
所述步骤(b)中纺丝时间可根据实验相关参数而定，优选的，纺丝时间为5-45min，更优选的，纺丝时间为5min、12min或45min。本发明所述的薄膜可以是油膜、高分子材料膜、磷脂双分子膜，优选的，所述的膜为磷脂双分子膜和高分子材料膜。
所述形成薄膜的方法可以采用本领域熟知的方法，例如包括：刷涂法、喷涂法、浸涂法、旋涂法、蒸镀法或刮涂法。优选的，所述的涂膜方法选自：喷涂法或浸涂法。
优选的，所述形成薄膜的方法为涂覆有机相后添加磷脂或在基底先涂有机相，浸没在水相中，使基底上的孔接触磷脂气液相界面或者磷脂固液相界面，形成薄膜；具体是在基底先涂有机相，浸没在水相中，含有磷脂气液相界面(例如沾了磷脂的气泡)或者固液相界面(例如沾了磷脂的刷子)贴着有机面刷过基底上的孔，形成薄膜。
所述的有机相选自：C5-C20的脂肪烃类、C8-C18的脂环烃类、C6-C14的醚类、脂肪酯类等。
优选的，所述有机相选自戊烷、己烷、辛烷、十六烷、环己烷、环己酮、甲苯环己酮、正己醚、戊酸己酯中的一种或两种以上的组合。
所述磷脂选自二植烷酰基-磷脂酰胆碱(DPhPC)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3磷酸胆碱、1,2-二-O-植烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DoPhPC)、棕榈酰基-油酰基-磷脂酰胆碱(POPC)、二油酰基-磷脂酰甲酯(DOPME)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、鞘磷脂、1,2-二-O-植烷基-sn-甘油、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-350]、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-550]、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-750]、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-1000]、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-乳糖基、GM1神经节苷脂、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、霉菌酸、PMOX-PDMS-PMOX等亲水-疏水-亲水三嵌段共聚物、PMOX-PDMS等亲水-疏水双嵌段共聚物中的一种或两种以上的组合。
一种用于测序的薄膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)在具有孔的基底表面形成网状结构层或多孔结构层；
(2)在网状结构层或多孔结构层上制备磷脂双分子层，形成薄膜。
优选的，所述步骤(1)为在具有孔的基底表面形成悬浮在孔上的网状结构层或多孔结构层。
优选的，所述步骤(1)中具有孔的基底选自：硅基材料基底、高分子聚合物材料基底、金属氧化物材料基底中的一种或两种以上的组合；在本发明的优选实施方式中，所述基底材料选自SU8光敏树脂、TMMF光敏树脂、特氟龙管横切面或聚醚醚酮管的横切面。
优选的，所述的网状结构层或多孔结构层是纤维材料制备而成。
所述的纤维材料选自：天然纤维或高分子聚合物材料。
所述纤维材料选自：胶原、蚕丝蛋白、透明质酸、聚酸胺纤维、聚酯纤维、聚乙烯纤维、聚丙烯纤维、聚乙烯酸纤维、聚氯乙烯纤维、壳聚糖纤维、聚氧乙烯纤维、聚乳酸纤维、聚甲基丙烯酸甲酯纤维、聚苯乙烯纤维、聚碳酸酯纤维、聚己内酯纤维、聚丙烯腈纤维、聚乙烯醇纤维、聚氨酯纤维、聚乙烯纤维、聚丙烯纤维、粘胶纤维、棉纤维、竹纤维、竹炭纤维、麻纤维、醋酸纤维素纤维、尼龙纤维、聚氧化乙烯纤维、聚乙烯醇纤维、聚偏氟乙烯纤维、丝素纤维、聚对苯二甲酸乙二醇酯纤维、聚酰亚胺纤维、聚乙烯醇缩丁醛纤维、聚乙烯吡咯烷酮纤维、聚丙烯酰胺纤维、聚苯并咪唑纤维、聚醚酰亚胺纤维、聚氧化乙烯纤维中的一种或两种以上的组合。优选的，所述的纤维材料为聚苯乙烯纤维和聚偏二氟乙烯纤维。
优选的，所述纤维材料为纳米纤维材料。
优选的，所述步骤(1)中的网状结构层或多孔结构层是用纺丝方法制备而成，更优选的，所述的纺丝方法为静电纺丝方法。
优选的，所述的静电纺丝方法的包括：
(a)将静电纺丝原料分散至溶剂中，制备电纺原料溶液；
(b)在电场作用下，在有孔的基底上喷射纺丝。
在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(a)中静电纺丝原料选自：壳聚糖、聚氧乙烯、聚乳酸、聚苯乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯、聚丙烯中的一种或两种以上的组合。
在本发明的具体实施方式中，所述的电纺原料溶液为10％-30wt％PS溶液，更优选的，所述的10％-30wt.％PS溶液溶剂为DMF。在本发明的一个实施方式中，所述的静电纺丝原料中还包括0.01-10wt.％的CTAB，优选的，所述的静电纺丝原料中还包括0.1-1wt.％的CTAB。在本发明的一个具体实施方式中，所述的电纺原料溶液包括10％PS和0.1％CTAB的组合物。
所述步骤(a)中搅拌2.5-3.5h，放置12h以上，优选的，搅拌3h，放置24h。
所述步骤(b)中电场电压为正电压20KV，负电压2.5KV。
所述步骤(b)中纺丝时间可根据实验相关参数而定，优选的，纺丝时间为5-45min，更优选的，纺丝时间为5min、12min或45min。
优选的，所述步骤(2)中制备磷脂双分子层包括涂膜过程，所述的涂膜过程为先涂有机相，再涂磷脂层或在基底先涂有机相，浸没在水相中，使基底上的孔接触磷脂气液相界面或者磷脂固液相界面，形成薄膜；具体是在基底先涂有机相，浸没在水相中，含有磷脂气液相界面(沾了磷脂的气泡)或者固液相界面(沾了磷脂的刷子)贴着有机面刷过基底上的孔，形成薄膜。
优选的，所述的有机相选自：戊烷、己烷、辛烷、十六烷、环己烷、环己酮、甲苯环己酮、正己醚、戊酸己酯中的一种或两种以上的组合。所述磷脂选自：二植烷酰基-磷脂酰胆碱(DPhPC)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3磷酸胆碱、1,2-二-O-植烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DoPhPC)中的一种或两种以上的组合。
优选的，所述步骤(2)还包括判断涂膜后是否形成闭路。
更优选的，在膜的两侧加电压，判断是否有10pA以下的电流，通过测试膜的电容以及是否可以在300mV的瞬间电压下击穿来判断是否形成了磷脂膜。
所述测试缓冲液为KCl、NaCl或LiCl溶液，浓度为0.1-1.5mol/L，pH值为7.0-8.0。
优选的，所述步骤(2)中制备磷脂双分子层的方法为在预涂磷脂的基底表面吹气泡再吸走。
优选的，所述一种形成薄膜的方法还包括步骤(3)：形成磷脂双分子层后，加入纳米孔蛋白，形成具有纳米孔通道的薄膜。
所述生物蛋白选自：α-溶血素蛋白、耻垢分枝杆菌中的孔蛋白(Mycobacteriumsmegmatis porinA，MspA)、Stable Protein 1(SP1)或气单胞菌溶素，CsgG孔蛋白。
优选的，所述纳米孔直径为0.8-25nm，优选的，所述纳米孔直径为0.8-2.8nm。
一种薄膜，所述的薄膜设置在有孔的基底上，所述薄膜在孔的上表面，所述的基底的孔上悬浮有网状结构层或多孔结构层。
所述的基底可以为任何可形成孔的基底，例如具有孔的平板、具有孔的圆柱体、具有孔的管道等，所述的基底可以为本领域熟知的材料制备，例如选金属材料、无机非金属材料、高分子材料中的一种或两种以上的组合。优选的，所述基底的材料选自：硅基材料、塑料材料、金属氧化物材料中的一种或两种以上的组合。
所述硅基材料选自：Si、SiO2、SiN、玻璃、硼硅酸盐等。
所述塑料材料选自：聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚醚醚酮、聚甲基丙烯酸酯、聚氨基甲酸乙酯等。
所述金属氧化物材料选自：氧化钛、氧化铝、氧化锌等。
所述的孔为圆形、椭圆形、方形、三角形或任意不规则形状。优选的，所述的孔为圆形或椭圆形。更优选的，所述孔为圆形。
所述孔的直径为1-500μm。优选的，所述孔的直径为25-100μm。在本发明的优选实施方式中，所述孔的直径为25-64μm。
所述的孔可以为一个或多个，例如是2、3、4、5、6、7、8、9或100、1000、10000个。
所述的网状结构层或多孔结构层为纤维材料制备而成，所述的纤维材料选自：天然纤维或高分子聚合物材料。
所述纤维材料选自：胶原、蚕丝蛋白、透明质酸、聚酸胺纤维、聚酯纤维、聚乙烯纤维、聚丙烯纤维、聚乙烯酸纤维、聚氯乙烯纤维、壳聚糖纤维、聚氧乙烯纤维、聚乳酸纤维、聚甲基丙烯酸甲酯纤维、聚苯乙烯纤维、聚碳酸酯纤维、聚己内酯纤维、聚丙烯腈纤维、聚乙烯醇纤维、聚氨酯纤维、聚乙烯纤维、聚丙烯纤维、粘胶纤维、棉纤维、竹纤维、竹炭纤维、麻纤维、醋酸纤维素纤维、尼龙纤维、聚氧化乙烯纤维、聚乙烯醇纤维、聚偏氟乙烯纤维、丝素纤维、聚对苯二甲酸乙二醇酯纤维、聚酰亚胺纤维、聚乙烯醇缩丁醛纤维、聚乙烯吡咯烷酮纤维、聚丙烯酰胺纤维、聚苯并咪唑纤维、聚醚酰亚胺纤维、聚氧化乙烯纤维中的一种或两种以上的组合。优选的，所述的纤维材料为聚苯乙烯纤维和聚偏二氟乙烯纤维。
优选的，所述纤维材料为纳米纤维材料。
所述的网状结构层、多孔结构层的孔隙为可以为规则或不规则形状，例如所述的孔隙为圆形、方形，所述孔隙面积为0.01-10000μm2。
所述的网状结构层或多孔结构层采用纺丝方法制备而成，优选的，所述的网状结构层或多孔结构层采用静电纺丝方法制备而成。
所述静电纺丝方法主要包括：(1)将静电纺丝原料分散至溶剂中，制备电纺原料溶液；(2)将电纺原料溶液加入到电场中进行纺丝。
所述静电纺丝原料选自天然纤维或高分子聚合物材料，优选的，所述静电纺丝原料选自：胶原、蚕丝蛋白、透明质酸、聚酸胺、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙烯酸、聚氯乙烯、壳聚糖、聚氧乙烯、聚乳酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚己内酯、聚丙烯腈、聚乙烯醇、聚氨酯、聚乙烯、粘胶、棉纤维、竹纤维、竹炭纤维、麻纤维、醋酸纤维素、尼龙、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、聚偏氟乙烯、丝素纤维、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚酰亚胺、聚乙烯醇缩丁醛、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚苯并咪唑、聚醚酰亚胺、聚氧化乙烯中的一种或两种以上的组合。优选的，所述静电纺丝原料选自聚苯乙烯和聚偏二氟乙烯。
优选的，所述静电纺丝原料为纳米纤维。
所述溶剂选自：N,N-二甲基甲酰胺、甲酰胺、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮、氯仿、N,N-二甲基乙酰胺、甲醇、乙醇、水、丙酮、二氯甲烷、甲酸、乙酸、二甲基亚砜、乙醚、三氯乙酸、三氟乙酸以及吡啶中的一种或两种以上的组合。优选的，所述的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。
在本发明的实施方式中，所述的电纺原料溶液为10％-30wt％PS溶液，更优选的，所述的10％-30wt.％PS溶液溶剂为DMF。在本发明的一个实施方式中，所述的静电纺丝原料中还包括0.01-10wt.％的CTAB，优选的，所述的静电纺丝原料中还包括0.1-1wt.％的CTAB。在本发明的一个具体实施方式中，所述的电纺原料溶液包括10％PS和0.1％CTAB的组合物。
优选的，所述的静电纺丝方法的包括：
(a)将静电纺丝原料分散至溶剂中，制备电纺原料溶液；
(b)在电场作用下，在有孔的基底上喷射纺丝。
所述步骤(a)中搅拌2.5-3.5h，放置12h以上，优选的，搅拌3h，放置24h。
所述步骤(b)中所述的电场为正电压20KV，负电压2.5KV。
所述步骤(b)中纺丝时间可根据实验相关参数而定，优选的，纺丝时间为5-45min，更优选的，纺丝时间为5min、12min或45min。本发明所述的薄膜可以是油膜、高分子材料膜、磷脂双分子膜，优选的，所述的膜为磷脂双分子膜。
所述形成薄膜的方法可以采用本领域熟知的方法，例如包括：刷涂法、喷涂法、浸涂法、旋涂法、蒸镀法或刮涂法。优选的，所述的涂膜方法选自：喷涂法或浸涂法。
优选的，所述形成薄膜的方法为涂覆有机相后添加磷脂或在基底先涂有机相，浸没在水相中，使基底上的孔接触磷脂气液相界面或者磷脂固液相界面，形成薄膜；具体是在基底先涂有机相，浸没在水相中，含有磷脂气液相界面(例如沾了磷脂的气泡)或者固液相界面(例如沾了磷脂的刷子)贴着有机面刷过基底上的孔，形成薄膜。
所述的有机相选自：C5-C20的脂肪烃类、C8-C18的脂环烃类、C6-C14的醚类、脂肪酯类等。
优选的，所述有机相选自戊烷、己烷、辛烷、十六烷、环己烷、环己酮、甲苯环己酮、正己醚、戊酸己酯中的一种或两种以上的组合。
所述磷脂选自二植烷酰基-磷脂酰胆碱(DPhPC)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3磷酸胆碱、1,2-二-O-植烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DoPhPC)、棕榈酰基-油酰基-磷脂酰胆碱(POPC)、二油酰基-磷脂酰甲酯(DOPME)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、鞘磷脂、1,2-二-O-植烷基-sn-甘油、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-350]、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-550]、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-750]、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-1000]、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-乳糖基、GM1神经节苷脂、溶血磷脂酰胆碱(LPC)中的一种或两种以上的组合。
一种用于测序的薄膜，所述的薄膜设置在有孔的基底上，所述薄膜在孔的上表面，所述的基底的孔上悬浮有网状结构层或多孔结构层，所述薄膜嵌入有生物蛋白形成纳米孔通道。
所述有孔的基底选自：硅基材料基底、高分子聚合物材料基底、金属氧化物材料基底、阵列芯片中的一种或两种以上的组合；优选的，所述基底材料选自：Si、SiO2、玻璃或PEEK管。
优选的，所述有孔的基底为阵列芯片。
所述的网状结构层或多孔结构层是用静电纺丝方法织成，静电纺丝的制备步骤如下：
(a)将静电纺丝原料分散至溶剂中，制备电纺原料溶液；
(b)在电场作用下，在有孔的基底上喷射纺丝。
优选的，所述步骤(a)中静电纺丝原料选自：壳聚糖、聚氧乙烯、聚乳酸、聚苯乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯、聚丙烯中的一种或两种以上的组合。
优选的，电纺原料溶液为10％-30wt.％PS溶液，更优选的，所述的10％-30wt.％PS溶液溶剂为DMF。在本发明的一个实施方式中，所述的静电纺丝原料中还包括0.01-10wt.％的CTAB，优选的，所述的静电纺丝原料中还包括0.1-1wt.％的CTAB。在本发明的一个具体实施方式中，所述的电纺原料溶液包括10％PS和0.1％CTAB的组合物。
所述步骤(a)中搅拌2.5-3.5h，放置12h以上，优选的，搅拌3h，放置24h。
所述步骤(b)中所述的电场电压为正电压20KV，负电压2.5KV。
所述步骤(b)中纺丝时间可根据实验相关参数而定，优选的，纺丝时间为5-45min，更优选的，纺丝时间为5min、12min或45min。
所述薄膜为磷脂双分子层，制备磷脂双分子层包括先涂膜，涂膜方式为先涂有机相，再涂磷脂层或在基底先涂有机相，浸没在水相中，使基底上的孔接触磷脂气液相界面或者磷脂固液相界面，形成薄膜；具体是在基底先涂有机相，浸没在水相中，含有磷脂气液相界面(例如沾了磷脂的气泡)或者固液相界面(例如沾了磷脂的刷子)贴着有机面刷过基底上的孔，形成薄膜。
优选的，所述的有机相选自：戊烷、己烷、辛烷、十六烷、环己烷、环己酮、甲苯环己酮、正己醚、戊酸己酯中的一种或两种以上的组合。所述磷脂选自：二植烷酰基-磷脂酰胆碱(DPhPC)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3磷酸胆碱、1,2-二-O-植烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DoPhPC)中的一种或两种以上的组合。
优选的，制备磷脂双分子层还包括判断涂膜后是否形成闭路。
更优选的，在膜的两侧加电压，判断是否有10pA以下的电流，通过测试膜的电容以及是否可以在300mV的瞬间电压下击穿来判断是否形成了磷脂膜。
所述测试缓冲液为KCl、NaCl或LiCl溶液，浓度为0.1-1.5mol/L，pH值为7.0-8.0。
优选的，制备磷脂双分子层的方法为在磷脂层中间吹气泡再吸走。
更优选的，形成磷脂双分子层后，加入生物蛋白，形成具有纳米孔通道的薄膜。
所述生物蛋白选自：α-溶血素蛋白、耻垢分枝杆菌中的孔蛋白(Mycobacteriumsmegmatis porinA，MspA)、Csgg、Stable Protein 1(SP1)或气单胞菌溶素。
优选的，所述纳米孔直径为0.8-25nm，优选的，所述纳米孔直径为1-2.8nm。
一种薄膜在生物测序和/或检测中的用途。优选的，所述薄膜在DNA测序、DNA损伤、Micro-RNA检测中的应用。
本发明中，发明人在涂膜之前选择先在具有孔的基底材料上进行纺丝，再进行涂膜操作。此方法的优点在于有效的缩短了制备磷脂双分子层的时间，大大提高了生产效率。如若没有在涂膜之前先进行纺丝，涂膜过程中不仅需要涂多层磷脂层防止破裂，而且在用移液器吹打气泡时耗时耗力。因此，本发明的方法优化不仅节约资源和成本，更是有效的节省劳动时间，提高效率。
附图说明
图1以芯片为基底材料，纺丝5min，纺丝原料溶液为10wt.％PS。
图2以芯片为基底材料，纺丝5min，纺丝原料溶液为30wt.％PS。
图3以芯片为基底材料，纺丝5min，纺丝原料溶液为10wt.％PS+0.1wt.％CTAB。
图4以25μm PEEK管截面为基底材料，纺丝5min，纺丝原料溶液为10wt.％PS。
图5薄膜4上加入纳米孔蛋白前的电信号图。
图6薄膜4上加入纳米孔蛋白后，单链DNA的过孔信号图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明涉及的缩写对照如下：PS-聚苯乙烯、CTAB-溴化十六烷基三甲铵、PEEK-聚醚醚酮、DMF-二甲基甲酰胺。
实施例1薄膜1(芯片10％PS)的制备。
阵列芯片的制备：所述制作阵列芯片的整个过程均在洁净间无尘室设施中操作，选用玻璃作为基底，所述基底先用丙酮和IPA超声清洗去除油渍，再用氧等离子体进行清洗处理，最后使用150℃热板烘干。在所述基底上使用电子束蒸发镀10nm铬和100nm金后，放入旋涂机里以4000rpm，旋涂60s形成一层S1813光刻胶(MicroChem Corp.)，随后用热板95℃前烘2min后，使用UV光刻机透过掩模板进行曝光，将曝光后的基底取下放入正胶显影中显影120s，然后分别使用金、铬腐蚀液去除电极以外的金属形成金属层，最后用丙酮去除作为化学腐蚀的S1813光刻胶。将以上形成金属电极的玻璃片用覆膜机在辊轮75℃覆100μm干膜SUEX(D J Microlaminates)，随后使用掩膜板对准后UV曝光，95℃后烘后，使用SU8显影液显影30min，IPA冲洗后氮气吹干，最后150度保持硬烤1h。
纺丝：温度40℃，湿度40％，水平距离15cm，高度41cm，接收速度50r/min，平移速度400mm/min。将10％PS溶液磁力搅拌3h，放置24h；超声15min，用安装21号针头的注射器吸取3ml，排除气泡。点击静电纺丝机器控制面板上的快进按钮，让液体喷出，使针头中充满液体，在控制面板上调节相关参数，接通负极滚筒，在滚筒上裹一层铝箔纸；将电压分别调节成正电压20KV，负电压2.5KV待电压升至相应值时，点击开始。待铝箔纸上明显变白时，点击停止，将正负电压关闭，待电压将到0时，将铝箔上变白的擦去一部分，粘上提前准备好的芯片。打开电压，待电压升至相应值，点击开始进行纺丝，纺丝5min停止，如图1所示。
涂膜：在芯片的孔上加6μl己烷和十六烷的混合液，10min后再加8μl含有DPhPC的己烷，等待10min，在芯片上组装流体通道，并用离子缓冲液浸没芯片1h后，通过通电压测电流判断是否为通路。将一个气泡通过流体的泵流从流体通道的一段移动到另一端，途经芯片的孔，因气泡从芯片上孔的表面经过，即形成磷脂双分子层，进而得到薄膜1。
实施例2薄膜2(芯片30％PS)的制备
阵列芯片的制备同实施例1。纺丝：温度40℃，湿度40％，水平距离15cm，高度41cm，接收速度50r/min，平移速度400mm/min。将30％PS溶液磁力搅拌3h，放置24h；超声15min，用安装21号针头的注射器吸取3ml，排除气泡。点击静电纺丝机器控制面板上的快进按钮，让液体喷出，使针头中充满液体，在控制面板上调节相关参数，接通负极滚筒，在滚筒上裹一层铝箔纸；将电压分别调节成正电压20KV，负电压2.5KV待电压升至相应值时，点击开始。待铝箔纸上明显变白时，点击停止，将正负电压关闭，待电压将到0时，将铝箔上变白的擦去一部分，粘上提前准备好的芯片。打开电压，待电压升至相应值，点击开始进行纺丝，纺丝5min停止，如图2所示。
涂膜：在芯片的孔上加6μl己烷和十六烷的混合液，10min后再加8μl含有DPhPC的己烷，等待10min，在芯片上组装流体通道，并用离子缓冲液浸没芯片1h后，通过通电压测电流判断是否为通路。将一个气泡通过流体的泵流从流体通道的一段移动到到另一端，途经芯片的孔，因气泡从芯片上孔的表面经过，即形成磷脂双分子层，进而得到薄膜2。
实施例3薄膜3(芯片10％PS+0.1％CTAB)的制备
阵列芯片的制备同实施例1。纺丝：温度40℃，湿度40％，水平距离15cm，高度41cm，接收速度50r/min，平移速度400mm/min。将10％PS+0.1％CTAB溶液磁力搅拌3h，放置24h；超声15min，用安装21号针头的注射器吸取3ml，排除气泡。点击静电纺丝机器控制面板上的快进按钮，让液体喷出，使针头中充满液体，在控制面板上调节相关参数，接通负极滚筒，在滚筒上裹一层铝箔纸；将电压分别调节成正电压20KV，负电压2.5KV待电压升至相应值时，点击开始。待铝箔纸上明显变白时，点击停止，将正负电压关闭，待电压将到0时，将铝箔上变白的擦去一部分，粘上提前准备好的芯片。打开电压，待电压升至相应值，点击开始进行纺丝，纺丝5min停止，如图3所示。
涂膜：在芯片的孔上加6μl己烷和十六烷的混合液，10min后再加8μl含有DPhPC的己烷，等待10min，在芯片上组装流体通道，并用离子缓冲液浸没芯片1h后，通过通电压测电流判断是否为通路。将一个气泡通过流体的泵流从流体通道的一段移动到到另一端，途经芯片的孔，因气泡从芯片上孔的表面经过，即形成磷脂双分子层，进而得到薄膜3。
实施例4薄膜4(PEEK管10％PS)的制备
阵列芯片的制备同实施例1。纺丝：温度40℃，湿度40％，水平距离15cm，高度41cm，接收速度50r/min，平移速度400mm/min。将10％PS溶液磁力搅拌3h，放置24h；超声15min，用安装21号针头的注射器吸取3ml，排除气泡。点击静电纺丝机器控制面板上的快进按钮，让液体喷出，使针头中充满液体，在控制面板上调节相关参数，接通负极滚筒，在滚筒上裹一层铝箔纸；将电压分别调节成正电压20KV，负电压2.5KV待电压升至相应值时，点击开始。待铝箔纸上明显变白时，点击停止，将正负电压关闭，待电压将到0时，将铝箔上变白的擦去一部分，粘上提前准备好的25μm PEEK管。打开电压，待电压升至相应值，点击开始进行纺丝，纺丝5min停止，如图4所示。
涂膜：在PEEK管横截面的孔上加有机相己烷和十六烷的混合液1μl，再分两次加含有磷脂DPhPC的己烷，每次1μl，每次间隔2min。用注射器在PEEK管的一端挤压，并在涂有磷脂端加入离子缓冲液，判断是否为通路，测量结果如图5所示。用移液器在磷脂层上吹打气泡再吸走，即形成磷脂双分子层，进而得到薄膜4。
实施例5薄膜4上加入纳米孔的制备
在薄膜4的磷脂双分子层膜稳定后，在磷脂双分子层的cis端加入1μl的MspA蛋白溶液，施加电压使MspA蛋白嵌入磷脂双分子层中，当MspA蛋白在磷脂双分子层上形成稳定的纳米孔时，在纳米孔通道的两端施加电压，将待测DNA分子加入检测池的一端，待测分子随离子流驱动进入纳米孔，进而产生与其结构变化相对应的过孔信号，如图6所示。
以上具体实施方式只是对本发明内容的示意性说明，不代表本发明内容的限制。本领域技术人员可以想到的是本发明中具体结构可以有其它的变化形式。

Claims (22)

1.一种形成薄膜的方法，包括如下步骤：
(1)在具有孔的基底表面形成网状结构层或多孔结构层；
(2)形成薄膜。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的网状结构层或多孔结构层悬浮在孔上。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的基底材料选自：金属材料、无机非金属材料、高分子材料中的一种或两种以上的组合。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基底材料选自：硅基材料、塑料材料、金属氧化物材料中的一种或两种以上的组合。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的孔为圆形、椭圆形、方形、三角形或任意不规则形状。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的孔为圆形，所述孔的直径为1-500μm。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的网状结构层或多孔结构层为纤维材料制备而成，所述的纤维材料选自：天然纤维或高分子聚合物材料。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的网状结构层、多孔结构层的孔隙为规则或不规则形状，所述孔径面积为0.01-10000μm2。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的网状结构层或多孔结构层采用纺丝方法制备而成。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的薄膜是油膜、高分子材料膜或磷脂双分子膜。
11.一种用于测序的薄膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)在具有孔的基底表面形成网状结构层或多孔结构层；
(2)在网状结构层或多孔结构层上制备磷脂双分子层、或单层或双层自主装高分子嵌段共聚物，形成薄膜。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的网状结构层或多孔结构层悬浮在孔上。
13.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中具有孔的基底选自：硅基材料基底、高分子聚合物材料基底、金属氧化物材料基底中的一种或两种以上的组合。
14.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的网状结构层或多孔结构层是用静电纺丝方法织成，静电纺丝的制备步骤如下：
(a)将静电纺丝原料分散至溶剂中制备电纺原料溶液；
(b)在电场作用下，在有孔的基底上喷射纺丝。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中静电纺丝原料选自：壳聚糖、聚氧乙烯、聚乳酸、聚苯乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯、聚丙烯中的一种或两种以上的组合。
16.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中制备磷脂双分子层包括涂膜过程，涂膜方式为先涂有机相，再涂磷脂层，或者，在基底先涂有机相，浸没在水相中，使基底上的孔接触磷脂气液相界面或者磷脂固液相界面。
17.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)还包括判断涂膜后是否形成闭路。
18.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述形成薄膜的方法还包括步骤(3)：形成磷脂双分子层后，加入纳米孔蛋白。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述纳米孔直径为0.5-100nm。
20.一种薄膜，其特征在于，所述的薄膜设置在有孔的基底上，且所述薄膜在孔的上表面，所述的基底的孔上悬浮有网状结构层或多孔结构层。
21.权利要求20所述的薄膜，其特征在于，所述薄膜嵌入有生物蛋白形成纳米孔通道。
22.权利要求20或21任一所述的薄膜在生物测序和/或检测中的用途。
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