CN103930543A

CN103930543A - 葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸

Info

Publication number: CN103930543A
Application number: CN201280043431.5A
Authority: CN
Inventors: 松井知子; S.克拉克
Original assignee: Novo Nordisk AS; Novozymes North America Inc
Current assignee: Novo Nordisk AS; Novozymes North America Inc
Priority date: 2011-09-06
Filing date: 2012-09-05
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2032-09-05
Also published as: CA2842248A1; DK2748315T3; EA201490568A1; EP2748315B1; WO2013036526A1; CN103930543B; MX351154B; IN2014CN02469A; ES2656556T3; EP2748315A1; CA2842248C; US20140342422A1; US9534239B2; MX2014002415A

Abstract

本发明涉及具有对蛋白酶切口的减小的敏感度的多种葡糖淀粉酶变体。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸，包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Description

葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸

对序列表的引用

本申请含有处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

发明背景

发明领域

本发明涉及一种葡糖淀粉酶变体、编码该变体的多核苷酸、产生这些变体的方法、以及使用这些变体的方法。

相关技术说明

葡糖淀粉酶（1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3）是催化D-葡萄糖从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放的一种酶。葡糖淀粉酶由若干丝状真菌和酵母产生，其中来自曲霉菌属（Aspergillus）的那些在商业上最为重要。

在商业上，葡糖淀粉酶用于将已经由α-淀粉酶部分水解的淀粉转化成葡萄糖。然后可以使用发酵有机体将葡萄糖直接或间接转化成发酵产品。商业发酵产品的实例包括醇类（例如，乙醇、甲醇、丁醇、1,3-丙二醇）；有机酸类（例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸盐、乳酸、丁二酸、2,5-二酮-D-葡糖酸）；酮类（例如，丙酮）；氨基酸（例如，谷氨酸）；气体（例如，H₂和CO₂）；以及更复杂的化合物，包括例如抗生素（例如，盘尼西林和四环素）；酶；维生素（例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素）；激素以及难以合成生产的其他化合物。发酵过程通常还用于可食用酒精（例如，啤酒和酒）工业、乳制品（例如，在酸乳和奶酪的生产中）工业中。

最终产品还可以是糖浆。例如，最终产品可以是葡萄糖，但是还可以被葡萄糖异构酶转化成果糖或者由几乎均等的葡萄糖与果糖组成的一种混合物。这种混合物或者进一步富含果糖的一种混合物是全世界商业化的最常用的高果糖玉米糖浆（HFCS）。

本发明的一个目的是提供具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸，并且这些多肽和多核苷酸在发酵产品的生产过程中提供高产量，这些生产过程例如乙醇生产过程，包括从未糊化的生淀粉（或者未蒸煮的淀粉）的一步乙醇发酵过程。共同未决的专利申请WO2011/127802披露了来自草酸青霉菌的野生型葡糖淀粉酶。

本发明提供了与其亲本相比具有改进的特性的葡糖淀粉酶变体。

发明概述

本发明涉及一种葡糖淀粉酶变体，该葡糖淀粉酶变体至少在与SEQ IDNO:2的成熟多肽的位置79相对应的一个位置处包含一个取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性。

在另外的方面,本发明涉及一种变体葡糖淀粉酶催化域，该变体葡糖淀粉酶催化域至少在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置79相对应的一个位置处包含一个取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性。

在另一方面，本发明涉及一种包含本发明的多肽的组合物。

本发明还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸，包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及产生这些变体的方法。

本发明还涉及在糖浆和/或一种发酵产品的生产中使用本发明的多肽的方法。

定义

葡糖淀粉酶：术语葡糖淀粉酶（1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3）被定义为催化D-葡萄糖从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放的一种酶。出于本发明的目的，根据在此的‘材料与方法’部分所述的程序来确定葡糖淀粉酶活性。

本发明的多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20%、优选至少40%、优选至少45%、更优选至少50%、更优选至少55%、更优选至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、甚至更优选至少90%、最优选至少95%以及最优选至少100%的葡糖淀粉酶活性。

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而天然存在，并且可导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的（在编码的多肽中没有变化）或者可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。一个多肽的等位基因变体是由一个基因的等位基因变体编码的多肽。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从成熟的、剪接的mRNA分子反转录制备的DNA分子，该mRNA分子是从真核细胞或原核细胞中获得。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。起始的初级RNA转录物是通过一系列步骤加工的mRNA的前体，这些步骤包括在作为成熟剪接的mRNA出现之前进行剪接。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定一个变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般是通过以起始密码子（例如ATG、GTG或TTG）开始并以终止密码子（例如TAA、TAG或TGA）结束的一个开放读码框来决定。编码序列可以是一个基因组DNA、cDNA、合成的DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列针对编码该变体的多核苷酸来说可以是原生的（即，来自相同基因）或者外源的（即，来自不同基因），或者相对于彼此是原生的或外源的。这类控制序列包含但不局限于前导子、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。这些控制序列至少包含一个启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

表达：术语“表达”包括涉及在一个变体的产生中的任何步骤，包括但不局限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指包含编码一种变体的一种多核苷酸并可操作地连接至提供其表达的控制序列的线性或环形DNA分子。

片段：术语“片段”意指使一个或多个（例如，若干个）氨基酸从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺少的多肽，其中该片段具有葡糖淀粉酶活性。在一方面，一个片段含有至少465个氨基酸残基（例如，SEQ ID NO:2的氨基酸30至494）。

高严格条件：术语“高严格条件”意指对于至少100个核苷酸长的探针来说，按照标准DNA印迹法程序，在42℃下于5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切且变性的蛙鱼精DNA以及50%甲酰胺中进行12至24小时的预杂交和杂交。最终，使用2X SSC、0.2%SDS在65℃下洗涤运载体材料三次，每次持续15分钟。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导、等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖了由于在复制过程中存在的突变而与亲本细胞不相同的亲本细胞的任何子代。

改进的特性：术语“改进的特性”意指与一种变体相关的相对于亲本有所改进的特征。这类改进的特性包括但不局限于改进的对由宿主蛋白酶所引起的降解或切口的稳定性。改进的稳定性相当于减小的敏感度。优选地，该敏感度减小至少10%、优选至少20%、更优选至少30%、优选至少40%、优选至少45%、更优选至少50%、更优选至少55%、更优选至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、甚至更优选至少90%、更优选至少95%、并且甚至最优选至少100%。

分离的：术语“分离的”意指处于非天然存在的形式或环境中的一种物质。分离的物质的非限制实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其在自然界中相关联的一种或多种或全部天然存在的组分中除去的任何物质，包括但不局限于任何酶、变体、核酸、蛋白、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的那种物质通过人工手动改性的任何物质；或者(4)通过增加该物质相对于与其天然相关联的其他组分的量来改性的任何物质（例如，编码该物质的一个基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动更强的启动子的使用）。一种分离的物质可以存在于发酵液样品中。

低严格条件：术语“低严格条件”意指对于至少100个核苷酸长的探针来说，按照标准DNA印迹法程序，在42℃下于5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切且变性的蛙鱼精DNA以及25%甲酰胺中进行12至24小时预杂交和杂交。最终，使用2X SSC、0.2%SDS在50℃下洗涤运载体材料三次，每次持续15分钟。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰（例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化、等）之后处于其最终形式的一种多肽。在一方面，基于预测SEQ ID NO:2的氨基酸1至21是一个信号肽的程序SignalP（尼尔森（Nielsen）等人，1997，蛋白工程（Protein Engineering）10:1-6），成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸22至616。在本领域中已知的是，一个宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽（即，具有一个不同的C-末端和/或N-末端氨基酸）的混合物。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有葡糖淀粉酶活性的一种成熟多肽的一种多核苷酸。在一方面，基于预测SEQ ID NO:1的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP（上文的尼尔森等人，1997），这一成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸64至1848。

中等严格条件：术语“中等严格条件”意指对于至少100个核苷酸长的探针来说，按照标准DNA印迹法程序，在42℃下于5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切且变性的蛙鱼精DNA以及35%甲酰胺中进行12至24小时预杂交和杂交。最终，使用2X SSC、0.2%SDS在55℃下洗涤运载体材料三次，每次持续15分钟。

中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于至少100个核苷酸长的探针来说，按照标准DNA印迹法程序，在42℃下于5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切且变性的蛙鱼精DNA以及35%甲酰胺中进行12至24小时预杂交和杂交。最终，使用2X SSC、0.2%SDS在60℃下洗涤运载体材料三次，每次持续15分钟。

突变体：术语“突变体”意指编码一种变体的一种多核苷酸。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链亦或双链的一种核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或者以一种否则将不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指其中一个控制序列位于相对于一个多核苷酸的编码序列的适当位置处，这样使得该控制序列指导该编码序列的表达的配置。

亲本或亲本葡糖淀粉酶术语“亲本”或“亲本葡糖淀粉酶”意指对其做出改变以产生本发明的酶变体的一种葡糖淀粉酶。该亲本可以是天然存在的（野生型）多肽或其变体或片段。在一个实施例中，该亲本葡糖淀粉酶是SEQID NO:2的成熟多肽。

序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施（Needleman-Wunsch）算法（尼德曼&翁施，1970，分子生物学杂志（J.Mol.Biol.）48:443-453）来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性，该算法如EMBOSS软件包（EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件（The European Molecular Biology Open SoftwareSuite），赖斯（Rice）等人，2000，遗传学趋势（Trends Genet.）16:276-277）（优选5.0.0版或更新版本）的Needle程序所实施的。使用的参数是10的空位开放罚分、0.5的空位扩展罚分以及EBLOSUM62（BLOSUM62的EMBOSS版本）取代矩阵。将标记为“最长一致性”的Needle的输出（使用非简化选项（nobrief option）获得）用作百分比一致性并且计算如下：

（一致性残基x100）/（比对的长度-比对中的空位总数）

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法（上文的尼德曼&翁施，1970）来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列一致性，该算法如EMBOSS软件包（EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，上文的赖斯等人，2000）（优选5.0.0版或更新版本）的Needle程序所实施的。使用的参数是10的空位开放罚分、0.5的空位扩展罚分以及EDNAFULL（NCBI NUC4.4的EMBOSS版本）取代矩阵。将标记为“最长一致性”的Needle的输出（使用非简化选项（nobrief option）获得）用作一致性百分比并且计算如下：

（一致性脱氧核苷酸x100）/（比对的长度-比对中的空位总数）

子序列:术语“子序列”意指使一个或多个（例如，若干个）核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺少的多核苷酸，其中该子序列编码具有葡糖淀粉酶活性的一个片段。在一方面，一个子序列包含至少1395个核苷酸（例如，SEQ ID NO:1的核苷酸88至1482）。

变体:术语“变体”意指具有葡糖淀粉酶活性的、包含一个改变（即在一个或多个（例如，若干）位置处的一个取代、插入和/或缺失）的一个多肽。取代意指用一个不同的氨基酸替换占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；并且插入意指邻近并且紧跟在占据某一位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。本发明的这些变体具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20%、例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少100%的葡糖淀粉酶活性。

非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于至少100个核苷酸长的探针来说，按照标准DNA印迹法程序，在42℃下于5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切且变性的蛙鱼精DNA以及50%甲酰胺中进行12至24小时预杂交和杂交。最终，使用2X SSC、0.2%SDS在70℃下洗涤运载体材料三次，每次持续15分钟。

非常低严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于至少100个核苷酸长的探针来说，按照标准DNA印迹法程序，在42℃下于5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切且变性的蛙鱼精DNA以及25%甲酰胺中进行12至24小时预杂交和杂交。最终，使用2X SSC、0.2%SDS在45℃下洗涤运载体材料三次，每次持续15分钟。

野生型葡糖淀粉酶：术语“野生型葡糖淀粉酶”意指由天然存在的微生物（例如在自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌）表达的一种葡糖淀粉酶。

用于变体表示的常规

出于本发明的目的，将包括在SEQ ID NO:2中的成熟多肽用于确定另一种葡糖淀粉酶中的对应氨基酸残基。将另一种葡糖淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的披露为氨基酸22至616的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用尼德曼-翁施算法（尼德曼&翁施，1970，分子生物学杂志48:443-453）来确定与SEQ ID NO:2中所披露的成熟多肽的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号，该算法如EMBOSS软件包（EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，遗传学趋势16:276-277）（优选5.0.0版或更新版本）的Needle程序所实施的。使用的参数是10的空位开放罚分、0.5的空位扩展罚分、以及EBLOSUM62（BLOSUM62的EMBOSS版本）取代矩阵。因此，如果例如该变体在位置79处具有一个取代，则这与如SEQ ID NO:2所披露的全长多肽中的位置100相对应，因为氨基酸1至21是信号肽并且位置22将与这一成熟多肽中的位置1相对应。

通过使用若干计算机程序、使用它们相应的默认参数来比对多个多肽序列可以确定在另一种葡糖淀粉酶中的对应氨基酸残基的鉴别，这些计算机程序包括但不局限于MUSCLE（通过期望值的对数的多序列比较（multiplesequence comparison by log‐expectation）；3.5版或更新版本；埃德加（Edgar），2004，核酸研究（Nucleic Acids Research）32:1792-1797）、MAFFT（6.857版或更新版本；加藤（Katoh）&库玛（Kuma），2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤&都（Toh），2007，生物信息学（Bioinformatics）23:372-374；加藤等人，2009，分子生物学方法（Methods in Molecular Biology）537:39-64；加藤&都，2010，生物信息学26:1899-1900）以及采用ClustalW的EMBOSS EMMA（1.83或更新版本；汤普森（Thompson）等人，1994，核酸研究22:4673-4680）。

当从SEQ ID NO:2的成熟多肽中分叉分出其他酶，这样使得传统的基于序列的比较不能检测它们的关系（林达尔（Lindahl）&埃洛弗松（Elofsson），2000，分子生物学杂志295:613-615）时，则可以使用其他逐对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示（轮廓（profile））来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过一个迭代数据库搜索过程来产生多个轮廓并且能够检测远距离同源物（阿特休尔（Atschul）等人，1997，核酸研究25:3389-3402）。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序（例如GenTHREADER）（琼斯（Jones），1999，分子生物学杂志287:797-815；麦谷芬（McGuffin）&琼斯，2003，生物信息学19:874-881）利用来自多种来源（PSI-BLAST，二级结构预测、结构比对轮廓以及溶剂化可能性）的信息作为对预测查询序列的结构折叠的神经网络的输出。类似地，高夫（Gough）等人，2000，分子生物学杂志313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定这类模型的准确度。

对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。使用多种算法（例如距离比对矩阵（赫尔姆（Holm）&桑德尔（Sander），1998，蛋白杂志（Proteins）33:88-96）或者组合扩展（辛迪亚洛夫（Shindyalov）&伯恩（Bourne），1998，蛋白工程11:739-747））可以比对两个或更多个蛋白结构，并且可以额外利用这些算法的实施来随所感兴趣的结构查询结构数据库以便发现可能的结构同源物（例如，赫尔姆&帕克（Park），2000，生物信息学16:566-567）。

在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。采用了已接受的IUPAC单个字母和三字母的氨基酸缩写。

取代对于一个氨基酸取代，使用了以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此，在位置226上的苏氨酸被丙氨酸取代被表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。多个突变由加号（“+”）分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或者“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411上甘氨酸（G）被精氨酸（R）并且丝氨酸（S）被苯丙氨酸（F）取代。

缺失对于一个氨基酸缺失，使用了以下命名法。原始氨基酸、位置、*。因此，在位置195上的甘氨酸缺失被表示为“Gly195*”或者“G195*”。多个缺失由加号（“+”）分开，例如“Gly195*+Ser411*”或者“G195*+S411*”。

插入对于一个氨基酸插入，使用了以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，在位置195上的甘氨酸之后插入赖氨酸被表示为“Gly195GlyLys”或者“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为“原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2”；等。例如，在位置195上的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为“Gly195GlyLysAla”或者“G195GKA”。

在这类情况下，通过将小写字母添加到在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：

亲本：	变体:
		195	195195a195b
G	G-K-A

多种变化包含多种变化的变体由加号（“+”）分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或者“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195上的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。

不同变化可以在一个位置上引入不同的变化时，这些不同的变化由一个逗号分开，例如“Arg170Tyr，Glu”代表在位置170上的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly，Ala+Arg170Gly，Ala”表示以下变体：

“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、以及“Tyr167Ala+Arg170Ala”。

发明详述

本发明涉及多种分离的葡糖淀粉酶变体，它们至少在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置79相对应的一个位置上包含一个取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性。

变体

本发明还提供了多种葡糖淀粉酶变体，它们至少在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置79相对应的一个位置上包含一个取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性。根据本发明的这些变体具有对蛋白酶降解的减小的敏感度。

在另一个实施例中，该变体选自下组，该组由以下各项组成：

a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65%序列一致性的一种多肽；

b)由在低严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或者(ii)(i)的全长补体杂交的一种多核苷酸编码的一种多肽;

c)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少65%一致性的一种多核苷酸编码的一种多肽；以及

d)具有葡糖淀粉酶活性的SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个片段。

在一个实施例中，该变体与成熟亲本葡糖淀粉酶的氨基酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或者至少99%、但是小于100%的序列一致性。

在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、例如至少96%、至少97%、至少98%、或者至少99%、但小于100%的序列一致性。

在一方面，在本发明的变体中的变化数目是1至20个，例如1至10个和1至5个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10个变化。

在另一方面,该变体是由一种多核苷酸编码，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或者(ii)(i)的全长补体杂交（萨拉布鲁克（Sambrook）等人，1989，分子克隆实验指南（Molecular Cloning:A Laboratory Manual），第二版，冷泉港（Cold Spring Harbor），纽约）。

在另一方面中，该变体由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列一致性的一种多核苷酸编码。

在另一方面，该变体包含在与位置79相对应的一个位置上的一个取代或者由该取代组成。在另一方面，在与位置79相对应的位置上的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或者Val取代。在另一方面，在与位置79相对应的一个位置上的氨基酸被Ala、Gly、Ile、Leu、Ser、Thr、Val、优选Val取代。在另一方面，该变体包含选自SEQ ID NO:2的成熟多肽的K79V、K79A、K79G、K79I、K79L、K79S、K79T的取代或者由该取代组成。在另一方面，该变体包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代K79V或者由该取代组成。在另一个特定实施例中，成熟变体多肽由SEQ ID NO:3组成。

这些变体在一个或多个（例如，若干个）其他位置上可进一步包含一个或多个额外的取代。

这些氨基酸变化可具有一个微小的性质，即不显著影响蛋白的折叠和/或活性的保守性氨基酸取代或者插入；典型地1至30个氨基酸的小缺失；小氨基或羧基末端扩展，例如氨基末端甲硫氨酸残基；高达20至25个残基的一个小接头肽；或者通过改变净电荷或另一种功能来促进纯化的一个小扩展，例如一个多组氨酸束（tract）、一个抗原表位或者一个结合域。

保守取代的实例处于以下组内：碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸以及组氨酸）、酸性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）、极性氨基酸（谷氨酰胺和天冬酰胺）、疏水性氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸以及缬氨酸）、芳族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸以及酪氨酸）、以及小氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及甲硫氨酸）。一般不改变特异性活性的氨基酸取代在本领域中是已知的，并且例如由H·诺伊拉特（H.Neurath）和R·L·希尔（R.L.Hill），1979在蛋白（TheProteins），学术出版社（Academic Press），纽约中进行描述。常见的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。

可替代地，这些氨基酸变化具有改变这些多肽的物理化学特性的这样一种性质。例如，氨基酸变化可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变pH最佳值、等。

在一种多肽中的必需氨基酸可以根据本领域已知的程序来鉴别，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变（坎宁安（Cunningham）&威尔斯（Wells），1989，科学（Science）244:1081-1085）。在后一种技术中，在分子中的每个残基上引入单一丙氨酸突变，并且测试所得的突变型分子的葡糖淀粉酶活性以鉴别对分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿（Hilton）等人，1996，生物化学杂志（J.Biol.Chem.）271:4699-4708。酶的活性位点或其他生物学相互作用还可以通过结构的物理分析来确定，例如通过如核磁共振、结晶学、电子衍射、或者光亲和标记的这类技术结合推定的接触位点氨基酸的突变来确定。参见，例如德沃斯（de Vos）等人，1992，科学255:306-312；史密斯（Smith）等人，1992，分子生物学杂志224:899-904；乌拉达维（Wlodaver）等人，1992，欧洲生化学会联合会快报（FEBS Lett.）309:59-64。必需氨基酸的身份还可以通过与一个相关多肽进行比对来推断。

在一个实施例中，这些变体可以由至少465个氨基酸的催化域组成，例如，在如SEQ ID NO:2所示的亲本葡糖淀粉酶中的氨基酸30至494。

本发明的第二方面涉及一种变体葡糖淀粉酶催化域，该变体葡糖淀粉酶催化域至少在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置79相对应的一个位置上包含一个取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性。

在一个实施例中，该变体葡糖淀粉酶催化域可以选自下组，该组由以下各项组成：

(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸30至494具有至少65%序列一致性的一个催化域；

(b)由在中等严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸88至1482、或者(ii)(i)的全长补体杂交的一种多核苷酸编码的一个催化域；

(c)由与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸88至1482具有至少65%序列一致性的一种多核苷酸编码的一个催化域；以及

(d)在一个或多个（例如，若干个）位置上包含一个取代、缺失和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸30至494的一种变体；

并且其中该催化域具有葡糖淀粉酶活性。

在一个实施例中，该催化域可被认为包含来自SEQ ID NO:2的氨基酸495至506的接头区域。SEQ ID NO:2的氨基酸507至615与一个淀粉结合域相对应。在一个实施例中，根据本发明的催化域被连接至一个接头和一个碳水化合物结合域。

在一个实施例中，该变体葡糖淀粉酶催化域与亲本葡糖淀粉酶催化域的氨基酸序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或者至少99%、但是小于100%的序列一致性。

在另一个实施例中，该变体与包含在SEQ ID NO:2中的催化域（例如SEQ ID NO:2的氨基酸30至494）具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、例如至少96%、至少97%、至少98%、或者至少99%、但小于100%的序列一致性。

在另一方面，该变体葡糖淀粉酶催化域是由一种多核苷酸编码，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的催化域编码序列、或者(ii)(i)或(ii)的全长补体杂交（萨拉布鲁克等人，1989，分子克隆实验指南，第二版，冷泉港，纽约）。

在一个实施例中，该变体与亲本酶相比具有改进的化学稳定性。具体地说，所改进的稳定性是针对由宿主蛋白酶进行切口的改进的稳定性。因此，在一个实施例中，本发明涉及相对于亲本具有一个改进的特性的一种变体，其中这一改进的特性是对蛋白酶降解的减小的敏感性。

亲本葡糖淀粉酶

该亲本葡糖淀粉酶可以是(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65%序列一致性的一种多肽；(b)由在低严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或者(ii)(i)的全长补体杂交的一种多核苷酸编码的一种多肽；或者(c)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少65%序列一致性的一种多核苷酸编码的一种多肽；或者d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的具有葡糖淀粉酶活性的一个片段。

在一方面，该亲本与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或者100%的序列一致性，这一成熟多肽具有葡糖淀粉酶活性。在一方面，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽的不同之处不多于10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。

在另一方面，该亲本包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者由它组成。在另一方面，该亲本包含SEQ ID NO:2的成熟多肽或者由它组成。在另一方面，该亲本包含SEQ ID NO:2的氨基酸30至494或者它组成。

在另一方面，该亲本是SEQ ID NO:2的成熟多肽的、包含至少465个氨基酸残基、例如至少470个氨基酸残基以及至少475个氨基酸残基的一个片段。

在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个等位基因变体。

在另一方面，该亲本是由一种多核苷酸编码，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或者(ii)(i)或(ii)的全长补体杂交（萨拉布鲁克等，1989，分子克隆实验指南，第二版，冷泉港港，纽约）。

可以使用SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列、连同SEQ ID NO:2的多肽或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆编码来自不同属或种类的菌株的亲本的DNA。具体地说，按照标准DNA印迹法程序，这类探针可以用于与所感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便识别并分离其中的对应基因。这类探针可以显著短于整个序列，但是应至少为15个、例如至少25个、至少35个或者至少70个核苷酸长。优选地，该核酸探针是至少100个核苷酸长、例如至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或者至少900个核苷酸长。DNA探针与RNA探针两者都可以使用。这些探针典型地被标记用于检测对应的基因（例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或者抗生物素蛋白）。本发明涵盖了这类探针。

可以针对与上文所述的探针杂交并编码一个亲本的DNA，来筛选由这类其他菌株制备的一个基因组DNA或cDNA库。来自这类其他菌株的基因组或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或者其他分离技术来分离的。来自这些库的DNA或者分离的DNA可以转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的运载体材料上。为了鉴别与SEQ ID NO:1或其子序列杂交的一个克隆或DNA，将该运载体材料用于DNA印迹中。

出于本发明的目的，杂交指示该多核苷酸在非常低至非常高严格条件下与跟以下各项相对应的一个标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)其全长补体；或者(iv)其子序列。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下该核酸探针杂交的分子。

在一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸64至1848。在另一方面，该核酸探针是编码SEQ ID NO:2的多肽、其成熟多肽、或者其片段的一种多核苷酸。在另一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1。

在另一个实施例中，该亲本是由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或者100%的序列一致性。

该多肽可以是其中一个多肽的一个区域融合在另一个多肽的一个区域的N-末端或C-末端的一种杂交多肽。

该亲本可以是其中另一个多肽融合在本发明的多肽的N-末端或者C-末端的一种融合多肽或者可切割的融合多肽。通过将编码另一种多肽的一种多核苷酸融合到本发明的一种多核苷酸上产生了一种融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并且包括连接编码这些多肽的编码序列，这样使得它们同框并且该融合多肽的表达处于相同一个或多个启动子和终止子的控制下。还可以使用其中在翻译之后产生融合多肽的内含肽技术（库珀（Cooper）等人，1993，欧洲分子生物学杂志12:2575-2583；道森（Dawson）等人，1994，科学266:776-779）来构建融合多肽。

一个融合多肽可以在两个多肽之间进一步包含一个切割位点。在分泌该融合蛋白时，该位点被切割从而释放这两个多肽。切割位点的实例包括但不局限于在以下文献中披露的位点：马丁（Martin）等人，2003，工程微生物和生物技术杂志（J.Ind.Microbiol.Biotechnol.）3:568-576；斯瓦蒂娜（Svetina）等人，2000，生物技术杂志（J.Biotechnol.）76:245-251；托斯马森-威尔逊（Rasmussen-Wilson）等人，1997，应用与环境微生物学（Appl.Environ.Microbiol），63:3488-3493；沃德（Ward）等人，1995，生物技术（Biotechnology）13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras）等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿（Eaton）等人，1986，生物化学（Biochemistry）25:505-512；柯林斯瑞思（Collins-Racie）等人，1995，生物技术13:982-987；卡特（Carter）等人，1989，蛋白：结构、功能以及遗传学（Proteins:Structure,Function,and Genetics）6:240-248；以及史蒂文斯（Stevens），2003，世界药物发现（Drug DiscoveryWorld）4:35-48。

在一个具体实施例中，这一杂交多肽包括融合到一个接头和一个碳水化合物结合域上的变体葡糖淀粉酶催化域。

该亲本可以从任何属类的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由一种多核苷酸编码的亲本是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生。在一个方面，该亲本是胞外分泌的。

该亲本可以是一种真菌性葡糖淀粉酶。例如，该亲本可以是一种青霉菌（Penicillium）葡糖淀粉酶，例如像一种草酸青霉菌葡糖淀粉酶。

在另一方面，该亲本是一种草酸青霉菌，例如SEQ ID NO:2的葡糖淀粉酶或其成熟多肽。

应理解，对于上述种类，本发明涵盖了完全和不完全状态以及其他分类学上的等效物，例如无性型，不管它们所已知的种类名称是什么。本领域普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。

这些种类的菌株对于公众来说是易于在多个培养物保藏中心获得的，例如美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection）（ATCC）、德国微生物与菌种保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH）（DSMZ）、荷兰国际微生物菌种保藏中心（CentraalbureauVoor Schimmelcultures）（CBS）、以及美国农业研究菌种保藏中心（AgriculturalResearch Service Patent Culture Collection）、北方地区研究中心（NorthernRegional Research Center）（NRRL）。

该亲本可以从其他来源鉴别并获得，这些其他来源包括从自然界（例如，土壤、堆肥、水等）分离的微生物或者使用上述探针直接从天然材料（例如，土壤、堆肥、水等）获得的DNA样品。用于直接从天然栖息地中分离微生物和DNA的技术在本领域是熟知的。然后可以通过类似地筛选另一种微生物的一个基因组DNA或cDNA库或混合的DNA样品来获得编码一个亲本的一种多核苷酸。一旦已经用一个或多个探针检测到编码一个亲本的一种多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的多种技术来分离或克隆该多核苷酸（参见，例如上文的萨拉布鲁克等人，1989）。

变体的制备

可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组、等。

定点诱变是其中在编码该亲本的一个多核苷酸内的一个或多个限定的位点处引入一个或多个（例如，若干个）突变的一种技术。

通过涉及含有所希望的突变的寡核苷酸引物的使用的PCR可以体外实现定点诱变。还可以通过以下方式在体外进行定点诱变：涉及由一种限制性内切酶在包含编码该亲本的多核苷酸的质粒的一个位点处进行切割的盒式诱变，和随后连接一种包含该多核苷酸中的突变的寡核苷酸。通常，消化该质粒的限制性内切酶与该寡核苷酸是相同的，以允许该质粒的粘性末端与插入片段彼此连接。参见，例如，谢雷尔（Scherer）&戴维斯（Davis），1979，美国国家科学院院刊（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）76:4949-4955；以及巴顿（Barton）等人，1990，核酸研究，18:7349-4966。

还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见，例如美国专利申请公开号2004/0171154；Storici（斯托西）等人，2001，自然：生物技术（NatureBiotechnol.）19:773-776；卡伦（Kren）等人，1998，自然：医学（Nat.Med.）4:285-290；以及卡利萨诺（Calissano）&马奇诺（Macino），1996，真菌遗传学通讯（Fungal Genet.Newslett.）43:15-16。

在本发明中，可以使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的很多可商购的试剂盒。

合成基因构建需要体外合成一种设计的多核苷酸分子以编码一种所感兴趣的多肽。可以利用多种技术进行基因合成，这些技术例如由田（Tian）等人（2004，自然432:1050-1054）描述的基于多重微芯片的技术以及其中在光可编程的微流体芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单一或多种氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，该相关的筛选程序例如由瑞德哈尔-奥尔森（Reidhaar-Olson）&萨奥尔（Sauer），1988，科学241:53-57；鲍依（Bowie）&萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊86:2152-2156；WO95/17413；或者WO95/22625所描述的那些。可以使用的其他方法包括：易错PCR、噬菌体展示（例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204)以及定区诱变（德比希尔（Derbyshire等人，1986，基因（Gene）46:145；内尔（Ner）等人，1988,DNA7:127））。

诱变/改组方法可以与高通量的自动化筛选方法进行组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变的多肽的活性（内斯（Ness）等人，1999，自然：生物技术（Nature Biotechnology）17:893-896）。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以从这些宿主细胞中回收并使用本领域的标准方法来快速测序。这些方法允许快速确定单独的氨基酸残基在多肽中的重要性。

通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是，利用合成的多核苷酸片段的一个过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来放大，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR放大。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的变体的分离的多核苷酸。

核酸构建体

本发明还涉及包含编码本发明的一种变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的一种多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在一种适合的宿主细胞中的表达。

可以按多种方式来操纵该多核苷酸以提供一种变体的表达。取决于表达载体，在该多核苷酸插入到该载体中之前，该多核苷酸的操纵可以是令人希望的或者需要的。用于利用重组DNA方法来修饰多核苷酸的技术在本领域是熟知的。

控制序列可以是一个启动子，即由一个宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的一种多核苷酸。启动子包含介导该变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞内示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型启动子、截短型启动子以及杂交型启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源亦或异源的细胞外或细胞内多肽的基因中获得。

用于指导本发明的核酸构建体在一个细菌宿主细胞中的转录的适合的启动子的实例是从以下获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）α-淀粉酶基因（amyQ）、地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）α-淀粉酶基因（amyL）、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因（penP）、嗜热脂肪芽胞杆菌（Bacillus stearothermophilus）麦芽糖淀粉酶基因（amyM）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）果聚糖蔗糖酶基因（sacB）、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）cryIIIA基因（阿盖塞（Agaisse）&勒尔克吕（Lereclus），1994，分子微生物学（MolecularMicrobiology）13:97-107）、大肠杆菌乳糖操纵子、大肠杆菌trc启动子（埃贡（Egon）等人，1988，基因69:301-315）、天蓝色链霉菌（Streptomycescoelicolor）琼脂糖酶基因（dagA）、以及原核β-内酰胺酶基因（维拉-卡马洛夫（Villa-Kamaroff）等人，1978，美国国家科学院院刊75:3727-3731）、以及tac启动子（德波尔（DeBoer）等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25）。另外的启动子描述在“来自重组细菌的有用蛋白（Useful proteins fromrecombinant bacteria）”（见吉尔伯特（Gilbert）等人，1980，科学美国人（Scientific American）242:74-94）以及上文的萨拉布鲁克等人，1989中。串联启动子的实例披露在WO99/43835中。

用于指导本发明的核酸构建体在一个丝状真菌宿主细胞中的转录的适合的启动子的实例是从以下各项的基因中获得的启动子：构巢曲霉（Aspergillusnidulans）乙酰胺酶、黑曲霉（Aspergillus niger）中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉（Aspergillus awamori）葡糖淀粉酶（glaA）、米曲霉（Aspergillus oryzae）TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）胰蛋白酶样蛋白酶（WO96/00787）、镰孢霉（Fusarium venenatum）淀粉葡糖苷酶（WO00/56900）、镰孢霉达莉亚（Fusarium venenatum Daria）（WO00/56900）、镰孢霉奎恩（Fusarium venenatum Quinn）（WO00/56900）、米黑根毛霉（Rhizomucormiehei）脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉（Trichoderma reesei）β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶；以及NA2-tpi启动子（来自曲霉菌中性α-淀粉酶基因的一个修饰的启动子，在该基因中未翻译的前导子已被来自曲霉菌磷酸丙糖异构酶基因的未翻译的前导子替换；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，在该基因中未翻译的前导子已经被来自一种构巢曲霉或米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的一个未翻译的前导子替换）；以及其突变型启动子、截短型启动子和杂交型启动子。

在一个酵母宿主中，有用的启动子是从以下各项的基因中获得：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）烯醇酶（ENO-1）、酿酒酵母半乳糖激酶（GAL1）、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ADH1、ADH2/GAP）、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶（TPI）、酿酒酵母金属硫蛋白（CUP1）以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯（Romanos）等人，1992，酵母杂志（Yeast）8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。

用于细菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：克劳氏芽孢杆菌（Bacillus clausii）碱性蛋白酶（aprH）、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶（amyL）、以及大肠杆菌（Escherichia coli）核糖体RNA（rrnB）。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C（CYC1）、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。是由上文的罗马诺斯等人（1992）描述了酵母宿主细胞的其他有用的终止子。

该控制序列还可以是一个基因的启动子下游和编码序列上游的、增加该基因表达的一个mRNA稳定区域。

适用的mRNA稳定区域的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因（WO94/25612）和枯草芽孢杆菌SP82基因（化（Hue）等人，1995，细菌学杂志（Journal of Bacteriology）177:3465-3471）。

控制序列还可以是一个前导子，即对于通过宿主细胞来翻译很重要的mRNA的一个未翻译区域。前导序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导子。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从以下各项的基因中获得的：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶。

用于酵母宿主细胞的适合的前导子是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母烯醇酶（ENO-1）、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子、以及酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ADH2/GAP）。

该控制序列还可以是一种多腺苷酸化序列，即可操作地连接至该变体编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的一个信号的一种序列。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何多腺苷酸化序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。

郭（Guo）&谢尔曼（Sherman），1995，分子与细胞生物学杂志（Mol.CellularBiol.）15:5983-5990描述了酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列。

控制序列还可以是编码连接至一个变体的N-末端上的一个信号肽并指导该变体进入细胞的分泌途径的一个信号肽编码区域。该多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包含在翻译读码框内与编码该变体的编码序列的区段天然地连接的一个信号肽编码序列。可替代地，该编码序列的5’-端可以包含对该编码序列是外源的一种信号肽编码序列。在该编码序列不天然地包含一个信号肽编码序列时，可能需要一种外源信号肽编码序列。可替代地，一种外源信号肽编码序列可简单地替换该天然的信号肽编码序列以便提高该变体的分泌。然而，可以使用指导所表达的变体进入宿主细胞的分泌途径中的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因中获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌NCIB11837麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽胞杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽胞杆菌中性蛋白酶（nprT、nprS、nprM）、以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳（Simonen）&帕尔瓦（Palva），1993，微生物学评论（Microbiological Reviews）57:109-137描述了另外的信号肽。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因中获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉（Humicola insolens）纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉（Humicola lanuginosa）脂肪酶、以及米黑根毛霉（Rhizomucormiehei）天冬氨酸蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。上文的罗马诺斯等人（1992）描述了其他有用的信号肽编码序列。

控制序列还可以是编码位于一个变体的N-末端的一种前肽的一种前肽编码序列。生成的多肽被称为前酶（proenzyme）或多肽原（或者在一些情况下被称为酶原（zymogen））。一种多肽原一般是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。该前肽编码序列可以从以下各项的基因中获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶（aprE）、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶（nprT）、嗜热毁丝菌（Myceliophthora thermophila）漆酶（WO95/33836）、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。

还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调控该变体的表达的调控序列。调控系统的实例是响应于一种化学或物理刺激而引起该基因的表达开启或关闭的那些，包括一种调控化合物的存在。在原核系统中的调控系统包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调控序列的其他实例是允许基因放大的那些。在真核系统中，这些调控序列包括在氨甲蝶呤存在下进行放大的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属进行放大的金属硫蛋白酶基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调控序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以接合在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包含一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，通过将该多核苷酸或者包含该多核苷酸的一种核酸构建体插入到用于表达的一个适当的载体中可以表达该多核苷酸。在产生该表达载体过程中，将该编码序列定位在该载体中，这样使得该编码序列与用于表达的适当的控制序列可操作地连接。

这一重组表达载体可以是可便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体（例如，一种质粒或病毒）。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性或闭合环状质粒。

该载体可以是一种自主复制载体，即，作为一种染色体外实体存在的一种载体，该载体的复制与染色体复制无关，例如一种质粒、一种染色体外元件、一种微型染色体、或一种人工染色体。该载体可以包含任何构件用于确保自我复制。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时整合到基因组中并且与已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒、或两个或更多个载体或质粒（这些载体或质粒共同包含了有待引入到宿主细胞的基因组之中的全部DNA）、或一个转座子。

该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个可选择标记。一个可选择标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。

细菌可选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或者赋予抗生素抗性（例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性）的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不局限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在一个丝状真菌宿主细胞中使用的可选择标记包括但不局限于amdS（乙酰胺酶）、argB（鸟氨酸氨甲酰基转移酶）、bar（草胺膦乙酰转移酶）、hph（潮霉素磷酸转移酶）、niaD（硝酸还原酶）、pyrG（乳清苷-5’-磷酸脱羧酶）、sC（硫酸腺苷基转移酶）、以及trpC（邻氨基苯甲酸合成酶）、连同其等效物。优选在曲霉菌细胞中使用的是构巢曲霉或米曲菌amdS和pyrG基因以及解潮性链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）bar基因。

该载体优选包含允许将该载体整合到宿主细胞基因组中或者该载体在细胞中不依赖该基因组而自主复制的一个或多个元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该变体的多核苷酸序列或者通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组在一个或多个染色体内的一个或多个精确位置处整合到该宿主细胞的基因组中的额外的多核苷酸。为了增加在一个精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，通过非同源重组可以将该载体整合到该宿主细胞的基因组内。

对于自主复制，该载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞内进行自主复制的复制起点。复制起点可以是在一个细胞内起作用的介导自主复制的任何质粒复制基因。术语“复制起点”或“质粒复制基因”意指使一个质粒或载体能够在体内复制的一种多核苷酸。

细菌的复制起点的实例是允许在大肠杆菌内进行复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184以及允许在芽孢杆菌内进行复制的pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

用于在一个酵母宿主细胞内使用的复制起点的实例是2微米的复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1（格姆斯（Gems）等人，1991，基因98:61-67；卡伦（Cullen）等人，1987，核酸研究15:9163-9175；WO00/24883）。根据WO00/24883中披露的方法可以实现AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到一个宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个额外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个可放大的可选择标记基因与该多核苷酸可以获得增加的多核苷酸拷贝数目，其中通过在适当可选择的试剂存在下培养细胞可以选择包含放大的可选择标记基因拷贝和由此额外的多核苷酸拷贝的细胞。

用于连接上文所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序对于本领域普通技术人员来说是熟知的（参见，例如上文的萨拉布鲁克等人，1989）。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的一种多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包含一种多核苷酸的一个构建体或载体引入到一个宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为一个染色体整合体或作为一个自主复制的染色体外载体，如早先所述。术语“宿主细胞”涵盖了由于在复制过程中存在的突变而与亲本细胞不相同的亲本细胞的任何子代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该变体的基因及其来源。

宿主细胞可以是在重组产生一个变体中有用的任何细胞，例如一个原核细胞或一个真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何格兰氏阳性细菌或格兰氏阴性细菌。格兰氏阳性细菌包括但不局限于芽孢杆菌、梭菌（Clostridium）、肠球菌（Enterococcus）、地芽孢杆菌（Geobacillus）、乳酸杆菌（Lactobacillus）、乳球菌（Lactococcus）、大洋芽孢杆菌（Oceanobacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、链球菌（Streptococcus）、以及链霉菌（Streptomyces）。格兰氏阴性细菌包括但不局限于弯曲杆菌（Campylobacter）、大肠杆菌、黄杆菌（Flavobacterium）、梭杆菌（Fusobacterium）、螺杆菌（Helicobacter）、泥杆菌（Ilyobacter）、奈瑟氏菌（Neisseria）、假单胞菌（Pseudomonas）、沙门氏菌（Salmonella）、以及脲原体（Ureaplasma）。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不局限于嗜碱芽孢杆菌（Bacillus alkalophilus）、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌（Bacillus brevis）、环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）、克劳氏芽孢杆菌（Bacillus clausii）、凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）、坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）、灿烂芽胞杆菌（Bacillus lautus）、迟缓芽孢杆菌（Bacillus lentus）、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、短小芽胞杆菌（Bacillus pumilus）、嗜热脂肪芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌细胞，包括但不局限于似马链球菌（Streptococcus equisimilis）、酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）、乳房链球菌（Streptococcus uberis）、以及马链球兽瘟亚种（Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus）细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌细胞，包括但不局限于产色链霉菌（Streptomyces achromogenes）、阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌（Streptomyces griseus）、以及变铅青链霉菌（Streptomyceslividans）细胞。

通过原生质体转化（参见例如，常（Chang）&科恩（Cohen），1979，分子遗传学与基因组（Mol.Gen.Genet.）168:111-115）、感受态细胞转化（参见，例如，杨格（Young）&斯皮宰曾（Spizizen），1961，细菌学杂志（J.Bacteriol.）81:823-829；或者杜博楠（Dubnau）&大卫多夫-阿贝尔森（Davidoff-Abelson），1971，分子生物学杂志56:209-221）、电穿孔（参见，例如，茂川（Shigekawa）&道尔（Dower），1988，生物技术（Biotechniques）6:742-751）、或者轭合（参见，例如凯勒（Koehler）&索恩（Thorne），1987，细菌学杂志169:5271-5278）可以实现将DNA引入到一个芽孢杆菌细胞之中。通过原生质体转化（参见例如，哈那汗（Hanahan），1983，分子生物学杂志166:557-580）或者电穿孔（参见，例如，道尔等人，1988，核酸研究16:6127-6145）可以实现将DNA引入到一个大肠杆菌细胞之中。通过原生质体转化/电穿孔（参见例如，宫(Gong)等人，2004，微生物学报（Folia Microbiol.）（布拉格（Praha））49:399-405）、轭合（参见，例如，马佐迪耶（Mazodier）等人，1989，细菌学杂志171:3583-3585）、或转导（参见，例如，博科思等人，2001，美国国家科学院院刊98:6289-6294）可以实现将DNA引入到一个链霉菌细胞中。通过电穿孔（参见，例如，崔（Choi）等人，2006，微生物学方法杂志（J.Microbiol.Methods）64:391-397）、或者轭合（参见，例如，皮内多（Pinedo）&斯麦茨（Smets），2005，应用与环境微生物学71:51-57）可以实现将DNA引入到一个假单胞菌细胞之中。通过天然感受态（参见例如，佩里（Perry）&和仓光（Kuramitsu），1981，感染与免疫（Infect.Immun.）32:1295-1297）、原生质体转化（参见，例如，卡特（Catt）&朱力克（Jollick），1991，微体生物（Microbios）68:189-207）、电穿孔（参见，例如，巴克利（Buckley）等人，1999，应用与环境微生物学65:3800-3804）或者轭合（参见，例如，克拉维尔（Clewell），1981，生物学评论（Microbiol.Rev.）45:409-436）可以实现将DNA引入到链球菌之中。然而，可以使用在本领域已知的任何方法将DNA引入到一个宿主细胞中。

该宿主细胞还可以是一个真核细胞，例如一个哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、或真菌细胞。

该宿主细胞可以是一种真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）、以及接合菌门（Zygomycota）、连同卵菌门（Oomycota）和全部有丝分裂孢子真菌（如由霍克斯沃思（Hawksworth）等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典（Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi），第8版，1995，国际应用生物科学中心（CAB International），大学出版社（University Press），英国剑桥（Cambridge,UK）中进行定义的）。

该真菌宿主细胞可以是一种酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子囊孢子酵母（ascosporogenous yeast）（内孢霉目（Endomycetale））、担子孢子酵母（basidiosporogenous yeast）、以及属于不完全菌类（芽生菌（Blastomycete））的酵母。由于酵母的分类在将来可能有变化，出于本发明的目的，酵母应如酵母生物学和活动性（Biology and Activities of Yeast）（斯金纳（Skinner）、帕斯莫尔（Passmore）、以及达文波特（Davenport）编辑，应用细菌学学会讨论会（Soc.App.Bacteriol.Symposium）系列号9，1980）所述地进行定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母（Candida）、汉逊酵母（Hansenula）、克鲁维酵母（Kluyveromyces）、毕赤酵母（Pichia）、糖酵母（Saccharomyces）、裂殖酵母（Schizosaccharomyces）、或者亚罗酵母（Yarrowia）细胞，例如一种乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、卡尔斯伯酵母（Saccharomycescarlsbergensis）、酿酒酵母、糖化酵母（Saccharomyces diastaticus）、道格拉氏酵母（Saccharomyces douglasii）、克鲁维氏酵母（Saccharomyces kluyveri）、诺地酵母（Saccharomyces norbensis）、卵形酵母（Saccharomyces oviformis）、或解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）细胞。

该真菌宿主细胞可以是一种丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括所有丝状形式的细分真菌门和卵菌门（如由上文的霍克斯沃思等人，1995所定义的）。丝状真菌的特征一般在于由甲壳素、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖组成的一个菌丝体壁。营养生长是通过菌丝伸长来进行的并且碳分解代谢是专性需氧的。与之相比，酵母（例如酿酒酵母）的营养生长是通过单细胞菌体的出芽而进行的、并且碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢属（Acremonium）、曲霉菌属、短梗霉属（Aureobasidium）、烟管菌属（Bjerkandera）、拟蜡菌属（Ceriporiopsis）、金孢子菌属（Chrysosporium）、鬼伞属（Coprinus）、革盖菌属（Coriolus）、隐球菌属（Cryptococcus）、网孢菌属（Filibasidium）、镰刀菌属（Fusarium）、腐质霉属（Humicola）、稻瘟病菌属（Magnaporthe）、毛霉菌（Mucor）、毁丝霉属（Myceliophthora）、新美鞭菌属（Neocallimastix）、脉孢菌属（Neurospora）、拟青霉属（Paecilomyces）、青霉菌属（Penicillium）、平革菌属（Phanerochaete）、白腐菌属（Phlebia）、梨囊鞭菌属（Piromyces）、侧耳属（Pleurotus）、裂褶菌属（Schizophyllum）、踝节菌属（Talaromyces）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）、梭孢壳属（Thielavia）、弯颈霉属（Tolypocladium）、栓菌属（Trametes）、或木霉属（Trichoderma）细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉（Aspergillus foetidus）、烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）、日本曲霉（Aspergillus japonicus）、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、烟管菌（Bjerkandera adusta）、干拟蜡菌（Ceriporiopsisaneirina）、Ceriporiopsis caregiea、浅黄拟蜡孔菌（Ceriporiopsis gilvescens）、（Ceriporiopsis pannocinta）、（Ceriporiopsis rivulosa）、（Ceriporiopsis subrufa）、虫拟蜡菌（Ceriporiopsis subvermispora）、（Chrysosporium inops）、嗜角质金孢子菌（Chrysosporium keratinophilum）、（Chrysosporium lucknowense）、（Chrysosporium merdarium）、毡金孢子菌（Chrysosporium pannicola）、（Chrysosporium queenslandicum）、热带金孢子菌（Chrysosporium tropicum）、（Chrysosporium zonatum）、灰盖鬼伞（Coprinus cinereus）、毛云芝菌（Coriolushirsutus）、杆孢状镰刀菌（Fusarium bactridioides）、纹镰刀菌（Fusariumcerealis）、克鲁克威尔镰孢菌（Fusarium crookwellense）、黄色镰刀菌（Fusariumculmorum）、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、禾镰刀菌（Fusariumgraminum）、异孢镰刀菌（Fusarium heterosporum）、合欢木镰刀菌（Fusariumnegundi）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、网状镰刀菌（Fusariumreticulatum）、粉红镰刀菌（Fusarium roseum）、接骨木镰刀菌（Fusariumsambucinum）、肤色镰刀菌（Fusarium sarcochroum）、拟分枝孢镰刀菌（Fusarium sporotrichioides）、硫色镰刀菌（Fusarium sulphureum）、囊珠镰刀菌（Fusarium torulosum）、拟丝孢镰刀菌（Fusarium trichothecioides）、镰孢霉（Fusarium venenatum）、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉（Mucor miehei）、嗜热毁丝菌（Myceliophthora thermophila）、粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）、产紫青霉菌（Penicillium purpurogenum）、黄孢原毛平革菌（Phanerochaetechrysosporium）、射脉侧菌（Phlebia radiata）、白腐菌（Pleurotus eryngii）、太瑞斯梭孢壳霉（Thielavia terrestris）、长绒毛栓菌（Trametes villosa）、彩绒栓菌（Trametes versicolor）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、康宁木霉（Trichoderma koningii）、长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）、里氏木霉、或者绿色木霉（Trichoderma viride）。

可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化以及本身已知的一种方式进行细胞壁再生的一个过程来转化真菌细胞。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序被描述在EP238023；耶尔顿（Yelton）等人，1984，美国国家科学院院刊81:1470-1474以及克里斯坦森（Christensen）等人，1988，生物技术（Bio/Technology）6:1419-1422中。马拉迪耶（Malardier）等人，1989，基因78:147-156和WO96/00787描述了用于转化镰刀菌种类的适合的方法。使用贝克尔（Becker）&瓜伦特（Guarente），在阿贝尔森·J·N（Abelson,J.N.）&西蒙·M·I（Simon,M.I.）编辑，酵母遗传学和分子生物学指南（Guide to YeastGenetics and Molecular Biology），酶学方法（Methods in Enzymology），第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司（Academic Press,Inc）纽约；伊托（Ito）等人，1983，细菌性杂志153:163；以及何妮诺（Hinnen）等人，1978，美国国家科学院院刊75:1920描述的程序来转化酵母。

产生方法

本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适合于该变体的表达的条件下培养本发明的一种宿主细胞；并且(b)回收该变体。

使用本领域已知的方法在适合于产生该变体的一种营养培养基中培养这些宿主细胞。例如，可以通过在一种适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条件下进行摇瓶培养、或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵（包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵）来培养该细胞。使用本领域已知的程序，在包含碳源和氮源以及无机盐的一种合适的营养培养基中进行培养。合适的培养基从商业供应商处可获得或者可根据公开的组成（例如，在美国典型培养物保藏中心目录中）来制备。如果该变体被分泌到该营养培养基中，则该变体可直接从该培养基中回收。如果该变体没有分泌，则它可从细胞裂解液中回收。

使用本领域已知的对变体特异的多种方法可以检测该变体。这些检测方法包括但不局限于特异性抗体的使用、一种酶产物的形成、或者一种酶底物的消失。例如，可以使用一种酶测定来确定该变体的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收该变体，这些常规程序包括但不局限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。

可以通过本领域已知的多种程序来纯化该变体以获得大致上纯的变体，这些程序包括但不局限于色谱法（例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及大小排除色谱）、电泳程序（例如，制备型等电点聚焦）、有差别的溶解（例如，硫酸铵沉淀）、SDS-PAGE、或者萃取（参见，例如蛋白纯化（Protein Purification），詹森（Janson）&赖登（Ryden）编辑，VCH出版社（VCH Publishers），纽约，1989）。

在一个替代方面，没有回收该变体，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的一个来源。

组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。优选地，该组合物还包含一种运载体和/或一种赋形剂。更优选地，这些组合物富含这样一种多肽。术语“富含”指示该组合物的葡糖淀粉酶活性已经增加，例如，以至少1.1的一个富集因子。优选地，配制这些组合物以提供所希望的特性，例如浅颜色、低气味、以及可接受的储存稳定性。

该组合物可以包含作为主要酶组分的本发明的一种多肽，例如一种单组分组合物。可替代地，该组合物可以包含多种酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化氢酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。

在一个具体的实施例中，该组合物包含一种α淀粉酶和根据本发明的多肽。

例如可以通过属于以下属类的一种微生物来产生额外的一种或多种酶：曲霉属，优选棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）、泡盛曲霉、烟曲霉菌、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉；镰刀菌属，优选杆孢状镰刀菌、纹镰刀菌、克鲁克威尔镰孢菌、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾镰刀菌、异孢镰刀菌、合欢木镰刀菌、尖孢镰刀菌、网状镰刀菌、粉红镰刀菌、接骨木镰刀菌、肤色镰刀菌、硫色镰刀菌、囊珠镰刀菌、拟丝孢镰刀菌、或镰孢霉；腐质霉属，优选特异腐质霉或柔毛腐质霉；或者木霉属，优选哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉。

可以根据本领域已知的方法来制备多肽组合物，并且这些多肽组合物可以处于液体或干燥组合物的形式。例如，多肽组合物可处于颗粒或微粒的形式。可以根据本领域已知的方法使包含在该组合物中的多肽稳定。

以下给出了本发明的多肽或多肽组合物的优选用途的实例。可以基于本领域已知的方法来确定本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的多种其他条件。

葡糖淀粉酶与α-淀粉酶的组合

根据本发明的这一方面，本发明的一种葡糖淀粉酶可以与一种α-淀粉酶组合。优选地，酸性α-淀粉酶与葡糖淀粉酶之间的比率是在0.05AFAU/AGU与5.0AFAU/AGU之间。更优选地，酸性α-淀粉酶活性与葡糖淀粉酶活性之间的比率是至少0.10、至少0.15、至少0.20、至少0.25、至少0.30、至少0.35、至少0.40、至少0.45、至少0.50、至少0.55、至少0.60、至少0.65、至少0.70、至少0.75、至少0.80、至少0.85、至少0.90、至少0.95、至少1.00、至少1.05、至少1.10、至少1.20、至少1.30、至少1.40、至少1.50、至少1.60、至少1.70、至少1.80、至少1.85、或甚至至少1.90AFAU/AGU。然而，酸性α-淀粉酶活性与葡糖淀粉酶活性之间的比率应优选小于4.50、小于4.00、小于3.50、小于3.00、小于2.50、或甚至小于2.25AFAU/AGU。

以上组合物适合在液化、糖化、和/或发酵过程中使用，优选在淀粉转化中使用，尤其是用于产生糖浆和发酵产品，例如乙醇。

以下给出了本发明的多肽组合物的优选用途的实例。可以基于本领域已知的方法来确定本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的多种其他条件。

用途

本发明还针对本发明的一种多肽在一个液化过程、一个糖化过程、和/或一个发酵过程中的用途。可以在一个单个过程中，例如在一个液化过程、一个糖化过程、或一个发酵过程中使用该多肽。也可以在多个过程的一个组合中、例如在一个液化和糖化过程、在一个液化和发酵过程中、或者在一个糖化和发酵过程中（优选是与淀粉转化有关）使用该多肽。

在本发明的一个优选方面，这一液化、糖化、和/或发酵过程包括连续或同时地进行的液化和糖化过程。

在常规的酶液化过程中，添加热稳定的α-淀粉酶并且将长链淀粉降解成支链且线性的更短单位（麦芽糊精），但是没有添加葡糖淀粉酶。

当将本发明的葡糖淀粉酶（可能结合α-淀粉酶）应用于液化和/或糖化过程、尤其是一个同时的液化和糖化过程中时，可以在更高的温度下进行该过程。通过在更高的温度下进行这一液化和/或糖化过程，可以在更短的时段内进行该过程，或者可替代地可以使用更低的酶剂量来进行该过程。此外，当在更高温度下进行液化和/或糖化过程时，微生物污染的风险减小。

含淀粉的材料的转化

本发明提供了本发明的葡糖淀粉酶用于从淀粉中产生葡萄糖和类似物的用途。总体上，该方法包括单独亦或在一种α-淀粉酶存在下使用本发明的葡糖淀粉酶部分地水解前体淀粉的步骤。

本发明的葡糖淀粉酶还可以结合仅水解在包含至少四个葡糖残基的分子中的α-(1,6)-糖苷键的一种酶来使用。

在另一个方面，本发明涉及本发明的一种葡糖淀粉酶在淀粉转化中的用途。此外，可以在包括一个连续的糖化过程的一个连续淀粉转化过程中使用本发明的葡糖淀粉酶。

糖浆、饮料和/或发酵产品的产生

本发明的葡糖淀粉酶的用途包括将淀粉转化成例如糖浆饮料和/或一种发酵产品（包括乙醇）。

本发明还提供了一种使用本发明的葡糖淀粉酶用于从含淀粉的材料中产生糖浆（例如葡萄糖）和类似物的过程。在“含淀粉的材料”部分中例证说明了适合的起始材料。总体上，该过程包括以下步骤：在本发明的葡糖淀粉酶单独亦或结合α-淀粉酶的存在下部分或完全水解含淀粉的材料（液化和/或糖化）以从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放葡萄糖。

本发明的葡糖淀粉酶还可以按固定的形式使用。这适合且经常用于产生特种糖浆（例如麦芽糖糖浆）连同用在与果糖糖浆（例如，高果糖糖浆（HFS））的产生有关的寡糖的残液流中。

本发明的葡糖淀粉酶还可以用于产生不同的饮料，例如但不局限于番茄、马铃薯、甘薯、甜薯、和/或南瓜的饮料。

发酵产品

术语“发酵产品”意指通过包括使用一种发酵有机体的一个发酵过程的过程产生的产品。根据本发明考虑的发酵产品包括醇类（例如，阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、丙三醇（glycerol）、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇[丙二醇]、丁二醇、甘油（glycerin）、山梨醇、以及木糖醇）；有机酸类（例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、丁二酸、以及木糖酸）；酮类（例如，丙酮）；氨基酸类（例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、以及苏氨酸）；一种烷烃（例如，戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、以及十二烷）；一种环烷烃（例如，环戊烷、环己烷、环庚烷、以及环辛烷）；一种烯烃（例如，戊烯、己烯、庚烯、以及辛烯）；多种气体（例如，甲烷、氢气（H₂）、二氧化碳（CO₂）、以及一氧化碳（CO））；抗生素类（例如，盘尼西林和四环素）；酶类；维生素类（例如，核黄素、B₁₂、β-胡萝卜素）以及激素类。在一个优选方面，发酵产品是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇，即适于饮用的浓酒精（neutral spirits）；或者在可食用酒精工业（例如啤酒和白酒）、乳制品工业（例如，发酵的乳制品）、皮革工业、以及烟草工业中使用的工业乙醇或产品。优选的啤酒类型包括爱尔啤酒（ale）、烈性黑啤酒（stout）、波特啤酒（porter）、拉格啤酒（lager）、苦啤酒（bitter）、麦芽酒（maltliquor）、低麦芽啤酒（happoushu）、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒、或清淡啤酒。优选使用的发酵过程包括本领域熟知的醇发酵过程。优选的发酵过程是本领域熟知的厌氧发酵过程。

酿造

在酿造工业中可以使用本发明的葡糖淀粉酶。按本领域普通技术人员可容易确定的有效量来添加本发明的葡糖淀粉酶。

液化、糖化和/或发酵产品的产生

在这个方面，本发明涉及一种用于由含淀粉的材料产生一种液化、糖化和/或发酵产品的过程，该过程包括以下步骤：用本发明的一种多肽处理含淀粉的材料。

在以下“含淀粉的材料”部分中列出了多种适合的含淀粉的起始材料。在以下“酶”部分中列出了多种所考虑的酶。优选地，本发明的过程包括用单独的或与一种α-淀粉酶一起的本发明的一种多肽来处理含淀粉的材料。

本发明的液化和/或糖化产品是糊精或低分子量糖（例如，DP1-3）。在这一液化过程中，通过添加本发明的一种葡糖淀粉酶提高了淀粉到葡萄糖、糊精和/或低分子量糖的转化。发酵之后，这一发酵产品（例如乙醇）可以任选例如通过蒸馏来回收。优选在酵母（优选酵母属的一种菌株）存在下进行发酵。在以下“发酵有机体”部分中列出了多种适合的发酵有机体。

用于由含糊化淀粉的材料产生发酵产品的过程

在这个方面，本发明涉及一种用于由含淀粉的材料产生发酵产品（尤其是乙醇）的过程，该过程包括一个液化步骤和连续或同时进行的糖化和发酵步骤。

本发明涉及一种用于由含淀粉的材料产生发酵产品的过程，该过程包括以下步骤：

(a)使用一种α-淀粉酶，使含淀粉的材料液化；

(b)使用一种葡糖淀粉酶使步骤(a)中获得的液化材料糖化；并且

(c)使用一种发酵有机体来发酵糖化的材料。

优选，步骤(a)还包括使用本发明的葡糖淀粉酶。在一个实施例中，在步骤(b)中还存在/添加了本发明的葡糖淀粉酶。

优选地，在一个液化过程中用本发明的一种多肽处理含淀粉的材料的步骤是在一种α淀粉酶存在下进行的，并且是在40℃与100℃之间、更优选在80℃与90℃之间、例如85℃的温度下以及在pH2.0与pH7.0之间、更优选在pH4.0与pH6.0之间、甚至更优选在pH4.5与pH5.0之间、例如像pH4.8下进行的。

发酵之后，这一发酵产品（例如尤其是乙醇）可任选地例如通过蒸馏来回收。在以下“含淀粉的材料”部分中列出了多种适合的含淀粉的起始材料。在以下“酶”部分中列出了多种所考虑的酶。优选在一种α淀粉酶存在下进行液化。优选在酵母（优选酵母属的一种菌株）存在下进行发酵。在以下“发酵有机体”部分中列出了多种适合的发酵有机体。在多个优选实施例中，连续或同时进行步骤(b)和(c)（即，作为SSF过程）。

在一个具体实施例中，本发明的过程在步骤(a)之前进一步包括以下步骤：

x)优选通过碾磨来减小含淀粉的材料的粒径；并且

y)形成包含这一含淀粉的材料和水的一种浆料。

该水性浆料可以包含从10wt%至40wt%、优选25wt%至35wt%的含淀粉的材料。将该浆料加热至糊化温度以上，并且可添加α-淀粉酶、优选细菌和/或酸性真菌α淀粉酶以开始液化（稀薄化（thinning））。在一个实施例中，在本发明的步骤(a)中经受一种α-淀粉酶之前可以喷气蒸煮该浆料以进一步使该浆料糊化。

更确切地说，液化可作为一个三步热浆料过程进行。将该浆料加热至60℃-95℃之间、优选80℃-85℃之间，并且添加α-淀粉酶以开始液化（稀薄化）。然后，可以在95℃-140℃、优选105℃-125℃之间的温度下喷气蒸煮该浆料，持续1-15分钟、优选持续3-10分钟、尤其是约5分钟。将该浆料蒸煮至60℃-95℃并且添加更多的α-淀粉酶以完成水解（二级液化）。通常在pH4.5-pH6.5、特别是在pH5-pH6之间进行液化过程。碾磨和液化的全谷粒被称为醪液。

可使用本领域熟知的条件来进行步骤(b)中的糖化。例如，整个糖化过程可持续高达从约24小时至约72小时，然而，通常在30℃-65℃之间、典型地约60℃的温度下仅典型地进行40-90分钟的预先糖化，随后在一个连续的糖化和发酵过程（SSF过程）的发酵过程中完成糖化。糖化典型地在从30℃-65℃、典型地约60℃的温度下并在pH4与pH5之间、一般在约pH4.5下进行。

在发酵产品（尤其是乙醇）生产中最广泛使用的过程是同时糖化和发酵（SSF）过程，其中没有糖化的保持阶段（holding stage），这意味着发酵有机体（例如酵母）和一种或多种酶可一起添加。SSF可典型地是在25℃与40℃之间、例如29℃与35℃之间、例如30℃与34℃之间、例如约32℃的温度下进行。根据本发明，在发酵过程中可调高或调低温度。

根据本发明，发酵步骤(c)包括但不局限于用于产生以下各项的发酵过程：醇类（例如，乙醇、甲醇、丁醇）；有机酸类（例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸）；酮类（例如，丙酮）；氨基酸类（例如，谷氨酸）；多种气体（例如，H₂和CO₂）；抗生素（例如，盘尼西林和四环素）；酶类；维生素类（例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素）；以及激素类。优选的发酵过程包括如本领域熟知的醇发酵过程。优选的发酵过程是如本领域熟知的厌氧发酵过程。

用于由含未糊化淀粉的材料产生发酵产品的过程

在这个方面，本发明涉及用于由含淀粉的材料产生发酵产品的过程，其中这一含淀粉的材料没有进行糊化（即，未蒸煮的含淀粉的材料）。根据本发明，可以在未对具有含淀粉的材料的水性浆料进行液化的情况下产生所希望的发酵产品（例如乙醇）。在一个实施例中，本发明的一种过程包括在低于糊化温度下、在一种α淀粉酶存在下将（碾磨的）含淀粉的材料（例如颗粒状淀粉）糖化以产生可以通过一种适合的发酵有机体发酵成所希望的发酵产品的多种糖。在另一个实施例中，在糖化和发酵过程中使用了本发明的葡糖淀粉酶和一种α淀粉酶。在一方面，本发明涉及一种用于由含淀粉的材料产生发酵产品的过程，该过程包括：

(a)在低于所述含淀粉的材料的起始糊化温度的温度下，用根据本发明的一种成熟葡糖淀粉酶来使含淀粉的材料糖化，该葡糖淀粉酶优选具有如SEQ ID NO:2中的氨基酸22至616所示的序列，

(b)使用一种发酵有机体进行发酵。

可以连续或同时进行本发明的方法的步骤(a)和(b)。在一个实施例中，在步骤(a)之前制备包含水和含淀粉的材料的一种浆料。

在一个优选实施例中，步骤(a)包括添加一种α淀粉酶。

这一发酵过程可以进行1至250小时、优选从25至190小时、更优选从30至180小时、更优选从40至170小时、甚至更优选从50至160小时、还更优选从60至150小时、甚至还更优选从70至140小时、以及最优选从80至130小时的一段时间。

术语“起始糊化温度”意指淀粉糊化开始时的最低温度。在水中加热的淀粉在50℃与75℃C之间开始糊化；糊化的确切温度取决于具体淀粉并且可由本领域普通技术人员容易地确定。因此，初始糊化温度可根据植物种类、植物种类的具体品系连同生长条件而变化。在本发明的背景下，一种给定的含淀粉的材料的初始糊化温度是使用由高瑞斯坦（Gorinstein）&李（Lii），1992，淀粉44(12):461-466所述的方法使得5%的淀粉颗粒的双折射丧失的温度。

在步骤(a)之前，可以制备具有含淀粉的材料的10wt%-55wt%干燥固体、优选25wt%-40wt%干燥固体、更优选30wt%-35wt%干燥固体的一种含淀粉的材料（例如颗粒状淀粉）的浆料。该浆料可以包含水和/或工艺用水，例如釜馏物（反流）、涤气器水、蒸发器冷凝物或馏出物、来自蒸馏的侧部汽提器水、或其他发酵产品工厂工艺用水。因为本发明的过程是在低于糊化温度下进行的并且因此没有显著的粘性增加发生，所以如果需要可以使用高水平的釜馏物。在一个实施例中，水性浆料包含从约1vol%至约70vol%釜馏物、优选15vol%至60vol%釜馏物、尤其是从约30vol%至50vol%釜馏物。

优选可以通过干式或湿式碾磨将粒径减小至0.05mm至3.0mm、优选0.1mm至0.5mm来制备这一含淀粉的材料。在经受本发明的一种方法之后，这一含淀粉的材料的至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或优选至少99%的干燥固体可以被转化成一种可溶的淀粉水解物。

在低于初始糊化温度的温度下进行本发明的过程。优选地，进行步骤(a)的温度是在30℃-75℃之间、优选在45℃-60℃之间。

在一个优选实施例中，作为一个连续或同时的糖化和发酵过程进行步骤(a)和步骤(b)。在这样一个优选的实施例中，该过程典型地是在25℃与40℃之间、例如29℃与35℃之间、例如30℃与34℃之间、例如约32℃的温度下进行的。根据本发明，在发酵过程中可调高或调低温度。

在一个实施例中，进行同时糖化和发酵，这样使得糖水平（例如葡萄糖水平）保持在一个低水平下，例如低于6wt%、优选低于约3wt%、优选低于约2wt%、更优选低于约1wt%、甚至更优选低于约0.5wt%、或甚至更优选0.25wt%、例如低于约0.1wt%。通过简单地采用调整量的酶和发酵有机体可以实现糖的这类低水平。本领域普通技术人员可容易地确定有待使用的酶和发酵有机体的量。还可以选择酶和发酵有机体体的所采用的量以在发酵液中维持低麦芽糖浓度。例如，麦芽糖水平可保持在低于约0.5wt%或低于约0.2wt%。

该过程可以是在pH3与pH7之间的范围内、优选从pH3.5至pH6、或更优选从pH4至pH5的pH下进行。

含淀粉的材料

根据本发明可以使用任何适合的含淀粉的起始材料，包括颗粒状淀粉。一般基于所希望的发酵产品来选择起始材料。适合在本发明的方法中使用的含淀粉的起始材料的实例包括块茎、根、茎、全谷粒、玉米、穗轴、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻米、豌豆、豆类、甜薯、或其混合物、或者谷类、含糖原料（例如糖蜜）、水果材料、甘蔗或甜菜、马铃薯、以及含纤维素的材料（例如木材或植物残渣）、或其混合物。考虑了糯与非糯类型的玉米与大麦两者。

发酵有机体

“发酵有机体”是指适合在发酵过程中使用并且能够产生所希望的发酵产品的任何有机体，包括细菌和真菌有机体。尤其适合的发酵有机体能够使糖（例如葡萄糖或麦芽糖）直接或间接发酵成、即转化成所希望的发酵产品。发酵有机体的实例包括真菌有机体，例如酵母。优选的酵母包括酵母属菌株，具体地说是酿酒酵母。可商购的酵母包括例如Red Star^TM/乐斯福（Lesaffre）乙醇红（可从美国红星/乐斯福（Red Star/Lesaffre）获得）、FALI（可从美国伯恩斯菲利普食品有限公司（Burns Philp Food Inc.）的分公司弗莱施曼酵母（Fleischmann’s Yeast）公司获得）、SUPERSTART（可从阿尔泰克公司（Alltech）获得）、GERT STRAND（可从瑞典的Gert Strand AB公司获得）、以及FERMIOL（可从帝斯曼食品配料部（DSM Specialties）获得）。

酶

葡糖淀粉酶

该葡糖淀粉酶优选是本发明的一种葡糖淀粉酶。然而，如上文提到的，本发明的一种葡糖淀粉酶还可以结合其他葡糖淀粉酶。

可以按以下量添加该葡糖淀粉酶：0.001至10AGU/g DS（干燥固体）、优选从0.01至5AGU/g DS、例如约0.05、0.1、0.3、0.5、1、或2AGU/g DS、尤其是0.05至0.5AGU/g DS；或者0.02至20AGU/g DS、优选0.1至10AGU/gDS。

α-淀粉酶

根据本发明，α-淀粉酶可以是任何来源的。优选是真菌或细菌来源的α-淀粉酶。

在一个优选方面，该α-淀粉酶是一种酸性α-淀粉酶，例如真菌酸性α-淀粉酶或细菌酸性α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”意指以有效量添加的一种α-淀粉酶（E.C.3.2.1.1）在最佳pH3至pH7的范围内、优选从pH3.5至pH6、或更优选从pH4至pH5下具有活性。

细菌α-淀粉酶

根据本发明，一种细菌α-淀粉酶可优选来源于芽孢杆菌属。

在一个优选方面，芽孢杆菌α-淀粉酶是来源于地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，但还可以是来源于其他芽孢杆菌。所考虑的α-淀粉酶的具体实例包括示出在WO99/19467的SEQID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶（BLA）、示出在WO99/19467的SEQ IDNO:5中的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶（BAN）、以及示出在WO99/19467的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶（BSG）。在本发明的一个实施例中，该α-淀粉酶是与如WO99/19467中的SEQ ID NO:1、2、3、4、或5所示的任何序列分别具有至少60%、优选至少70%、更优选至少80%、甚至更优选至少90%、例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%一致性的一致性程度的一种酶。

芽孢杆菌α-淀粉酶还可以是一种变体和/或杂交种，尤其是在任何以下各项中所述的一种变体和/或杂交种：WO96/23873、WO96/23874、WO97/41213、WO99/19467、WO00/60059、以及WO02/10355（所有文件都通过引用结合在此）。确切考虑的α-淀粉酶变体被披露在美国专利号6,093,562、美国专利号6,297,038或美国专利号6,187,576（通过引用结合在此）中，并且包括具有以下的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶（BSGα-淀粉酶）变体：在位置179至182中具有一个或两个氨基酸的缺失、优选披露在WO96/23873（参见，例如，第20页，第1至10行）（通过引用结合在此）中的一种双缺失（优选与WO99/19467披露的SEQ ID NO:3中阐述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比对应于δ（181-182）的双缺失）、或者使用WO99/19467（该参考文献通过引用结合在此）的SEQ ID NO:3进行编号的氨基酸179和180的缺失。甚至更优选的是芽孢杆菌α-淀粉酶、尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，它与WO99/19467中披露的SEQ ID NO:3阐述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有与δ（181-182）相对应的一种双缺失并且进一步包含一个N193F取代（也被表示为I181*+G182*+N193F）。

α-淀粉酶还可以是一种麦芽糖α-淀粉酶。一种“麦芽糖α-淀粉酶”（葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133）能够将直链淀粉和支链淀粉水解成处于α-构型的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB11837的一种麦芽糖α-淀粉酶是从丹麦诺维信公司（Novozymes A/S）可商购的。该麦芽糖α-淀粉酶被描述在美国专利号4,598,048、美国专利号4,604,355以及美国专利号6,162,628中，将其通过引用结合在此。

细菌杂交α-淀粉酶

确切考虑的一种杂交α-淀粉酶包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶（示出为WO99/19467中的SEQ ID NO:4）的445个C-末端氨基酸残基和来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶（示出为WO99/194676中的SEQ ID NO:3）的37个N-末端氨基酸残基，它们具有一个或多个、尤其是全部的以下取代：

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S（使用地衣芽孢杆菌编号）。还优选的是具有一个或多个以下突变（或在其他芽孢杆菌α-淀粉酶骨架中的对应突变）的变体：H154Y、A181T、N190F、A209V、以及Q264S；和/或在位置176与179之间的两个残基的缺失、优选E178和G179的缺失（使用WO99/19467的SEQ ID NO:5编号）。

真菌α-淀粉酶

真菌酸性α-淀粉酶包括来源于曲霉属的一种菌株的酸性α-淀粉酶，例如米曲霉、黑曲霉、或白曲霉（Aspergillus kawachii）α-淀粉酶。

一种优选的酸性真菌α-淀粉酶是优选来源于一种米曲霉菌株的一种Fungamyl样α-淀粉酶。在本披露中，术语“Fungamyl样α-淀粉酶”指示与WO96/23874中的SEQ ID NO:10所示出的氨基酸序列的成熟部分显示有高一致性、即大于70%、大于75%、大于80%、大于85%、大于90%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%、大于99%、或甚至100%一致性的一种α-淀粉酶。

另一种优选的酸性α-淀粉酶是来源于黑曲霉菌株。在一个优选方面，酸性真菌α-淀粉酶是来自在Swiss-prot/TeEMBL数据库中在主入藏号P56271下披露为“AMYA_ASPNG”并且在WO89/01969（实例3）中进行更详细描述的黑曲霉的一种α-淀粉酶。酸性黑曲霉酸性α-淀粉酶还在WO2004/080923（诺维信）中示出为SEQ ID NO:1，将其通过引用结合在此。还考虑了与WO2004/080923中的SEQ ID NO:1具有至少70%一致性、例如至少80%或甚至至少90%一致性、例如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%一致性的所述酸性真菌淀粉酶的多种变体。

在一个优选方面，α-淀粉酶是来源于白曲霉并且是由金子（Kaneko）等人，1996，发酵与生物工程杂志（J.Ferment.Bioeng.）81:292-298：“编码来自白曲霉的酸稳定的α-淀粉酶的一种基因的核苷酸序列的分子克隆和测定（Molecular-cloning and determination of the nucleotide-sequence of a geneencoding an acid-stable alpha-amylase from Aspergillus kawachii）”所披露；并且进一步被披露为EMBL：#AB008370。

该真菌酸性α-淀粉酶还可以是包含一个碳水化合物结合模块（CBM）和一个α-淀粉酶催化域（即，一个非杂交种）的一种野生型酶或其变体。在一个实施例中，野生型酸性α-淀粉酶是来源于一种白曲霉菌株。

根据本发明，可以按以下量添加一种酸性α-淀粉酶：0.01至10AFAU/gDS、优选0.01至5AFAU/g DS、尤其是0.02至2AFAU/g DS。

真菌杂交α-淀粉酶

在一个优选方面，该真菌酸性α-淀粉酶是一种杂交α-淀粉酶。真菌杂交α-淀粉酶的优选实例包括在WO2005/003311或美国专利公开号2005/0054071（诺维信）或美国专利申请号2006/0148054（诺维信）中披露的那些，将其通过引用结合在此。一种杂交α-淀粉酶可以包含一个α-淀粉酶催化域（CD）和一个碳水化合物结合域/模块（CBM）以及任选的一个接头。

所考虑的杂交α-淀粉酶的具体实例包括但不局限于在美国专利申请号2006/0148054中所披露的那些，包括具有催化域JA118和罗氏阿太菌（Atheliarolfsii）SBD的真菌α-淀粉酶变体（在美国申请号2006/0148054中的SEQ IDNO:100）、具有罗氏阿太菌AMG接头和SBD的微小根毛霉（Rhizomucorpusillus）α-淀粉酶（在美国申请号2006/0148054中的SEQ ID NO:101）、以及具有罗氏阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的大型亚灰树花菌（Meripilusgiganteus）α-淀粉酶（在美国申请号2006/0148054中的SEQ ID NO:102）；以及具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和CBM的微小根毛霉α-淀粉酶（在国际公开号WO2007/144424中的SEQ ID NO2）。

所考虑的杂交α-淀粉酶的其他具体实例包括但不局限于在美国专利公开号2005/0054071中披露的那些，包括在第15页的表3中披露的那些，例如具有白曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。

商用的α-淀粉酶产品

包含α-淀粉酶的优选商用组合物包括：来自帝斯曼（吉斯特·布罗卡德斯有限公司（Gist Brocades））的MYCOLASE，BAN^TM、TERMAMYL^TMSC、FUNGAMYL^TM、LIQUOZYME^TMSC、LIQUOZYME^TMSC DS、以及SAN^TMSUPER、SAN^TMEXTRA L（诺维信公司）、以及CLARASE^TML-40,000、DEX-LO^TM、SPEZYME^TMFRED、SPEZYME^TMAA、SPEZYME^TMEthyl、以及SPEZYME^TMDELTA AA（杰能科国际有限公司（Genencor Int.））。

本发明进一步通过以下实例进行描述，这些实例不应被解释成限制本发明的范围。

实例

材料和方法

葡糖淀粉酶活性

可以按单位AGU来测量葡糖淀粉酶活性。

葡糖淀粉酶活性（AGU）

葡糖淀粉酶单位（AGU）被定义为在标准条件下（37℃，pH4.3，底物：100mM麦芽糖，缓冲液：0.1M乙酸盐，反应时间：6分钟，如以下葡糖淀粉酶孵育中所说明的）每分钟水解1微摩尔麦芽糖由此产生葡萄糖的酶的量。

通过3个反应步骤描述分析原理：

步骤1是一个酶反应：

葡糖淀粉酶（AMG）EC3.2.1.3(外-α-1,4-葡聚糖-葡糖淀粉酶）水解麦芽糖以形成α-D-葡萄糖。孵育之后，用NaOH来停止该反应。

步骤2和步骤3引起一个终点反应。

在由己糖激酶催化的一个反应中，葡萄糖被ATP磷酸化。形成的葡萄糖-6-磷酸被葡萄糖-6-磷酸脱氢酶氧化成6-磷酸葡萄糖酸。在这个相同的反应中，等摩尔量的NAD+被还原成NADH，导致在340nm处的吸光度增加。可以使用自动分析仪系统例如Konelab30分析仪（赛默飞世尔科技公司（ThermoFisher Scientific））。

酸性α-淀粉酶活性

当根据本发明使用时，可以按AFAU（酸性真菌α-淀粉酶单位）来测量任何酸性α-淀粉酶的活性。可替代地，可按KNU-s（千诺维信单位（TermamylSC））来测量酸性α-淀粉酶的活性。

酸性α-淀粉酶活性（AFAU）

可按AFAU（酸性真菌α-淀粉酶单位）来测量酸性α-淀粉酶活性。1AFAU被定义为在下述标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶的量。

酸性α-淀粉酶是一种内-α-淀粉酶（1,4-α-D-葡聚糖-葡糖淀粉酶，E.C.3.2.1.1），它水解在淀粉分子的内部区域中的α-1,4-糖苷键以形成具有不同链长度的糊精和寡糖。与碘形成的颜色的强度与淀粉的浓度成正比。使用反比色法将酶活性测定为在指定的分析条件下淀粉浓度的减小。

蓝色/紫色 t=23秒无色

标准条件/反应条件：

底物：可溶性淀粉，约0.17g/L

缓冲液：柠檬酸盐，约0.03M

碘（I₂）： 0.03g/L

CaCl₂： 1.85mM

pH： 2.50±0.05

孵育温度： 40℃

反应时间： 23秒

波长 590nm

酶浓度 0.025AFAU/mL

酶工作范围： 0.01AFAU/mL至0.04AFAU/mL

当向丹麦诺维信公司请求时，更详细地描述此分析方法的一个文件夹EB-SM-0259.02/01是可用的，该文件夹通过引用包括在此。

DNA操纵

除非另外说明，否则使用如以下所述的分子生物学标准方法来进行DNA操纵和转化：萨拉布鲁克等人（1989），分子克隆实验指南，冷泉港实验室，冷泉港实验室，纽约；奥苏贝尔·F·M（Ausubel,F.M.）等人（编辑）“分子生物学实验指南（Current protocols in Molecular Biology）”，约翰威立父子公司，1995；哈伍德·C·R（Harwood,C.R.）&卡廷·S·M（Cutting,S.M.）（编辑）。

DNA测序

通过电穿孔（BIO-RAD基因脉冲发生器（BIO-RAD Gene Pulser））或在化学上进行用于DNA测序的大肠杆菌转化。通过碱法（分子克隆，冷泉港）或使用质粒试剂盒制备DNA质粒。通过凯杰（Qiagen）凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。使用PTC-200DNA引擎（PTC-200DNAEngine）进行PCR。使用ABI PRISMTM310基因分析器来测定所有的DNA序列。

培养基

YP-2%麦芽糖是由10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨以及20g/L麦芽糖组成的。

MLC培养基是由40g/L葡萄糖、50g/L大豆粉、4g/L柠檬酸组成的，pH为5.0。

M410培养基是由50g/L麦芽糖·1H₂O、8g/L酵母提取物、2g/LMgSO₄·7H₂O、4g/L柠檬酸·1H₂O、50g/L葡萄糖、2g/L K₂HPO₄、0.5ml/L AMG微量金属溶液、以及2g/L脲组成的，pH为4.5。AMG微量金属溶液是由13.9g/L FeSO₄·7H₂O、13.5g/L MnSO₄·1H₂O、6.8g/L ZnCl₂、2.5g/L CuSO₄·5H₂O、0.24g/L NiCl₂·6H₂O、以及3g/L柠檬酸组成的。

除非另外说明，否则培养基是根据以下来制备的：萨拉布鲁克等人（1989），分子克隆实验指南，冷泉港实验室，冷泉港，纽约。用作缓冲液和底物的化学品是至少试剂等级的商品。

酶

葡糖淀粉酶：

如本发明的SEQ ID NO:2所披露的草酸青霉菌葡糖淀粉酶

埃默森篮状菌（Talaromyces emersonii）葡糖淀粉酶（它在国际公开号WO99/28448被披露为SEQ ID NO:7）

黑曲霉葡糖淀粉酶（uniprot：P69328）（它被披露在斯文森（Svensson）等人，1986，“来自黑曲霉的一种葡糖淀粉酶G2的表征（Characterization of aglucoamylase G2from Aspergillus niger）”；欧洲生物化学杂志（Eur.J.Biochem.）154:497-502）。

瓣环栓菌（Trametes cingulata）葡糖淀粉酶，如WO2006/069289的SEQID NO:2所披露的且从诺维信公司可获得。

α-淀粉酶：

酸性α-淀粉酶，在国际公开号WO2005/003311中被披露为变体JA001

由地衣芽孢杆菌产生的α-淀粉酶，例如Termamyl^TM SC（从丹麦巴格斯瓦尔德（Bagsvaerd）的诺维信公司可商购的α-淀粉酶）。

杂交α-淀粉酶，由具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶组成、在WO2006/069290的表5中被披露为V039（诺维信公司）

α-淀粉酶A：嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶（在EP1023439B1中的SEQ IDNO:3），具有WO2011/082425中示出为SEQ ID NO:6的截短至491个氨基酸的突变I181*+G182*+N193F。

α-淀粉酶1407：嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶（EP1023439B1中的SEQ IDNO:3），具有截短至491个氨基酸（还参见WO2011/082425）的突变I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S。

蛋白酶196：来源于嗜热子囊菌CGMCC号0670的、披露为具有以下突变的WO2003/048353中的SEQ ID NO:2的氨基酸1至177的金属蛋白酶：A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L（还参见WO2011/072191）。

实例1：草酸青霉菌菌株的葡糖淀粉酶基因的克隆

草酸青霉菌菌株cDNA的制备

通过按照cDNA末端系统（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市的英杰公司（Invitrogen Corp.））的3’快速放大技术的说明来合成cDNA。

草酸青霉菌菌株的葡糖淀粉酶基因的克隆

使用下文所示的、被设计成用来从5’末端放大葡糖淀粉酶基因的寡核苷酸引物来克隆草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因。

有义引物：5’-atgcgtctcactctattatcaggtg-3’（SEQ ID NO:4）

通过PCR用有义引物和AUAP（由cDNA末端系统的3’快速放大技术提供）、通过使用Platinum HIFI Taq DNA聚合酶（美国加利福尼亚州卡尔斯巴市的英杰公司）来放大全长基因。放大反应是由5μl的10×PCR缓冲液、2μl的25mM MgCl₂、1μl的10mM dNTP、1μl的10uM有义引物、1μl的10uMAUAP、2μl的第一链cDNA、0.5μl的HIFI Taq、以及37.5μl的去离子水组成的。PCR程序是：94℃，3分钟；进行10次94℃持续40秒、60℃40秒（其中每次循序下降1℃）、68℃持续2分钟的循环；进行25次94℃持续40秒、50℃持续40秒、68℃持续2分钟的循环；在68℃进行10分钟最终扩展。

使用一个pGEM-T载体系统（美国威斯康星州麦迪逊市的普洛麦格公司（Promega Corporation））将获得的PCR片段克隆到pGEM-T载体（美国威斯康星州麦迪的逊市普洛麦格公司）中以产生质粒AMG1。对插入到质粒AMG1中的葡糖淀粉酶基因进行测序确认。将含有质粒AMG1（表示为NN059173）的大肠杆菌TOP10于2009年11月23日保藏在在德国微生物与菌种保藏中心（DSMZ）并且指定登录号为DSM23123。

实例2：克隆的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的表达

通过PCR使用以下所示的两种克隆引物F和引物R将草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因重新从质粒AMG1克隆到曲霉菌表达载体中，这两种克隆引物是基于已知的序列和添加的标志来设计以用于通过IN-FUSION^TM策略直接克隆。

引物F：5’ACACAACTGGGGATCCACCATGCGTCTCACTCTATTATC（SEQ ID NO:5）

引物R：5’AGATCTCGAGAAGCTTAAAACTGCCACACGTCGTTGG（SEQ ID NO:6）

用质粒AMG1来进行PCR反应以便放大全长基因。PCR反应是由40μg的质粒AMG1DNA、1μl的每种引物（100μM）、12.5μl的2×扩展剂高保真主体混合物（Extensor Hi-Fidelity Master Mix，英国拜力公司（ABgene））、以及9.5μl的PCR级水组成。使用DYAD PCR仪器（美国加利福尼亚州赫拉克勒斯的Bio-Rad实验室国际公司）进行PCR反应，该仪器的程序为：在94℃下持续2分钟，随后进行94℃持续15秒、50℃持续30秒、以及72℃持续1分钟的的25次循环；并且然后在72℃下10分钟。

通过1.0%琼脂糖凝胶电泳使用1×TAE缓冲液来分离反应产物，其中将约1.9kb的PCR产物带从该凝胶中切除并根据制造商的说明使用DNA和凝胶带纯化试剂盒（通用电气医疗集团（GE Healthcare），英国）进行纯化。根据制造商的说明使用IN-FUSIONTM Dry-Down PCR克隆试剂盒（美国加利福尼亚州帕洛阿尔托（Palo Alto）的BD生物科学（BD Biosciences））将与草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因相对应的DNA克隆到用BamHI和HindIII线性化的曲霉菌表达载体中。这一线性化的载体构建是如WO2005/042735A1所述的。

将2μl体积的连接混合物用于转化25μl的融合蓝色（Fusion Blue）大肠杆菌细胞（包含在IN-FUSIONTM Dry-Down PCR克隆试剂盒之中）。在42℃热休克45秒并在冰中冷却之后，添加250μl的SOC培养基，并且将这些细胞在225rpm下在37℃下孵育90分钟，随后铺在每ml含50μg氨苄西林（ampicillin）的LB琼脂板上，并在37℃下培养过夜。在每毫升增补50μg氨苄西林的3ml LB培养基中接种所选择的菌落并在225rpm下在37℃下孵育过夜。根据制造商的说明使用小JETSTAR（德国Genomed公司）纯化来自所选择的菌落的质粒DNA。在异源表达之前通过桑格测序（Sangersequencing）来验证草酸青霉菌葡糖淀粉酶基因序列。选择这些质粒之一用于进一步表达，并将其命名为XYZ XYZ1471-4。

如WO95/02043所述地制备黑曲霉MBin118的原生质体。将一百μl的原生质体悬浮液与2.5μg的XYZ1471-4质粒相混合，并且添加250微升的60%PEG4000（艾普利公司（Applichem））（聚乙二醇，分子量4,000）、10mMCaCl₂、以及10mM Tris-HCl（pH7.5）并轻轻混合。在37℃下孵育该混合物30分钟并且在补充有10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖（科夫（Cove），1996，生物化学与生物物理学报（Biochim.Biophys.Acta）133:51-56）（1M）板上将原生质体与6%的低熔琼脂糖（惠泰克生物分子应用公司（Biowhittaker Molecular Applications））相混合，并将其作为一个顶层添加在补充有10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖（1M）板以用于转化株选择（每板4ml顶层琼脂）。在37℃下孵育5天之后，拾取十六种转化株的孢子并将其接种在96深孔MT板的750μl YP-2%麦芽糖培养基上。在30℃下静止培养5天之后，在SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）凝胶，即Griton XT Precast凝胶（BioRad，美国加利福尼亚州）上分析来自每个孔的10μl培养液，以便基于产生大量葡糖淀粉酶的能力鉴别最好的转化株。在原始转化板上鉴别所选择的转化株并将其作为孢子保存在20%甘油贮备物中并冷冻保存（-80℃）。

培养：在100ml的MLC培养基中接种所选择的转化株并在30℃下在旋转振荡器上的500ml摇瓶中培养2天。将3ml的培养液接种到100ml的M410培养基中并在30℃下培养3天。将培养液离心并使用0.2μm的膜滤器过滤上清液。

α-环糊精亲和凝胶。使10克环氧基活化的琼脂糖6B（英国查尔方特圣吉尔斯（Chalfont St.Giles）的通用电气医疗集团）粉末悬浮在蒸馏水中并在烧结玻璃过滤器上用蒸馏水进行洗涤。使凝胶悬浮于偶合溶液（100ml的12.5mg/mlα-环糊精，0.5M NaOH）并在室温下孵育一天，同时轻轻振荡。在烧结玻璃过滤器上使用蒸馏水洗涤该凝胶，并使其悬浮在pH10的100ml1M乙醇胺中，并在50℃孵育4小时以进行封闭。随后使用pH8的50mM Tris-HCl和可替代地pH4.0的50mM NaOAc洗涤该凝胶若干次。最后使用平衡缓冲液（50mM NaOAc，150mM NaCl，pH4.5）将该凝胶装填在35-40ml的柱中。

从培养液纯化葡糖淀粉酶。通过0.22μm PES过滤器过滤来自具有葡糖淀粉酶基因的黑曲霉MBin118的发酵的培养液，并施加在之前在50mMNaOAc、150mM NaCl、pH4.5缓冲液中平衡的α-环糊精亲和凝胶柱上。用平衡缓冲液将未结合的材料从该柱中洗出，并且使用3个柱体积以上的含有10mMβ-环糊精的相同缓冲液洗脱葡糖淀粉酶。

检查洗脱液的葡糖淀粉酶活性以查看葡糖淀粉酶是否已结合至α-环糊精亲和凝胶。然后相对于pH5.0的20mM NaOAc透析纯化的葡糖淀粉酶样品。最后通过SDS-PAGE检查纯度并且仅发现一条单独的带。

实例3：草酸青霉菌葡糖淀粉酶的定位变体的构建和表达

用实例2所述的质粒XYZ1471-4、使用以下所示的引物K79V F和K79VR（这些引物被设计成用于将成熟序列的位置79处的赖氨酸（K）取代为缬氨酸（V））以及以下所示的引物F-NP003940和R-NP003940（这两个引物基于已知的序列和添加的标志来设计以用于通过IN-FUSION^TM策略直接克隆）进行两个PCR反应。

引物K79V F18聚体GCAGTCTTTCCAATTGAC（SEQ ID NO:7）

引物K79V R18聚体AATTGGAAAGACTGCCCG（SEQ ID NO:8）

引物F-NP003940：5’ACACAACTGGGGATCCACCATGCGTCTCACTCTATTATC（SEQ ID NO:9）

引物R-NP003940：5’AGATCTCGAGAAGCTTAAAACTGCCACACGTCGTTGG（SEQ ID NO:10）

在以下所述的条件下使用PTC-200DNA引擎进行PCR。

根据制造商的说明通过凯杰凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。根据制造商的说明，使用IN-FUSION^TM Dry-Down PCR克隆试剂盒（美国加利福尼亚州帕洛阿尔托的BD生物科学）将所得的纯化的两个片段克隆到用BamHI和HindIII线性化的曲霉菌表达载体中。这一线性化的载体构建是如WO2005/042735A1所述的。

使用连接混合物来转化大肠杆菌DH5α细胞（TOYOBO公司）。在每毫升补充有50μg氨苄西林的3ml LB培养基中接种所选择的菌落，并在225rpm下在37℃下孵育过夜。根据制造商的说明使用凯杰质粒小试剂盒（凯杰公司）从所选择的菌落纯化质粒DNA。在异源表达之前验证草酸青霉菌葡糖淀粉酶定点变体基因序列的序列，并选择这些质粒之一来用于进一步表达并且它其命名为pPoPE001。

如WO95/02043所述地制备黑曲霉MBin118的原生质体。将100μl的原生质体悬浮液与2.5μg的pPoPE001质粒相混合，并且添加250微升的60%PEG4000（艾普利公司）（聚乙二醇，分子量4,000）、10mM CaCl₂、以及10mM Tris-HCl（pH7.5）并轻轻混合。在37℃下孵育该混合物30分钟，并且在补充有10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖（科夫，1996，生物化学与生物物理学报133:51-56）中将原生质体与1%的琼脂糖L（日本基因公司（Nippon Gene））相混合，并将其作为一个顶层添加在补充有10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖板上以用于转化株选择（每板4ml顶层琼脂）。在37℃下孵育5天之后，拾取十六种转化株的孢子并将其接种在96深孔MT板中的750μl YP-2%麦芽糖培养基上。在30℃下静止培养5天之后，在SDS-PAGE凝胶上分析来自每个孔的10μl培养液以便基于产生大量葡糖淀粉酶的能力来鉴别最好的转化株。

实例4：定点Po AMG变体PE001的纯化

将所选择的变体转化株和表达实例1所述的野生型草酸青霉菌葡糖淀粉酶的菌株培养在100ml的YP-2%麦芽糖培养基中，并且培养物通过0.22μmPES过滤器过滤，并施加在之前于50mM NaOAc、150mM NaCl、pH4.5缓冲液中平衡的α-环糊精亲和凝胶柱上。使用平衡缓冲液将未结合的材料从该柱中洗出，并且使用3倍柱体积以上的含有10mMβ-环糊精的相同缓冲液洗脱葡糖淀粉酶。

检查洗脱液的葡糖淀粉酶活性以查看葡糖淀粉酶是否已结合至α-环糊精亲和凝胶。随后相对于pH5.0的20mM NaOAc透析纯化的葡糖淀粉酶样品。

实例5：PE001的表征

蛋白酶稳定性

将40μl在50mM乙酸钠缓冲液（pH4.5）中的酶溶液（1mg/ml）与1/10

体积的1mg/ml蛋白酶溶液相混合，该蛋白酶溶液例如在生物化学杂志（Biochem J.）147(1):45-53(1975)中所述的曲霉蛋白酶I、或从西格玛公司（Sigma）可商购的产品以及在市岛（Ichishima），2003，生物化学杂志（Biochemical Journal）371(2):541中所述的aorsin；并且在4℃或32℃下孵育过夜。作为对照实验，将H₂O而不是蛋白酶添加到样品之中。将样品装载在SDS-PAGE上以查看葡糖淀粉酶是否被蛋白酶切割。

在SDS-PAGE中，PE001仅示出与完整分子相对应的一条带，而野生型葡糖淀粉酶被蛋白酶降解并且示出60kDa的更低分子大小的一条带。

表1蛋白酶处理之后的SDS-PAGE结果

N.D.：未检测到。

实例6：培养过程中更少切割

在32℃下将变体和野生型草酸青霉菌葡糖淀粉酶的曲霉菌转化株在含有4X稀释的补充有pH 4.5的10 mM乙酸钠缓冲液的YP-2%麦芽糖培养基的6孔MT板中培养1周。

将培养物上清液装载在SDS-PAGE上。

表2培养物上清液的SDS-PAGE结果

N.D.：未检测到。

在发酵过程中野生型葡糖淀粉酶被宿主蛋白酶切割，而变体则仅产生完

整的分子。

实例7：变体与亲本相比的葡糖淀粉酶活性

针对野生型草酸青霉菌的纯化的酶和变体葡糖淀粉酶检查如上文所述作

为AGU测量的葡糖淀粉酶活性。

葡糖淀粉酶单位（AGU）被定义为在标准条件下（37℃，pH4.3，底物：

100mM麦芽糖，缓冲液：0.1M醋酸盐，反应时间：6分钟）每分钟水解1

微摩尔麦芽糖的酶的量。

表3

相对比活性	AGU/mg

草酸青霉菌，wt	100%
		草酸青霉菌PE001	102%

实例8：使用草酸青霉菌AMG变体PE001的全玉米液化和SSF过程

在全玉米液化与淀粉糖化（示出在下一部分中）二者中测试示出对蛋白酶降解的减小的敏感度的草酸青霉菌AMG（PoAMG）变体PE001。对于全玉米液化，以不同的剂量添加PE001酶与一种低pH淀粉酶变体α淀粉酶1407。在一些液化中，用低pH淀粉酶α-淀粉酶1407与热稳定性蛋白酶、即蛋白酶196二者来测试PE001变体。在所有的实验中，使用被称为“Lab-O-Mat”的自动化系统进行液化。这个仪器控制了温度并提供了持续的混合。其他实验条件是：pH是4.8（用于含有AA1407低pH淀粉酶的液化液）或5.8（用于α淀粉酶A对照），32%干燥固体，85℃，2小时的总时间。酶给予方案示出在表4中。在32℃下，在0.5AGU/g干燥固体的剂量下，使用包含埃默森篮状菌AMG作为主要活性和瓣环栓菌AMG和杂交AA作为副活性（80%/19%/1%）的一种组合物对液化的醪液进行糖化和发酵，持续54小时。

表4.使用PoAMG蛋白酶对稳定的变体PE001进行切口而进行的三种全玉米液化实验的酶给予方案。

HPLC定量的乙醇滴度（按每升的克数）示出在表4中。

表5.平均乙醇滴度和相关的标准偏差，按每升的克数。蛋白酶196是WO2011/072191所述的一种温度稳定性蛋白酶，并且AA1407是WO2011/082425所述的一种低pH淀粉酶。

实例9：在位置79上具有替代的取代的变体的蛋白酶稳定性的表征

使用适当的引物如实例3中所述，构建在SEQ ID NO:2的位置79上包含取代K79A、K79G、K79I、K79L、K79S、K79T的变体。

如实例4中所述，培养并且纯化各变体，并如下所述地测试蛋白酶稳定性。

蛋白酶稳定性

将20μl在pH4.5的50mM乙酸钠缓冲液中的酶溶液（1mg/ml）与1/10体积的1mg/ml蛋白酶溶液（例如市岛，2003，生物化学杂志371:541中所述的aorsin）相混合并在-20℃或37℃下孵育过夜。作为对照实验，将H₂O而不是蛋白酶添加到样品之中。将样品装载在SDS-PAGE上以查看葡糖淀粉酶变体是否被蛋白酶切割。

在SDS-PAGE上，所有变体仅显示与完整分子（70kDa）相对应的一条带，而野生型葡糖淀粉酶被降解并且显示60kDa的更低分子大小的一条带。

在此所说明和要求的发明并不局限于在此所披露的具体方面的范围，因为这些方面是旨在作为本发明的若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员来说从前述说明将变得清楚。这些修改也旨在落入所附权利要求书的范围。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

本发明进一步通过以下编号的段落进行说明。

[1]一种葡糖淀粉酶变体，该变体至少在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置79相对应的一个位置处包含一个取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性。

[2]如段落1所述的变体，该变体选自下组，该组由以下各项组成：

a)与SEQ ID NO:2的这一成熟多肽具有至少65%的序列一致性的一种多肽；

b)由在低严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或者(ii)(i)的全长补体杂交的一种多核苷酸编码的一种多肽；

c)由与SEQ ID NO:1的这一成熟多肽编码序列具有至少65%的一致性的一种多核苷酸编码的一种多肽；以及

d)SEQ ID NO:2的这一成熟多肽的具有葡糖淀粉酶活性的一个片段。

[3]如段落1或2所述的变体，其中该变体与SEQ ID NO:2的这一成熟多肽具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的序列一致性。

[4]如段落1或2所述的变体，其中该变体是由一种多核苷酸编码的，该多核苷酸在低严格条件下、中等严格条件下、中-高严格条件下、高严格条件下或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的这一成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的该全长补体杂交。

[5]如段落1或2所述的变体，其中该变体是由一种多核苷酸编码的，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的这一成熟多肽编码序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列一致性。

[6]如段落1-5中任一段落所述的变体，该变体是选自下组的一种亲本葡糖淀粉酶的一种变体，该组由以下各项组成：

b)由在低严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的这一成熟多肽编码序列、或者(ii)(i)的该全长补体杂交的一种多核苷酸编码的一种多肽；

c)由与SEQ ID NO:1的这一成熟多肽编码序列具有至少65%一致性的一种多核苷酸编码的一种多肽；以及

[7]如段落6所述的变体，其中该亲本葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:2的这一成熟多肽具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。

[8]如段落6或7所述的变体，其中该亲本葡糖淀粉酶是由一种多核苷酸编码的，该多核苷酸在低严格条件下、中等严格条件下、中-高严格条件下、高严格条件下或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的这一成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的该全长补体杂交。

[9]如段落6-8中任一段落所述的变体，其中该亲本葡糖淀粉酶是由一种多核苷酸编码的，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的这一成熟多肽编码序列具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。

[10]如段落1-9中任一段落所述的变体，其中取代的数目是1-20个，例如1-10和1-5，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10个取代。

[11]如段落1-10中任一段落所述的变体，其中该变体包含选自K79V、K79A、K79G、K79I、K79L、K79S、K79T的一个取代。

[12]如段落1-11中任一段落所述的变体，其中该变体包含取代K79V。

[13]如段落1-12中任一段落所述的变体，该变体相对于亲本具有一个改进的特性，其中这一改进的特性是对蛋白酶降解的减小的敏感度。

[14]一种变体葡糖淀粉酶催化域，该催化域至少在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置79相对应的一个位置处包含一个取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性。

[15]如段落14所述的变体葡糖淀粉酶催化域，该催化域选自下组，该组由以下各项组成：

(a)与SEQ ID NO:2的氨基酸30至494具有至少65%的序列一致性的一个催化域；

(c)由与(i)SEQ ID NO:1的核苷酸88至1482具有至少65%的序列一致性的一种多核苷酸编码的一个催化域；以及

(d)SEQ ID NO:2的氨基酸30至494的一种变体，该变体在一个或多个（例如若干个）位置处包含一个取代、缺失和/或插入；

并且其中该催化域具有葡糖淀粉酶活性。

[16]如段落15所述的多肽，该多肽进一步包含一个接头和一个碳水化合物结合域。

[17]一种组合物，该组合物包含段落1-16中任一段落所述的多肽。

[18]如段落17所述的组合物，该组合物包含一种α-淀粉酶和如段落1-16中任一段落所述的多肽。

[19]一种如段落1-16中任一段落所述的多肽用于生产糖浆和/或一种发酵产品的用途。

[20]如段落19所述的用途，其中起始材料是糊化的或未糊化的含淀粉的材料。

[21]一种如段落1-16中任一段落所述的多肽用于酿造的用途。

[22]一种用于由含淀粉的材料来生产发酵产品的过程，该过程包括以下步骤：

(a)在一种α-淀粉酶存在下使含淀粉的材料液化；

(b)使所液化的材料糖化；并且

(c)使用一种发酵有机体进行发酵；

其中使用如段落1-16中任一项所述的至少一种葡糖淀粉酶进行步骤(a)和/或步骤(b)。

[23]一种用于由含淀粉的材料来生产发酵产品的过程，该过程包括以下步骤：

(a)在低于所述含淀粉的材料的初始糊化温度的温度下使含淀粉的材料糖化；并且

(b)使用一种发酵有机体进行发酵，

其中使用如段落1-16中任一段落所述的至少一种葡糖淀粉酶进行步骤(a)。

[24]一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如段落1-16中任一项所述的多肽。

[25]一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如段落24所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导多肽在一个表达宿主内产生的一个或多个控制序列。

[26]一种重组宿主细胞，这一重组宿主细胞包含如段落24所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导多肽的产生的一个或多个控制序列。

[27]一种产生如段落1-16中任一段落所述的多肽的方法，该方法包括：

(a)培养一种细胞，该细胞在其野生型形式中在有益于产生该多肽的条件下产生该多肽；并且

(b)回收该多肽。

[28]一种产生如段落1-16中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：

(a)在有益于产生该多肽的条件下培养如段落26所述的宿主细胞；并且

(b)回收该多肽。

[29]一种包含如段落24所述的多核苷酸的核酸构建体。

[30]一种包含如段落24所述的多核苷酸的表达载体。

[31]一种包含如段落24所述的多核苷酸的宿主细胞。

Claims

1.一种葡糖淀粉酶变体，该变体至少在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置79相对应的一个位置处包含一个取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性。

2.如权利要求1所述的葡糖淀粉酶变体，该变体选自下组，该组由以下各项组成：

a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65%的序列一致性的一种多肽；

3.如权利要求1或2所述的葡糖淀粉酶变体，该变体是选自下组的亲本葡糖淀粉酶的一种变体，该组由以下各项组成：

4.如权利要求1-3中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中取代的数目是1-20个，例如1-10个和1-5个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10个取代。

5.如权利要求1-4中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中该变体包含选自K79V、K79A、K79G、K79I、K79L、K79S、K79T的一个取代。

6.如权利要求1-5中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，其中该变体包含取代K79V。

7.如权利要求1-6中任一项所述的葡糖淀粉酶变体，该变体相对于该亲本具有一个改进的特性，其中这一改进的特性是对蛋白酶降解的减小的敏感度。

8.一种变体葡糖淀粉酶催化域，该催化域至少在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置79相对应的一个位置处包含一个取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性。

9.如权利要求8所述的变体葡糖淀粉酶催化域，该催化域选自下组，该组由以下各项组成：

并且其中该催化域具有葡糖淀粉酶活性。

10.一种组合物，该组合物包含如权利要求1-9中任一项所述的葡糖淀粉酶变体。

11.一种如权利要求1-9中任一项所述的葡糖淀粉酶变体用于生产糖浆和/或一种发酵产品的用途。

12.一种如权利要求1-9中任一项所述的葡糖淀粉酶变体用于酿造的用途。

13.一种用于由含淀粉的材料来生产发酵产品的过程，该过程包括以下步骤：

(a)在一种α-淀粉酶存在下使含淀粉的材料液化；

(b)使所液化的材料糖化；并且

(c)使用一种发酵有机体进行发酵；

其中使用如权利要求1-9中任一项所述的至少一种葡糖淀粉酶变体进行步骤(a)和/或步骤(b)。

14.一种用于由含淀粉的材料来生产发酵产品的过程，该过程包括以下步骤：

(b)使用一种发酵有机体进行发酵，

其中使用如权利要求1-9中任一项所述的至少一种葡糖淀粉酶变体进行步骤(a)。

15.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1-9中任一项所述的葡糖淀粉酶变体。

16.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如权利要求15所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导葡糖淀粉酶变体在一种表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。

17.一种重组宿主细胞，这一重组宿主细胞包含如权利要求15所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导葡糖淀粉酶变体的产生的一个或多个控制序列。

18.一种产生如权利要求1-9中任一项所述的葡糖淀粉酶变体的方法，该方法包括：

(a)在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求22所述的宿主细胞；并且

(b)回收该葡糖淀粉酶变体。

19.一种包含如权利要求15所述的多核苷酸的核酸构建体。

20.一种包含如权利要求15所述的多核苷酸的表达载体。

21.一种包含如权利要求15所述的多核苷酸的宿主细胞。