CN103930165B - 用以治疗肥胖症的代谢紊乱的CaMKII、IP3R、钙调神经磷酸酶、P38和MK2/3抑制剂 - Google Patents

用以治疗肥胖症的代谢紊乱的CaMKII、IP3R、钙调神经磷酸酶、P38和MK2/3抑制剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及治疗或预防受试者的代谢病症的方法、治疗或预防患有代谢病症的受试者的冠状动脉疾病的方法以及降低受试者的肝葡萄糖产生的方法。所述方法包括但不限于向所述受试者施用CaMKII、IP3R、钙调神经磷酸酶、p38、MK2/3或其任何组合的抑制剂。本发明也提供鉴定抑制CaMKII、IP3R、钙调神经磷酸酶、p38或MK2/3的活性或降低CaMKII、IP3R、钙调神经磷酸酶、p38或MK2/3的活性和/或活化的化合物的方法。

Description

用以治疗肥胖症的代谢紊乱的CaMKII、IP3R、钙调神经磷酸 酶、P38和MK2/3抑制剂
本申请要求2011年9月2日提交的美国临时申请号61/530,851、2012年3月30日提交的美国临时申请号61/618,551、2012年4月6日提交的美国临时申请号61/621,407、2012年7月26日提交的美国临时申请号61/676,091和2012年7月26日提交的美国临时申请号61/676,152的优先权，所述临时申请全部以引用的方式整体并入本文。
本专利公开含有受版权保护的材料。版权所有者不反对由任何人以专利文件或专利公开出现在美国专利与商标局专利文档或记录中的形式复制所述专利文件或专利公开，但另外保留任何及所有版权权利。
本文中引用的所有专利、专利申请和公布据此以引用的方式整体并入本文。这些公布的公开内容据此以引用的方式整体并入本申请以更充分描述其中如为熟练技术人员所知的截至本文所述的本发明的日期的技术现状。
政府资助
本发明根据由国立卫生研究所(National Institute of Health)和国立心脏、肺及血液研究所(National Heart,Lung and Blood Institute)颁发的授予号P01HL087123在政府资助下进行。因此，美国政府拥有本发明的某些权利。
发明背景
肥胖症诱发的胰岛素抗性和肝葡萄糖及脂肪代谢紊乱增加心脏病、癌症和其它广布及毁灭性疾病的风险。当前治疗选项极其有限，从而产生影响身患当前肥胖症流行病的亿万超重人员的迫切的未满足临床需要。对用以治疗和诊断肥胖症诱发的胰岛素抗性和肝葡萄糖及脂肪代谢紊乱的方法存在需要。本发明处理这些需要。
发明概述
本公开提供用于治疗和/或预防代谢病症的方法。本公开也提供用于鉴定用于治疗和/或预防受试者的代谢病症的化合物或化合物的组合的方法。
本公开提供用于治疗和/或预防代谢病症的方法。一方面，本公开提供一种治疗或预防受试者的代谢病症的方法，其中所述病症由肥胖症诱发，所述方法包括降低CaMKII的活性，从而治疗或预防所述病症。在一个实施方案中，病症选自由1型糖尿病、2型糖尿病、胰岛素抗性和代谢综合征组成的组。在另一实施方案中，治疗或预防影响受试者的糖原分解或糖异生。在一个实施方案中，治疗或预防降低受试者的肝葡萄糖产生、高血糖、脂肪肝、胰岛素抗性、胰岛素抗性相关的炎症、胰岛素抗性相关的血脂异常或其任何组合。在另一实施方案中，治疗或预防降低CaMKII的磷酸化和/或活化。在一个实施方案中，CaMKII的活性是胰高血糖素(glucagon)诱导的活性。在一个实施方案中，治疗或预防降低G6pc和/或Pck1在受试者的细胞中的表达。在另一实施方案中，治疗或预防降低受试者的细胞的核中的FoxO1蛋白质含量。在另一实施方案中，治疗或预防降低FoxO1蛋白质的氨基酸S284、S295、S326、S467、S475、S246、S253、S413或S415或其任何组合的磷酸化。
另一方面，本公开提供一种治疗或预防患有代谢病症的受试者的冠状动脉疾病的方法，所述方法包括降低所述受试者的CaMKII的活性，从而治疗或预防所述冠状动脉疾病。在一个实施方案中，病症选自由1型糖尿病、2型糖尿病、胰岛素抗性和代谢综合征组成的组。在另一实施方案中，治疗或预防影响受试者的糖原分解或糖异生。在一个实施方案中，治疗或预防降低受试者的肝葡萄糖产生、高血糖、脂肪肝、胰岛素抗性、胰岛素抗性相关的炎症、胰岛素抗性相关的血脂异常或其任何组合。在另一实施方案中，治疗或预防降低CaMKII的磷酸化和/或活化。在一个实施方案中，CaMKII的活性是胰高血糖素诱导的活性。在一个实施方案中，治疗或预防降低G6pc和/或Pck1在受试者的细胞中的表达。在另一实施方案中，治疗或预防降低受试者的细胞的核中的FoxO1蛋白质含量。在另一实施方案中，治疗或预防降低FoxO1蛋白质的氨基酸S284、S295、S326、S467、S475、S246、S253、S413或S415或其任何组合的磷酸化。在一个实施方案中，治疗或预防包括降低受试者的巨噬细胞中的CaMKII活性。
在一个实施方案中，冠状动脉疾病与动脉粥样化形成和/或动脉粥样硬化相关。在另一实施方案中，方法进一步包括治疗或预防心力衰竭、高血压和/或肾病。在另一实施方案中，病症与晚期病变性巨噬细胞凋亡相关。在另一实施方案中，病症与斑块坏死相关。在另一实施方案中，治疗或预防患有代谢病症的受试者的冠状动脉疾病导致减轻高胰岛素血症和/或血脂异常。在另一实施方案中，治疗或预防患有代谢病症的受试者的冠状动脉疾病导致减轻动脉粥样化形成和/或动脉粥样硬化。
在一个实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用降低编码CaMKII蛋白质的基因的表达的反义RNA的步骤。在另一实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用特异性结合CaMKII蛋白质的肽或多肽的步骤。在另一实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用小分子的步骤。在一个实施方案中，小分子是选自由以下组成的组的CaMKII抑制剂：KN-93、薰草菌素C(lavendustin C)、CK59、Ant-CaMKIINtide、KN62、DY9760e、诺卡土壤菌属(Nocardiopsis sp.)K-252a、H89二盐酸盐、PP1类似物II1NM-PP1、eEF-2激酶抑制剂NH125和STO-609。
另一方面，本公开提供一种降低受试者的肝葡萄糖产生的方法，所述方法包括降低CaMKII的活性，从而导致所述受试者的肝葡萄糖的所述降低。在一个实施方案中，降低肝葡萄糖产生降低CaMKII的磷酸化和/或活化。在另一实施方案中，CaMKII的活性是胰高血糖素诱导的活性。在另一实施方案中，降低肝葡萄糖产生降低G6pc和/或Pck1在受试者的细胞中的表达。在一个实施方案中，降低肝葡萄糖产生降低受试者的高血糖、脂肪肝、胰岛素抗性、胰岛素抗性相关的炎症、胰岛素抗性相关的血脂异常或其任何组合。在另一实施方案中，降低肝葡萄糖产生降低受试者的细胞的核中的FoxO1蛋白质含量。在另一实施方案中，降低肝葡萄糖产生降低FoxO1蛋白质的氨基酸S284、S295、S326、S467、S475、S246、S253、S413或S415或其任何组合的磷酸化。
在一个实施方案中，降低肝葡萄糖产生包括向受试者施用降低编码CaMKII蛋白质的基因的表达的反义RNA的步骤。在另一实施方案中，降低肝葡萄糖产生包括向受试者施用特异性结合CaMKII蛋白质的肽或多肽的步骤。在另一实施方案中，降低肝葡萄糖产生包括向受试者施用小分子的步骤。在一个实施方案中，小分子是选自由以下组成的组的CaMKII抑制剂：KN-93、薰草菌素C、CK59、Ant-CaMKIINtide、KN62、DY9760e、诺卡土壤菌属K-252a、H89二盐酸盐、PP1类似物II1NM-PP1、eEF-2激酶抑制剂NH125和STO-609。
另一方面，本公开提供一种用于鉴定抑制CaMKII的活性的化合物的方法，所述方法包括a)使细胞与CaMKII融合蛋白接触，其中所述CaMKII融合蛋白包含在一个末端的受体荧光团蛋白质和在另一末端的供体荧光团蛋白质；以及b)在不存在和存在测试化合物的情况下测量FRET效率，其中相较于在不存在所述测试化合物的情况下的FRET效率，在所述测试化合物存在的情况下的FRET效率较大指示所述测试化合物抑制CaMKII的活性。
在一个实施方案中，受体荧光团蛋白质选自由以下组成的组：mOrange、mStrawberry、Venus、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白。
在另一实施方案中，细胞是HEK293T细胞、肝细胞、U2OS细胞、HeLa细胞、鼠胚胎成纤维细胞(MEF)或巨噬细胞。在另一实施方案中，细胞来自Insr-/-小鼠、Camk2g-/-小鼠、Foxo1-/-小鼠、db/db小鼠、ob/ob小鼠、p38-/-小鼠、非肥胖糖尿病(NOD)小鼠、喂食高脂肪膳食的小鼠或链脲霉素(streptozotocin)处理的小鼠。在另一实施方案中，细胞来自表达突变FoxO1蛋白质的小鼠。在一个实施方案中，突变FoxO1蛋白质包含在S284、S295、S326、S467、S475、S246、S253、S413或S415处的丙氨酸取代或在S284、S295、S326、S467、S475、S246、S253、S413或S415处的天冬氨酸取代或其任何组合。
在一个实施方案中，使细胞经受ER应激。在另一实施方案中，细胞用胰高血糖素、8-溴cAMP、H89二盐酸盐、光溜海绵素C(Xestospongin C)、毛喉素(forskolin)、饱和脂肪酸或其任何组合处理。
一方面，本公开提供一种治疗或预防受试者的代谢病症的方法，其中所述病症由肥胖症诱发，所述方法包括降低IP3R1、IP3R2或IP3R3的活性，从而治疗或预防所述病症。另一方面，本公开提供一种治疗或预防受试者的代谢病症的方法，其中所述病症由肥胖症诱发，所述方法包括降低钙调神经磷酸酶的活性，从而治疗或预防所述病症。
在一个实施方案中，病症选自由1型糖尿病、2型糖尿病、胰岛素抗性、肥胖症和代谢综合征组成的组。
在另一实施方案中，治疗或预防影响受试者的糖原分解或糖异生。
在一个实施方案中，治疗或预防降低受试者的肝葡萄糖产生、高血糖、脂肪肝、胰岛素抗性、胰岛素抗性相关的炎症、胰岛素抗性相关的血脂异常或其任何组合。
在一个实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用降低编码IP3R1蛋白质、IP3R2蛋白质或IP3R3蛋白质的基因的表达的反义RNA的步骤。在另一实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用特异性结合IP3R1蛋白质、IP3R2蛋白质或IP3R3蛋白质的肽或多肽的步骤。
在一个实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用小分子的步骤。在一个实施方案中，小分子是IP3R1蛋白质抑制剂、IP3R2蛋白质抑制剂或IP3R3蛋白质抑制剂。
在一个实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用降低编码钙调神经磷酸酶蛋白质的基因的表达的反义RNA的步骤。在另一实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用特异性结合钙调神经磷酸酶蛋白质的肽或多肽的步骤。
在一个实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用小分子的步骤。在另一实施方案中，小分子是钙调神经磷酸酶抑制剂。
另一方面，本公开提供一种用于鉴定抑制IP3R1、IP3R2或IP3R3的活性的化合物的方法，所述方法包括a)使细胞与测试化合物接触；以及b)测量IP3R1、IP3R2或IP3R3活性，其中相较于在不存在所述化合物的情况下的IP3R1、IP3R2或IP3R3的活性，在存在所述化合物的情况下的IP3R1、IP3R2或IP3R3的活性降低指示所述化合物是分别IP3R1、IP3R2或IP3R3的抑制剂。
在一个实施方案中，通过在用IP3的诱导剂刺激之后，释放至细胞的胞质液中的钙来测量活性。在一个实施方案中，通过胞质液钙染料的荧光的增加来测量钙释放。在一个实施方案中，胞质液钙染料是Fluo-3。
另一方面，本公开提供一种用于鉴定抑制钙调神经磷酸酶的活性的化合物的方法，所述方法包括a)使细胞与测试化合物接触；以及b)测量钙调神经磷酸酶活性，其中相较于在不存在所述化合物的情况下的钙调神经磷酸酶的活性，在存在所述化合物的情况下的钙调神经磷酸酶的活性降低指示所述化合物是钙调神经磷酸酶的抑制剂。
在一个实施方案中，通过使用钙调神经磷酸酶底物肽检测磷酸酶活性来测量钙调神经磷酸酶的活性。在一个实施方案中，细胞是HEK293T细胞、肝细胞、U2OS细胞、HeLa细胞或鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。在另一实施方案中，细胞来自db/db小鼠、ob/ob小鼠、非肥胖糖尿病(NOD)小鼠、喂食高脂肪膳食的小鼠或链脲霉素处理的小鼠。
在一个实施方案中，细胞用胰高血糖素、H89二盐酸盐、胰岛素、毛喉素、ER应激的诱导剂、衣霉素(tunicamycin)、饱和脂肪酸或其任何组合处理。
另一方面，本公开提供一种治疗或预防受试者的代谢病症的方法，其中所述病症由肥胖症诱发，所述方法包括降低p38的活性，从而治疗或预防所述病症。另一方面，本公开提供一种治疗或预防受试者的代谢病症的方法，其中所述病症由肥胖症诱发，所述方法包括降低MK2/3的活性，从而治疗或预防所述病症。
在一个实施方案中，病症选自由1型糖尿病、2型糖尿病、胰岛素抗性、肥胖症和代谢综合征组成的组。
在一个实施方案中，治疗或预防影响受试者的糖原分解或糖异生。在另一实施方案中，治疗或预防降低受试者的肝葡萄糖产生、高血糖、脂肪肝、胰岛素抗性、胰岛素抗性相关的炎症、胰岛素抗性相关的血脂异常或其任何组合。
在一个实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用降低编码p38蛋白质的基因的表达的反义RNA的步骤。在另一实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用特异性结合p38蛋白质的肽或多肽的步骤。在另一实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用小分子的步骤。在一个实施方案中，小分子是p38抑制剂。
在一个实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用降低编码MK2/3蛋白质的基因的表达的反义RNA的步骤。在另一实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用特异性结合MK2/3蛋白质的肽或多肽的步骤。在一个实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用小分子的步骤。在一个实施方案中，小分子是MK2/3抑制剂。
另一方面，本公开提供一种用于鉴定抑制p38的活性的化合物的方法，所述方法包括a)使细胞与测试化合物接触；以及b)测量p38激酶活性，其中相较于在不存在所述化合物的情况下的p38的激酶活性，在存在所述化合物的情况下的p38的激酶活性降低指示所述化合物是p38的抑制剂。另一方面，本公开提供一种用于鉴定抑制MK2/3的活性的化合物的方法，所述方法包括a)使细胞与测试化合物接触；以及b)测量MK2/3激酶活性，其中相较于在不存在所述化合物的情况下的MK2/3的激酶活性，在存在所述化合物的情况下的MK2/3的激酶活性降低指示所述化合物是MK2/3的抑制剂。
在一个实施方案中，使用p38特异性肽测量p38激酶活性。在一个实施方案中，使用MK2/3特异性肽测量MK2/3激酶活性。
在一个实施方案中，细胞是HEK293T细胞、肝细胞、U2OS细胞、HeLa细胞、巨噬细胞或鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。在另一实施方案中，细胞来自Insr-/-小鼠、db/db小鼠、ob/ob小鼠、非肥胖糖尿病(NOD)小鼠、喂食高脂肪膳食的小鼠或链脲霉素处理的小鼠。在另一实施方案中，细胞用胰高血糖素、8-溴cAMP、H89二盐酸盐、毛喉素、饱和脂肪酸或其任何组合处理。
本发明的这些和其它实施方案在连同以下描述和随附图式一起考虑时将会被更好地了解和理解。然而，应了解尽管指示本发明的各种实施方案及其众多特定细节，但以下描述仅通过说明而非限制方式给出。可在不脱离本发明的精神下在本发明的范围内进行许多替代、修改、添加和/或重排，且本发明包括所有此类替代、修改、添加和/或重排。
附图简述
图1A-J.胰高血糖素和禁食活化肝CaMKII。图1A.在用100nM胰高血糖素(Gluc)或媒介物对照(Veh)刺激指示时间的原代小鼠HC的一式三份孔中测定CaMKII酶活性(相对于Veh*P<0.05且**P<0.01；平均值±S.E.M.)。图1B-1J.通过免疫印迹测定探测HC或肝的提取物的磷酸-CaMKII、总CaMKII和β-肌动蛋白。图1B.使HC与00nM胰高血糖素一起孵育指示时间；图1C.将胰高血糖素添加至用媒介物对照(Veh)或5μM BAPTA-AM预处理1小时的HC中；图1D.将胰高血糖素添加至用0.5μM光溜海绵素(XesC)预处理的HC或添加至来自用腺-LacZ对照或腺-Cre转导的Ip3r1fl/fl小鼠的HC中(条形图＝Ip3r1mRNA水平)；图1E.将胰高血糖素添加至用媒介物对照(Veh)或10μM H89预处理1小时的HC中。图1F.使HC与100μM8-溴-cAMP一起孵育指示时间。图1G-1J.体内实验。在图1G中，小鼠用200μg kg-1体重的胰高血糖素腹膜内(i.p.)处理30分钟，且在图1H中，小鼠在胰高血糖素处理之前用10pmol g-1光溜海绵素C或媒介物对照腹膜内预处理4天。在图1I-1J中，小鼠被任意喂食或禁食12小时，或禁食12小时且接着再喂食4小时。
图2A-E.CaMKII调控原代肝细胞中的葡萄糖产生和肝G6Pc和Pck1表达。图2A在MOI为20下用表达LacZ、CA-CaMKII或K43A-CaMKII的腺病毒载体转导原代小鼠肝细胞。使细胞经受过夜血清耗竭且接着在无血清和葡萄糖的培养基中与毛喉素(10μm)一起孵育14小时。如所述测量葡萄糖含量。图2B如同图2A中一样，例外之处是使用WT肝细胞和Camk2g-/-肝细胞。图2C在MOI为20下用表达LacZ、CA-CaMKII或K43A-CaMKII的腺病毒载体感染原代小鼠肝细胞。使细胞经受过夜血清耗竭且接着在无血清培养基中与毛喉素(10μm)一起孵育5小时。分离RNA且通过实时Q-PCR分析基因表达。(*，P<0.05；**，P<0.01)图2D使来自WT小鼠和Camk2g-/-小鼠的原代肝细胞经受过夜血清耗竭且接着在无血清培养基中与毛喉素(10μm)一起孵育5小时。通过实时Q–PCR测定RNA中的G6pc和Pck1mRNA。(**，P<0.01；****，P<0.0005)。图2E.如同图2D中一样，例外之处是胰高血糖素(100nm)用于刺激糖异生。(*，P<0.05；**，P<0.01)
图3A-C.CaMKII调控原代肝细胞中的肝FoxO1亚细胞定位。图3A在MOI为2下用表达鼠GFP-FoxO1的腺病毒转导来自WT小鼠和Camk2g-/-小鼠的原代肝细胞。使细胞经受过夜血清耗竭且接着在无血清培养基中孵育5小时。通过间接免疫荧光评估FoxO1亚细胞定位。比例尺(bar)，10μm。在右图中定量数据。(****，P<0.0005)。图3B在MOI为20下用表达LacZ、CA-CaMKII或K43A-CaMKII的腺病毒载体转导原代小鼠肝细胞。4小时后，在MOI为5下用鼠GFP-FoxO1腺病毒感染细胞。使细胞经受过夜血清耗竭且接着在无血清培养基中孵育5小时。随后通过间接免疫荧光评估FoxO1亚细胞定位。比例尺，5μm。在下图中定量数据。(****，P<0.0005；####P<0.0005)。图3C原代小鼠肝细胞用表达LacZ或CA-CaMKII的腺病毒载体感染。通过免疫印迹测定核提取物的FoxO1和核磷酸蛋白(核装载对照)。
图4A-D.CaMKIIγ缺乏降低血糖、G6pc和Pck1表达和核FoxO1。图4A禁食12小时的8周龄WT小鼠和Camk2g-/-小鼠中的血糖浓度(*，P<0.05)图4B将8-10周龄WT小鼠和Camk2g-/-小鼠禁食18小时且接着用丙酮酸(2mg kg-1)激发。(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.005)图4C禁食12小时的WT小鼠和Camk2g-/-小鼠中的肝G6pc和Pck1基因表达水平。(**，P<0.01；***，P<0.001)图4D如同图4C中一样，例外之处是通过免疫印迹测定肝核提取物的FoxO1和核磷酸蛋白。这些数据的密度计量定量显示于下图中。(***，P<0.001)
图5A-F.急性抑制CaMKII降低血糖、G6pc和Pck1表达和核FoxO1。通过尾部静脉用1.5x109pfu的含有对照LacZ(n＝5)或K43A-CaMKII(n＝5)的腺病毒注射9周龄WT小鼠。图5A在第5天在禁食12小时之后的血糖水平。(***，P<0.001)图5B禁食12小时的小鼠中的肝糖异生基因表达。(**，P<0.01；***，P<0.001)。图5C.如同图5B中一样，例外之处是通过免疫印迹测定肝核提取物的FoxO1和核磷酸蛋白。图5D肝糖原含量。图5E-5F用200μg kg-1体重的胰高血糖素腹膜內注射LacZ或K43A-CaMKII处理的小鼠且在30分钟后处死。测定肝G6pcmRNA，且通过PAS染色检查肝切片的糖原含量，其定量为PAS阳性肝细胞的百分比(n＝4只小鼠)。比例尺，20μm。
图6A-D.组成型活性CaMKII增加血糖、G6pc和Pck1表达和核FoxO1。用1.5x109pfu的含有对照LacZ(n＝5)或CA-CaMKII(n＝5)的腺病毒注射9周龄WT小鼠。图6A在第6天在禁食12小时之后测定血糖。(*，P<0.05)图6B在禁食17小时的小鼠中进行丙酮酸激发测试。(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.005)图6C测定禁食12小时(*，P<0.05)或任意喂食(*，P<0.05；***，P<0.005)的小鼠中的G6pc和Pck1mRNA水平。图6D通过免疫印迹测定用对照LacZ(n＝5)或CA-CaMKII(n＝5)注射的喂食小鼠中的肝核提取物的FoxO1和核磷酸蛋白。
图7A-D.Camk2g-/-肝细胞中和体内葡萄糖代谢损害由用组成型核FoxO1-ADA转导而得以挽救。图7A在MOI为0.2下用表达FoxO1-ADA的腺病毒转导来自WT小鼠和Camk2g-/-小鼠的原代肝细胞。使细胞经受过夜血清耗竭且接着在无血清培养基中与毛喉素(10μm)一起孵育5小时。分离RNA且通过实时Q-PCR分析基因表达。(**，P<0.01；#，P<0.05；##，P<0.01)图7B用1.5x109pfu的含有对照LacZ(n＝5)或K43A-CaMKII(n＝10)的腺病毒注射8周龄WT小鼠。1天后，半数腺-K43A-CaMKII注射的小鼠接受0.1x109pfu的含有FoxO1-ADA的腺病毒，而其余小鼠接受LacZ对照。在第5天在禁食12小时之后测定血糖水平。(*，P<0.05；#，P<0.05)图7C通过免疫印迹测定肝核提取物的FoxO1和核磷酸蛋白图7D测定来自禁食12小时的小鼠的肝的G6pc、Pck1和Igfbp1mRNA水平。(*，P<0.05；**，P<0.01；#，P<0.05)
图8A-B.肥胖肝中的P-CaMKIIγ。来自图8A10周龄WT小鼠或ob/ob小鼠和喂食标准膳食或高卡路里(DIO)膳食20周的小鼠；或图8B瘦人或病态肥胖人的肝提取物的免疫印迹。显示图8A中的小鼠数据的密度计量定量；P<0.001。
图9A-I.在肥胖小鼠中，CaMKIIγ缺乏减轻高胰岛素血症且改善胰岛素和葡萄糖代谢。图9A-9B，喂食和禁食WT(n＝10)和Camk2g-/-(n＝7)DIO-肥胖雄性小鼠中的血浆胰岛素。图9C，WT小鼠和Camk2g-/-小鼠(n＝5)中的胰岛素耐受性测试(ITT)。图9D，体重。图9E-G，在用腺-LacZ对照或腺-K43ACaMKII(显性阴性)处理之前或之后，DIO小鼠中的血浆胰岛素、葡萄糖耐受性测试(GTT)和FoxO1靶标的肝mRNA(n＝6)。在图9E中，*，P<0.01对比腺病毒前且<0.005对比第7天LacZ。在图9G中，*，P<0.01。图9H-I，ob/ob肥胖小鼠用CaMKII抑制剂KN93或它的失活同系物KN92处理。接着测定血糖以及G6pc和Pck1在肝中的表达(重复值变化10％)。
图10A-D.CaMKIIγ缺乏改善肥胖小鼠中的脂肪变性、血脂异常和炎症。图10A-B、10D，在DIO膳食20周之后，测定WT(n＝10)和Camk2g-/-(n＝7)小鼠中的肝TG含量、血浆脂质和肝TnfamRNA(G，*，P<0.005；H，*，P<0.05**，P<0.01；I，*，P<0.05)。图10C，在用腺-LacZ对照或腺-K43ACaMKII(显性阴性)处理之前或之后，来自DIO小鼠的肝中的p-S6K和总S6K以及分拣蛋白-1的免疫印迹。
图11.CaMKIIγ缺乏通过补充机制介导对动脉粥样硬化的遏制。
图12.CaMKIIγ在UPR诱导的细胞凋亡中的作用
图13.CaMKIIγ单倍剂量不足保护免遭ER应激诱导的细胞凋亡。在对照或FC装载(胆固醇)条件下处理来自WT、Camk2g+/-或Camk2g-/-小鼠的且接着测定细胞凋亡。相对于彼此*、#、@＝P<0.01。
图14.CaMKIIγ在胰岛素抗性环境中的ER应激诱导的细胞凋亡中的关键作用的概述。
图15A-B.胰岛素抗性和ERK1/2抑制增加p-CaMKII。图15A WT、Insr-/-和ob/ob ±FC装载或oxLDL和图15B用5μMU0126ERK抑制剂处理WT ±4小时的pThr287-CaMKII的免疫印迹。
图16.CaMKIIγ缺乏遏制UPR。使来自WT小鼠或Camk2g-/-小鼠的与毒胡萝卜素(Thaps)一起或在FC装载条件(胆固醇)下孵育且接着进行免疫印迹以测定UPR蛋白质、CaMKIIγ和β-肌动蛋白。
图17.晚期人冠状动脉斑块中的巨噬细胞中的p-CaMKI。检查的面积由Movat五色染色剂染色的斑块试样中的方框描绘；NC，坏死核心；比例尺，2mm。如果是阳性，那么抗体反应产生微红棕色产物，并且如果是阴性，那么是淡蓝色。对于放大图像，比例尺，100μm。
图18.肝细胞CaMKIIγ缺乏通过经由涉及核外排FoxO1的机制降低糖异生(GNG)和肝葡萄糖产生(HGP)来减轻高胰岛素血症和随后血脂异常。
图19A-H.禁食活化肝CaMKII，且CaMKII缺乏或抑制遏制GNG和核FoxO1。图19A，WT小鼠被任意喂食或禁食12小时(上部)；或禁食12小时且接着再喂食4小时(下部)。对肝提取物进行免疫印迹以测定p-CaMKII、总CaMKII和β-肌动蛋白。图19B，禁食12小时的WT小鼠和Camk2g-/-小鼠或用腺-LacZ或腺-K43A-CaMKII处理的WT小鼠中的血糖(*，P<0.001)。图19C，用2mg/kg丙酮酸激发的禁食18小时的WT小鼠和Camk2g-/-小鼠中的血糖。图19D，用腺-LacZ或腺-K43A-CaMKII处理的小鼠中的肝G6pc和Pck1mRNA(*，P<0.01)。图19E，对来自B中的实验(左侧)的肝的核提取物进行免疫印迹以测定FoxO1和核磷酸蛋白(Np；核装载对照)且通过密度计量术定量(*，P<0.001)。图19F，来自WT小鼠或Camk2g-/-小鼠的原代HC(左侧)—或用腺-LacZ、组成型活性CaMKII(T287D)或K43A-CaMKII转导的WT HC(右侧)—用腺-GFP-FoxO1(共)转导。通过对免疫荧光共焦显微数据的图像分析来定量血清饥饿细胞中的FoxO1亚细胞定位(*、#，P<0.005)。图19G，来自WT小鼠或Camk2g-/-小鼠的HC用腺-LacZ或FoxO1-ADA转导，接着经受血清饥饿，用毛喉素处理，且测定G6pc mRNA(*，P<0.01)。图19H，在血清饥饿WT HC中而非在CaMKII缺乏的HC中被磷酸化的Ser残基；DBD＝DNA结合结构域。
图20A-B.在WD喂食的Ldlr-/-小鼠的肝中，CaMKIIγ被磷酸化。通过免疫印迹测定用标准膳食或西方膳食11周的Ldlr-/-小鼠的血糖(图20A；P<0.001)以及肝p-CaMKII、总CaMKII和β-肌动蛋白(图20B)。
图21A-21AV显示处于禁食和肥胖症时的胰高血糖素诱导的肝葡萄糖产生的分子关联。图21A显示在肝葡萄糖产生期间，糖原分解和糖异生的直接信号传导和转录调控。图21B显示肝葡萄糖产生(HGP)的转录控制。图21C显示肝葡萄糖产生、禁食/胰高血糖素、胰岛素抗性/DM2和钙与肥胖症之间的关联。将研究钙增加与HGP之间的关联。图21D-F显示钙、肝葡萄糖产生与细胞凋亡之间的关联的简要历史观点。图21D是显示晚期动脉粥样硬化中的巨噬细胞死亡的图。图21E是显示钙感受性信号传导分子钙/钙调蛋白依赖性蛋白质激酶II(CaMKII)的图。图21F是显示动脉粥样硬化中的巨噬细胞死亡的机制的图。图21G是显示在不受理论束缚下，CaMKII-γ可调控HGP的图。图21H-L显示胰高血糖素活化培养的原代鼠肝细胞中的CaMKII。图21H显示胰高血糖素活化原代鼠肝细胞中的CaMKII。图21I显示胰高血糖素与CaMKII的活化之间的关联。图21J显示胰高血糖素与钙增加之间的关联。图21K显示胰高血糖素在体内通过IP3R活化肝CaMKII。图21L显示在体内禁食活化且再喂食遏制肝CaMKII。图21M显示CaMKII在PKA诱导的由原代肝细胞达成的葡萄糖产生中起重要作用。图21N显示CamKII在原代肝细胞中的PKA和胰高血糖素介导的Gcpc和Pck1诱导中起重要作用。图21O是显示通过基因诱导的机制，禁食和胰高血糖素、CaMKII与葡萄糖产生之间的关联的图。图21P是显示HGP的转录控制的图。图21Q显示在血清饥饿原代肝细胞中，FoxO1处于核中。图21R显示CamKII在血清饥饿原代肝细胞中的FoxO1核定位中起重要作用。图21S显示CamKII在血清饥饿原代肝细胞中的FoxO1核定位中起重要作用。图21T显示核提取物的蛋白质印迹测定，其显示CaMKII在血清饥饿原代肝细胞中的FoxO1核定位中起重要作用。图21U是显示包括CRTC2-PGC1α途径的HGP的转录控制的图。图21V显示CaMKII不在原代肝细胞中的Pgc1诱导的CRTC2核定位中起作用。图21W是显示禁食和胰高血糖素产生、CaMKII、FoxO1与葡萄糖产生之间的关联的图。图21X呈现禁食CaMKIIγ-/-小鼠中的血糖和丙酮酸激发测试的体内证据。图21Y呈现禁食CaMKIIγ-/-小鼠中的肝Gcpc/Pck1mRNA和核FoxO1的体内证据。图21Z呈现禁食腺-K43ACaMKII转导的WT小鼠中的血糖和糖原储库的体内证据。图21AA呈现禁食腺-K43A CaMKII转导的WT小鼠中的肝Gcpc/Pck1mRNA和核FoxO1的体内证据。图21AB呈现胰高血糖素处理的腺-K43ACaMKII转导的WT小鼠中的肝Gcpc mRNA和糖原储库的体内证据。图21AC呈现禁食腺-CA CaMKII转导的WT小鼠中的血糖和丙酮酸激发测试的体内证据。图21AD呈现禁食和喂食的腺-CA CaMKII转导的WT小鼠中的肝Gcpc/Pck1mRNA的体内证据。图21AE呈现禁食和喂食的腺-CA CaMKII转导的WT小鼠中的核FoxO1的体内证据。图21AF-AH显示CaMKII缺乏对HGP的遏制作用是通过核外排FoxO1介导的原因证据。图21AF是指示在不受理论束缚下，CaMKII缺乏的作用可通过用组成型核FoxO-ADA转导来阻止的图。图21AG显示毛喉素处理的原代肝细胞中的G6pc/Pck1。图21AH显示禁食腺-K43A CaMKII转导的小鼠中的血糖水平以及血糖和FoxO1基因的相对mRNA水平。图21AI是显示CaMKII介导的通过FoxO1调控葡萄糖产生与肥胖症和胰岛素抗性的相关性的图。图21AJ显示在肥胖小鼠的肝中，CaMKIIγ被活化。图21AK显示在肥胖人的肝中，CaMKIIγ被活化。图21AL显示在肥胖小鼠中，CaMKIIγ缺乏降低血浆胰岛素且改善胰岛素敏感性。图21AM显示在肥胖小鼠中，CaMKIIγ缺乏改善肝对急性胰岛素的响应。图21AN-AO显示急性腺病毒介导的CaMKIIγ抑制改善ob/ob小鼠中的代谢参数。图21AP显示急性腺病毒介导的CaMKIIγ抑制降低G6pc和Pck1在ob/ob小鼠的肝中的表达。图21AQ显示急性腺病毒介导的CaMKIIγ抑制降低ob/ob小鼠的肝中的核FoxO1。图21AR显示CaMKIIγ缺乏减轻肥胖小鼠中的脂肪肝。图21AS显示CaMKII抑制降低ob/ob小鼠中的肝脂肪生成基因表达。图21AT显示CaMKIIγ缺乏部分降低肥胖小鼠中的血浆胆固醇和甘油三酯。图21AU显示CaMKIIγ缺乏降低肥胖小鼠中的肝TNFα。图21AV显示调控胰高血糖素诱导的葡萄糖产生的工作模型。未来研究包括但不限于HGP和葡萄糖利用的直接测定(钳夹研究)、CaMKII调控核FoxO1的机制、CaMKII缺乏可如何影响肝ER应激以及反之亦然、CaMKII缺乏对胰岛素敏感性具有什么影响、肝巨噬细胞中的CaMKII是否在肥胖症中起作用、CaMKII对动脉粥样硬化的影响以及CaMKII的治疗潜力。
图22A-E.CaMKII调控原代HC中的葡萄糖产生和肝G6Pc和Pck1表达。图22A通过RT-PCR探测来自3只WT小鼠和3只Camk2g-/-小鼠的HC的RNA以及来自WT小鼠的小鼠脑的RNA的指示Camk2亚型mRNA。图22B使来自WT小鼠和Camk2g-/-小鼠的HC经受过夜血清耗竭且接着在无血清和葡萄糖培养基中与毛喉素(10μm)一起孵育14小时，并接着测定培养基中的葡萄糖(在各组中相对于WT**P<0.01；平均值±S.E.M.)。图22C来自WT小鼠的HC用表达LacZ、CA-CaMKII或KD-CaMKII的腺病毒载体在MOI为20下转导且接着如图22B中测定葡萄糖产生(在各组中相对于LacZ*P<0.05且**P<0.01；平均值±S.E.M.)。图22D-22E使与图22B和图22C中的那些HC类似的HC经受过夜血清耗竭且接着如所指示，在无血清培养基中与10μM毛喉素或100nM胰高血糖素一起孵育5小时。通过RT-qPCR测定RNA的G6pc和Pck1mRNA(在各组中相对于LacZ或WT*P<0.05且**P<0.01；平均值±S.E.M.)。
图23A-G.体内CaMKIIγ缺乏或急性抑制降低血糖和肝G6pc和Pck1。图23A禁食12小时的8周龄WT小鼠和Camk2g-/-小鼠的血糖(*P<0.05)。图23B如同图23A中一样，但将小鼠禁食18小时且接着用2mg kg-1丙酮酸激发(图23B)。(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.005；平均值±S.E.M.)。图23C禁食12小时的WT小鼠和Camk2g-/-小鼠中的肝G6pc和Pck1mRNA(**P<0.01；***P<0.001；平均值±S.E.M.)。图23D用胰高血糖素(200μg kg-1)腹膜内注射WT小鼠和Camk2g-/-小鼠且在30分钟之后处死。测定肝G6pc mRNA(*P<0.05；平均值±S.E.M.)。图23E-G向9周龄WT小鼠施用1.5x109pfu的腺-LacZ或KD-CaMKII，且5天后测定禁食12小时的小鼠中的以下参数：图23E，血糖(***P<0.001；平均值±S.E.M.)；图23F，肝G6pc和Pck1mRNA(**P<0.01；***P<0.001；平均值±S.E.M.)；和图23G，肝糖原含量以及PAS阳性细胞(**P<0.01；平均值±S.E.M.)。图G也显示禁食WT小鼠和Camk2g-/-小鼠中的肝糖原含量(*P<0.05；平均值±S.E.M.)。对于所有图，除其中n＝4/组的图D之外，n＝5/组。
图24A-D.CaMKII调控肝FoxO1亚细胞定位。图24A在MOI为2下用表达鼠GFP-FoxO1的腺病毒转导来自WT小鼠和Camk2g-/-小鼠的HC。使细胞经受过夜血清耗竭且接着在无血清培养基中孵育5小时。通过间接免疫荧光评估FoxO1亚细胞定位。比例尺，10μm。在右图中定量数据。(#P<0.0005；平均值±S.E.M.)。图24B在MOI为20下用表达LacZ、CA-CaMKII或KD-CaMKII的腺病毒载体转导HC且接着在4小时之后用腺-GFP-FoxO1转导，随后如图24A中进行荧光显微测定和定量(相对于LacZ#P<0.005；平均值±S.E.M.)。比例尺，5μm。图24C如图24B中，用腺-LacZ或CA-CaMKII且接着用腺-GFP-FoxO1转导HC。在血清耗竭培养基中孵育过夜且接着在无血清培养基中孵育5小时之后，将细胞用100nM胰岛素处理指示时间。如图24B中定量FoxO1亚细胞定位(在各组中相对于LacZ*P<0.005；平均值±S.E.M.)。图24D通过免疫印迹探测来自以下小鼠的肝中的核FoxO1和核磷酸蛋白：禁食WT小鼠、Camk2g-/-小鼠或用腺-LacZ或KD-CaMKII处理的WT小鼠；用腺-LacZ或CA-CaMKII处理的喂食WT小鼠；或用200μgkg-1体重的胰高血糖素腹膜内处理30分钟的喂食WT小鼠。对于胰高血糖素实验，平均FoxO:Np密度计量比值在图中(*P＝0.029；泳道6和8中的瑕疵自密度计量分析排除)。
图25A-E.CaMKII抑制对葡萄糖代谢的损害由用组成型核FoxO1-ADA转导而得以挽救。图25A用腺-LacZ或CA-CaMKII转导来自野生型小鼠或L-FoxO1敲除小鼠的HC。使细胞经受过夜血清耗竭且接着在不存在或存在毛喉素(10μm)的情况下在无血清培养基中孵育5小时。测定RNA的G6pc mRNA(*P<0.001；平均值±S.E.M.)。图25B在MOI为0.2下向来自WT小鼠和Camk2g-/-小鼠的HC施用腺-LacZ或FoxO1-ADA。使细胞经受过夜血清耗竭且接着在无血清培养基中与10μM毛喉素一起孵育5小时。测定RNA的G6pc和Pck1mRNA(相对于WT组**P<0.01；相对于Camk2g-/-/LacZ组#P<0.05且##P<0.01；平均值±S.E.M.)。插图，通过免疫印迹探测来自一组平行细胞的核的FoxO1和核磷酸蛋白；平均密度计量比似乎低于各对泳道。图25C-E向8周龄WT小鼠施用腺-LacZ或KD-CaMKII，且接着在1天后，半数腺-KD-CaMKII小鼠接受腺-FoxO1-ADA，而另外半数接受腺-LacZ对照。在第5天在禁食12小时之后测定血糖水平(相对于LacZ/LacZ*P<0.05；相对于KD/LacZ#P<0.05；n＝5/组；平均值±S.E.M.)，且测定肝的核FoxO1蛋白质(相对于KD/LacZ**P<0.01；平均值±S.E.M.)；G6pc、Pck1和Igfbp1mRNA(相对于LacZ/LacZ*P<0.05且**P<0.01；相对于KD/LacZ#P<0.05；n＝3/组；平均值±S.E.M.)。图E的插图显示血凝素(HA)标记的KD-CaMKII蛋白质的水平(抗HA免疫印迹)。
图26A-C.FoxO1的非AKT磷酸位点在CaMKII介导的FoxO1核定位中的作用。图26A在MOI为2下用腺-FLAG-FoxO1转导来自WT小鼠和Camk2g-/-小鼠的HC。使细胞经受过夜血清耗竭且接着在无血清培养基中孵育5小时。使用抗FLAG免疫纯化FoxO1，随后进行还原、烷基化和蛋白水解消化。如实验程序中所述，通过TiO2色谱富集磷酸化肽且接着通过LC-MS/MS进行分析。表显示KO和WT样本中的磷酸化肽的光谱计数数值、Debunker计分和A计分；肽序列中的Δ指示磷酸化位点。光谱计数数值、Debunker计分和A计分的截断值分别设置在5、0.5和12下。手动检查计分(斜体字)低于这些值的肽的光谱以消除不确定的磷酸化位点(图31A-B针对WT肽4和5；且以引用的方式整体并入本文的http://fields.scripps.edu/published/foxo1_Tabas_2012/针对KO肽7、10和11)。仅计算KO和WT中的组合光谱计数>10的肽的KO/WT光谱计数比。图26B用编码鼠Flag-FoxO1或Flag-7A-FoxO1突变体的表达质粒转染来自L-FoxO1小鼠的HC。在48小时之后，使细胞经受过夜血清耗竭且接着在无血清培养基中与胰高血糖素(100nm)一起孵育4小时。通过免疫印迹测定核提取物的Flag和核磷酸蛋白(核装载对照)，且通过RT-qPCR探测来自一组平行细胞的RNA的Foxo1mRNA。mRNA和免疫印迹数据的密度计量定量显示于图中(*P<0.005；平均值±S.E.M.)图26C与图26B类似，例外之处是在用WT或突变FoxO1质粒转染之后1天，用腺-LacZ或CA-CaMKII转导HC(*P＝0.003；平均值±S.E.M.)。
图27A-D.CaMKII在肥胖症中的肝葡萄糖代谢中的作用图27A通过免疫印迹探测来自10周龄WT小鼠或ob/ob小鼠或喂食标准膳食或高卡路里膳食20周的WT小鼠(膳食诱导的肥胖症；DIO)的肝提取物的p-CaMKIIγ和总CaMKIIγ以及β-肌动蛋白。密度计量定量显示于条形图中(***P<0.001；平均值±S.E.M.)。通过来自DIOCamk2g-/-小鼠的肝提取物中不存在p-CaMKIIγ和总CaMKIIγ条带来显示抗体特异性。图27B-D在用腺-LacZ或KD-CaMKII处理之前或之后，ob/ob小鼠中的空腹血糖、在丙酮酸激发之后的血糖、以及肝G6pc、Pck1和Igfbp1mRNA(n＝5/组；相对于LacZ*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005且****P<0.001；平均值±S.E.M.)。
图28A-G.(与图1和22相关)。图28A小鼠用指示剂量的胰高血糖素腹膜内注射且在15分钟之后处死。通过免疫印迹探测肝的磷酸CaMKII和总CaMKII以及β-肌动蛋白。图28B小鼠(n＝5/组)被任意喂食或禁食12小时且接着测定血浆的胰高血糖素(*P＝0.007；平均值±S.E.M.)。图28C小鼠持续4天每天用10pmol g-1光溜海绵素C(XesC)或媒介物对照腹膜内注射且接着被任意喂食或禁食12小时。通过免疫印迹测定肝磷酸CaMKII、总CaMKII和β-肌动蛋白水平。图28D相对于CA-CaMKII，用腺-LacZ转导的HC中的CaMKII的免疫印迹。图28EHC用腺-LacZ或KD-CaMKII转导。使细胞经受过夜血清耗竭且接着测定CaMKII活性(*P<0.005；平均值±S.E.M.)。图28F相对于Camk2g-/-小鼠，来自WT小鼠的未处理HC中的G6pc和Pck1mRNA水平(*P0.05)。相较于图22D中毛喉素处理的WT HC中的mRNA水平，未处理WT HC中的G6pc和Pck1的水平分别降低约165倍和约2500倍。图28G如图28D中，来自Camk2g-/-小鼠的HC用腺-LacZ或KD-CaMKII转导，在培养基±毛喉素中孵育14小时，且接着测定G6pc mRNA(相对于其它2组*P<0.05；平均值±S.E.M.)。黑色圆圈表示毛喉素处理的腺-LacZ WT HC的G6pcmRNA值(1.99±0.3；相对于Camk2g-/-值*P<0.001；平均值±S.E.M.)。
图29A-E.与图23相关。图29A测定WT小鼠和Camk2g-/-小鼠以及用腺-LacZ或KD-CaMKII处理的WT小鼠(n＝5/组)的血浆中的空腹胰高血糖素和胰岛素水平；n.s.，不显著。图29B使来自用腺-LacZ或KD-CaMKII处理的小鼠的肝的CaMKII免疫沉淀(IP)且接着测定CaMKII活性。插图中的数据通过显示Camk2g-/-小鼠的肝中的激酶活性可忽略，且当非免疫IgG用于方案的CaMKII IP部分中时，激酶活性可忽略来验证CaMKII测定(*P<0.006；平均值±S.E.M.)。图29C-DWT小鼠用腺-LacZ或CA-CaMKII处理(n＝5/组)。在5天之后，测定小鼠在丙酮酸激发之前或之后的血糖，且接着在任意喂食一段时期之后，处死小鼠，且测定肝的G6pc和Pck1mRNA(*P<0.05；**P<0.01；***，P<0.005；平均值±S.E.M.)。图29E小鼠用腺-LacZ或CA-CaMKII处理(n＝5/组)。在5天之后，将小鼠禁食过夜且接着测定肝的糖原含量(*P<0.05；平均值±S.E.M.)。
图30A-D.与图24-25相关。图30A在MOI为1下用腺-LacZ或CA-CaMKII转导HC且在4小时之后用腺-GFP-FoxO1转导。在血清耗竭培养基中孵育过夜且接着在无血清培养基中孵育5小时之后，细胞用100nM胰岛素处理15分钟。定量FoxO1亚细胞定位。(*P<0.005；平均值±S.E.M.)。插图，通过免疫印迹探测来自一组平行细胞的溶解产物的CaMKII和β-肌动蛋白。图30B用编码G6PC启动子的含有完整FoxO结合位点(-1227WT)或突变FoxO结合位点(-1227Mut)的核苷酸-1227至+57的荧光素酶融合构建体转染FAO肝细胞。在不存在或存在0.1mM cAMP和1μM地塞米松的情况下孵育16小时之后，测量相对荧光素酶活性。相对所有其它组*P<0.001；相对于未处理Mut**P＝0.009(平均值±S.E.M.)。图30C通过免疫印迹探测来自腺-LacZ和KD-CaMKII处理的小鼠的肝的核的CREB或Crtc2和核磷酸蛋白(Np)，且探测胰高血糖素处理的来自WT小鼠或Camk2g-/-小鼠的HC的细胞提取物的p-CREB和β-肌动蛋白。图30D探测来自胰高血糖素处理的来自WT小鼠或Camk2g-/-小鼠的HC的核的Crtc2和核磷酸蛋白(Np)。
图31A-F.与图26相关—FoxO1磷酸化。图31A对来自禁食WT小鼠和Camk2g-/-小鼠的肝的提取物进行免疫印迹以测定磷酸T24-FoxO1、磷酸253-FoxO1和磷酸316-FoxO1以及β-肌动蛋白。图31B对来自禁食腺-FoxO1处理的WT小鼠和Camk2g-/-小鼠的肝的提取物进行免疫印迹以测定乙酰化FoxO1(Ac-FoxO1)和β-肌动蛋白。平均Ac-FoxO:β-肌动蛋白密度计量比值似乎低于印迹；n.s.，不显著。图31C具有用粗体表示的鉴定磷酸位点的鼠FoxO1序列；与图26、31F和32相关的关键残基的数据概述在下方显示于序列下方的项目清单中。图31D来自Camk2g-/-HC的4号磷酸化肽的MS/MS光谱和b、y离子表。图31E来自Camk2g-/-HC的5号磷酸化肽的MS/MS光谱和b、y离子表。图31F与图26B中的实验类似，例外之处是L-Foxo1HC用FLAG-9A-FoxO1突变体而非FLAG-7A-Foxo1转染(*P＝0.006；**P＝0.02；平均值±S.E.M.)。
图32A-E.与图26相关—p38。图32A小鼠被任意喂食或禁食12小时。通过免疫印迹测定肝磷酸p38、总p38、p-MK2、总MK-2和β-肌动蛋白。图32B使WT HC经受过夜血清耗竭且接着在有或无SB202190的无血清培养基中与100nm胰高血糖素一起孵育5小时；或将胰高血糖素添加至来自用腺-LacZ(对照)或腺-Cre处理的P38afl/fl小鼠的HC中。测定RNA的G6pc和Pck1mRNA(*P<0.05；平均值±S.E.M.)。图32C测定来自禁食WT小鼠和Camk2g-/-小鼠的HC的p-p38、总p38和β-肌动蛋白。图32D WT小鼠用12.5mg kg-1体重的p38抑制剂(SB202190)或媒介物对照腹膜内注射。在12小时之后，小鼠用额外剂量的SB202190注射且禁食过夜。测定肝的核FoxO1、核磷酸蛋白、p-MK2、总MK-2和β-肌动蛋白。核FoxO1与p-MK2条带强度之间的关联显示于图中。图32E使腺-GFP-FoxO1转导的HC经受过夜血清耗竭，且接着在具有SB202190或媒介物(Veh)对照的无血清培养基中孵育5小时。通过间接免疫荧光评估FoxO1定位(比例尺，10μm；*P<0.05；平均值±S.E.M.)。
图33A-D.钙调神经磷酸酶促进禁食期间的CRTC2活化。图33A.Ser/Thr磷酸酶抑制剂(冈田酸(OA)、环孢菌素A(CsA))对CRTC2脱磷酸和CRE-荧光素酶(luc)报道体(reporter)活化的影响(*P<0.001；n＝3)。图33B.胰高血糖素(Gcg)对肝细胞中的野生型(WT)和钙调神经磷酸酶缺陷型(ΔCalna)CRTC2的脱磷酸(左侧)和活性(右侧)的影响(*P<0.001；n＝3)。图33C.钙调神经磷酸酶A过度表达(左侧)或敲低(右侧)对肝细胞的CRTC2脱磷酸(顶部)、CRE-luc报道体活性(中间，*P<0.001；n＝3)和葡萄糖输出(底部，*P<0.001；n＝3)的影响。图33D.肝钙调神经磷酸酶过度表达(左侧)或敲低(右侧)对禁食6-8小时的小鼠中的CRE-luc活性、糖异生基因(Pck1、G6pc)表达和血糖浓度的影响(*P<0.01；n＝5)。对于这个图和其它图，数据显示为平均值±s.e.m。
图34A-D.胰高血糖素通过活化InsP3受体来刺激CRTC2脱磷酸。图34A.通过荧光成像来显示胰高血糖素(Gcg)对肝细胞中的钙移动的影响。显示在敲低所有3个InsP3R家族成员之后的钙移动和钙调神经磷酸酶活化(*P<0.001；n＝3)。图34B.钙螯合剂(BAPTA)对CRTC2脱磷酸和CRE-luc活化的影响(*P<0.001；n＝3)。图34C.InsP3R耗竭对肝细胞的CRTC2脱磷酸、CRE-luc活性和葡萄糖输出的影响(*P<0.001；n＝3)。图34D.肝InsP3R敲低对CRE-luc活性、血糖和糖异生基因表达的影响(*P<0.01；n＝5)。
图35A-F.胰高血糖素通过PKA依赖性InsP3R磷酸化来刺激CRTC2活性。图35A和B.使用磷酸PKA底物抗血清获得的InsP3R1免疫沉淀的免疫印迹，其显示H89(A)和在一个或两个(DM)PKA共有位点(Ser1589、Ser1756)处的Ala突变(B)对暴露于胰高血糖素(Gcg)的肝细胞中的InsP3R1磷酸化的影响。显示野生型InsP3R1和PKA突变InsP3R1对响应于Gcg的钙移动的影响(B)(*P<0.001；n＝3)。图35C和D.野生型InsP3R1或PKA缺陷型InsP3R1(DM)对肝细胞的钙调神经磷酸酶(Calna)活化(C)和CRTC2脱磷酸(C)以及CRE-luc活化(D)和葡萄糖输出(D)的影响(*P<0.001；n＝3)。图35E.野生型InsP3R1和PKA缺陷型InsP3R1对肝CRE-luc活性、空腹血糖和糖异生基因表达(G6pc、Pck1)的影响(相对于野生型*P<0.01；n＝5)。图35F.原代肝细胞中的CRTC2与InsP3R1的共免疫沉淀。指示对胰高血糖素(100nM；15分钟)的暴露。显示核(Nu)和核后(p/Nu)上清液部分中的CRTC2和InsP3R1的输入水平。
图36A-C.糖尿病中的InsP3R活性被上调。图36A.瘦小鼠和db/db小鼠中的肝CRE-luc和钙调神经磷酸酶活性(*P<0.001；n＝5)。图36B.显示任意喂食瘦小鼠、db/db小鼠或ob/ob小鼠的肝中的InsP3R家族成员的相对量和磷酸化的免疫印迹。指示在PKA或AKT位点处的InsP3R磷酸化。图36C.RNAi介导的InsP3R或钙调神经磷酸酶A耗竭对db/db小鼠中的CRE-luc活性、糖异生基因表达和肝葡萄糖产生的影响，通过丙酮酸耐受性测试所测定(*P<0.01；n＝5)。
图37A-E.胰高血糖素通过钙调神经磷酸酶依赖性机制来刺激肝细胞中的CRTC2活性。图37A.Ser/Thr磷酸酶抑制剂(冈田酸(OA)、环孢菌素A(CsA))对暴露于胰高血糖素(Gcg)的原代小鼠肝细胞中的CRTC2定位的影响。比例尺，5μm。图37B.钙调神经磷酸酶抑制剂(钙调神经磷酸酶自体抑制性肽(CAP)，CN585)和PP1/PP2A抑制剂(花萼海绵体诱癌素A)对原代肝细胞中的CRE-荧光素酶报道体活性的影响(*P<0.001；n＝3)。图37C和D.野生型CRTC2和磷酸化缺陷型(S171A、S275A)活性CRTC2突变体对CRE-luc活性(C)(*P<0.001；n＝3)和CRTC2细胞定位的影响图37D.指示的胰高血糖素处理。比例尺，5μm。图37E.CsA对表达野生型CRTC2或组成型活性(S171A/S275A)突变CRTC2的细胞中的CRE-luc活性的影响(*P<0.001；n＝3)。NS，无统计差异。
图38A-D.钙调神经磷酸酶调节肝细胞中的CRTC2活性。图38A.对CRTC2中的钙调神经磷酸酶结合位点的分析。示意图中指示不同CRTC2多肽和氨基酸取代/缺失。显示自HEK293T细胞中的HA标记的钙调神经磷酸酶(Calna)的IP回收的flag标记的CRTC2的免疫印迹。图38B.显示原代肝细胞的培养物中野生型CRTC2多肽和突变CRTC2多肽与钙调神经磷酸酶的相对结合的共免疫沉淀测定。指示用编码野生型或钙调神经磷酸酶缺陷型(ΔCalna)Flag标记的CRTC2加HA标记的钙调神经磷酸酶A(Calna)的腺病毒感染的细胞。显示自HA-钙调神经磷酸酶IP回收CRTC2多肽。图38C.暴露于胰高血糖素的肝细胞中的野生型(WT)CRTC2和钙调神经磷酸酶缺陷型(ΔCalna)CRTC2的核穿梭。比例尺，5μm。图38D.使用磷酸PKA底物抗体(抗RRXpS/T)测定的Calna过度表达(O.E.)或通过RNAi介导的敲低达成的耗竭对肝细胞中的下游PKA信号传导的影响。
图39A-B.钙调神经磷酸酶调控肝中的CRTC2活性。钙调神经磷酸酶(Calna)过度表达(A)或RNAi介导的耗竭(B)对禁食小鼠的肝中的禁食诱导性CREB靶标基因(Nr4a1、Nr4a2、Pgc1α)的mRNA量的影响(*P<0.01；n＝5)。显示相较于对照，来自钙调神经磷酸酶过度表达或敲低小鼠的肝中的相对钙调神经磷酸酶蛋白质量的免疫印迹。
图40A-C.钙调神经磷酸酶和InsP3R通过调节CRTC2活性来调控糖异生。图40A-B.腺病毒编码的Crtc2RNAi对如所指示表达腺病毒编码的钙调神经磷酸酶或InsP3R1的禁食小鼠中的血糖浓度(A)和肝基因表达(B)的影响。n＝4。NS，无统计差异。图40C.显示图A和B中表征的小鼠中的CRTC2、钙调神经磷酸酶(Calna)和InsP3R1的肝蛋白质量的免疫印迹。
图41A-C.胰高血糖素刺激肝细胞中的钙移动。图41A和B.通过荧光成像测定的胰高血糖素(Gcg)和PKA抑制剂H89对原代肝细胞中的钙移动的影响(*P<0.001；n＝3)。图41C.通过对用磷酸PKA底物抗血清对来自暴露于胰高血糖素(Gcg)的原代肝细胞的溶解产物制备的免疫沉淀的MS分析鉴定的InsP3R1肽。
图42A-E.InsP3受体为响应于cAMP激动剂的CRTC2活化所需。图42A、B.光溜海绵素C(Xc)对暴露于毛喉素(FSK)的原代肝细胞中的钙移动和CRTC2脱磷酸(A)以及对葡萄糖-6-磷酸酶(G6pc)和PEPCK(Pck1)的mRNA量(B)的影响(*P<0.001；n＝3)。图42C-E.胰高血糖素对来自InsP3R2敲除小鼠和对照同窝小鼠的原代肝细胞中的钙移动和钙调神经磷酸酶活化(C)(*P<0.001；n＝4)以及CRE-luc报道体活化和葡萄糖分泌(D)(*P<0.001；n＝4)和CRTC2脱磷酸(E)的影响。图42E.右侧条形图显示暴露于胰高血糖素的野生型肝细胞和InsP3R2敲除肝细胞中的相对CRTC2脱磷酸，通过密度计量术所测定(*P<0.01；n＝3)。
图43A-E.InsP3R调节肝糖异生。图43A.RNAi介导的所有3个InsP3R家族成员耗竭对禁食肝中的钙调神经磷酸酶活化的影响(*P<0.001；n＝5)。图43B和C.肝InsP3R敲低对小鼠的肝中的禁食诱导性CREB靶标基因的mRNA量(B)以及对InsP3R蛋白质量(C)的影响(*P<0.01；n＝5)。图43D和E.野生型小鼠和InsP3R2敲除小鼠中的通过丙酮酸耐受性测试测量的肝糖异生(D)(*P<0.02；**P<0.01；n＝4)和糖异生基因表达(E)(*P<0.01；n＝4)。免疫印迹显示来自对照小鼠和InsP3R2敲除小鼠的肝提取物中的InsP3R2蛋白质量。
图44A-D.胰高血糖素通过PKA介导的磷酸化来调节InsP3R活性。图44A.使用磷酸PKA底物抗血清对自原代肝细胞制备的InsP3R的免疫沉淀获得的显示胰高血糖素(Gcg)对InsP3R磷酸化的影响的免疫印迹。图44B.显示禁食6-8小时的肝或再喂食2小时小鼠肝中在PKA或AKT位点处的InsP3R磷酸化的免疫印迹。图44C和D.野生型InsP3R1和PKA缺陷型(DM)InsP3R1对禁食肝中的钙调神经磷酸酶(Calna)活化(C，*P<0.001,n＝5)和CREB靶标基因(D，*P<0.01,n＝5)的影响。右侧，显示用编码野生型InsP3R1或PKA缺陷型(DM)InsP3R1的腺病毒注射的小鼠的肝中的相对InsP3R蛋白质量的免疫印迹。
图45A-I.肝细胞中InsP3R与CRTC2的缔合。图45A.自抗CRTC2免疫沉淀回收的InsP3R1肽(根据MS分析)。图45B.显示自HEK293T细胞中的HA标记的InsP3R1的IP回收的Flag标记的CRTC2的量的共免疫沉淀测定。图45C和D.对CRTC2(C)和InsP3R1(D)中为CRTC2:InsP3R1相互作用所需的区域的缺失分析。各示意图中指示相互作用胜任性CRTC2和InsP3R1多肽(+)。图45E.InsP3R耗竭对暴露于胰高血糖素(Gcg)的肝细胞中的与ER富集的高密度微粒体(HDM)以及胞质液(Cyto)和核(Nucl)部分相关的CRTC2蛋白质量的影响。指示各部分中的ER定位(GRP78)、胞质液(微管蛋白)和核(CREB)蛋白质的相对量。图45F.InsP3R耗竭对肝细胞中的CRTC2定位的影响。比例尺，5μm。图45G-I.野生型、InsP3R缺陷型(ΔCBD，51-692aa)和豆蔻酰化CRTC2突变多肽的细胞定位(G)、磷酸化状态(H)和活性(I)(*P<0.001；n＝3)。比例尺，5μm。
图46A-D.胰岛素通过AKT介导的InsP3R磷酸化来下调CRTC2活性。图46A.左侧，使用磷酸AKT底物抗血清对自原代肝细胞制备的InsP3R的免疫沉淀获得的显示胰岛素(INS)对InsP3R磷酸化的影响的免疫印迹。底部右侧，胰岛素(INS)对野生型InsP3R1和在共有AKT磷酸化位点(Ser2682)处含有丙氨酸取代的突变InsP3R1的磷酸化的影响。图46B.胰岛素对表达野生型InsP3R1或AKT缺陷型(S2682A)InsP3R1的原代肝细胞中的胰高血糖素(Gcg)诱导的钙移动和钙调神经磷酸酶(Calna)活化的影响(*P<0.001；n＝3)。图46C.野生型InsP3R1和AKT缺陷型(S2862A)InsP3R1对肝细胞的CRTC2脱磷酸(顶部)、CRE-luc报道体活化(底部左侧)和葡萄糖输出(底部右侧)的影响(*P<0.001；n＝3)。图46D.野生型InsP3R1和AKT缺陷型(S2682A)InsP3R1对禁食或再喂食小鼠中的CRE-luc活性、血糖和CREB靶标基因表达(G6pc、Pck1、Nr4a1、Nr4a2、Pgc1α)的影响(*P<0.01；n＝5)。底部右侧，显示用编码野生型InsP3R1或AKT缺陷型(S2682A)InsP3R1的腺病毒注射的小鼠的肝中的相对InsP3R蛋白质量的免疫印迹(*P<0.01；n＝5)。
图47A-C.肥胖症中的肝cAMP信号传导和钙调神经磷酸酶活性增加。图47A和B.瘦小鼠、db/db小鼠和ob/ob小鼠中的肝CRE-luc报道体活性和钙调神经磷酸酶活性(A)以及cAMP含量(B)(*P<0.001；n＝5)。图47C.用Insp3r或Calna RNAi腺病毒注射的小鼠的肝中的InsP3R和钙调神经磷酸酶(Calna)蛋白质量的免疫印迹。
图48.禁食和喂食途径通过对InsP3R活性的拮抗作用来调控CRTC2依赖性糖异生。禁食信号传导通过PKA依赖性磷酸化来活化InsP3R，从而导致钙调神经磷酸酶(Calna)活性和随后CRTC2脱磷酸增加。相反，喂食通过AKT依赖性磷酸化抑制InsP3R活性，从而阻断钙调神经磷酸酶依赖性CRTC2脱磷酸。
图49A-S.IP3R在培养的肝细胞中的毛喉素/胰高血糖素诱导的G6Pase/PEPCK中的作用以及在体内空腹血糖中的作用。图49A、B.FSK诱导的G6Pase和PEPCK是钙依赖性的。图49C-D.IP3R活性为毛喉素和胰高血糖素诱导的G6Pase和PEPCK所需(FAO大鼠肝细胞细胞系)。图49E-F.IP3R活性为毛喉素诱导的G6Pase和PEPCK所需(原代鼠肝细胞)。图49G-H.IP3R1反义寡核苷酸遏制毛喉素诱导的G6Pase和PEPCK(原代鼠肝细胞)。图49I.毛喉素活化FAO肝细胞中的IP3R活性(肌醇/ATP诱导的钙释放测定)。图49J.PKA抑制剂H89遏制毛喉素诱导的IP3R活化。图49K-L.IP3R活性为毛喉素诱导的PGC1α所需。图49M-N.钙调神经磷酸酶抑制性肽遏制毛喉素诱导的G6Pase和PEPCK。图49O.IP3R活性为毛喉素诱导的钙调神经磷酸酶活化所需。图49P-Q.IP3R活性为毛喉素诱导的TORC2脱磷酸和核定位所需。图49R.TORC2转导部分恢复IP3R抑制的肝细胞中的毛喉素诱导的G6Pase。图49S.光溜海绵素C处理降低C57BL/6J小鼠中的空腹葡萄糖水平。
图50A-M.IP3R在肥胖症/胰岛素抗性诱导的高血糖和糖异生中的作用。图50A.光溜海绵素C处理ob/ob小鼠抑制新鲜分离的腹膜腔巨噬细胞中的IICR的IP3R测定的证据。图50B-E.抑制IP3R降低ob/ob小鼠中的空腹血糖水平。图50F.抑制IP3R降低ob/ob中的肝PEPCK、G6Pase和PGC1α表达。图50G-I.抑制IP3R降低作为ER应激和胰岛素抗性的模型的棕榈酸盐处理的肝细胞中的PEPCK、G6Pase和PGC1α表达。图50J-K.抑制IP3R降低作为胰岛素抗性的模型的Akt抑制的肝细胞中的G6Pase和PEPCK表达。图50L.IP3R活性为毛喉素诱导的TORC2脱磷酸所需。图50M.IP3R活化为TORC2核保留所需。
图51.显示IP3R途径的图。
图52.CA-CaMKII不增加p38缺乏的肝细胞中的核FoxO1。用腺-LacZ或腺-Cre转导来自p38fl/fl小鼠的原代肝细胞(HC)。在12小时之后，半数细胞用腺-CA-CaMKII转导而另外半数用腺-LacZ转导。细胞在血清耗竭培养基中孵育过夜且接着在无血清培养基中孵育5小时。通过免疫印迹测定核提取物的FoxO1和核磷酸蛋白(Np)。
图53A-B.MK-2调控肝FoxO1亚细胞定位和肝G6Pc和Pck1。图53A.使腺-GFP-FoxO1转导的HC经受过夜血清耗竭，且接着在具有2uM MK-2抑制剂或媒介物(Veh)对照的无血清培养基中孵育30分钟。通过间接免疫荧光评估FoxO1定位(比例尺，10μm；*P<0.005；平均值±S.E.M.)。图53B使WT HC经受过夜血清耗竭且接着在有或无MK-2抑制剂的无血清培养基中与100nm胰高血糖素一起孵育5小时。测定RNA的G6pc和Pck1mRNA(*P<0.005；平均值±S.E.M.)。MK-2抑制剂来自Calbiochem(目录号475864)：2-(2-喹啉-3-基吡啶-4-基)-1,5,6,7-四氢-4H-吡咯并-[3,2-c]吡啶-4-酮。
图54.p38缺乏遏制衣霉素诱导的UPR活化。将衣霉素添加至来自用腺-LacZ对照或腺-Cre转导的p38fl/fl小鼠的HC中。对溶解产物进行免疫印迹以测定p-PERK、PERK、CHOP、p58IPK和肌动蛋白。
图55.p38缺乏遏制棕榈酸盐诱导的UPR活化。将棕榈酸盐添加至来自用腺-LacZ对照或腺-Cre转导的p38fl/fl小鼠的HC中。对溶解产物进行免疫印迹以测定p-PERK、CHOP和肌动蛋白。
图56.HC中的急性胰岛素诱导的p-AKT由p38缺乏增强。如同图55中一样，例外之处是HC用100nM胰岛素处理5分钟。对溶解产物进行免疫印迹以测定p-Akt、Akt和肌动蛋白。
图57A-E.图57A.小鼠被任意喂食或禁食12小时。通过免疫印迹测定肝磷酸p38、总p38、p-MK2、总MK-2和β-肌动蛋白。图57B使WT HC经受过夜血清耗竭且接着在有或无SB202190的无血清培养基中与100nm胰高血糖素一起孵育5小时；或将胰高血糖素添加至来自用腺-LacZ(对照)或腺-Cre处理的P38afl/fl小鼠的HC中。测定RNA的G6pc和Pck1mRNA(*P<0.05；平均值±S.E.M.)。图57C.测定来自禁食WT小鼠和Camk2g-/-小鼠的HC的p-p38、总p38和β-肌动蛋白。图57D.WT小鼠用12.5mg kg-1体重的p38抑制剂(SB202190)或媒介物对照腹膜内注射。在12小时之后，小鼠用额外剂量的SB202190注射且禁食过夜。测定肝的核FoxO1、核磷酸蛋白、p-MK2、总MK-2和β-肌动蛋白。核FoxO1与p-MK2条带强度之间的关联显示于图中。图57E.使腺-GFP-FoxO1转导的HC经受过夜血清耗竭，且接着在具有SB202190或媒介物(Veh)对照的无血清培养基中孵育5小时。通过间接免疫荧光评估FoxO1定位(比例尺，10μm；*P<0.05；平均值±S.E.M.)。
图58.p38缺乏降低衣霉素诱导的UPR活化。在MOI为5下用对照腺-LacZ(Ad-LacZ)或用以缺失p38的腺-Cre(Ad-Cre)转导来自p38αflox/flox小鼠的原代肝细胞。在36小时之后，细胞用0.5ug/ml衣霉素处理4小时。接着对溶解产物进行免疫印迹以测定p-Perk、CHOP、Trb3、p58IPK和肌动蛋白。
图59.p38缺乏钝化棕榈酸盐诱导的胰岛素抗性。在MOI为5下用腺-LacZ(Ad-LacZ)或腺-Cre(Ad-Cre)转导来自p38fl/fl小鼠的原代肝细胞。在24小时之后，细胞用棕榈酸盐处理过夜。在与棕榈酸盐一起在无血清培养基中孵育5小时之后，细胞用100nM胰岛素处理5分钟。接着对溶解产物进行免疫印迹以测定p-Akt、Akt、肌动蛋白、p-perk、CHOP和Trb3。
图60.CA-CaMKII不增加p38缺乏的肝细胞中的核FoxO1：CaMKII和p38处于相同信号传导途径中的证据。在MOI为5下用腺-LacZ(Ad-LacZ)或腺-Cre(Ad-Cre)过夜转导来自p38fl/fl小鼠的原代肝细胞，随后在MOI为1下用腺-LacZ或腺-CA-CaMKII(CA)转导。在12小时之后，使细胞经受过夜血清耗竭且接着在无血清培养基中孵育4小时。通过免疫印迹测定核提取物的FoxO1和核磷酸蛋白(核装载对照)。
图61.显性阴性(DN)-MK2遏制毛喉素诱导的Pck1和G6Pc诱导。用表达LacZ或DN-MK2的腺病毒载体转导来自WT小鼠的原代肝细胞。接着使细胞经受过夜血清耗竭且接着在无血清培养基中与2μM毛喉素一起孵育5小时。通过RT-qPCR测定RNA的G6pc和Pck1mRNA。*，P<0.0001
图62.DN-MK2降低核FoxO1水平。在MOI为1下用腺-LacZ(LacZ)或腺-DN-MK2(DN-MK2)转导来自WT小鼠的原代肝细胞。在24小时之后，使细胞经受过夜血清耗竭且接着在无血清培养基中孵育4小时。通过免疫印迹测定核提取物的FoxO1和核磷酸蛋白(核装载对照)。
图63.组成型活性(CA)-CaMKII不增加MK-2抑制的肝细胞中的核FoxO1：CaMKII和MK2处于相同信号传导途径中的证据。在MOI为1下用腺-LacZ(LacZ)或腺-DN-MK2(DN-MK2)过夜转导来自WT小鼠的原代肝细胞，随后在MOI为1下用腺-LacZ或腺-CA-CaMKII(CA-CaMKII)转导。在12小时之后，使细胞经受过夜血清耗竭且接着在无血清培养基中孵育4小时。通过免疫印迹测定核提取物的FoxO1和核磷酸蛋白(核装载对照)。
图64.肝MK-2抑制不改变体重或食物摄取。用1x10^9pfu的含有对照LacZ(n＝5)或DN-MK-2(n＝5)的腺病毒注射10周龄ob/ob小鼠
图65.肝MK-2抑制改善肥胖小鼠中的高血糖。用1x10^9pfu的含有对照LacZ(n＝5)或DN-MK-2(n＝5)的腺病毒注射10周龄ob/ob小鼠。在第3天在禁食6小时之后的血糖水平；**＝p<0.05
图66.肝MK-2抑制改善肥胖小鼠中的高血糖(绝对值)。在第5天进行葡萄糖耐受性测试(0.5g/kg腹膜内)(对于各组，n＝5)*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.005
图67.肝MK-2抑制改善肥胖小鼠中的高血糖(相对于时间＝0)。在第5天进行葡萄糖耐受性测试(0.5g/kg腹膜内)(对于各组，n＝5)*＝p<0.05,**＝p<0.01,***＝p<0.005
图68.肝MK-2抑制改善肥胖小鼠的高胰岛素血症。用1x10^9pfu的含有对照LacZ(n＝5)或DN-MK-2(n＝5)的腺病毒注射10周龄ob/ob小鼠。在第8天在禁食6小时之后的血清胰岛素水平；**＝p<0.05
图69.MK-2抑制剂遏制原代肝细胞中的毛喉素诱导的Pck1和G6Pc诱导。使来自WT小鼠的原代肝细胞经受过夜血清耗竭且接着用300nM MK-2抑制剂(化合物28)或媒介物预处理1小时。细胞接着于有或无抑制剂的无血清培养基中用2μM毛喉素处理4小时。通过RT-qPCR测定RNA的G6pc和Pck1mRNA。*，P<0.0001。
图70-76显示在肥胖小鼠中进行的MK-2抑制剂研究(来自Huang等的化合物28*)。通过腹膜内注射(以150ul总体积)每日向ob/ob小鼠施用-MK-2抑制剂(10μg/小鼠；0.2mg/kg)或媒介物对照1次。参见Huang X,Zhu X,Chen X,Zhou W,Xiao D,Degrado S,AslanianR,Fossetta J,Lundell D,Tian F,Trivedi P,Palani A.Bioorg Med Chem Lett.2012年1月1日；22(1):65-70,“A three-step protocol for lead optimization:quickidentification of key conformational features and functional groups in theSAR studies of non-ATP competitive MK2(MAPKAPK2)inhibitors”.Department ofMedicinal Chemistry,Merck Research Laboratories,2015Galloping Hill Road,Kenilworth,NJ07033,USA。
图70显示MK-2抑制剂不改变体重。通过腹膜内注射每日向10周龄ob/ob小鼠施用MK-2抑制剂1次(150ul总体积)。
图71显示MK-2抑制剂不改变食物摄取。通过腹膜内注射每日向10周龄ob/ob小鼠施用MK-2抑制剂1次(150ul总体积)。
图72显示MK-2抑制剂降低空腹血糖。通过腹膜内注射每日向10周龄ob/ob小鼠施用MK-2抑制剂1次(150ul总体积)。在第5天的6小时空腹血糖水平。*，p<0.05
图73显示MK-2抑制剂改善肥胖小鼠中的高血糖。通过腹膜内注射每日向10周龄ob/ob小鼠施用MK-2抑制剂1次(150ul总体积)。在第7天进行葡萄糖耐受性测试(0.5g/kg腹膜内)。*，p<0.05
图74显示MK-2抑制剂改善肥胖小鼠中的胰岛素抗性。通过腹膜内注射每日向10周龄ob/ob小鼠施用MK-2抑制剂1次(150ul总体积)。在第12天进行胰岛素耐受性测试(1.5IU/kg)。*，p<0.05
图75显示MK-2抑制剂降低空腹胰岛素水平。通过腹膜内注射每日向10周龄ob/ob小鼠施用MK-2抑制剂1次(150ul总体积)。在第10天的6小时空腹胰岛素水平。*，p<0.05
图76显示MK-2抑制剂不改变总WBC。通过腹膜内注射每日向10周龄ob/ob小鼠施用MK-2抑制剂1次(150ul总体积)。在第18天的总WBC计数水平。
图77.由p38达成的FoxO1体外磷酸化。使1ug WT GST-FoxO1或GST对照与25ug活化p38(Upstate Biotechnology)一起在15ul激酶缓冲液中在30℃下孵育30分钟，所述缓冲液含有25mMTris-HCl(pH7.5)、5mMβ-甘油磷酸酯、2mM二硫苏糖醇(DTT)、0.1mM Na3VO4、10mMMgCl2和2.5μCi[γ-32P]ATP。通过SDS-PAGE分离样本且通过放射自显影进行观察，随后进行免疫印迹分析。
图78.由MK-2达成的FoxO1体外磷酸化。使1ug WTGST-FoxO1、GST(对照)或GST-Hsp25与或不与25ug活化MK-2(Upstate Biotechnology)一起在15ul激酶缓冲液中在30℃下孵育30分钟，所述缓冲液含有25mM Tris-HCl(pH7.5)、5mMβ-甘油磷酸酯、2mM二硫苏糖醇(DTT)、0.1mM Na3VO4、10mM MgCl2和2.5μCi[γ-32P]ATP。通过SDS-PAGE分离样本且通过放射自显影进行观察，随后进行免疫印迹分析。
图79.显性-阴性MK2降低ob/ob小鼠中的肝G6pc。用1x109pfu的含有对照LacZ(n＝5)或DN-MK2(n＝5)的腺病毒注射9周龄ob/ob小鼠。在注射之后8天分析肝G6pc mRNA。(*p<0.05)。
图80.MK-2抑制剂降低ob/ob小鼠的肝中的FoxO1靶基因。通过腹膜内注射，每日用MK-2抑制剂(0.2mg/kg)或媒介物对照处理10周龄ob/ob小鼠1次，持续20天。通过qRT–PCR分析肝G6pc、Pck1和Igfbp-1mRNA。(*p<0.05，**p<0.05)。图80-85中使用的MK-2抑制剂是以下中所述的化合物28：Huang X,Zhu X,Chen X,Zhou W,Xiao D,Degrado S,Aslanian R,Fossetta J,Lundell D,Tian F,Trivedi P,Palani A.Bioorg Med Chem Lett.2012年1月1日；22(1):65-70,“Athree-step protocol for lead optimization:quickidentification of key conformational features and functional groups in theSAR studies of non-ATP competitive MK2(MAPKAPK2)inhibitors”.Department ofMedicinal Chemistry,Merck Research Laboratories,2015Galloping Hill Road,Kenilworth,NJ07033,USA。
图81：MK-2抑制剂改善ob/ob小鼠中的肝胰岛素信号传导。通过腹膜内注射，每日用MK-2抑制剂(0.2mg/kg)或媒介物对照处理10周龄ob/ob小鼠1次，持续20天。在禁食6小时之后，通过门静脉将胰岛素(2IU/kg)注射至小鼠中，持续3分钟。通过蛋白质印迹分析肝磷酸Akt(丝氨酸473)和总Akt水平。免疫印迹数据的密度计量定量显示于图中。(*p<0.05)。
图82.MK-2抑制剂降低ob/ob小鼠的肝中的Chop和Trib3mRNA。如同图80中一样，例外之处是分析肝Chop和Trb3mRNA水平。(*p<0.05)。
图83.MK-2抑制剂降低ob/ob小鼠的肝中的FA合成mRNA和Tnfa mRNA。如同图80中一样，例外之处是分析肝Fas、Scd1、Srebp1、Tnfa mRNA水平。(*p<0.05)。
图84.MK-2抑制剂介导的FBG降低与二甲双胍是累加性的。每日1次用媒介物对照、单独MK-2抑制剂(0.2mg/kg)、单独二甲双胍(250mg/kg)或MK-2抑制剂与二甲双胍的注射处理10周龄ob/ob小鼠，持续5天。显示6小时空腹血糖水平。(*p<0.05)。
图85.MK-2抑制剂介导的肝G6pc降低与二甲双胍是累加性的。如同图84中一样，例外之处是通过qRT–PCR分析肝G6Pc mRNA。(*p<0.05)。
图86.p38缺乏遏制衣霉素诱导的UPR活化和Trb3上调。在MOI为10下用表达LacZ或Cre的腺病毒载体转导来自p38floxed小鼠的原代小鼠肝细胞。在转染之后36小时，细胞用衣霉素(1μg/ml)处理4小时。通过免疫印迹测定细胞溶解产物的磷酸Perk、Perk、Chop、β-肌动蛋白和Trb3。
图87.p38缺乏遏制Trb3mRNA水平。在MOI为10下用表达LacZ或Cre的腺病毒载体转导来自p38floxed小鼠的原代小鼠肝细胞。在转染之后24小时，细胞用棕榈酸盐(300μm)处理18小时。通过qRT–PCR测定Trb3mRNA。(，P<0.0005；*，P<0.0001)。
图88.p38-/-肝细胞中的急性胰岛素诱导的p-AKT增强由用Ad-Trb3转导而得以挽救。在MOI为10下用表达LacZ或Cre的腺病毒载体转导来自p38floxed小鼠的原代小鼠肝细胞。在过夜孵育之后，半数腺-Cre处理的细胞用腺-Trb3转导而其余细胞接受腺-LacZ。在12小时之后，细胞用棕榈酸盐(300μm)处理14小时，随后在无血清培养基中处理5小时。在无血清培养基中孵育5小时之后，细胞用胰岛素(100nm)刺激5分钟。接着通过免疫印迹测定细胞溶解产物的磷酸Akt(丝氨酸473)、Akt、Trb3和β-肌动蛋白。
发明详述
本文中提及的专利和科学文献确定可为本领域技术人员所用的知识。本文中引用的颁予专利、申请和其它公布据此以引用的方式并入本文，所述引用的程度就如同已明确地和个别地指示各自以引用的方式并入一般。
如将为本领域普通技术人员显而易知，本文所述的任何方法或组合物都可关于本文所述的任何其它方法或组合物加以执行。
定义和缩写
除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述”包括复数个提及物。
当在权利要求和/或说明书中连同术语“包含”一起使用时，使用措辞“一个(a)”或“一种(an)”可意味“一个”，但它也符合“一个或多个”、“至少一个”及“一个或一个以上”的含义。
术语“约”在本文中用于指近似、在…左右、粗略地或大约。当术语“约”连同数值范围一起使用时，它通过使边界延伸高于及低于所述数值来修饰那个范围。一般而言，术语“约”在本文中用于以高于及低于所述值20％变化来修饰数值。
如本文所用，缩写“CaMKII”是指酶——钙钙调蛋白依赖性激酶II，包括它的亚型和它们的剪接变体的任一者。本领域中已知编码CaMKII的不同亚型的基因的核酸序列，包括但不限于基因的开放阅读框的核酸序列。本领域中已知编码人CaMKII的不同亚型的基因的核酸序列，包括但不限于基因的开放阅读框的核酸序列。本领域中已知CaMKII多肽和蛋白质的氨基酸序列，包括但不限于人CaMKII多肽和蛋白质的氨基酸序列。转录物变体和剪接变体的序列在本领域中也是已知的(参见例如Couchonnal和Anderson,2008，其以引用的方式整体并入本文)。小家鼠(mus musculus)CaMKII-γ的核酸序列的登录号是NM_178597且人CaMKII-γ的核酸序列的登录号是NM_172171.2。小家鼠CaMKII-γ的氨基酸序列的登录号是NP_848712.2且人CaMKII-γ的氨基酸序列的登录号是NP_751911.1。
如本文所用，缩写“IP3R”是指1,4,5-三磷酸肌醇受体，包括它的亚型和它们的剪接变体的任一者。在IP3R家族内，已鉴定和表征了若干种亚型。缩写“IP3R1”是指I型IP3R亚型，缩写“IP3R2”是指II型IP3R亚型，且缩写“IP3R3”是指III型IP3R亚型。本领域中已知编码IP3R的不同亚型的基因的核酸序列，包括但不限于基因的开放阅读框的核酸序列。本领域中已知编码人IP3R的不同亚型的基因的核酸序列，包括但不限于基因的开放阅读框的核酸序列。本领域中已知IP3R多肽和蛋白质的氨基酸序列，包括但不限于不同IP3R亚型的人IP3R多肽和蛋白质的氨基酸序列。小家鼠IP3R1的核酸序列的登录号是NM_010585.5且人IP3R1的核酸序列的登录号是NM_001099952.2。小家鼠IP3R1的氨基酸序列的登录号是NP_034715.3且人IP3R1的氨基酸序列的登录号是NP_001093422.2。对于有关IP3R的其它信息，参见Wehrens等,2005,Annu Rev Physiol.,67:69-98.“Intracellular calcium releaseand cardiac disease”；也参见Patterson等,2004,Annu Rev Biochem.73:437-65.“Inositol 1,4,5-trisphosphate receptors as signal integrators.”和Volpe等,1990,Am J Physiol.；258(6Pt1):C1086-91.“Regulation of inositol 1,4,5-trisphosphate-induced Ca2+release.II.Effect of cAMP-dependent proteinkinase.”，其全部以引用的方式并入本文。
如本文所用，缩写“p38”是指任何p38分裂素(mitogen)活化的蛋白质(MAP)激酶。已鉴定若干种p38MAP激酶，包括p38-α(也称为MAPK14)、p38-β(也称为MAPK11)、p38-γ(也称为MAPK12/ERK6)和p38-δ(也称为MAPK13/SAPK4)。本领域中已知编码p38的基因的核酸序列，包括但不限于基因的开放阅读框的核酸序列。本领域中已知编码人p38的基因的核酸序列，包括但不限于基因的开放阅读框的核酸序列。本领域中已知p38多肽和蛋白质的氨基酸序列，包括但不限于人p38多肽和蛋白质的氨基酸序列。小家鼠p38-α(MAPK14)的核酸序列的登录号是NM_011951.3且人p38-α(MAPK14)的核酸序列的登录号是NM_001315.2。小家鼠p38-α(MAPK14)的氨基酸序列的登录号是NP_036081.1且人p38-α(MAPK14)的氨基酸序列的登录号是NP_001306.1。对于有关p38的其它信息，参见Marber等,2011,J Mol CellCardiol.；51(4):485-90“The p38mitogen-activated protein kinase pathway--apotential target for intervention in infarction,hypertrophy,and heartfailure.”；也参见Kostenko等,2011,World J Biol Chem.26；2(5):73-89.“Physiological roles of mitogen-activated-protein-kinase-activated p38-regulated/activated protein kinase.”和Cuadrado等,2010,Biochem J.；429(3):403-17.“Mechanisms and functions of p38MAPK signalling.”，其全部以引用的方式并入本文。
如本文所用，缩写“MK2”是指p38活化的激酶MK2，也称为MAP激酶活化的蛋白质激酶2(或MAPKAPK2)。本领域中已知编码MK2的基因的核酸序列，包括但不限于基因的开放阅读框的核酸序列。本领域中已知编码人MK2的基因的核酸序列，包括但不限于基因的开放阅读框的核酸序列。本领域中已知MK2多肽和蛋白质的氨基酸序列，包括但不限于人MK2多肽和蛋白质的氨基酸序列。小家鼠MK2的核酸序列的登录号是NM_008551且人MK2的核酸序列的登录号是NM_004759.4。小家鼠MK2的氨基酸序列的登录号是NP_032577.1且人MK2的氨基酸序列的登录号是NP_004750.1。
如本文所用，缩写“MK3”是指p38活化的激酶MK3，也称为MAP激酶活化的蛋白质激酶3(或MAPKAPK3)。本领域中已知编码MK3的基因的核酸序列，包括但不限于基因的开放阅读框的核酸序列。本领域中已知编码人MK3的基因的核酸序列，包括但不限于基因的开放阅读框的核酸序列。本领域中已知MK3多肽和蛋白质的氨基酸序列，包括但不限于人MK3多肽和蛋白质的氨基酸序列。缩写“MK2/3”是指MK2或MK3或MK2与MK3两者。小家鼠MK3的核酸序列的登录号是NM_178907.3且人MK3的核酸序列的登录号是NM_001243926.1。小家鼠MK3的氨基酸序列的登录号是NP_849238且人MK3的氨基酸序列的登录号是NP_004626.1。对于有关MK2和MK3的其它信息，参见Gaestel等,2006,Nat Rev Mol Cell Biol.7(2):120-30.“MAPKAP kinases-MKs-two's company,three's a crowd.”；也参见Shiryaev等,2010,Cell Signal.；22(8):1185-92.“Mitogen-activated protein kinase p38and MK2,MK3and MK5:ménage à trois or ménageàquatre？”和Kotlyarov等,2002,Biochem SocTrans.；30(Pt6):959-63.“Is MK2(mitogen-activated protein kinase-activatedprotein kinase2)the key for understanding post-transcriptional regulation ofgene expression？”，其全部以引用的方式并入本文。
如本文所用，术语“钙调神经磷酸酶”是指蛋白质磷酸酶钙调神经磷酸酶的催化亚单位或蛋白质磷酸酶钙调神经磷酸酶的调控亚单位或两者，包括它们的亚型和它们的剪接变体的任一者。本领域中已知编码钙调神经磷酸酶的亚单位的不同亚型的基因的核酸序列，包括但不限于基因的开放阅读框的核酸序列。本领域中已知编码人钙调神经磷酸酶的亚单位的不同亚型的基因的核酸序列，包括但不限于基因的开放阅读框的核酸序列。本领域中已知钙调神经磷酸酶多肽和蛋白质的氨基酸序列，包括但不限于人钙调神经磷酸酶多肽和蛋白质的氨基酸序列。小家鼠钙调神经磷酸酶亚单位B的核酸序列的登录号是NM_024459.2且人钙调神经磷酸酶催化亚单位的核酸序列的登录号是NM_000944.4。小家鼠钙调神经磷酸酶亚单位B的氨基酸序列的登录号是NP_077779.2且人钙调神经磷酸酶催化亚单位的氨基酸序列的登录号是NP_000935.1。对于有关钙调神经磷酸酶的其它信息，参见Wilkins等,2004,Biochem Biophys Res Commun.1；322(4):1178-91.“Calcium-calcineurin signaling in the regulation of cardiac hypertrophy.”；也参见Periasamy,2002,J Mol Cell Cardiol.34(3):259-62.“Calcineurin and theheartbeat,an evolving story.”和Buchholz等,2007,Cell Cycle.6(1):16-9.“Anemerging role for Ca2+/calcineurin/NFAT signaling in cancerogenesis.”，其全部以引用的方式并入本文。
如本文所用，术语“代谢综合征”用于描述当一起发生时，增加心血管疾病、中风和2型糖尿病的风险的医学病症的组合。这些病症包括但不限于向心性肥胖症(围绕身体的中部和上部的额外重量)；胰岛素抗性；衰老；应激；激素变化；血液凝结过度；血脂异常，其包括HDL较低；促进心脏病的一种类型的LDL；以及载脂蛋白(apolipoprotein)B100升高。
治疗和预防的方法
本发明涉及钙感受性酶CaMKII在原代HC中由cAMP和胰高血糖素且在体内由胰高血糖素和禁食以钙和IP3R依赖性方式活化的发现。CaMKII的遗传缺乏或抑制通过影响FoxO1的磷酸化来阻断其核易位，损害禁食和胰高血糖素/cAMP诱导的糖原分解和糖异生，且降低血糖水平，而组成型活性CaMKII具有相反作用。CaMKII缺乏对葡萄糖代谢的遏制作用通过用组成型核FoxO1进行转导而得以废除，从而指示CaMKII缺乏的作用需要FoxO1的核外排。这个相同途径也参与肥胖症环境中的过度HGP。这些结果揭示FoxO1核定位和肝葡萄糖体内平衡中涉及钙介导的信号传导途径。
本发明也涉及指示两种药物靶标—称为IP3受体的肝钙转运体和称为钙调神经磷酸酶的肝磷酸酶-的抑制剂可在这个小生境中具有巨大价值的发现，包括在肥胖症的模型中的验证。近来发现IP3受体和钙调神经磷酸酶在肝葡萄糖产生(HGP)方面的新作用，所述肝葡萄糖产生在肥胖症和2型糖尿病中被过度活化。在处于禁食或肥胖症时，胰高血糖素活化IP3受体和IP3R诱导的钙自内质网向胞质液的释放。释放的钙接着活化2种钙敏感性酶。所述酶的一者是CaMKII。CaMKII的活化是必需的，因为它促进FoxO1进入核中，此接着诱导HGP的基因且部分地造成小鼠肥胖症模型中的空腹高血糖和代谢紊乱。钙调神经磷酸酶是由释放的钙活化的另一种酶。钙调神经磷酸酶是一种使称为Crtc2的另一转录因子脱磷酸，由此促进它进入核中的磷酸酶。Crtc2连同FoxO1一起起作用以诱导肥胖症中HGP的基因。因此，如同抑制CaMKII一样，抑制Crtc2遏制小鼠肥胖症模型中的空腹高血糖。因此，本发明提供IP3受体和钙调神经磷酸酶抑制剂的开发以及在临床前肥胖症和胰岛素抗性模型中对它们的测试。
最后，本发明涉及p38和MK2/3抑制剂也可在这个小生境中具有巨大价值的发现。
本发明提供治疗或预防受试者的代谢病症的方法、治疗或预防患有代谢病症的受试者的冠状动脉疾病的方法以及降低受试者的肝葡萄糖产生的方法。本发明提供对受试者的代谢病症的治疗和/或预防、对患有代谢病症的受试者的冠状动脉疾病的治疗和/或预防以及降低受试者的肝葡萄糖产生的方法，所述治疗和/或预防以及方法是通过向所述受试者施用抑制或降低CaMKII、IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和IP3R3)、钙调神经磷酸酶、p38、MK2/3或其任何组合的活性的化合物来进行的。
本发明也提供鉴定抑制CaMKII的活性或降低CaMKII的活性和/或活化的化合物的方法。因此，本发明也提供对用以预防肥胖症、1型糖尿病和2型糖尿病的代谢紊乱的CaMKII的抑制剂的筛选、开发和测试。本发明进一步提供对用以与其它抑制剂组合来预防肥胖症、1型糖尿病和2型糖尿病的代谢紊乱的CaMKII的抑制剂的筛选、开发和测试，所述其它抑制剂如但不限于IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和IP3R3)、钙调神经磷酸酶、p38和/或MK2/3的抑制剂。
本发明也提供对用以预防肥胖症、1型糖尿病和2型糖尿病的代谢紊乱的IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和IP3R3)的抑制剂和钙调神经磷酸酶的抑制剂的筛选、开发和测试。本发明进一步提供对用以与其它抑制剂组合来预防肥胖症、1型糖尿病和2型糖尿病的代谢紊乱的IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和IP3R3)的抑制剂和/或钙调神经磷酸酶的抑制剂的筛选、开发和测试，所述其它抑制剂如但不限于CaMKII、钙调神经磷酸酶、p38和/或MK2/3抑制剂。
本发明也提供对用以预防肥胖症、1型糖尿病和2型糖尿病的代谢紊乱的p38和MK2/3的抑制剂的筛选、开发和测试。本发明进一步提供对用以与其它抑制剂组合来预防肥胖症、1型糖尿病和2型糖尿病的代谢紊乱的p38和MK2/3的抑制剂的筛选、开发和测试，所述其它抑制剂如但不限于CaMKII、IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和IP3R3)和/或钙调神经磷酸酶抑制剂。
在某些方面，本文所述的本发明基于如下发现：CaMKII的抑制剂可治疗肥胖症诱发的胰岛素抗性和肝葡萄糖及脂肪代谢紊乱。
在某些方面，本文所述的本发明出于药物开发的目的提供CaMKII抑制剂以改善肥胖症、代谢综合征、1型糖尿病和2型糖尿病中的代谢紊乱和它们的后果。
在某些方面，本文所述的本发明提供用于治疗和诊断如肥胖症、代谢综合征和2型糖尿病的胰岛素抗性状态的代谢紊乱，包括心脏病的方法。
在某些方面，本发明涉及与肝CaMKII在胰高血糖素介导的肝葡萄糖产生(HGP)中的作用相关的研究结果。
如本文所述，CaMKII在原代肝细胞中由胰高血糖素活化且在体内由胰高血糖素和禁食活化。肝CaMKII的遗传缺乏或抑制降低血糖水平，遏制HGP基因G6pc和Pck1，降低糖原耗竭，且阻断HGP转录因子FoxO1的核易位。相反，组成型活性CaMKII诱导G6pc和Pck1，刺激葡萄糖产生，且升高血糖水平。CaMKII缺乏对葡萄糖代谢的遏制作用由组成型核FoxO1废除，从而指示CaMKII缺乏的作用可需要核外排FoxO1。
本文所述的结果鉴定在控制HGP方面的一种由CaMKII调控的分子途径。
在某些方面，本发明与发现禁食和胰高血糖素活化肝CaMKII相关。在某些方面，本发明与发现CaMKII刺激肝葡萄糖产生相关。在某些方面，本发明与发现CaMKII促进FoxO1的核定位和活化相关。在某些方面，本发明与发现CaMKII缺乏时的葡萄糖产生受损害需要核外排FoxO1相关。在某些方面，本文所述的方法适用于治疗和诊断心力衰竭，因为过度活性CaMKII已牵涉于心力衰竭中。
本公开提供用于治疗和/或预防代谢病症的方法。一方面，本公开提供一种治疗或预防有需要的受试者的代谢病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的CaMKII的抑制剂，从而治疗或预防所述病症。另一方面，本公开提供一种治疗或预防有需要的受试者的代谢病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的IP3R1、IP3R2和/或IP3R3的抑制剂，从而治疗或预防所述病症。另一方面，本公开提供一种治疗或预防有需要的受试者的代谢病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的钙调神经磷酸酶的抑制剂，从而治疗或预防所述病症。另一方面，本公开提供一种治疗或预防有需要的受试者的代谢病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的p38的抑制剂，从而治疗或预防所述病症。另一方面，本公开提供一种治疗或预防有需要的受试者的代谢病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的MK2/3的抑制剂，从而治疗或预防所述病症。另一方面，本公开提供一种治疗或预防有需要的受试者的代谢病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的CaMKII、IP3R1、IP3R2、IP3R3、钙调神经磷酸酶、p38、MK2/3或其任何组合的抑制剂，从而治疗或预防所述病症。
一方面，本公开提供一种治疗或预防受试者的代谢病症的方法，所述方法包括降低CaMKII的活性，从而治疗或预防所述病症。一方面，本公开提供一种治疗或预防受试者的代谢病症的方法，其中所述病症由肥胖症诱发，所述方法包括降低CaMKII的活性，从而治疗或预防所述病症。一方面，本公开提供一种治疗或预防受试者的代谢病症的方法，其中所述病症并非由肥胖症诱发，所述方法包括降低CaMKII的活性，从而治疗或预防所述病症。
在一个实施方案中，病症选自由1型糖尿病、2型糖尿病、胰岛素抗性和代谢综合征组成的组。
在一个实施方案中，治疗或预防影响受试者的糖原分解或糖异生。在另一实施方案中，治疗或预防不影响受试者的糖原分解或糖异生。
在一个实施方案中，治疗或预防降低受试者的肝葡萄糖产生、高血糖、脂肪肝、胰岛素抗性、胰岛素抗性相关的炎症、胰岛素抗性相关的血脂异常或其任何组合。在另一实施方案中，治疗或预防增加受试者的肝葡萄糖产生、高血糖、脂肪肝、胰岛素抗性、胰岛素抗性相关的炎症、胰岛素抗性相关的血脂异常或其任何组合。在另一实施方案中，治疗或预防对受试者的肝葡萄糖产生、高血糖、脂肪肝、胰岛素抗性、胰岛素抗性相关的炎症、胰岛素抗性相关的血脂异常或其任何组合无影响。
在一个实施方案中，治疗或预防降低CaMKII的磷酸化和/或活化。在另一实施方案中，治疗或预防抑制CaMKII的磷酸化。在另一实施方案中，治疗或预防抑制CaMKII的活性和/或活化。在一个实施方案中，治疗或预防增加CaMKII的磷酸化和/或活化。在另一实施方案中，治疗或预防增加CaMKII的活性和/或活化。
在一个实施方案中，CaMKII的活性是胰高血糖素诱导的活性。
在一个实施方案中，治疗或预防降低或抑制G6pc和/或Pck1在受试者的细胞中的表达。在一个实施方案中，治疗或预防增加G6pc和/或Pck1在受试者的细胞中的表达。
在另一实施方案中，治疗或预防降低受试者的细胞的核中的FoxO1蛋白质含量。在另一实施方案中，治疗或预防增加受试者的细胞的核中的FoxO1蛋白质含量。
在另一实施方案中，治疗或预防降低或抑制FoxO1蛋白质的氨基酸S284、S295、S326、S467、S475、S246、S253、S413或S415或其任何组合的磷酸化。在另一实施方案中，治疗或预防增加FoxO1蛋白质的氨基酸S284、S295、S326、S467、S475、S246、S253、S413或S415或其任何组合的磷酸化。
另一方面，本公开提供一种治疗或预防受试者的冠状动脉疾病的方法，所述方法包括降低所述受试者的CaMKII的活性，从而治疗或预防所述冠状动脉疾病。本公开提供一种治疗或预防患有代谢病症的受试者的冠状动脉疾病的方法，所述方法包括增加所述受试者的CaMKII的活性，从而治疗或预防所述冠状动脉疾病。
在一个实施方案中，病症选自由1型糖尿病、2型糖尿病、胰岛素抗性和代谢综合征组成的组。
在另一实施方案中，治疗或预防影响受试者的糖原分解或糖异生。在另一实施方案中，治疗或预防不影响受试者的糖原分解或糖异生。
在一个实施方案中，治疗或预防降低受试者的肝葡萄糖产生、高血糖、脂肪肝、胰岛素抗性、胰岛素抗性相关的炎症、胰岛素抗性相关的血脂异常或其任何组合。在另一实施方案中，治疗或预防增加受试者的肝葡萄糖产生、高血糖、脂肪肝、胰岛素抗性、胰岛素抗性相关的炎症、胰岛素抗性相关的血脂异常或其任何组合。
在一个实施方案中，治疗或预防降低CaMKII的磷酸化和/或活化。在另一实施方案中，治疗或预防增加CaMKII的磷酸化和/或活化。
在一个实施方案中，CaMKII的活性是胰高血糖素诱导的活性。在另一实施方案中，CaMKII的活性不是胰高血糖素诱导的活性。
在一个实施方案中，治疗或预防降低G6pc和/或Pck1在受试者的细胞中的表达。在另一实施方案中，治疗或预防增加G6pc和/或Pck1在受试者的细胞中的表达。
在一个实施方案中，治疗或预防降低受试者的细胞的核中的FoxO1蛋白质含量。在另一实施方案中，治疗或预防增加受试者的细胞的核中的FoxO1蛋白质含量。
在另一实施方案中，治疗或预防降低FoxO1蛋白质的氨基酸S284、S295、S326、S467、S475、S246、S253、S413或S415或其任何组合的磷酸化。在另一实施方案中，治疗或预防增加FoxO1蛋白质的氨基酸S284、S295、S326、S467、S475、S246、S253、S413或S415或其任何组合的磷酸化。
在一个实施方案中，治疗或预防包括降低受试者的巨噬细胞中的CaMKII活性。在另一实施方案中，治疗或预防包括增加受试者的巨噬细胞中的CaMKII活性。
在一个实施方案中，冠状动脉疾病与动脉粥样化形成和/或动脉粥样硬化相关。在另一实施方案中，方法进一步包括治疗或预防心力衰竭、高血压和/或肾病。在另一实施方案中，病症与晚期病变性巨噬细胞凋亡相关。在另一实施方案中，病症与斑块坏死相关。
在一个实施方案中，治疗或预防患有代谢病症的受试者的冠状动脉疾病导致减轻高胰岛素血症和/或血脂异常。在另一实施方案中，治疗或预防患有代谢病症的受试者的冠状动脉疾病导致增加高胰岛素血症和/或血脂异常。
在一个实施方案中，治疗或预防患有代谢病症的受试者的冠状动脉疾病导致减轻动脉粥样化形成和/或动脉粥样硬化。在另一实施方案中，治疗或预防患有代谢病症的受试者的冠状动脉疾病导致增加动脉粥样化形成和/或动脉粥样硬化。
在一个实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用CaMKII蛋白质的抑制剂的步骤。在一个实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用降低编码CaMKII蛋白质的基因的表达的反义RNA或siRNA的步骤。在另一实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用特异性结合CaMKII蛋白质的肽或多肽的步骤。在另一实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用小分子的步骤。在一个实施方案中，小分子是选自由以下组成的组的CaMKII抑制剂：KN-93、薰草菌素C、CK59、Ant-CaMKIINtide、KN62、DY9760e、诺卡土壤菌属K-252a、H89二盐酸盐、PP1类似物II1NM-PP1、eEF-2激酶抑制剂NH125和STO-609。
另一方面，本公开提供一种降低受试者的肝葡萄糖产生的方法，所述方法包括降低CaMKII的活性，从而导致所述受试者的肝葡萄糖的所述降低。另一方面，本公开提供一种降低受试者的肝葡萄糖产生的方法，所述方法包括增加CaMKII的活性，从而导致所述受试者的肝葡萄糖的降低。
另一方面，本公开提供一种增加受试者的肝葡萄糖产生的方法，所述方法包括增加CaMKII的活性，从而导致所述受试者的肝葡萄糖的所述增加。另一方面，本公开提供一种增加受试者的肝葡萄糖产生的方法，所述方法包括降低CaMKII的活性，从而导致所述受试者的肝葡萄糖的所述增加。
在一个实施方案中，降低肝葡萄糖产生降低CaMKII的磷酸化和/或活化。在另一实施方案中，降低肝葡萄糖产生增加CaMKII的磷酸化和/或活化。
在一个实施方案中，增加肝葡萄糖产生降低CaMKII的磷酸化和/或活化。在另一实施方案中，增加肝葡萄糖产生增加CaMKII的磷酸化和/或活化。
在一个实施方案中，CaMKII的活性是胰高血糖素诱导的活性。
在一个实施方案中，降低肝葡萄糖产生降低G6pc和/或Pck1在受试者的细胞中的表达。在另一实施方案中，降低肝葡萄糖产生增加G6pc和/或Pck1在受试者的细胞中的表达。在一个实施方案中，增加肝葡萄糖产生降低G6pc和/或Pck1在受试者的细胞中的表达。在另一实施方案中，增加肝葡萄糖产生增加G6pc和/或Pck1在受试者的细胞中的表达。
在一个实施方案中，降低肝葡萄糖产生降低受试者的高血糖、脂肪肝、胰岛素抗性、胰岛素抗性相关的炎症、胰岛素抗性相关的血脂异常或其任何组合。在另一实施方案中，降低肝葡萄糖产生增加受试者的高血糖、脂肪肝、胰岛素抗性、胰岛素抗性相关的炎症、胰岛素抗性相关的血脂异常或其任何组合。在一个实施方案中，增加肝葡萄糖产生降低受试者的高血糖、脂肪肝、胰岛素抗性、胰岛素抗性相关的炎症、胰岛素抗性相关的血脂异常或其任何组合。在另一实施方案中，增加肝葡萄糖产生增加受试者的高血糖、脂肪肝、胰岛素抗性、胰岛素抗性相关的炎症、胰岛素抗性相关的血脂异常或其任何组合。
在另一实施方案中，降低肝葡萄糖产生降低受试者的细胞的核中的FoxO1蛋白质含量。在另一实施方案中，降低肝葡萄糖产生降低FoxO1蛋白质的氨基酸S284、S295、S326、S467、S475、S246、S253、S413或S415或其任何组合的磷酸化。在另一实施方案中，降低肝葡萄糖产生增加受试者的细胞的核中的FoxO1蛋白质含量。在另一实施方案中，降低肝葡萄糖产生增加FoxO1蛋白质的氨基酸S284、S295、S326、S467、S475、S246、S253、S413或S415或其任何组合的磷酸化。
在另一实施方案中，增加肝葡萄糖产生降低受试者的细胞的核中的FoxO1蛋白质含量。在另一实施方案中，增加肝葡萄糖产生降低FoxO1蛋白质的氨基酸S284、S295、S326、S467、S475、S246、S253、S413或S415或其任何组合的磷酸化。在另一实施方案中，增加肝葡萄糖产生增加受试者的细胞的核中的FoxO1蛋白质含量。在另一实施方案中，增加肝葡萄糖产生增加FoxO1蛋白质的氨基酸S284、S295、S326、S467、S475、S246、S253、S413或S415或其任何组合的磷酸化。
在一个实施方案中，降低肝葡萄糖产生包括向受试者施用降低编码CaMKII蛋白质的基因的表达的反义RNA的步骤。在一个实施方案中，增加肝葡萄糖产生包括向受试者施用降低编码CaMKII蛋白质的基因的表达的反义RNA的步骤。
在另一实施方案中，降低肝葡萄糖产生包括向受试者施用特异性结合CaMKII蛋白质的肽或多肽的步骤。在另一实施方案中，增加肝葡萄糖产生包括向受试者施用特异性结合CaMKII蛋白质的肽或多肽的步骤。
在另一实施方案中，降低肝葡萄糖产生包括向受试者施用小分子的步骤。在另一实施方案中，增加肝葡萄糖产生包括向受试者施用小分子的步骤。
在一个实施方案中，小分子是选自由以下组成的组的CaMKII抑制剂：KN-93、薰草菌素C、CK59、Ant-CaMKIINtide、KN62、DY9760e、诺卡土壤菌属K-252a、H89二盐酸盐、PP1类似物II1NM-PP1、eEF-2激酶抑制剂NH125和STO-609。
一方面，本公开提供一种治疗或预防受试者的代谢病症的方法，所述方法包括降低IP3R1、IP3R2或IP3R3的活性，从而治疗或预防所述病症。本公开提供一种治疗或预防受试者的代谢病症的方法，其中所述病症由肥胖症诱发，所述方法包括降低IP3R1、IP3R2或IP3R3的活性，从而治疗或预防所述病症。本公开提供一种治疗或预防受试者的代谢病症的方法，其中所述病症并非由肥胖症诱发，所述方法包括降低IP3R1、IP3R2或IP3R3的活性，从而治疗或预防所述病症。
另一方面，本公开提供一种治疗或预防受试者的代谢病症的方法，所述方法包括降低钙调神经磷酸酶的活性，从而治疗或预防所述病症。另一方面，本公开提供一种治疗或预防受试者的代谢病症的方法，其中所述病症由肥胖症诱发，所述方法包括降低钙调神经磷酸酶的活性，从而治疗或预防所述病症。另一方面，本公开提供一种治疗或预防受试者的代谢病症的方法，其中所述病症并非由肥胖症诱发，所述方法包括降低钙调神经磷酸酶的活性，从而治疗或预防所述病症。
在一个实施方案中，病症选自由1型糖尿病、2型糖尿病、胰岛素抗性、肥胖症和代谢综合征组成的组。
在一个实施方案中，治疗或预防影响受试者的糖原分解或糖异生。在另一实施方案中，治疗或预防不影响受试者的糖原分解或糖异生。
在一个实施方案中，治疗或预防降低受试者的肝葡萄糖产生、高血糖、脂肪肝、胰岛素抗性、胰岛素抗性相关的炎症、胰岛素抗性相关的血脂异常或其任何组合。在另一实施方案中，治疗或预防增加受试者的肝葡萄糖产生、高血糖、脂肪肝、胰岛素抗性、胰岛素抗性相关的炎症、胰岛素抗性相关的血脂异常或其任何组合。
在一个实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用IP3R1蛋白质、IP3R2蛋白质、IP3R3蛋白质或其任何组合的抑制剂的步骤。在一个实施方案中，抑制剂是光溜海绵素C。在另一实施方案中，抑制剂是2-APB。在另一实施方案中，抑制剂是咖啡因(caffeine)。
在一个实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用降低编码IP3R1蛋白质、IP3R2蛋白质或IP3R3蛋白质或其任何组合的基因的表达的反义RNA或siRNA的步骤。在另一实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用特异性结合IP3R1蛋白质、IP3R2蛋白质或IP3R3蛋白质或其任何组合的肽或多肽的步骤。
在一个实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用小分子的步骤。在一个实施方案中，小分子是IP3R1蛋白质抑制剂、IP3R2蛋白质抑制剂或IP3R3蛋白质抑制剂。在一个实施方案中，小分子是光溜海绵素C。在另一实施方案中，小分子是2-APB。在另一实施方案中，小分子是咖啡因。
在一个实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用钙调神经磷酸酶的抑制剂的步骤。在一个实施方案中，钙调神经磷酸酶的抑制剂是环孢菌素A(cyclosporin A)。在另一实施方案中，钙调神经磷酸酶的抑制剂是吡美莫司(pimecrolimus)。在另一实施方案中，钙调神经磷酸酶的抑制剂是他克莫司(tacrolimus)。
在一个实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用降低编码钙调神经磷酸酶蛋白质的基因的表达的反义RNA或siRNA的步骤。在另一实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用特异性结合钙调神经磷酸酶蛋白质的肽或寡肽或多肽的步骤。在一个实施方案中，寡肽是环孢菌素A。
在一个实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用小分子的步骤。在另一实施方案中，小分子是钙调神经磷酸酶抑制剂。在一个实施方案中，小分子是吡美莫司。在另一实施方案中，小分子是他克莫司。
另一方面，本公开提供一种治疗或预防受试者的代谢病症的方法，所述方法包括降低p38的活性，从而治疗或预防所述病症。另一方面，本公开提供一种治疗或预防受试者的代谢病症的方法，其中所述病症由肥胖症诱发，所述方法包括降低p38的活性，从而治疗或预防所述病症。另一方面，本公开提供一种治疗或预防受试者的代谢病症的方法，其中所述病症并非由肥胖症诱发，所述方法包括降低p38的活性，从而治疗或预防所述病症。
另一方面，本公开提供一种治疗或预防受试者的代谢病症的方法，所述方法包括降低MK2/3的活性，从而治疗或预防所述病症。另一方面，本公开提供一种治疗或预防受试者的代谢病症的方法，其中所述病症由肥胖症诱发，所述方法包括降低MK2/3的活性，从而治疗或预防所述病症。另一方面，本公开提供一种治疗或预防受试者的代谢病症的方法，其中所述病症并非由肥胖症诱发，所述方法包括降低MK2/3的活性，从而治疗或预防所述病症。
在一个实施方案中，病症选自由1型糖尿病、2型糖尿病、胰岛素抗性、肥胖症和代谢综合征组成的组。
在一个实施方案中，治疗或预防影响受试者的糖原分解或糖异生。在另一实施方案中，治疗或预防不影响受试者的糖原分解或糖异生。
在一个实施方案中，治疗或预防降低受试者的肝葡萄糖产生、高血糖、脂肪肝、胰岛素抗性、胰岛素抗性相关的炎症、胰岛素抗性相关的血脂异常或其任何组合。在另一实施方案中，治疗或预防增加受试者的肝葡萄糖产生、高血糖、脂肪肝、胰岛素抗性、胰岛素抗性相关的炎症、胰岛素抗性相关的血脂异常或其任何组合。
在一个实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用p38的抑制剂的步骤。在一个实施方案中，p38的抑制剂是SB203580。在另一实施方案中，p38的抑制剂是SB202190。在另一实施方案中，p38的抑制剂是SB239063。
在一个实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用降低编码p38蛋白质的基因的表达的反义RNA或siRNA的步骤。在另一实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用特异性结合p38蛋白质的肽或多肽的步骤。在另一实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用小分子的步骤。在一个实施方案中，小分子是p38抑制剂。在一个实施方案中，小分子是SB203580。在另一实施方案中，小分子是SB202190。在另一实施方案中，小分子是SB239063。
在一个实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用MK2/3的抑制剂的步骤。在一个实施方案中，MK2/3的抑制剂是Hsp25激酶抑制剂。
在一个实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用降低编码MK2/3蛋白质的基因的表达的反义RNA或siRNA的步骤。在另一实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用特异性结合MK2/3蛋白质的肽或多肽的步骤。在一个实施方案中，肽是Hsp25激酶抑制剂。在一个实施方案中，治疗或预防包括向受试者施用小分子的步骤。在一个实施方案中，小分子是MK2/3抑制剂。
筛选方法
本公开提供用于鉴定治疗或预防受试者的代谢病症的化合物或化合物的组合的方法。本公开也提供用于鉴定治疗或预防患有代谢病症的受试者的冠状动脉疾病的化合物或化合物的组合的方法。在一个实施方案中，病症由肥胖症诱发。在另一实施方案中，病症并非由肥胖症诱发。本公开也提供用于鉴定降低受试者的肝葡萄糖产生的化合物或化合物的组合的方法。
本公开也提供用于鉴定抑制或降低CaMKII的活性和/或活化的化合物或化合物的组合的方法。本公开也提供用于鉴定抑制或降低IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和IP3R3)的活性和/或活化的化合物或化合物的组合的方法。本公开也提供用于鉴定抑制或降低钙调神经磷酸酶的活性和/或活化的化合物或化合物的组合的方法。本公开也提供用于鉴定抑制或降低p38的活性和/或活化的化合物或化合物的组合的方法。本公开也提供用于鉴定抑制或降低MK2/3的活性和/或活化的化合物或化合物的组合的方法。
本公开也提供用于鉴定抑制CaMKII、IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和IP3R3)、钙调神经磷酸酶、p38、MK2/3或其任何组合的活性和/或活化的化合物或化合物的组合的方法。本公开也提供用于鉴定降低CaMKII、IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和IP3R3)、钙调神经磷酸酶、p38、MK2/3或其任何组合的活性的化合物或化合物的组合的方法。
本公开提供一种用于鉴定抑制CaMKII的活性的化合物的方法，所述方法包括a)使细胞与CaMKII融合蛋白接触，其中所述CaMKII融合蛋白包含在一个末端的受体荧光团蛋白质和在另一末端的供体荧光团蛋白质；以及b)在不存在和存在测试化合物的情况下测量FRET效率，其中相较于在不存在所述测试化合物的情况下的FRET效率，在所述测试化合物存在的情况下的FRET效率较大指示所述测试化合物抑制CaMKII的活性(参见Takao等,2005；和Kwok等,2008，其以引用的方式整体并入本文)。
本公开提供一种用于鉴定抑制CaMKII的活性的化合物的方法，所述方法包括a)使细胞与CaMKII融合蛋白接触，其中所述CaMKII融合蛋白包含在一个末端的受体荧光团蛋白质和在另一末端的供体荧光团蛋白质；以及b)在不存在和存在测试化合物的情况下测量所述供体蛋白质与所述受体蛋白质的比率，其中相较于在不存在所述测试化合物的情况下的比率，在所述测试化合物存在的情况下的比率降低指示所述测试化合物抑制CaMKII的活性(参见Takao等,2005；和Kwok等,2008，其以引用的方式整体并入本文)。
在一个实施方案中，受体荧光团蛋白质选自由以下组成的组：mOrange、mStrawberry、Venus、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白。在另一实施方案中，供体蛋白质选自由以下组成的组：mOrange、mStrawberry、Venus、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白(参见Takao等,2005；和Kwok等,2008，其以引用的方式整体并入本文)。
在一个实施方案中，细胞是HEK293T细胞、肝细胞、U2OS细胞、HeLa细胞、鼠胚胎成纤维细胞(MEF)或巨噬细胞。在另一实施方案中，细胞来自Insr-/-小鼠、Camk2g-/-小鼠、Foxo1-/-小鼠、db/db小鼠、ob/ob小鼠、p38-/-小鼠、非肥胖糖尿病(NOD)小鼠、喂食高脂肪膳食的小鼠或链脲霉素处理的小鼠。在另一实施方案中，细胞来自表达突变FoxO1蛋白质的小鼠。在一个实施方案中，突变FoxO1蛋白质包含在S284、S295、S326、S467、S475、S246、S253、S413或S415处的丙氨酸取代或在S284、S295、S326、S467、S475、S246、S253、S413或S415处的天冬氨酸取代或其任何组合。
在一个实施方案中，使细胞经受ER应激。在另一实施方案中，细胞用胰高血糖素、8-溴cAMP、H89二盐酸盐、光溜海绵素C、毛喉素、饱和脂肪酸或其任何组合处理。
另一方面，本公开提供一种用于鉴定抑制IP3R1、IP3R2或IP3R3的活性的化合物的方法，所述方法包括a)使细胞与测试化合物接触；以及b)测量IP3R1、IP3R2或IP3R3活性，其中相较于在不存在所述化合物的情况下的IP3R1、IP3R2或IP3R3的活性，在存在所述化合物的情况下的IP3R1、IP3R2或IP3R3的活性降低指示所述化合物是分别IP3R1、IP3R2或IP3R3的抑制剂。
在一个实施方案中，通过在用IP3的诱导剂刺激之后，释放至细胞的胞质液中的钙来测量活性。在一个实施方案中，通过胞质液钙染料的荧光的增加来测量钙释放。在一个实施方案中，胞质液钙染料是Fluo-3。
另一方面，本公开提供一种用于鉴定抑制钙调神经磷酸酶的活性的化合物的方法，所述方法包括a)使细胞与测试化合物接触；以及b)测量钙调神经磷酸酶活性，其中相较于在不存在所述化合物的情况下的钙调神经磷酸酶的活性，在存在所述化合物的情况下的钙调神经磷酸酶的活性降低指示所述化合物是钙调神经磷酸酶的抑制剂。
在一个实施方案中，通过使用钙调神经磷酸酶底物肽检测磷酸酶活性来测量钙调神经磷酸酶的活性。在一个实施方案中，细胞是HEK293T细胞、肝细胞、U2OS细胞、HeLa细胞或鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。在另一实施方案中，细胞来自db/db小鼠、ob/ob小鼠、非肥胖糖尿病(NOD)小鼠、喂食高脂肪膳食的小鼠或链脲霉素处理的小鼠。
在一个实施方案中，细胞用胰高血糖素、H89二盐酸盐、胰岛素、毛喉素、ER应激的诱导剂、衣霉素、饱和脂肪酸或其任何组合处理。
另一方面，本公开提供一种用于鉴定抑制p38的活性的化合物的方法，所述方法包括a)使细胞与测试化合物接触；以及b)测量p38激酶活性，其中相较于在不存在所述化合物的情况下的p38的激酶活性，在存在所述化合物的情况下的p38的激酶活性降低指示所述化合物是p38的抑制剂。另一方面，本公开提供一种用于鉴定抑制MK2/3的活性的化合物的方法，所述方法包括a)使细胞与测试化合物接触；以及b)测量MK2/3激酶活性，其中相较于在不存在所述化合物的情况下的MK2/3的激酶活性，在存在所述化合物的情况下的MK2/3的激酶活性降低指示所述化合物是MK2/3的抑制剂。
在一个实施方案中，使用p38特异性肽测量p38激酶活性。在一个实施方案中，使用MK2/3特异性肽测量MK2/3激酶活性。
在一个实施方案中，细胞是HEK293T细胞、肝细胞、U2OS细胞、HeLa细胞、巨噬细胞或鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。在另一实施方案中，细胞来自Insr-/-小鼠、db/db小鼠、ob/ob小鼠、非肥胖糖尿病(NOD)小鼠、喂食高脂肪膳食的小鼠或链脲霉素处理的小鼠。在另一实施方案中，细胞用胰高血糖素、8-溴cAMP、H89二盐酸盐、毛喉素、饱和脂肪酸或其任何组合处理。
一方面，方法包括向作为代谢病症或心血管疾病(如冠状动脉疾病)的模型的动物施用测试化合物或测试化合物的组合，以及确定相较于未如此处理的动物，所述化合物或化合物的组合是否改善代谢功能和/或心血管功能。
本发明提供用于鉴定可用于治疗或预防受试者的代谢病症、治疗或预防患有代谢病症的受试者的冠状动脉疾病和/或降低受试者的肝葡萄糖产生的化合物的方法。本发明提供用于鉴定抑制CaMKII的活性或降低CaMKII的磷酸化和/或活化的化合物的方法。本发明提供用于鉴定抑制IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和IP3R3)的活性或降低IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和IP3R3)的磷酸化和/或活化的化合物的方法。本发明提供用于鉴定抑制钙调神经磷酸酶的活性或降低钙调神经磷酸酶的磷酸化和/或活化的化合物的方法。本发明提供用于鉴定抑制p38的活性或降低p38的磷酸化和/或活化的化合物的方法。本发明提供用于鉴定抑制MK2/3的活性或降低MK2/3的磷酸化和/或活化的化合物的方法。
方法可包括鉴定测试化合物或药剂(例如肽(如抗体或其片段)、小分子或核酸(如siRNA或反义RNA)或其它药剂)。
在一个实施方案中，化合物可为肽片段。片段包括介于约8个氨基酸与约100个氨基酸之间且包括约8个氨基酸和约100个氨基酸的所有可能的氨基酸长度，例如以下长度：介于约10个氨基酸与约100个氨基酸之间、介于约15个氨基酸与约100个氨基酸之间、介于约20个氨基酸与约100个氨基酸之间、介于约35个氨基酸与约100个氨基酸之间、介于约40个氨基酸与约100个氨基酸之间、介于约50个氨基酸与约100个氨基酸之间、介于约70个氨基酸与约100个氨基酸之间、介于约75个氨基酸与约100个氨基酸之间或介于约80个氨基酸与约100个氨基酸之间。这些肽片段可商购获得或通过液相或固相合成方法加以合成(Atherton等,(1989)Solid Phase Peptide Synthesis:a Practical Approach.IRLPress,Oxford,England)。肽片段可自天然来源分离，进行遗传工程改造，或以化学方式制备。这些方法在本领域中是熟知的。
化合物可为蛋白质，如抗体(单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体或完全人抗体)或其结合片段。抗体片段可为除全长形式以外的抗体形式且除已被工程改造的抗体片段之外，也包括存在于全长抗体内的部分或组分。抗体片段可包括但不限于单链Fv(scFv)、双链抗体、Fv和(Fab′)2、三链抗体、Fc、Fab、CDR1、CDR2、CDR3、CDR的组合、可变区、四链抗体、双功能杂交抗体、框架区、恒定区等(参见Maynard等,(2000)Ann.Rev.Biomed.Eng.2:339-76；Hudson(1998)Curr.Opin.Biotechnol.9:395-402)。抗体可商购获得，定制产生或根据本领域中确立的方法针对目标抗原来合成(Janeway等,(2001)Immunobiology,第5版,Garland Publishing)。
化合物可选自包含以下的组：siRNA；干扰RNA或RNAi；dsRNA；RNA聚合酶III转录的DNA；核糖酶；和可为RNA、DNA或人工核酸的反义核酸。包括反义DNA、RNA和DNA/RNA分子的反义寡核苷酸通过结合靶向的mRNA且阻止蛋白质翻译来起直接阻断mRNA翻译的作用。可例如通过常规磷酸二酯技术合成具有至少约15个碱基的反义寡核苷酸(Dallas等,(2006)Med.Sci.Monit.12(4):RA67-74；Kalota等,(2006)Handb.Exp.Pharmacol.173:173-96；Lutzelburger等,(2006)Handb.Exp.Pharmacol.173:243-59)。反义核苷酸序列包括但不限于吗啉基核苷酸序列、2’-O-甲基多核苷酸、DNA、RNA等。
siRNA包含双链结构，其含有约15至约50个碱基对，例如约21至约25个碱基对，且具有与在细胞内表达的靶基因或RNA相同或近乎相同的核苷酸序列。siRNA包含通过标准沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对相互作用退火在一起的正义RNA链和互补反义RNA链。正义链包含与靶miRNA分子内含有的核酸序列大致上相同的核酸序列。与靶mRNA内含有的靶序列“大致上相同”是指核酸序列与靶序列有约3％或更小的不同。siRNA的正义链和反义链可构成两个互补单链RNA分子，或可构成其中两个互补部分进行碱基配对且由单链“发夹”区共价连接的单一分子。也参见McMnaus and Sharp(2002)Nat Rev Genetics,3:737-47，以及Sen和Blau(2006)FASEB J.,20:1293-99，其整个公开内容以引用的方式并入本文。
siRNA可为改变的RNA，其因添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA。所述改变可包括如向siRNA的末端或向siRNA的一个或多个内部核苷酸添加非核苷酸物质，或进行使siRNA对核酸酶消化具有抗性的修饰，或用脱氧核糖核苷酸取代siRNA中的一个或多个核苷酸。siRNA的一个或两个链也可包含3’突出(overhang)。如本文所用，3’突出是指自双链体RNA链的3’末端延伸的至少一个未配对核苷酸。例如，siRNA可包含至少一个长度为1至约6个核苷酸(其包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)、或长度为1至约5个核苷酸、或长度为1至约4个核苷酸、或长度为约2至约4个核苷酸的3’突出。例如，siRNA的各链可包含具有二胸苷酸(“TT”)或二尿苷酸(“uu”)的3’突出。
siRNA可以化学方式或以生物方式产生，或可自重组质粒或病毒载体表达(例如参见美国专利号7,294,504和美国专利号7,422,896，其整个公开内容以引用的方式并入本文)。用于产生和测试dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于Gewirtz的美国专利申请公布号2002/0173478、Hannon等的美国专利申请公布号2007/0072204和Reich等的美国专利申请公布号2004/0018176中，所述公布的整个公开内容以引用的方式并入本文。
RNA聚合酶III转录的DNA含有启动子，如U6启动子。这些DNA可被转录来在细胞中产生可充当siRNA或线性RNA的小发夹RNA，所述siRNA或线性RNA可充当反义RNA。化合物可含有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、合成核苷酸或任何适合组合以使靶RNA和/或基因受抑制。此外，这些形式的核酸可为单链、双链、三链或四链。(参见例如Bass(2001)Nature,411,428429；Elbashir等,(2001)Nature,411,494498；和PCT公布号WO00/44895、WO01/36646、WO99/32619、WO00/01846、WO01/29058、WO99/07409、WO00/44914)。
化合物可为结合蛋白质且破坏它的功能，或相反增强它的功能的小分子。小分子是通常具有低分子量的一组不同的合成且天然物质。它们可自天然来源(例如植物、真菌、微生物等)分离，商购获得和/或以文库或集合形式获得，或加以合成。可通过对组合文库的电子筛选(in silico screening)或高通量(HTP)筛选来鉴定候选小分子。大多数常规药物(如阿斯匹林(aspirin)、青霉素和许多化学治疗剂)是小分子，可商购获得，可化学合成，或可如下所述自随机或组合文库获得(Werner等,(2006)Brief Funct.Genomic Proteomic5(1):32-6)。
除激动剂之外，对目标分子的一级序列的认识以及该序列与功能已知的蛋白质的相似性也可提供关于目标蛋白质的抑制剂或拮抗剂的信息。通过例如使用X射线结晶学、中子衍射、核磁共振光谱术和用于结构确定的其它技术确定蛋白质的结构特征，对激动剂和拮抗剂的鉴定和筛选得以进一步促进。这些技术提供对激动剂和拮抗剂的合理设计或鉴定。
可自具有合成或天然化合物的大型文库筛选测试化合物(参见Wang等,(2007)Curr Med Chem,14(2):133-55；Mannhold(2006)Curr Top Med Chem,6(10):1031-47；和Hensen(2006)Curr Med Chem 13(4):361-76)。众多手段当前用于随机和定向合成基于糖、肽和核酸的化合物。合成化合物文库可商购自Maybridge Chemical Co.(Trevillet,Cornwall,UK)、AMRI(Albany,NY)、ChemBridge(San Diego,CA)和MicroSource(Gaylordsville,CT)。稀有化学文库可自Aldrich(Milwaukee,Wis.)获得。或者，呈细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物的文库可自例如Pan Laboratories(Bothell,Wash.)或MycoSearch(N.C.)获得，或可易于产生。另外，天然和合成产生的文库及化合物易于通过常规化学、物理和生物化学手段加以修饰(Blondelle等,(1996)Tib Tech14:60)。
用于制备分子文库的方法在本领域中是熟知的且许多文库可商购。本发明中的目标文库包括肽文库、随机化寡核苷酸文库、合成有机组合文库等。简并肽文库可易于以溶液形式、以作为细菌鞭毛肽展示文库或作为噬菌体展示文库的固定形式制备。肽配体可选自含有至少一个氨基酸的肽的组合文库。可合成类肽和非肽合成部分的文库。可进一步合成含有相较于它们的天然存在的对应物，较少经受酶促降解的非肽合成部分的所述文库。例如，文库也可包括但不限于肽于质粒上(peptide-on-plasmid)文库、合成小分子文库、适体文库、基于体外翻译的文库、多核糖体文库、合成肽文库、神经递质文库和化学文库。
化学合成文库的实例描述于以下中：Fodor等,(1991)Science 251:767-773；Houghten等,(1991)Nature354:84-86；Lam等,(1991)Nature354:82-84；Medynski,(1994)BioTechnology12:709-710；Gallop 等,(1994)J.Medicinal Chemistry37(9):1233-1251；Ohlmeyer等,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:10922-10926；Erb等,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:11422-11426；Houghten等,(1992)Biotechniques 13:412；Jayawickreme等,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:1614-1618；Salmon等,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:11708-11712；PCT公布号WO93/20242,日期1993年10月14日；和Brenner等,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5381-5383。噬菌体展示文库的实例描述于以下中：Scott等,(1990)Science249:386-390；Devlin等,(1990)Science,249:404-406；Christian,等,(1992)J.Mol.Biol.227:711-718；Lenstra,(1992)J.Immunol.Meth.152:149-157；Kay等,(1993)Gene128:59-65；和PCT公布号WO94/18318。基于体外翻译的文库包括但不限于描述于以下中的那些：PCT公布号WO91/05058；和Mattheakis等,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:9022-9026。
可通过任何种类的通常已知方法来实现对文库筛选。参见例如公开对肽文库的筛选的以下参考文献：Parmley和Smith,(1989)Adv.Exp.Med.Biol.251:215-218；Scott和Smith,(1990)Science249:386-390；Fowlkes等,(1992)BioTechniques13:422-427；Oldenburg等,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5393-5397；Yu等,(1994)Cell76:933-945；Staudt等,(1988)Science241:577-580；Bock等,(1992)Nature355:564-566；Tuerk等,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6988-6992；Ellington等,(1992)Nature355:850-852；美国专利号5,096,815；5,223,409；和5,198,346，其全部属于Ladner等；Rebar等,(1993)Science263:671-673；和PCT公布WO94/18318。
也可产生且筛选小分子组合文库。小有机化合物的组合文库是在一个或多个多样性要点方面彼此不同的密切相关类似物的集合且使用多步方法通过有机技术来合成。组合文库包括巨大数目的小有机化合物。一种类型的组合文库是借助于用以产生化合物阵列的平行合成方法所制备。化合物阵列可为可通过它们在笛卡儿坐标(Cartesian coordinate)中的空间地址鉴定的化合物的集合且可被安排以使各化合物具有共同分子核心和一个或多个可变结构多样性要素。在所述化合物阵列中的化合物在单独反应容器中平行产生，其中通过各化合物的空间地址来鉴定和追踪所述各化合物。平行合成混合物和平行合成方法的实例提供于以下中：1994年1月5日提交的U.S.序列号08/177,497及1995年7月13日公布的其相应的PCT公布专利申请W095/18972以及1998年1月27日授予的美国专利号5,712,171及其相应的PCT公布专利申请W096/22529，所述专利据此以引用的方式并入本文。
在一个非限制性实施例中，可筛选非肽文库，如苯并二氮呯(benzodiazepine)文库(参见例如Bunin等,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:4708-4712)。也可使用类肽文库，如由Simon等,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:9367-9371所述者。Ostresh等(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:11138-11142描述可使用的文库的另一实例，其中肽中的酰胺官能基已被全甲基化来产生化学转化的组合文库。
计算机建模和搜寻技术允许鉴定化合物或改进已鉴定的化合物，所述化合物可治疗或预防受试者的代谢病症，治疗或预防患有代谢病症的受试者的冠状动脉疾病，降低受试者的肝葡萄糖产生，和/或抑制或降低CaMKII、IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2、IP3R3)、钙调神经磷酸酶、p38、MK2/3或其任何组合的活性和/或活化。用于制备或鉴定结合靶标的肽的其它方法在本领域中是已知的。分子印迹例如可用于重新构建结合某一分子的大分子结构，如肽。参见例如Kenneth J.Shea,Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers:The De Novo synthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sites,TRIP第2卷,第5期,1994年5月；Mosbach,(1994)Trends in Biochem.Sci.,19(9)；和Wulff,G.,Polymeric Reagents and Catalysts(Ford,W.T.编)ACS Symposium第308号,第186-230页,American Chemical Society(1986)。一种用于制备所述结构的方法涉及以下步骤：(i)围绕展现所需活性的已知底物(模板)聚合功能性单体；(ii)移除模板分子；且接着(iii)在由模板留下的空位中聚合第二类单体以提供展现一种或多种与模板的性质类似的所需性质的新型分子。除以这个方式制备肽之外，也可制备其它结合分子，如多糖、核苷、药物、核蛋白、脂蛋白、碳水化合物、糖蛋白、类固醇、脂质和其它生物活性物质。这个方法适用于设计广泛多种比它们的天然对应物更稳定(因为它们是通过功能性单体的自由基聚合制备)的生物模拟物，从而产生具有不可生物降解的骨架的化合物。用于设计所述分子的其它方法包括例如基于结构活性关系的药物设计，其需要合成和评估许多化合物以及进行分子建模。
筛选测定。测试化合物或药剂可通过以下两种类型的测定来鉴定：(a)细胞基测定；或(b)无细胞测定。测定可为包括直接或间接测量测试化合物的结合的结合测定。测定也可为包括直接或间接测量化合物的活性的活性测定。测定也可为包括直接或间接测量mRNA核酸序列或由目标基因编码的蛋白质的表达的表达测定。各种筛选测定可与包括测量测试化合物对代谢病症或冠状动脉疾病的症状或肝葡萄糖升高的作用的体内测定组合。体内测定也可包括在已知哺乳动物模型中评估测试化合物对代谢病症或冠状动脉疾病或肝葡萄糖升高的作用。
也可进行用于筛选结合目标蛋白质或调节目标蛋白质的活性的测试化合物的测定。可通过任何适合手段，如自常规化合物文库获得测试化合物。可通过使测试化合物与放射性同位素或酶标记偶联以使测试化合物与表达目标蛋白质的细胞的结合可通过检测复合物中的标记的化合物加以测量来实现测定测试化合物结合膜结合形式的蛋白质的能力。例如，测试化合物可用3H、14C、35S或125I直接或间接标记，且可随后通过直接计数放射性发射或通过闪烁计数来检测放射性同位素。或者，测试化合物可用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶进行酶标记，且通过测定适当底物向产物的转化来检测酶标记。
可固定目标蛋白质或目标蛋白质的靶标以有助于使一种或两种蛋白质的复合形式与未复合形式分离。可在适于含有反应物的任何容器中实现测试化合物与目标蛋白质(如CaMKII、IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2、IP3R3)、钙调神经磷酸酶、p38或MK2/3或其变体)的结合，或在存在和不存在测试化合物的情况下，目标蛋白质与靶分子的相互作用。此类容器的实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。在一个实施方案中，可提供添加允许一种或两种蛋白质结合于基质的结构域的融合蛋白(例如，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白可吸附于谷胱甘肽琼脂糖珠粒(Sigma Chemical；St.Louis,Mo.)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上)。
目标蛋白质或其变体也可通过结合于固体载体加以固定。适合的固体载体的非限制性实例包括玻璃或塑料载片、组织培养板、微量滴定孔、管、硅芯片或如珠粒(包括但不限于乳胶、聚苯乙烯或玻璃珠粒)的粒子。本领域中已知的任何方法都可用于使多肽(或多核苷酸)或其变体或测试化合物连接于固体载体，包括使用共价和非共价键联或被动吸收。
本发明的筛选方法也可涉及监测目标蛋白质，如CaMKII、IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2、IP3R3)、钙调神经磷酸酶、p38或MK2/3或其变体的表达。例如，可通过使细胞与测试化合物接触且测定目标蛋白质在所述细胞中的表达来鉴定目标蛋白质的表达的调控剂。将在测试化合物存在的情况下目标蛋白质在细胞中的表达水平与在不存在测试化合物的情况下目标蛋白质的表达水平进行比较。测试化合物可接着基于这个比较被鉴定为目标蛋白质的表达的调控剂。例如，当目标蛋白质在细胞中的表达在测试化合物存在的情况下比在不存在测试化合物的情况下统计或显著更大时，测试化合物被鉴定为目标蛋白质在细胞中的表达的刺激剂/增强剂。或者，当目标蛋白质在细胞中的表达在测试化合物存在的情况下比在不存在测试化合物的情况下统计或显著更小时，化合物被鉴定为目标蛋白质在细胞中的表达的抑制剂。测试化合物也可被称为拮抗剂。用以测定由目标基因或mRNA编码的蛋白质在细胞中的表达水平的方法在本领域中是熟知的。
对于结合测定，测试化合物可为结合由目标基因编码的多肽或其变体且占据它的结合位点的小分子。此可使配体结合位点不可为底物所到达以使正常生物活性受阻止。此类小分子的实例包括但不限于小肽或肽样分子。在结合测定中，测试化合物或由目标基因编码的多肽可包含可检测标记，如荧光、放射性同位素、化学发光或酶标记(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶)。可接着通过直接计数放射性发射，通过闪烁计数，或通过测定适当底物向可检测产物的转化来确定对结合于由目标基因编码的多肽的测试化合物的检测。
也可使用实时生物分子相互作用分析(BIA)来实现测定测试化合物结合目标蛋白质的能力[McConnell等,1992,Science257,1906-1912；Sjolander,Urbaniczky,1991,Anal.Chem.63,2338-2345]。BIA是一种用于在不标记任何相互作用物的情况下实时研究生物特异性相互作用的技术(例如BIA-coreTM)。光学现象表面等离子体共振(SPR)的变化可用作对生物分子之间的实时反应的指示。
为鉴定与目标蛋白质结合或相互作用且调节它的活性的其它蛋白质，由目标基因编码的多肽可根据本领域中实施的方法，在双杂交测定或三杂交测定中用作诱饵蛋白(bait protein)(Szabo等,1995,Curr.Opin.Struct.Biol.5,699-705；美国专利号5,283,317)。双杂交系统是基于由可分开的DNA结合和活化结构域组成的大多数转录因子的模块性质。
功能性测定。可测试化合物增加或降低目标蛋白质，如CaMKII、IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2、IP3R3)、钙调神经磷酸酶、p38或MK2/3或其变体的活性的能力。可在使纯化的目标蛋白质、细胞膜制备物或完整细胞与测试化合物接触之后测量活性。使目标蛋白质的活性降低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或100％的测试化合物被鉴定为用于降低目标蛋白质的活性的潜在药剂，例如拮抗剂。使目标蛋白质的活性增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或100％的测试化合物被鉴定为用于增加目标蛋白质的活性的潜在药剂，例如激动剂。
化合物
本公开提供用于治疗和/或预防受试者的代谢病症的方法。本公开也提供用于治疗和/或预防患有代谢病症的受试者的冠状动脉疾病的方法。在一个实施方案中，病症由肥胖症诱发。在另一实施方案中，病症并非由肥胖症诱发。本公开也提供用于降低受试者的肝葡萄糖产生的方法。本公开也提供用于降低CaMKII、IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和IP3R3)、钙调神经磷酸酶、p38或MK2/3的活性或抑制所述活性的方法。本公开也提供用于降低CaMKII、IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和IP3R3)、钙调神经磷酸酶、p38或MK2/3的磷酸化和/或活化的方法。
一方面，本公开提供一种治疗或预防有需要的受试者的代谢病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的化合物，从而治疗或预防所述病症。
在一个实施方案中，化合物是CamKII的抑制剂。在另一实施方案中，化合物是IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和IP3R3)的抑制剂。在一个实施方案中，化合物是钙调神经磷酸酶的抑制剂。在一个实施方案中，化合物是p38的抑制剂。在另一实施方案中，化合物是MK2/3的抑制剂。在另一实施方案中，化合物是CamKII、IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和/或IP3R3)、钙调神经磷酸酶、p38、MK2/3或其任何组合的抑制剂。
在一个实施方案中，化合物是CaMKII的活化剂。在另一实施方案中，化合物是IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和IP3R3)的活化剂。在一个实施方案中，化合物是钙调神经磷酸酶的活化剂。在一个实施方案中，化合物是p38的活化剂。在另一实施方案中，化合物是MK2/3的活化剂。在另一实施方案中，化合物是CamKII、IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和/或IP3R3)、钙调神经磷酸酶、p38、MK2/3或其任何组合的活化剂。
作为CaMKII蛋白质、IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和IP3R3)、钙调神经磷酸酶、p38和/或MK2/3的抑制剂或活化剂的任何适合化合物都可用于本发明的方法中。此类化合物可为例如小分子药物、肽药剂、肽模拟药剂、抗体(包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体和完全人抗体以及抗体片段)、抑制性RNA分子(如siRNA)等。本领域技术人员将了解这些和其它类型的药剂可用于抑制或降低或增加CaMKII、IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和IP3R3)、钙调神经磷酸酶、p38、MK2/3或其任何组合的活性，或降低或增加CaMKII、IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和IP3R3)、钙调神经磷酸酶、p38、MK2/3或其任何组合的磷酸化和/或活化。
在一个实施方案中，本发明的化合物是CaMKII的小分子抑制剂。所述抑制剂包括但不限于KN-93(N-[2-[[[3-(4-氯苯基)-2-丙烯基]甲氨基]甲基]苯基]-N-(2-羟乙基)-4-甲氧基苯磺酰胺)；薰草菌素C(5-((2,5-二羟基苯甲基)氨基)-2-羟基苯甲酸)；CK59(2-(2-羟乙基氨基)-6-氨基己基氨基甲酸叔丁酯-9-异丙基嘌呤)；KN62(参见Clyne等,1995)；DY9760e(参见Sugimura等,1997)；诺卡土壤菌属K-252a(参见Kase等,1987)；H89二盐酸盐(N-[2-[[3-(4-溴苯基)-2-丙烯基]氨基]乙基]-5-异喹啉磺酰胺二盐酸盐)；PP1类似物II1NM-PP1(突变激酶抑制剂II，4-氨基-1-叔丁基-3-(1′-萘基甲基)吡唑并[3,4-d]嘧啶，NM)；eEF-2激酶抑制剂NH125(碘化1-苯甲基-3-十六基-2-甲基咪唑鎓，碘化1-十六基-3-苯甲基-2-甲基咪唑鎓，CaM依赖性激酶III抑制剂，NH125)和STO-609(参见Tokumitsu等,2002)。
在另一实施方案中，本发明的化合物是CaMKII的肽或肽模拟抑制剂或活化剂。此类肽或肽模拟抑制剂或活化剂包括但不限于Ant-CaMKIINtide、[Ala286]-Ca2+/钙调蛋白激酶II抑制剂281-301、[Ala286]-Ca2+/钙调蛋白激酶II抑制剂281-309和CaM激酶II(290-309)钙调蛋白拮抗剂。
在另一实施方案中，本发明的化合物是CaMKII的蛋白质或多肽抑制剂或活化剂。所述蛋白质或多肽抑制剂可为重组蛋白质或多肽，如但不限于癌调蛋白(oncomodulin)/MDP14。
在另一实施方案中，本发明的化合物是CaMKII蛋白质的组分的抗体抑制剂或活化剂。在另一实施方案中，本发明的化合物是CaMKII的核苷酸基抑制剂或活化剂。此类抑制剂包括但不限于抑制CaMKII或其变体的表达或活性的siRNA、shRNA、dsRNA、微小RNA、反义RNA分子和核糖酶。此类核苷酸基抑制剂可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或各种人工核苷酸衍生物。
可抑制CaMKII的活性或降低CaMKII的活化的其它化合物进一步描述于美国专利号7,205,298(Kuo等)、美国公布号2004/0086973(Duecker K.)、美国公布号2010-0056494(Winzeler等)、美国专利号5,386,019(Danishefsky等)和美国专利号6,828,327(Kuo等)中，所述专利以引用的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，本发明的化合物是IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和IP3R3)的小分子抑制剂。此类抑制剂包括但不限于来自Calbiochem(EMD Millipore)的光溜海绵素C，目录号682160。光溜海绵素C是一种自海洋海绵分离的氧杂喹嗪生物碱且是IP3介导的Ca2+释放的一种极强力、可逆且膜可渗透的阻断剂(IC50＝358nM)，其不与IP3结合位点相互作用。它显示超过1型利阿诺定(ryanodine)受体(RyR-1)的骨骼亚型的高选择性。它也以可逆方式阻断舒缓激肽(bradykinin)和氨基甲酰胆碱(carbamylcholine)诱导的Ca2+自内质网储库的流出。IP3R的其它小分子抑制剂包括来自Tocris,Bristol,UK的硼酸氨基乙氧基二苯酯(也称为2-APB)(参见Sugawara等,1997,EMBO J.,16:3078-88，以引用的方式整体并入本文)和咖啡因。在另一实施方案中，本发明的化合物是IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和IP3R3)的小分子活化剂。
在另一实施方案中，本发明的化合物是IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和IP3R3)的肽或肽模拟抑制剂或活化剂。在另一实施方案中，本发明的化合物是IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和IP3R3)的蛋白质或多肽抑制剂或活化剂。此类蛋白质或多肽抑制剂可为重组蛋白质或多肽。
在另一实施方案中，本发明的化合物是IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和IP3R3)的抗体抑制剂或活化剂。在另一实施方案中，本发明的化合物是IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和IP3R3)的核苷酸基抑制剂或活化剂。此类抑制剂包括但不限于抑制IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和IP3R3)或其变体的表达或活性的siRNA、shRNA、dsRNA、微小RNA、反义RNA分子和核糖酶。此类核苷酸基抑制剂可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或各种人工核苷酸衍生物。
在一个实施方案中，本发明的化合物是钙调神经磷酸酶的小分子抑制剂。此类抑制剂包括但不限于吡美莫司和他克莫司。在另一实施方案中，本发明的化合物是钙调神经磷酸酶的小分子活化剂。
在另一实施方案中，本发明的化合物是钙调神经磷酸酶的肽或肽模拟抑制剂或活化剂。所述肽或肽模拟抑制剂包括来自Calbiochem(EMD Millipore)的钙调神经磷酸酶(PP2B)抑制剂环孢菌素A，目录号239835。该化合物是具有免疫抑制性质的诱导大鼠胸腺细胞中和鼠B细胞淋巴瘤细胞系WEH1-231中的细胞凋亡的环状寡肽。它防止BLB细胞系中的抗IgM和离子霉素(ionomycin)诱导的细胞凋亡。环孢菌素A与亲环蛋白(cyclophilin)的复合物在纳摩尔亲和力下抑制蛋白质磷酸酶2B且抑制由白介素-1α(interleukin-1α)、脂多糖和TNF-α诱导的一氧化氮合成。它也自胚胎干细胞诱导心肌细胞。
在另一实施方案中，本发明的化合物是钙调神经磷酸酶的蛋白质或多肽抑制剂或活化剂。所述蛋白质或多肽抑制剂可为重组蛋白质或多肽。
在另一实施方案中，本发明的化合物是钙调神经磷酸酶的抗体抑制剂或活化剂。在另一实施方案中，本发明的化合物是钙调神经磷酸酶的核苷酸基抑制剂或活化剂。此类抑制剂包括但不限于抑制钙调神经磷酸酶或其变体的表达或活性的siRNA、shRNA、dsRNA、微小RNA、反义RNA分子和核糖酶。此类核苷酸基抑制剂可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或各种人工核苷酸衍生物。
在一个实施方案中，本发明的化合物是p38的小分子抑制剂。此类抑制剂包括但不限于SB202190、SB203580和SB239063。SB203580是可自Calbiochem(EMD Millipore)获得的化合物，目录号559389。它是p38MAP激酶的一种高度特异性、强力、细胞可渗透、选择性、可逆且ATP竞争性抑制剂(在体外IC50＝34nM、在细胞中600nM)。它在100μM下不显著抑制JNK和p42MAP激酶。它降低表柔比星诱导的细胞损伤和半胱天冬酶(caspase)-3/7活性且抑制自LPS刺激的人单核细胞和人单核细胞细胞系THP-1产生IL-1和TNF-α(IC50＝50-100nM)。它抑制PC12细胞中的骨形态发生蛋白质-2诱导的神经突起生长(neurite outgrowth)。在另一实施方案中，本发明的化合物是p38的小分子活化剂。
在另一实施方案中，本发明的化合物是p38的肽或肽模拟抑制剂或活化剂。
在另一实施方案中，本发明的化合物是p38的蛋白质或多肽抑制剂或活化剂。所述蛋白质或多肽抑制剂可为重组蛋白质或多肽。
在另一实施方案中，本发明的化合物是p38的抗体抑制剂或活化剂。在另一实施方案中，本发明的化合物是p38的核苷酸基抑制剂或活化剂。所述抑制剂包括但不限于抑制p38或其变体的表达或活性的siRNA、shRNA、dsRNA、微小RNA、反义RNA分子和核糖酶。此类核苷酸基抑制剂可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或各种人工核苷酸衍生物。
在一个实施方案中，本发明的化合物是MK2/3的小分子抑制剂。在另一实施方案中，本发明的化合物是MK2/3的小分子活化剂。MK2/3的此类小分子抑制剂包括但不限于氨基氰基吡啶化合物、吡咯并吡啶和咔啉基MK2抑制剂(参见Fyhrquist等,2010,J.Investig,Dermatol.,130:342-344，其以引用的方式整体并入本文)。
在另一实施方案中，本发明的化合物是MK2/3的肽或肽模拟抑制剂或活化剂。此类肽抑制剂包括但不限于可自Calbiochem(EMD Millipore)获得的Hsp25激酶抑制剂，目录号385880。所述抑制剂是具有13个残基的细胞可渗透肽，其充当哺乳动物热休克蛋白质(Hsp25)激酶[也称为分裂素活化的蛋白质激酶活化的蛋白质激酶-2(MAPKAP激酶-2)]的强力且选择性抑制剂。抑制关于底物肽是竞争性的(Ki＝8.1μM)且关于ATP是非竞争性的(Ki＝134μM)。
在另一实施方案中，本发明的化合物是MK2/3的蛋白质或多肽抑制剂或活化剂。所述蛋白质或多肽抑制剂可为重组蛋白质或多肽。
在另一实施方案中，本发明的化合物是MK2/3的抗体抑制剂或活化剂。在另一实施方案中，本发明的化合物是MK2/3的核苷酸基抑制剂或活化剂。此类抑制剂包括但不限于抑制MK2/3或其变体的表达或活性的siRNA、shRNA、dsRNA、微小RNA、反义RNA分子和核糖酶。此类核苷酸基抑制剂可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或各种人工核苷酸衍生物。
本领域技术人员将了解其它药剂可适用作CaMKII、IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2和IP3R3)、钙调神经磷酸酶、p38和/或MK2/3的抑制剂或活化剂，且可连同本发明的方法一起使用。
用于疗法的药物组合物和施用
本发明的化合物可向受试者施用1次(例如，以单次注射液或沉积物形式)。或者，本发明的化合物可持续约2天至约28天或约7天至约10天的时期每日向有需要的受试者施用1次或2次。本发明的化合物也可持续每年1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12次或其组合的时期每日向受试者施用1次或2次。此外，本发明的化合物可与另一治疗剂共施用。当剂量方案包括多次施用时，向受试者施用的化合物的有效量可包括历经整个剂量方案施用的化合物的总量。
化合物可通过适于向受试者的细胞递送化合物的任何手段向所述受试者施用。举例而言，化合物可通过适于转染细胞的方法来施用。用于真核细胞的转染方法在本领域中是熟知的，且包括将核酸直接注射至细胞的核或前核中；电穿孔；脂质体转移或由亲脂性物质介导的转移；受体介导的核酸递送；生物冲击或粒子加速；磷酸钙沉淀和由病毒载体介导的转染。
可配制且通过使活性成分与药剂在受试者(如人或动物(例如狗、猫或马))体内的作用部位产生接触的任何手段施用本发明的组合物以减轻与代谢病症或冠状动脉疾病或肝葡萄糖产生升高相关的症状。它们可通过可连同药物一起使用的任何常规手段以个别治疗活性成分形式或以治疗活性成分的组合形式加以施用。它们可单独施用，但通常与基于所选施用途径和标准药物规范选择的药物载体一起施用。
本发明的化合物可以有效治疗或预防代谢病症或冠状动脉疾病或降低肝葡萄糖产生的量向受试者施用。本领域技术人员可易于在考虑化合物是防治性使用抑或治疗性使用下以及在考虑其它因素下确定什么将是待向受试者施用的本发明的化合物的有效量，所述其它因素如受试者的年龄、重量和性别；受试者可正在服用的其它药物；受试者可具有的任何过敏或禁忌症等。例如，有效量可由熟练技术人员使用已知程序，包括分析体外或体内确定的滴定曲线加以确定。此外，本领域技术人员可由在适合动物模型物种中进行试探性实验且视受试者重量等按比例扩大或缩小剂量来确定有效剂量。也可通过在作为与受试者相同的物种的个体中进行临床试验，例如在低剂量下开始且逐渐增加剂量并监测对代谢病症或冠状动脉疾病的作用来确定有效量。也可在不进行过度实验下由本领域技术人员确定适当给药方案以确定例如以单次剂量抑或以多次剂量施用药剂，且在多次剂量的情况下，确定剂量之间的有效间隔。
治疗或预防代谢病症或冠状动脉疾病或降低肝葡萄糖产生的化合物的治疗有效剂量可取决于为本领域普通技术人员所知的许多因素。化合物的剂量可例如视所治疗受试者或样本的身份、尺寸和病状，进一步视施用组合物所用的途径和在可适用时，从业者需要化合物对目标靶标的作用而变化。这些量可易于由熟练技术人员确定。这些量包括例如每千克(kg)受试者重量的mg或微克(μg)量，如约0.25mg/kg、0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg、或约0.25mg/kg至约0.5mg/kg、0.5mg/kg至1mg/kg、1mg/kg至2mg/kg、2mg/kg至3mg/kg、3mg/kg至4mg/kg、4mg/kg至5mg/kg、5mg/kg至6mg/kg、6mg/kg至7mg/kg、7mg/kg至8mg/kg、8mg/kg至9mg/kg或9mg/kg至10mg/kg之间或介于之间的任何范围。这些量也包括化合物的单位剂量，例如至少约0.5mg、1mg、2mg、3mg、5mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、400mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg、625mg、650mg、675mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg或900mg以上。本文所述的任何治疗应用都可应用于需要所述疗法的任何受试者，包括例如哺乳动物，如狗、猫、母牛、马、兔、猴、猪、绵羊、山羊或人。
根据本发明使用的药物组合物可以常规方式使用一种或多种生理可接受的载体或赋形剂配制。可配制本发明的治疗组合物供多种施用途径，包括全身性和表面或局部施用。技术和制剂通常可见于Remmington’s Pharmaceutical Sciences,Meade PublishingCo.,Easton,Pa(第20版,2000)中，所述图书的整个公开内容以引用的方式并入本文。对于全身性施用，适用的是注射，包括肌肉内、静脉内、腹膜内和皮下注射。对于注射，本发明的治疗组合物可于液体溶液中配制，例如于生理相容缓冲液，如汉克氏溶液(Hank'ssolution)或林格氏溶液中配制。此外，治疗组合物可以固体形式配制且在使用之前即刻再溶解或混悬。也包括冻干形式。本发明的药物组合物的特征在于至少无菌且无热原。这些药物制剂包括供人和兽医学使用的制剂。
根据本发明，药学上可接受的载体可包括可与药物施用相容的任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。用于药物活性物质的此类介质和试剂的使用在本领域中是熟知的。可使用可与活性化合物相容的任何常规介质或药剂。补充性活性化合物也可并入组合物中。
本发明也提供包括与使用说明书一起包装的药学上可接受的载体和使用本发明的筛选测定鉴定的化合物的试剂盒。
含有本发明的化合物的药物组合物可连同药学上可接受的载体一起施用以达成本文论述的任何治疗作用。此类药物组合物可包含例如针对由目标基因编码的多肽或其变体的抗体或由目标基因编码的多肽的激动剂和拮抗剂。组合物可单独或与至少一种可于任何无菌生物相容性药物载体中加以施用的其它试剂，如稳定化化合物组合施用，所述载体包括但不限于生理盐水、缓冲生理盐水、右旋糖和水。组合物可单独或与其它药剂、药物或激素组合向患者施用。
配制本发明的药物组合物以可与它的预定施用途径相容。施用途径的实例包括胃肠外，例如静脉内、真皮内、皮下、经口(例如，吸入)、经皮(局部)、经粘膜和经直肠施用。用于肠胃外、真皮内或皮下用药的溶液或混悬液可包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、生理盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和用于调整张力的试剂，如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠调整pH。胃肠外制剂可封闭在由玻璃或塑料制得的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适于可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(在可溶于水的情况下)或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EMTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须无菌且就存在容易可注射性而言应是流体。它在制造和储存条件下必须稳定且必须防止如细菌和真菌的微生物的污染作用。载体可为含有例如水、乙醇、药学上可接受的多元醇(如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其适合混合物的溶剂或分散介质。适当流动性可例如通过使用包衣(如卵磷脂(lecithin))、在分散液的情况下通过维持所需粒度及通过使用表面活性剂加以维持。防止微生物作用可由各种抗细菌及抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞(thimerosal)等)达成。在许多情况下，可适用的是在组合物中包括等张剂，例如糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇)、氯化钠。延长可注射组合物的吸收可通过并入使吸收延迟的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来达成。
无菌可注射溶液可通过以所需量将化合物(例如小分子、肽或抗体)与(必要时)本文列举的一种成分或成分的组合一起并入适当溶剂中，随后过滤灭菌来制备。通常，通过将活性化合物并入含有基本分散介质和来自本文列举的成分的所需其它成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，适用制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加来自其先前无菌过滤溶液的任何其它所需成分的粉末。
经口组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可封闭在明胶胶囊中或压制成片剂。出于经口治疗性施用的目的，活性化合物可与赋形剂合并且以片剂、锭剂或胶囊形式使用。也可使用流体载体制备用作漱口药的经口组合物，其中于流体载体中的化合物经口施用且漱口并吐出或吞咽。
可以纳入药学上相容的粘合剂和/或佐剂物质作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有任何以下成分或具有类似性质的化合物：粘合剂，如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如海藻酸、羟基乙酸淀粉钠(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或sterotes；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。
全身性施用也可通过经粘膜或经皮手段来进行。对于经粘膜或经皮施用，适合于待渗透的屏障的渗透剂用于制剂中。此类渗透剂在本领域中通常是已知的，且例如对于经粘膜施用，包括清洁剂、胆汁盐和梭链孢酸(fusidic acid)衍生物。可通过使用经鼻喷雾剂或栓剂实现经粘膜施用。对于经皮施用，将活性化合物配制成如本领域中通常已知的软膏剂、油膏剂、凝胶剂或霜剂。在一些实施方案中，化合物可通过缓慢释放活性化合物以达成透皮吸收的经皮递送系统施用。渗透增强剂可用于促进调节介质中的活性因子的经皮渗透。经皮贴片描述于例如美国专利号5,407,713；美国专利号5,352,456；美国专利号5,332,213；美国专利号5,336,168；美国专利号5,290,561；美国专利号5,254,346；美国专利号5,164,189；美国专利号5,163,899；美国专利号5,088,977；美国专利号5,087,240；美国专利号5,008,110；和美国专利号4,921,475中。
化合物的施用不局限于单一途径，而是可涵盖通过多种途径进行施用。举例而言，通过多种途径进行的示例性施用尤其包括真皮内施用与肌肉内施用，或真皮内施用与皮下施用的组合。多种施用可依序或同时进行。通过多种途径进行的其它用药模式将为熟练技术人员显而易知。
本发明的化合物可配制成组合物以向受试者施用来治疗和/或预防代谢病症或冠状动脉疾病或降低肝葡萄糖产生。此类组合物可包含本发明的化合物与一种或多种药学上可接受的稀释剂和/或载体以及任选一种或多种其它药学上可接受的添加剂的混合物。药学上可接受的稀释剂和/或载体以及任何其它添加剂在可与组合物的其它成分相容且不有害于组合物将施用的受试者的意义上必须是“可接受的”。本领域技术人员可例如使用如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,(Mack Publishing Company:Easton,Pa.,1990),第1635-36页)的标准教科书中的教导，且在考虑所选递送途径下易于将本发明的化合物配制成适于向如人受试者的受试者施用的组合物。
可使用的稀释剂和/或载体和/或其它添加剂的实例包括但不限于水、二醇、油、醇、水性溶剂、有机溶剂、DMSO、生理盐水溶液、生理缓冲溶液、肽载体、淀粉、糖、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、pH缓冲剂、粒化剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、乳化剂、粘合剂、赋形剂、填充剂、助流剂、增溶剂、稳定剂、表面活性剂、混悬剂、张力剂、粘度改变剂、羧甲基纤维素、结晶纤维素、甘油、阿拉伯胶、乳糖、硬脂酸镁、甲基纤维素、粉末、生理盐水、海藻酸钠。可在考虑所用活性剂的性质(例如活性剂的溶解性和稳定性)、递送途径(例如经口、胃肠外等)、药剂是否将历经延长时期递送(如自控制释放胶囊递送)、药剂是否将与其它药剂共施用以及各种其它因素下改变所使用的稀释剂和/或载体和/或其它添加剂的组合。本领域技术人员将易于能够在不进行过度实验下配制化合物以用于所需用途。
本发明的化合物可通过允许药剂在体内施加它对受试者的作用的任何适合方法向受试者施用。例如，组合物可通过已知程序向受试者施用，所述程序包括但不限于通过经口施用、舌下或经颊施用、胃肠外施用、经皮施用、通过吸入、通过经鼻递送、经阴道、经直肠和肌肉内。本发明的化合物可胃肠外、或通过筋膜上、囊内、皮内、皮下、真皮内、鞘内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、血管内、静脉内、薄壁组织或舌下递送来施用。递送可通过注射、输注、导管递送或一些其它手段，如通过片剂或喷雾剂来进行。在一个实施方案中，通过直接递送至心脏组织的方式，如通过插入受试者的心脏中或附近的导管的方式，或通过使用能够使药物靶向心脏的递送媒介物来向受试者施用本发明的化合物。例如，本发明的化合物可缀合于靶向心脏的药剂(如抗体或抗体片段)或连同所述药剂一起施用。在一个实施方案中，通过直接递送至目标肌肉组织的方式，如通过插入受试者的目标肌肉中或附近的导管的方式，或通过使用能够使药物靶向肌肉的递送媒介物(如抗体或抗体片段)来向受试者施用本发明的化合物。
对于经口施用，本发明的化合物的制剂可呈现为胶囊、片剂、粉末、颗粒或混悬液或溶液。制剂可含有常规添加剂，如乳糖、甘露糖醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉、粘合剂、结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶、崩解剂、马铃薯淀粉、羧甲基纤维素钠、无水磷酸氢钙或羟基乙酸淀粉钠、润滑剂和/或硬脂酸镁。
对于胃肠外施用(即，通过除消化道以外的途径施用)，本发明的化合物可与和受试者的血液等张的无菌水溶液组合。所述制剂可通过以下方式制备：将活性成分溶解于含有生理相容物质(如氯化钠、甘氨酸等)且具有可与生理条件相容的缓冲pH的水中以产生水溶液，接着使所述溶液无菌。制剂可提供于单位剂量或多剂量容器，如密封安瓿或小瓶中。制剂可通过注射、输注或本领域中已知的其它手段来递送。
对于经皮施用，本发明的化合物可与增加皮肤对本发明的化合物的渗透性且允许化合物透过皮肤并进入血流中的皮肤渗透增强剂(如丙二醇、聚乙二醇、异丙醇、乙醇、油酸、N-甲基吡咯烷酮等)组合。本发明的化合物也可进一步与聚合物质(如乙基纤维素、羟丙基纤维素、乙烯/乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮等)组合以提供呈凝胶形式的组合物，将所述组合物溶解于如二氯甲烷的溶剂中，蒸发以获得所需粘度且接着涂覆于衬底材料以提供贴片。
在一些实施方案中，以单位剂型(如片剂、胶囊或单次剂量注射或输注小瓶)提供本发明的化合物。
组合疗法
根据本发明的方法，本发明的化合物可以单一药剂形式或与一种或多种其它药剂组合向受试者施用。在一个实施方案中，以单一药剂形式向受试者施用本发明的化合物。在一个实施方案中，向受试者施用单独本发明的化合物。在一个实施方案中，本发明的化合物与一种或多种其它药剂组合向受试者施用。
在某些实施方案中，本发明的化合物可与用于治疗或预防代谢病症或冠状动脉疾病或降低受试者的肝葡萄糖的其它药剂组合使用。在某些实施方案中，本发明的化合物可与不用于治疗或预防代谢病症或冠状动脉疾病或降低受试者的肝葡萄糖的其它药剂组合使用。在一个实施方案中，本发明的化合物可作为含有一种或多种其它活性剂的同一药物组合物或制剂的一部分递送至受试者。在另一实施方案中，本发明的化合物可以仅含有该活性剂的组合物或制剂形式递送至受试者，而一种或多种其它药剂是以一种或多种单独组合物或制剂形式向受试者施用。在一个实施方案中，其它药剂不用于治疗或预防代谢病症或冠状动脉疾病，或降低受试者的肝葡萄糖。在另一实施方案中，其它药剂用于治疗或预防代谢病症或冠状动脉疾病，或降低受试者的肝葡萄糖。
本发明的化合物和用于治疗或预防代谢病症或冠状动脉疾病或降低受试者的肝葡萄糖的其它药剂可在相同时间或在不同时间向受试者施用。本发明的化合物和不用于治疗或预防代谢病症或冠状动脉疾病或降低肝葡萄糖的其它药剂可在相同时间或在不同时间向受试者施用。例如，本发明的化合物和其它药剂可彼此在数分钟、数小时、数天、数周或数月内施用，例如作为受试者的总体治疗方案的一部分。在一些实施方案中，本发明的化合物可在施用其它药剂之前施用。在其它实施方案中，本发明的化合物可在施用其它药剂之后施用。
如上所述的本发明的化合物，包括但不限于CaMKII、IP3R(包括但不限于IP3R1、IP3R2、IP3R3)、钙调神经磷酸酶、p38和MK2/3的抑制剂，可彼此组合用于治疗或预防代谢病症或冠状动脉疾病或降低受试者的肝葡萄糖。
在一些实施方案中，相较于单独施用本发明的化合物或单独施用一种或多种其它药剂，本发明的化合物与一种或多种其它药剂组合施用具有累加作用。在其它实施方案中，相较于单独施用本发明的化合物或单独施用一种或多种其它药剂，本发明的化合物与一种或多种其它药剂组合施用具有协同作用。在一些实施方案中，相较于单独施用本发明的化合物或单独施用一种或多种其它药剂，本发明的化合物与一种或多种其它药剂组合施用可有助于降低副作用。
在一些实施方案中，本发明的化合物用作佐剂疗法。在其它实施方案中，本发明的化合物与佐剂疗法组合使用。
受试者
根据本发明的方法，受试者或患者可为患有或诊断有代谢病症或冠状动脉疾病或肝葡萄糖升高的任何动物。根据本发明的方法，受试者或患者可为易患代谢病症或冠状动脉疾病或肝葡萄糖升高或处于发展代谢病症或冠状动脉疾病或肝葡萄糖升高的风险中的任何动物。在优选实施方案中，受试者是人受试者。在一些实施方案中，受试者是啮齿动物，如小鼠。在一些实施方案中，受试者是母牛、猪、绵羊、山羊、猫、马、狗和/或用作家畜或作为宠物饲养的任何其它动物物种。
在一些实施方案中，受试者已怀疑患有代谢病症、冠状动脉疾病或肝葡萄糖升高。在其它实施方案中，在根据本发明的方法治疗之前，受试者正针对代谢病症、冠状动脉疾病或肝葡萄糖升高加以治疗。在其它实施方案中，在根据本发明的方法治疗之前，受试者未正针对代谢病症、冠状动脉疾病或肝葡萄糖升高加以治疗。
实施例
以下实施例说明本发明，且被阐述来帮助理解本发明，且不应解释成以任何方式限制如在此后权利要求中限定的本发明的范围。
实施例1：由钙感受性酶CaMKII调控肝细胞葡萄糖产生
肝葡萄糖产生对于葡萄糖体内平衡而言至关重要。已显示若干转录因子和共活化子调控这个过程，然而，潜伏机制尚未完全阐明。如本文所述，钙感受性酶CaMKII在原代肝细胞中由cAMP和胰高血糖素且在体内由胰高血糖素和禁食以钙和IP3R依赖性方式活化。CaMKII的遗传缺乏或抑制阻断FoxO1的核易位，损害禁食和胰高血糖素/cAMP诱导的糖原分解和糖异生，且降低血糖水平。相反，腺病毒表达组成型活性CaMKII诱导糖异生和糖原分解中涉及的基因，在体外和在体内均刺激葡萄糖产生，且升高血糖水平。CaMKII缺乏对葡萄糖代谢的遏制作用通过用组成型核FoxO1进行转导而得以废除，从而指示CaMKII缺乏的作用需要核外排FoxO1。这些结果揭示在通过胰高血糖素和禁食来控制肝葡萄糖体内平衡方面的一种新型钙感受性分子途径。
实施例2：由钙感受性酶CaMKII调控肝细胞葡萄糖产生
肝葡萄糖产生对于葡萄糖体内平衡而言至关重要。已显示若干转录因子和共活化子调控这个过程，然而，潜伏机制尚未完全阐明。如本文所述，钙感受性酶CaMKII在原代肝细胞中由cAMP和胰高血糖素且在体内由胰高血糖素和禁食以钙和IP3R依赖性方式活化。CaMKII的遗传缺乏或抑制阻断FoxO1的核易位，损害禁食和胰高血糖素/cAMP诱导的糖原分解和糖异生，且降低血糖水平。相反，腺病毒表达组成型活性CaMKII会诱导糖异生和糖原分解中涉及的基因，在体外和在体内均刺激葡萄糖产生，且升高血糖水平。重要的是CaMKII缺乏对葡萄糖代谢的遏制作用通过用组成型核FoxO1进行转导而得以废除，从而指示CaMKII缺乏的作用需要核外排FoxO1。本文所述的结果显示在通过胰高血糖素和禁食来控制肝葡萄糖体内平衡方面的一种钙感受性分子途径。
实施例3：由钙感受性酶CaMKII调控肝细胞葡萄糖产生
肝是负责在营养丧失条件下维持血糖正常的主要器官。在禁食的早期阶段期间，肝使用糖原储库来调动葡萄糖(Radziuk和Pye,2001)。随着禁食进展，葡萄糖自非碳水化合物前体的重新合成(糖异生)变为肝葡萄糖产生的主要促成过程(contributor)(Klover和Mooney,2004)。葡萄糖产生也由通过糖酵解、糖原合成和糖原分解的底物通量(substrateflux)调控。这些变化响应于直接激素信号传导而快速发生。此外，胰岛素与胰高血糖素两者均会影响糖原分解酶和糖异生酶(分别为葡萄糖-6-磷酸酶(G6pc)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(Pck1))的转录(Pilkis和Granner,1992)。在禁食期间，胰高血糖素和它的下游效应子cAMP诱导如FoxO(1、3和4)和Crct2的活化这些基因的表达的“葡萄糖生成性”转录因子的亚细胞定位变化(Lin和Accili,2011)。此外，如过氧化物酶体增殖物活化的受体-γ共活化子-1α(PGC-1α)和CBP的不同共活化子被认为与cAMP响应的不同组分(包括CREB、肝核因子4α(HNF4α)、Sirt1和时钟基因)相互作用，从而导致糖异生基因的转录增加(Hall等,1995；Matsumoto等,2007；Puigserver等,2003；Rhee等,2003)。
钙(Ca+2)已与糖异生的调控相关联，然而，潜伏机制尚未完全阐明(Friedmann和Rasmussen,1970；Kraus-Friedmann和Feng,1996；Marques-da-Silva等,1997)。证据指示胰高血糖素和cAMP改变肝中的Ca+2通量。由胰高血糖素进行刺激会导致钙流入，随后Ca+2自细胞内储库释放，且由于这些变化，胞质液Ca+2浓度增加(Bygrave和Benedetti,1993；Staddon和Hansford,1989)。值得注意的是已显示细胞内Ca+2螯合降低胰高血糖素诱导的葡萄糖产生(Mine等,1993)。然而，Ca+2如何调控这个现象的机制是未知的。基于显示细胞内Ca+2的重要性的这些先前研究，本文所述的结果显示活性由Ca+2增加的CaMKII可在胰高血糖素诱导的肝葡萄糖产生中起作用。
钙钙调蛋白依赖性激酶II(CaMKII)是一种作为细胞中的细胞Ca+2信号传导的重要介导物的丝氨酸–苏氨酸激酶。存在不同CaMKII亚型的4种基因：α、β、γ和δ。α和β亚型主要在神经元中，而CaMKIIγ和CaMKIIδ在广泛多种组织中表达。在结合Ca+2/钙调蛋白复合物之后，Thr287上的自体磷酸化产生Ca+2/钙调蛋白非依赖性活性(Couchonnal和Anderson,2008)。关于CaMKII的大多数研究已在神经元和心肌细胞中进行且对其它组织中的CaMKII仅存在有限了解，且CaMKII在代谢中的特定作用仍然未知。本文所述的结果显示CaMKII活性由cAMP和胰高血糖素增加且在体内也响应于禁食而增加。本文所述的结果说明CaMKII在糖原分解和糖异生的调控中起作用。具体来说，这些结果显示CaMKII在体外和在体内以调控两种关键酶G6pc和Pck1的表达的方式对FoxO1核定位具有深远影响。
结果
喂食至禁食代谢转换导致肝CaMKII活化
禁食导致已显示会增加细胞内钙的胰高血糖素的循环水平增加(Staddon和Hansford,1989)。本文所述的结果显示活性因细胞内Ca+2升高而增加的CaMKII可能由禁食活化。为测试这个想法，用以胰高血糖素激发各种时间的原代小鼠肝细胞进行的CaMKII活性测定显示CaMKII活性随时间稳定增加(图1A)。通过用抗pThr287-CaMKII抗体进行免疫印迹来确认CaMKII的活化状态。与激酶测定结果一致，在Thr287处的磷酸化由胰高血糖素处理诱导(图1B)。
为测定胞质液Ca+2对CaMKII活化的作用，测试显著降低胰高血糖素诱导的CaMKII磷酸化的胞质液Ca+2螯合剂1,2-双[2-氨基苯氧基]乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸四[乙酰氧基甲酯](BAPTA-AM)的作用(图1C)。位于内质网(ER)中的1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP3R)通道响应于第二信使IP3的结合而释放Ca2+，且在细胞内Ca+2体内平衡中起主要作用。胰高血糖素诱导的PKA使IP3R磷酸化且活化IP3R活性，且这个事件在肝葡萄糖产生中是重要的。为研究IP3R在胰高血糖素诱导的CaMKII活化中的作用，用IP3R抑制剂光溜海绵素C进行预处理。光溜海绵素C导致胰高血糖素诱导的CaMKII磷酸化显著降低，从而说明IP3R在这个过程中具有关键作用(图1D)。
响应于胰高血糖素的cAMP水平增加使作为糖异生中涉及的关键酶的PKA的活性增加。在这个情形下，用cAMP的膜渗透类似物8-溴-cAM处理肝细胞模拟胰高血糖素的作用且导致磷酸CaMKII显著增加(图1E)。为研究CaMKII磷酸化是否与PKA活化呈因果相关，在添加胰高血糖素之前用PKA抑制剂H89处理肝细胞。抑制PKA显著抑制胰高血糖素介导的磷酸CaMKII的增加(图1F)。这些数据支持存在一种途径，其中胰高血糖素通过它对IP3R介导的细胞内Ca+2释放的作用以cAMP-PKA依赖性方式促进CaMKII的磷酸化/活化。
为检查CaMKII在体内是否由胰高血糖素调控，小鼠用腹膜内(i.p.)胰高血糖素的大丸剂激发。与在培养的肝细胞中观察到的作用一致，肝CaMKII磷酸化由胰高血糖素处理诱导(图1G)。低至1μg kg-1的胰高血糖素剂量能够使肝中的CaMKII磷酸化。为获得IP3R在胰高血糖素介导的CaMKII磷酸化的调控中重要的体内证据，小鼠用光溜海绵素C腹膜内处理4天。接着用胰高血糖素激发小鼠，且测定肝提取物的p-CaMKII。如图1H中所示，光溜海绵素C处理使胰高血糖素诱导的CaMKII磷酸化降低。接着，比较在自喂食至禁食状态的过渡期间的肝CaMKII磷酸化。在禁食后，肝CaMKII磷酸化显著增加，而CaMKII的总量似乎不受营养状态影响(图1I)。此外，在再喂食后，肝中的p-CaMKII的水平减小(图1J)。这些数据显示肝CaMKII的活性由营养状态以与它在禁食诱导的肝葡萄糖产生中的作用一致的方式调控。
CaMKII促进原代肝细胞中的肝葡萄糖产生、G6pc和Pck1的表达以及FoxO1核定位
响应于禁食/再喂食对肝CaMKII活性的体内调控导致直接测试它在由肝细胞产生葡萄糖中的作用。检查用表达组成型活性CaMKII的腺病毒(腺-CA-CaMKII)、表达激酶不活化显性阴性形式的CaMKII的腺病毒(腺-K43A-CaMKII)、或对照腺-LacZ转导的原代肝细胞中自丙酮酸和乳酸的葡萄糖产生。CA-CaMKII构建体在T287D处具有氨基酸取代，其模拟那个位点处的自体磷酸化且在不存在结合的Ca+2/钙调蛋白的情况下产生自主活性(Pfleiderer等,2004)。在基本条件下以及在用毛喉素刺激之后检查细胞，所述毛喉素是胰高血糖素模拟物和强力腺苷酸环化酶活化剂。观察到用腺-CA-CaMKII转导的细胞中的基础条件诱导的葡萄糖释放与毛喉素诱导的葡萄糖释放两者均增加(图2A)。相反，用腺-K43A-CaMKII感染细胞使基础条件诱导的葡萄糖产生与毛喉素诱导的葡萄糖产生两者均降低(图2A)。为进一步证实这些结果，测定来自WT小鼠和来自缺乏CaMKIIγ的小鼠的肝细胞中的葡萄糖产生，所述CaMKIIγ是在肝细胞中表达的酶的主要亚型。CaMKIIγ缺乏的肝细胞中的葡萄糖产生被遏制(图2B)。因此，CaMKII在肝细胞中的葡萄糖产生的激素调控中起重要作用。
CaMKII对肝葡萄糖产生的作用激起关于对编码糖原分解和糖异生中的限速酶的基因的转录影响的研究。为此，原代肝细胞用腺-LacZ、CA-CaMKII或K43A-CaMKII转导且测量毛喉素诱导的G6pc和Pck1基因表达。相较于腺-LacZ，用腺-CA-CaMKII转导的肝细胞中的G6pc与Pck1两者的mRNA水平均显著较高，而用腺-K43A-CaMKII进行的转导使这两种基因的mRNA水平降低(图2C)。CaMKII对糖异生的作用进一步由以下观察结果所支持：相对于WT肝细胞，Camk2g-/-肝细胞中的毛喉素诱导的G6pc和Pck1mRNA水平显著较低(图2D)。用胰高血糖素处理获得类似结果(图2E)。因此，CaMKII为G6Pc和Pck1的表达所必需。
诱导G6pc和Pck1中涉及的一种主要转录因子是FoxO1，其活性主要由它的细胞质定位相对于核定位的变化调控(Greer和Brunet,2005)。相对于Camk2g-/-小鼠，测定GFP标记的FoxO1在来自WT小鼠的肝细胞中的分布。在WT肝细胞中，在血清饥饿条件下，大多数GFP-FoxO1处于核中(图3A)。相反，Camk2g-/-肝细胞显示GFP-FoxO1主要定位在胞质液中。此外，当肝细胞用组成型活性CaMKII转导时，FoxO1变为主要处于核中(图3B-C)。与Camk2g-/-数据一致，在用显性阴性腺-K43A-CaMKII转导的WT肝细胞中，FoxO1主要位于细胞质中(图3B)。这些数据指示CaMKII有助于血清饥饿肝细胞中的FoxO1亚细胞定位。
CaMKIIγ缺乏损害体内肝葡萄糖产生且组成型活性肝CaMKII刺激体内肝葡萄糖 产生
为评估CaMKII在体内肝葡萄糖代谢中的功能性作用，检查WT小鼠和Camk2g-/-小鼠中的空腹血糖水平。与体外数据一致，观察到相对于WT小鼠，禁食Camk2g-/-小鼠中的血糖水平的适度但统计显著降低(图4A)。相对于WT小鼠，在敲除小鼠中，空腹葡萄糖浓度的差异不与循环胰岛素浓度增加相关。突变小鼠也显示响应于丙酮酸激发测试，血浆葡萄糖较低(图4B)。与原代肝细胞数据一致，Camk2g-/-小鼠的肝中的G6pc和Pck1mRNA水平以及核FoxO1存在降低(图4C-D)。
为进一步证实这个重要结果，使用一种用以体内抑制肝CaMKII的腺病毒方法。相较于用腺-LacZ处理的小鼠，用腺-K43A-CaMKII处理C57BL/6小鼠导致空腹血糖水平降低(图5A)。与这个研究结果一致，用K43A-CaMKII注射的小鼠中的肝G6pc和Pck1mRNA表达水平以及核FoxO1水平较低(图5B-C)。因为FoxO1消除损害禁食糖异生与糖原分解两者，且CaMKII抑制对关键糖原分解酶G6pc具有深远影响，所以检查急性CaMKII抑制对肝糖原含量的作用。数据显示用腺-K43A-CaMKII处理的小鼠中的肝糖原含量增加60％(图5D)。为使这些研究结果与胰高血糖素直接关联，用胰高血糖素的大丸剂腹膜内注射用腺-LacZ或腺-K43A-CaMKII处理的小鼠且接着在30分钟后分析肝。在胰高血糖素注射之后，LacZ处理的小鼠的肝中的G6pc受显著诱导，但K43A-CaMKII处理的小鼠的肝中受诱导则小得多(图5E)。此外，K43A-CaMKII处理的小鼠具有较高水平的肝糖原，如通过过碘酸-希夫(Periodic acid-Schiff，PAS)染色剂所观察的(图5F)。这些结果进一步证实CaMKII在肝葡萄糖产生中具有作用。
通过用腺-CA-CaMKII处理小鼠来检查组成型活性肝CaMKII在小鼠中的作用。这个处理导致空腹葡萄糖水平增加(图6A)。喂食血糖水平也存在略微增加，但它未达到统计显著性。此外，过度表达CA-CaMKII的小鼠显示响应于丙酮酸施用，血糖水平显著增加(图6B)。与这些观察结果一致，用腺-CA-CaMKII处理的小鼠中的肝G6pc和Pck1mRNA水平以及核FoxO1存在增加(图6C-D)。这些组合的体内数据显示CaMKII影响血浆葡萄糖水平、丙酮酸转化成葡萄糖、核FoxO1和肝葡萄糖代谢基因的表达。
Camk2g-/-肝细胞和CaMKII抑制的小鼠中的葡萄糖代谢损害由用组成型核FoxO1 转导而得以挽救
为验证FoxO1在由CaMKII控制肝葡萄糖代谢中的重要性，用含有磷酸化缺陷型组成型核FoxO1突变体(FoxO1-ADA)的腺病毒(Nakae等,2001)转导来自Camk2g-/-小鼠的肝细胞以使核FoxO1的水平类似于在WT肝细胞中的水平。CaMKIIγ缺乏对G6pc和Pck1mRNA的遏制作用通过用腺-FoxO1-ADA转导加以废除(图7A)。用腺-FoxO1-ADA腺病毒处理小鼠挽救了腺-K43A-CaMKII处理的小鼠中的葡萄糖体内平衡的损害(图7B-D)。总之，这些结果与其中CaMKII通过促进FoxO1的核定位来促进肝葡萄糖产生的模型一致。
讨论
肝中的葡萄糖代谢由胰岛素和胰高血糖素的相反作用严密调控。许多信号传导分子和转录因子已牵涉于在食物丧失的时期期间对糖原分解和糖异生的控制中。本文体外和体内数据将CaMKII添加至这个清单中，且通过这样做，提供与细胞内钙在肝葡萄糖代谢中的作用的分子关联。具体来说，本文数据显示肝CaMKII响应于禁食而活化，从而导致FoxO1的核易位以及对糖原分解和糖异生基因的诱导。FoxO1在CaMKII作用中的作用由以下研究结果支持：当组成型核FoxO1引入CaMKIIγ缺乏的肝细胞中时，CaMKII缺乏对葡萄糖产生的遏制作用得以废除。
胰高血糖素-cAMP-PKA途径不仅导致如此处所示的CaMKII活化，而且也直接使Ser133上的cAMP响应元件结合(CREB)蛋白质磷酸化。磷酸化CREB转录诱导PGC1α，所述PGC1α与FoxO1一起发挥促进G6pc1和Pck1转录的作用(Herzig等,2001)。先前研究已显示来自脑组织的CREB也可由CaMKII在Ser133上体外磷酸化(Dash等,1991；Sheng等,1991)，且CaMKII的药物抑制剂在破骨细胞生成的细胞培养模型中阻断CREB转录活性(Ang等,2007)。未观察到相对于CaMKII缺乏的肝细胞，WT肝细胞中的核CREB或磷酸CREB的差异，从而排除CaMKII通过修饰CREB来施加它对肝葡萄糖代谢的作用的可能性。
FoxO1活性主要由包括磷酸化和乙酰化的翻译后修饰调控(vander Horst和Burgering,2007)。被充分证明的是FoxO1在Thr24、Ser256和Ser319处由生长因子通过Akt磷酸化以促进它的核外排。CaMKII促进FoxO1核定位。实际上，CaMKIIγ缺乏不影响这三个残基的磷酸化。有证据表明由如JNK和AMPK的其它激酶在非Akt位点上进行的FoxO磷酸化可能实际上促进它的核保留。因此，FoxO活性的平衡可由刺激性磷酸化事件与抑制性磷酸化事件的组合所致，且在不受理论束缚下，CaMKII可通过直接激酶作用或通过影响FoxO磷酸酶活性来影响这个平衡。FoxO1脱乙酰化也可促进它的核定位(Frescas等,2005)，但FoxO1乙酰化也不受CaMKII缺乏影响。或者，CaMKIIγ可能以某种方式影响细胞质或核中的FoxO1易位或FoxO1相互作用分子的表达或活性中涉及的可能影响这个过程的输入或输出机构。未来研究将集中于对这个机制的阐明。
发现肝葡萄糖产生中涉及的一种新型分子不仅提供对针对空腹低血糖的生理防御的了解，而且也可揭示针对存在于胰岛素抗性环境中的受干扰的葡萄糖代谢的新型治疗靶标。实际上，在2型糖尿病中，不成比例的肝葡萄糖输出和相对于胰岛素信号传导胰高血糖素的不平衡促成空腹高血糖(Saltiel,2001)。在这个情形下，未来研究将解决抑制肝CaMKII是否会改善肥胖症和胰岛素抗性的代谢异常。
实施例4：适于与本文所述的方法一起使用的实验程序
试剂和抗体
胰高血糖素、丙酮酸、毛喉素、H89和8-溴-cAMP来自Sigma。BAPTA-AM和抗核磷酸蛋白(nucleophosmin，Np)抗体来自Invitrogen。光溜海绵素C来自EMD Chemicals。抗磷酸Thr287CaMKII抗体来自Imgenex和Novus；抗总CaMKII和抗FoxO1抗体来自Santa CruzBiotechnology Inc，抗β-肌动蛋白抗体来自Abcam。
细胞培养
原代小鼠肝细胞是如先前所述(Matsumoto等,2002)分离自8至12周龄小鼠。使细胞经受过夜血清耗竭且接着在无血清培养基中与毛喉素(10μm)一起孵育5小时。
测量CaMKII活性
根据制造商说明书，使用来自Promega的CaMKII测定试剂盒测定CaMKII活性。在如图例中所指示处理肝细胞之后，通过暴露于含1％曲通-X(Triton-X)的50mM HEPES、150mMNaCl、10mM焦磷酸钠、10mM EDTA、10mM EGTA、1mM Na3VO4、50mM NaF、1mMPMSF和5μg/ml亮肽素(leupeptin)5分钟来使它们溶解。接着，将[γ-32P]ATP和CaMKII生物素化肽底物添加至溶解产物中且在30℃下孵育10分钟之后，使用SAM生物素捕集膜使[32P]-磷酸化底物与残余[32P]ATP分离并使用闪烁计数器定量。
腺病毒感染
编码LacZ、CA-CaMKII、K43A-CaMKII和GFP-FoxO1的腺病毒是先前所述(Pfleiderer等,2004；Tanaka等,2009)且由Viraquest,Inc.(North Liberty,IA)扩增。在接种之后12小时转导原代肝细胞。在转导之后24小时进行RNA和蛋白质分离以及葡萄糖产生。
原代肝细胞中的葡萄糖产生
如所述进行葡萄糖产生测定(Backs等,2010；Yoon等,2001)。简而言之，在如上所述收集和培养原代小鼠肝细胞之后，将细胞培养基转换成补充有20mM乳酸钠和2mM丙酮酸钠的无葡萄糖和苯酚的DMEM(pH7.4)。在培养16小时之后，收集500μl培养基，且使用比色葡萄糖测定试剂盒(Abcam)测量葡萄糖含量。接着相对于全细胞溶解产物中的总蛋白量使读数标准化。
小鼠实验
如先前所述产生Camk2g-/-小鼠(Backs等,2010)且杂交于C57BL6/J背景上。小鼠用标准膳食(standard chow diet)喂食且按照12小时光照-黑暗循环加以供养。通过尾部静脉注射递送重组腺病毒(1.5×109个斑块形成单位/小鼠)。使用葡萄糖测量计(OneTouch Ultra,Lifescan)测量在自由获取水下禁食12-14小时的小鼠中的空腹血糖。在禁食17小时之后，以腹膜内注射2g kg-1体重的丙酮酸来进行丙酮酸耐受性测试。历经随后2小时测量血糖水平。通过在10pmol g-1的剂量下持续4天进行每日腹膜内注射来向小鼠施用光溜海绵素C。
肝糖原测量
将50-100mg冷冻肝在具有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的1mL H2O中均质化。接着使样本与KOH(1:2)混合，煮沸25分钟且用70％乙醇洗涤。使沉淀干燥且将其溶解于100μl H2O中并根据制造商说明书，使用糖原测定试剂盒(Abcam)评估糖原含量。数据代表平均值±SEM。
小鼠肝切片的PAS染色
将肝样本固定在10％中性缓冲福尔马林中24小时且包埋在石蜡中。根据制造商说明书，使用过碘酸-希夫(PAS)染色剂(Sigma)染色切片(5微米)中的糖原。接着用苏木精对比染色切片且通过光学显微术进行检查。对于PAS染色的定量，随机选择来自4个不同切片的5个区域且对PAS阳性细胞的数目计数并表示为细胞总数的百分比，如先前所述(RazaAsim等,2010)。对样本的身份不知情的2个独立研究者进行分析。
免疫印迹和定量RT-PCR
使用RNeasy试剂盒(Qiagen)自肝细胞提取总RNA。使用寡聚(dT)和SuperscriptII(Invitrogen)自2μg总RNA合成cDNA。如先前所述进行实时qPCR分析和蛋白质印迹(Timmins等,2009)。根据制造商说明书，使用来自Panomics的核提取试剂盒进行自肝提取核。
统计分析
所有结果都呈现为平均值±SEM。使用学生t检验(student’s t-test)计算P值。
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实施例5：肝CaMKII在胰高血糖素介导的肝葡萄糖产生(HGP)中的作用
肥胖症诱发的胰岛素抗性和肝葡萄糖及脂肪代谢紊乱增加心脏病、癌症和其它广布及毁灭性疾病的风险。当前治疗选项极其有限，从而产生影响身患当前肥胖症流行病的亿万超重人员的迫切的未满足临床需要。历经过去2年，若干发现(包括在肥胖症的模型中的验证)指示独特药物靶标—称为CaMKII的肝酶-的抑制剂可在这个小生境中具有巨大价值。因此，本发明的总体目标在于出于药物开发的目的开发且测试CaMKII抑制剂以改善肥胖症、代谢综合征和2型糖尿病中的代谢紊乱和它们的后果。
显示CaMKII在原代肝细胞中由胰高血糖素活化且在体内由胰高血糖素和禁食活化(图1)。肝CaMKII的遗传缺乏或抑制降低血糖水平，遏制HGP基因G6pc和Pck1，降低糖原耗竭，且阻断HGP转录因子FoxO1的核易位(关于显性阴性CaMKII的数据显示于图5中)。相反，组成型活性CaMKII诱导G6pc和Pck1，刺激葡萄糖产生，且升高血糖水平。重要的是CaMKII缺乏对葡萄糖代谢的遏制作用由组成型核FoxO1废除，从而指示CaMKII缺乏的作用需要核外排FoxO1(图7)。这些结果揭示在控制HGP方面的一种由CaMKII调控的新型分子途径。
检查肥胖症，因为胰高血糖素超过胰岛素信号传导的不平衡会促成肥胖症中的高血糖和胰岛素抗性。在瘦素(leptin)缺乏的(ob/ob)小鼠和膳食诱导的肥胖(DIO)小鼠的肝中，CaMKII被活化，但在瘦小鼠的肝中不被活化(图8A)。在肥胖人的肝中，CaMKII也被活化，但在瘦人中不被活化(图8B)。最重要的是遗传或药理学抑制肥胖小鼠中的肝CaMKII降低空腹血糖；改善胰岛素抗性；降低HGP中涉及的关键基因的表达；减轻脂肪肝和炎症且改善血脂异常(图9-10)。这些数据支持治疗性靶向CaMKII将改善肥胖受试者中的高血糖和胰岛素抗性的概念。
CaMKIIγ反义寡核苷酸(ASO)将在肥胖症的小鼠模型中加以测试
针对Camk2g的ASO将在肥胖症的小鼠模型中加以测试。Isis具有对照ASO和4种不同Camk2g ASO，其将用于处理DIO肥胖小鼠(持续6周一周一次腹膜内注射)。将测量肝和其它组织中的Camk2gmRNA的水平且将评估总体耐受性，包括肝重量、肝功能测试和对禁食的耐受性。将测试改进以下参数的功效：禁食和喂食血浆葡萄糖和胰岛素；HGP基因表达和FoxO1核定位；通过高胰岛素血症性血糖正常钳夹(hyperinsulinemic euglycemic clamp)研究获得的HGP和外周胰岛素敏感性；脂肪肝；以及血浆甘油三酯和脂肪酸。
筛选和测试CaMKII的新型化学抑制剂：
将使用对CaMKII活性的高通量荧光基测定来筛选“可药物化”化学文库，所述测定依赖于当使酶失活时的荧光发射比变化。将确定结构-活性关系且将使已存在且可商购用于体外和临床前研究的CaMKII抑制剂的效能和特异性最优化。最有希望的靶物(hit)将接着在胰岛素抗性原代肝细胞的模型中进行二次筛选，此涉及以模拟肥胖小鼠中的肝中所见的葡萄糖产生和胰岛素抗性增加的方式用饱和脂肪酸处理细胞。使用这个模型，将检查CaMKII、葡萄糖产生和胰岛素抗性的最强力抑制剂。将根据以上对于ASO概述的策略对以克数量制备的最有希望的药物进行体内测试，其中对监测CaMKII的活性和非肝组织中的抑制后果保持警惕。将评估经口可用药物的递送简易性和向肝的递送，即通过门脉循环递送。如果改变药物变得必须，那么可改变药物以实现经口可用性。
实施例6
肥胖症/胰岛素抗性中促进冠状动脉疾病(CAD)的风险增加的两个主要因素是斑块自身中的促动脉粥样化过程和全身性风险因素(特别是肝源性血脂异常)增加。人糖尿病性斑块的特征在于促进炎症、斑块破裂和急性CAD的坏死面积尤其较大。斑块坏死是由于死细胞清除有缺陷的环境中的巨噬细胞()凋亡而发展。将检查晚期斑块中的延长的内质网(ER)应激触发死亡和斑块坏死所依据的机制。这些过程在胰岛素信号传导有缺陷的中被扩大。延长的ER应激促进细胞质钙(Ca2+)升高，所述钙通过活化Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白质激酶II-γ(CaMKIIγ)来触发细胞凋亡。缺失或抑制肥胖小鼠中的CaMKIIγ可保护免受高胰岛素血症、糖异生、血脂异常、脂肪肝和ER应激。这些新研究结果指示一种酶可对促进胰岛素抗性受试者的CAD的两种补充过程具有关键作用(图11)。因此，CaMKIIγ缺乏可减少胰岛素抗性的鼠模型中的晚期病变性细胞凋亡和斑块坏死且肝CaMKIIγ缺乏将改善肥胖小鼠中的致动脉粥样化代谢紊乱。
CaMKIIγ缺乏将减少胰岛素抗性小鼠中的晚期病变性 细胞凋亡和斑块 坏死
体外数据显示CaMKIIγ协调ER应激的中的许多关键细胞凋亡途径。PPG数据显示胰岛素抗性中的Ca2+代谢被扰乱且CaMKIIγ被活化。因此，CaMKIIγ可在ER应激的胰岛素抗性的细胞凋亡中起特别重要作用。将首先确定自缺陷型胰岛素信号传导的两种概念验证模型Insr-/-和ob/ob分离的中的siRNA介导的Camk2g沉默是否会遏制这些细胞中的极高程度的ER应激诱导的细胞凋亡，且接着探究保护的分子/细胞机制。将测量作为CaMKII活化的量度的p-CaMKII以确定相对于人和小鼠中的较早阶段动脉粥样硬化病变，它在晚期阶段动脉粥样硬化病变中的病变性中是否较高。为测试原因，将来自Camg2gfl/flLysmcre+/-Insr-/-小鼠以及来自WT小鼠和来自缺乏 CaMKIIγ或胰岛素受体的小鼠的骨髓细胞分别移植至Ldlr-/-小鼠中，且接着置放在西方膳食(Westerndiet)上。Insr-/-→ Ldlr-/-小鼠中的高程度的晚期病变性细胞凋亡和斑块坏死将因 CaMKII缺乏而显著改善。
肝CaMKIIγ缺乏改善肥胖症的代谢紊乱以及肝特异性CaMKIIγ缺乏将遏制肥胖 小鼠的动脉粥样硬化所凭借的机制。
Camk2gfl/fl X α1-抗胰蛋白酶-Cre小鼠将用于测试肝特异性CaMKIIγ缺乏是否会改善肥胖症中的葡萄糖、脂质和脂蛋白代谢。将测试肥胖通过涉及ER应激效应子CHOP的机制活化肝CaMKIIγ的想法。将探究肝CaMKIIγ缺乏对葡萄糖和脂质代谢的有益作用一种潜在机制，即核外排FoxO1以及抑制肝葡萄糖产生/糖异生。将探测相对于瘦人受试者，来自肥胖人受试者的肝试样中的CaMKII活化和相关机制。LysMCre模型将用于研究肝中的CaMKIIγ缺乏是否通过遏制ER应激和/或炎症来起作用，以及是否它也可促进对肥胖症中的肝介导的代谢紊乱的遏制。将测试以下事项：(a)西方膳食喂食的Ldlr-/-小鼠中的肝CaMKIIγ缺乏是否将遏制动脉粥样化形成；和(b)组合的肝和 CaMKIIγ缺乏是否将对所有阶段的动脉粥样硬化具有显著有益作用。
实施例7：斑块坏死
2-3％的引起急性CAD的病变不由它们的较大尺寸而由存在斑块坏死区分1,2，所述斑块坏死促进斑块破裂、急性管腔血栓形成和组织梗塞(3)。斑块坏死由细胞凋亡与死的清除或“胞葬(efferocytosis)”有缺陷(从而导致细胞凋亡后坏死)的组合引起(4-6)。这个概念在考虑糖尿病和胰岛素抗性如何促进CAD方面特别重要，因为糖尿病受试者中的晚期动脉粥样硬化病变的特征在于当相较于来自非糖尿病个体的类似尺寸的病变时，坏死核心特别大(7-12)。对患有CAD的受试者的前瞻性研究发现仅糖尿病和年龄与坏死核心尺寸正相关(12)。这些数据提出关于晚期病变性细胞凋亡是否在糖尿病环境中增强的问题。
作为晚期病变性 细胞凋亡的机制的延长的ER应激
机制和体内数据支持延长的ER应激在晚期病变性细胞凋亡和斑块坏死中具有作用{4997, 5081}。ER应激诱导的细胞凋亡主要取决于所谓未折叠蛋白质响应(UPR)的CHOP分支(15,16)。在人冠状动脉中，在CHOP表达、细胞凋亡和晚期斑块阶段之间存在极强关联(17)。CHOP缺乏的动脉粥样硬化易感小鼠的晚期斑块进展受遏制(16)，此接着由使用骨髓转移来牵涉CHOP的作用的另一小组确认(18)。第三项研究显示被认为减轻ER应激的“化学侣伴蛋白”的动脉粥样化保护作用(19)。可用以下手段在培养的中建立CHOP诱导的细胞凋亡模型：(a)ER应激的强力诱导剂，如7-酮基胆固醇(16,20)，其为晚期动脉粥样硬化病变中的最丰富的氧甾酮(oxysterol)(17)；或(b)更微妙ER应激加动脉粥样化相关“第2靶目标”的组合，所述靶目标特别是由修饰的脂蛋白或饱和脂肪酸达成的样式识别受体(PRR)活化，所述活化扩大促细胞凋亡信号传导且遏制细胞存活信号传导(21,22)。2靶目标概念也适用于晚期病变性的另一模型，即用脂蛋白源性游离胆固醇(FC)装载的(23-26)，因为ER膜中的过量FC活化UPR，而修饰的脂蛋白活化PRR。出于这个提议最重要的是PPG已显示ER应激诱导的细胞凋亡在胰岛素信号传导有缺陷的中显著增强。
肝在肥胖症和胰岛素抗性中的促动脉粥样化作用。肝在胰岛素抗性中的CAD风险增加中起主要作用(27,28)。主要关联是通过以下方式来达成：VLDL apoB和甘油三酯(TG)分泌增加，此由与脂肪源性游离脂肪酸的肝递送增加偶联的重新脂肪生成触发；遏制apoB降解；和增强apoB翻译28。SREBP1c介导的脂肪生成和VLDL分泌是通过由血胰岛素过多活化“残余”胰岛素受体信号传导途径加以刺激(29-33)。胰岛素受体-mTORC1途径遏制分拣蛋白(sortilin)-1介导的apoB降解。肥胖症、胰岛素抗性和代谢紊乱之间的两种其它潜在关联是肝ER应激和炎症。肥胖症中的肝ER应激可通过IRE1-JNK介导的对Ser30734上的IRS-1的磷酸化或通过活化GSK-3β遏制胰岛素信号传导，所述GSK-3β抑制rictor介导的AKT活化(35,36)。减轻动物模型中的肝ER应激的操作改善胰岛素抗性(37,38)，且在人中的研究已显示重量损失降低肝ER应激(39)。肝ER应激促进SREBP-1c活化和脂肪变性(34,38,40)，但对VLDL分泌本身的影响仍待完全探究(41-43)。就炎症而言，细胞因子可自血液或通过由已牵涉于肥胖症诱导的胰岛素抗性中的固有库柏法(Kupffer)细胞或新募集的巨噬细胞分泌而进入肝中(28,44,45)。炎症性细胞因子活化JNK，所述JNK已通过破坏胰岛素受体信号传导(以上)以及通过活化激酶PKR46而与胰岛素抗性相关联。
CaMKII。
CaMKII是一种Ca2+活化的Ser/Thr激酶，其活性形式是具有12-14个由4种基因α、β、γ或δ47之一编码的亚单位的均多聚体。(注意：CaMKII不同于活化AMPK的CaMKK)。α和β亚型是在神经元中，而CaMKIIγ和CaMKIIδ在广泛多种组织中表达。和HC表达γ形式48。在基本状态下，调控结构域与催化结构域相互作用且抑制催化结构域。当胞质液Ca2+增加时，Ca2+-钙调蛋白复合物破坏这个相互作用，由此减轻自体抑制且促进Thr287的自体磷酸化。这个过程增加Ca2+-CaM结合的亲和力且导致Ca2+非依赖性激酶活化。关于CaMKII的大多数研究已在神经元和心肌细胞中进行。在中，体外抑制剂研究在以下中具有已报道的作用：吞噬溶酶体杀伤细菌；LPS介导的腺苷酰环化酶活化和HIF-1α诱导；PKR介导的p38活化；自体免疫诱导的细胞凋亡；和炎症性基因的去阻遏(49-54)。关于肝细胞中的CaMKII的公开数据极其有限。如以下章节中所说明，遗传靶向Camk2g用于显示在ER应激诱导的细胞凋亡中(48)以及在肥胖症环境中的肝驱动代谢紊乱中的新型作用。
CaMKIIγ在动脉粥样硬化中的作用先前从未加以探究，且它在由于胰岛素抗性中的钙动力学改变所产生的胰岛素抗性的环境中的重要性是一种新概念。一种新型cre-lox模型将用于测试这些想法。肝细胞CaMKIIγ在肥胖症的代谢紊乱中的作用可揭示这个关键领域中的其它新型原理。cre-lox模型也将理想地用以测试这个想法。最后，所提出的这个单一分子通过对病变性、肝细胞和可能肝的作用在介导肥胖症和胰岛素抗性环境中的动脉粥样硬化方面的完整作用代表一种可具有重要治疗意义的新颖概念。
与肥胖症和胰岛素抗性流行病相关的CAD风险因素将为历经下一个十年的CAD主要驱动因素(55)。这个研究结果阐明这个领域中的两个关键过程的新型机制和体内后果，一个过程集中于斑块细胞凋亡且另一过程集中于肝中促进CAD风险的代谢过程。研究集中在晚期斑块形态，特别是为实际上引起急性CAD的少数人斑块的最重要特征的坏死(56)。此外，研究结果包括使用处于各种进展阶段的人斑块试样和相对于瘦人受试者，来自肥胖人受试者的肝试样进行的未来研究。在完成提出的研究后，将获得用于肥胖/胰岛素抗性受试者的新型治疗策略，所述策略靶向动脉壁和肝中的共同促动脉粥样化信号传导途径。值得注意的是CaMKII抑制剂已在其中CaMKII被认为促进疾病进展的其它方案中，在动物模型中加以成功测试(57,58)。如本文所述，部分抑制所述酶对保护和HC具有显著作用，此进一步增加治疗方法的可行性。可通过选择性抑制γ亚型以及通过使用使药物靶向动脉粥样硬化病变和肝的策略来获得特异性(59,60)。然而，考虑到CaMKII抑制在糖尿病的其它方面，如心力衰竭(61)、高血压和肾病(62)、以及视网膜疾病(63)中的益处，这个特异性可能并不需要。
测试 CaMKIIγ缺乏是否将减少胰岛素敏感性且尤其 -胰岛素抗性小鼠中 的晚期病变性 细胞凋亡和斑块坏死。
存在对于涉及延长的ER应激与PRR信号传导组合的以上提及的细胞凋亡的“2靶目标”机制的有体外和体内证据(22,48,64-72)。一关键ER应激途径涉及CHOP介导的对ER氧化酶ERO1α的诱导，所述ERO1α接着活化ER Ca2+释放通道IP3R。释放的Ca2+活化CaMKIIγ，其转而又触发下游细胞凋亡途径，包括JNK-介导的对Fas死亡受体的诱导；外部线粒体膜的渗透化和细胞色素c的释放；以及诱导NADPH氧化酶介导的ROS，其也通过称为PKR的上游激酶扩增CHOP(图12)。关于以上提及的治疗潜力，CaMKIIγ的部分抑制足以保护(图13)。重要的是ER应激的CaMKIIγ缺乏小鼠被保护免遭腹膜和脾以及肾上皮细胞中的体内细胞凋亡。然而，-CaMKIIγ在晚期动脉粥样硬化病变性细胞凋亡和斑块坏死中的作用未知。
将这些概念应用于胰岛素抗性环境中的已成为PPG的主要目标。通过至少3种机制增强ER应激诱导的细胞凋亡：(a)上调清道夫受体(74)；(b)遏制AKT和NF-κB细胞存活途径(66)；和(c)下调ER Ca2+泵SERCA75。最重要的是晚期病变性细胞凋亡和斑块坏死在其中具有缺陷型胰岛素信号传导的病变中增加76，此与人糖尿病病变的极大坏死核心一致。另一研究显示当是Insr-/-或Irs2-/-77时，喂食极高胆固醇/胆酸盐(“Paigen”)膳食的混合遗传背景Apoe-/-小鼠的病变面积适度降低。这可与促炎症性Paigen膳食环境中的抗炎作用相关(77-79)，与以上NF-κB研究(66)一致。最重要的是不包括晚期病变性细胞凋亡和斑块坏死的关键终点，所述关键终点是PPG的焦点。
在不受理论束缚下，这3种机制与ER应激/PRR 2靶目标模型之间的关联易于基于这些机制和新数据(图14)而显而易知：(a)在胰岛素抗性中，ERK1/2-SERCA途径受抑制，此增加ER Ca2+释放至胞质液中(75)。本文所述的结果显示在Insr-/-和ob/ob 中，作为CaMKII活化的标记物的p-CaMKII增加，且在ERK抑制的WT 中与以上机制(75)一致(图15)；(b)抑制SERCA可延长ER应激(80)，且CaMKII活化通过前馈循环扩大ER应激(图16)—所有都与自ob/ob小鼠新鲜分离的中的CHOP增加的研究结果(68)一致。
机制研究。
将相对于胰岛素抗性ER应激的，测定对照中的CaMKII活性。为拓宽重要性，将使用不同来源的、胰岛素抗性的诱导剂、ER应激的活化剂和用于沉默CaMKIIγ的方法。将使用来自Insr-/-小鼠的腹膜(76)，此是基于胰岛素受体由血胰岛素过多引起的显著下调(81-84)，包括对来自胰岛素抗性人的单核细胞的显著下调(85,86)。这些vWT将用以下动脉粥样化相关ER应激活化剂(13)激发：FC装载物；7-酮基胆固醇；或低剂量ER应激加PRR活化剂，例如过氧亚硝酸盐供体SIN-1加氧化磷脂(oxPL)(72)。将测试作为CAD的风险因素(87-91)、人中的oxPL的载体(92)和ER应激的中的细胞凋亡的强力刺激剂(72)的脂蛋白Lp(a)。将通过pThr287免疫印迹(图15)或通过直接CaMKII激酶测定(48)来测定CaMKII活化。
ER应激的胰岛素抗性中的细胞凋亡的程度由两个组分组成：“基本”(即，ER应激的WT 中所见的程度)加因胰岛素抗性产生的增量，其中各自对最终细胞凋亡响应贡献约50％(76)。在ob/ob 中，部分CaMKII抑制导致ER应激诱导的细胞凋亡的基本组分降低约40％以及ob/ob诱导的增量部分抑制约65％，即，总细胞凋亡由抑制剂降低的程度在ob/ob 中大于在WTER应激的中(WT中5.0±0.4→3.1±0.2％相对于ob/ob中11.9±1.1→5.6±0.5％)。这些实验将使用(a)ob/o中的Camk2g siRNA；(b)ob/ob相对于ob/obCamk2g-/-；和(c)来自以下动脉粥样硬化研究的(即，Ldlr-/-小鼠用WT小鼠、Camk2g KO小鼠、Insr KO小鼠或Camk2gInsr DKO小鼠的骨髓移植)进行重复。将通过确定CAMKIIγ诱导的促细胞凋亡信号传导的哪些效应子在胰岛素抗性中增加以及因CaMKIIγ缺乏而降低来探测机制：Fas死亡受体诱导；STAT1活化；线粒体Ca2+摄取和细胞色素c释放；Nox2诱导/ROS48；UPR扩增；和PKR活化。四组—con-WT；胰岛素抗性WT；con-Camk2g-/-；和胰岛素抗性Camk2g-/-—将如下进行测定(48,68,93,94)：RT-QPCR用于FasmRNA且FACS分析用于Fas细胞表面表达；免疫印迹用于p-STAT1；若丹明-2染色和mt-pericam荧光(95)用于线粒体Ca2+；免疫印迹用于线粒体和胞质液细胞色素c以及半胱天冬酶-9活性测定；RT-QPCR用于Nox2mRNA且DCF染色用于细胞过氧化物积累；免疫印迹用于p-PERK和CHOP；以及免疫印迹用于p-PKR。相对于敏感性ER应激的，这些效应子终点将在胰岛素抗性中增加，且在不存在CaMKIIγ的情况下，胰岛素抗性中的基本ER应激诱导的组分与进一步增量两者均将降低，从而导致Camk2g-/-的总体显著降低。然而，胰岛素抗性导致特定终点选择性增加或如果数据指示除CaMKIIγ以外的因子可涉及于胰岛素抗性诱导的增量中，那么将构思且执行由数据驱动的机制实验。
在不受理论束缚下，胰岛素抗性(IR)增强ER应激的中的CaMKIIγ的促细胞凋亡作用(IR → CaMKII)。正反馈循环常涉及于ER应激诱导的细胞凋亡信号传导途径中(93)(图16)。因此，将探究CaMKIIγ是否可反馈增强胰岛素抗性(IR CaMKII)。如果是这样的话，那么基于先前研究(66,72,74,75,75)，CaMKIIγ缺乏可在胰岛素抗性中具有以下保护作用：(a) ↓ SRA和CD36，↑ p-Akt，↑ p-ERK，↑ SERCA2b，和↑ p-FoxO1(免疫印迹)；(b)↑ Serca2b，↓ Ikbe，和↑Bcl2(在胰岛素抗性中降低的NF-κB靶标66)(RT-QPCR)；(c) ↓ERCa2+(氟-3-毒胡萝卜素(thapsigargin)荧光显微测定)；和(d) ↓核FoxO(腺-GFP-FoxO1转导的中的免疫荧光)。考虑到CaMKIIγ为FoxO1在禁食和胰岛素抗性肝细胞中的核定位所必需，对后述测定特别感兴趣。总之，这些研究将提供关于CaMKIIγ在胰岛素抗性于ER应激的中的促细胞凋亡作用中的作用的全面见解。
人动脉粥样硬化。
然而原因研究将在小鼠中进行(下一章节)，但将测试斑块中的CaMKIIγ的活化是否(a)随斑块阶段推进而增加；以及是否(b)在缺陷型胰岛素信号传导环境中增加。将新鲜分离/快速冷冻颈动脉斑块试样在斑块中间分成3个邻近小切片。中间切片将用于抗p-CaMKII免疫印迹分析且通过与总CaMKIIγ的密度计量比和β-肌动蛋白装载对照加以定量。紧接的侧接区域将用超薄切片机切片且接着(a)用Movat五色染色剂染色以测量坏死面积(定量为总面积的百分比)；以及(b)对、p-CaMKII进行免疫染色(图17)，且进行针对细胞凋亡的TUNEL(定量为阳性的百分比)。目标是显示p-CaMKII与坏死面积(和TUNEL)之间的关联是在P＝0.05下显著的。此外，这些试样将使用Virmani-AHA流程(96)以盲法方式分类成5个阶段：1＝弥漫性内膜增厚；2＝纤维斑块；3＝厚盖粥瘤；4＝薄盖粥瘤；和5＝破裂斑块。目标是测试相对于1+2，在4+5阶段中，p-CaMKII是否富集。n＝15将以80％效力足以显示在4+5病变与1+2病变之间，存在p-CaMKII的在P＝0.05下的至少2倍差异。最后，将分析所有数据以获得与存在2型糖尿病的相对于病变阶段校正的关联以及p-CaMKII与两个病变阶段和存在2型糖尿病之间的正关联。
鼠动脉粥样硬化研究。
两个目标是：(a)测试CaMKIIγ活化和它的促细胞凋亡作用是否随斑块阶段推进而增加以及是否在胰岛素抗性环境中增加；和(b)作为原因研究，测试CaMKIIγ缺乏对晚期病变性细胞凋亡和斑块坏死的影响和机制。使用与先前所述(76)相同的总体策略，以下4组小鼠将用作向雄性Ldlr-/-小鼠中进行骨髓移植(BMT)的供体：Camk2gfl/flInsr+/+(WT→Ldlr-/-)；Camk2gfl/flLysmcre+/-Insr+/+(-CK KO→Ldlr-/-)；Camk2gfl/flInsr-/-(-InsR KO→Ldlr-/-)；和Camk2gfl/flLysmcre+/-Insr-/-(-CK/InsR DKO→Ldlr-/-)。所有基因型都已回交于C57BL6/J背景上>8代，且所有实验都将使用同窝对照。先前研究已显示Lysmcre+/-背景上的病变性中的floxed基因几乎完全缺失(67,97)。在BMT之后6周，小鼠将喂食西方膳食(WD)8、12、16和20周，此将使得能够分析早期、中间阶段和晚期/坏死病变(16,65,67,71,97-102)。以类似策略和目标进行的先前动脉粥样硬化研究(16,65,71,97,101,102)连同来自先前体内研究(76)的统计数值一起允许估计每组n＝30只雄性小鼠将给予我们80％机会来检测四组小鼠之间这些终点的33％差异。
这个领域中的出版物中已详述用于小鼠动脉粥样硬化研究(包括细胞凋亡和坏死核心定量)的总体方案(16,65,67,71,72,97,101-103)。简而言之，获得血浆以进行脂质/脂蛋白分析、空腹葡萄糖和胰岛素分析。分析主动脉根和头臂动脉的病变和坏死面积；细胞凋亡(TUNEL和活化的半胱天冬酶-3)；和原位胞葬。将测定病变中的原位胞葬(103)。坏死面积定义为具有碎片(在不存在细胞的情况下的特异性抗原)的非细胞面积且在不存在胶原蛋白染色的情况下获得。、SMC、EC和T细胞将通过IHC进行鉴定，且使用针对弹性蛋白(elastin)和胶原蛋白的凡尔霍夫氏(Verhoeff’s)和马逊氏(Masson’s)三色染色剂定量纤维盖的厚度(97)。后述测定将以如所述(104)通过探测20周病变以完全降解凡尔霍夫染色的样本中的内侧弹性纤维(“内侧侵蚀”)进行补充，因为遏制继发性坏死可导致MMP较少泄漏，此可为这个终点的原因(105)。如所述(104)，数据将定量为各组中病变显示内侧侵蚀的小鼠的数目。阳性结果将继之以如所述(106)，使用MMP明胶酶(MMP2/9)底物，通过酶谱分析和近红外荧光来测定病变切片的活性MMP。将使用皮尔氏(Perl's)铁染色剂(109)以及用于RBC的H&E切片检查和560nm荧光(107,110)来测定斑块内出血的晚期斑块性质(107,108)。使用抗F4/80()和抗p-CaMKII的IHC将用于评估p-CaMKII是否随斑块阶段推进而增加以及是否在缺陷型胰岛素信号传导环境中增加。在来自Camk2g-/-小鼠的中，抗p-CaMKII抗体不给予高于背景的信号。如同人病变(图17)一样，已获得晚期病变性中的与存在p-CaMKII一致的染色样式，且将使用-CK KO组验证这个信号。将定量IHC数据作为每个病变面积的p-CaMKII染色面积；作为的CaMKIIγ染色细胞的百分比；和p-CaMKII染色的的百分比。将对已自其移除外膜的主动脉根和穹隆区段进行免疫印迹以使可准确鉴定p-CaMKII(和总CaMKII)。这个分析不排除其它动脉壁细胞的影响，但IHC研究应允许我们评估这些其它细胞是否甚至表达所述酶的γ亚型。将进行促炎症性(TNFα和IL-6)和抗炎性(TGFβ和IL-10)细胞因子mRNA表达激光捕集显微解剖(LCM)-RT-QPCR，因为细胞凋亡和ER应激的降低将可能减少斑块炎症(70,111)，且不存在CaMKIIγ可通过使NCoR共阻遏子功能稳定来降低炎症性基因的转录(53,54)。捕集的RNA也将用于探究如由细胞培养研究所指导的体内机制。将评估活化的CaMKIIγ的促细胞凋亡转录靶标，特别是Fas、Nox2和Chop(Ddit3)mRNA48。也将测定Serca2b、Ikbe和Bcl2(在胰岛素抗性中降低的NF-κB靶标66)的mRNA。将测定作为FoxO1靶标(112)的Tlr4和Tlr2的mRNA表达。关于Nox2和氧化应激(93)，将使用DHE测定病变性ROS。这些结果将显示(a)相对于WT组，CKO组中的晚期病变性细胞凋亡和斑块坏死以及CaMKII-细胞凋亡途径的标记物将较低，且特别是相对于WT组的CK/InsRDKO组；(b)相对于WT组，CKO组中的Fas、Nox2和Chop mRNA以及ROS将较低，且特别是相对于WT组的CK/InsR DKO组；以及(c)相对于WT组，胰岛素抗性组中的Serca2b和Bcl2将较低且Ikbe较高，且将引起关注的是观察这些趋势在CK/InsR DKO组中是否逆转。
表1：小鼠模型和终点预测的概述
相对于WT组，在CKO组中坏死以及CaMKII-细胞凋亡途径的标记物将较低，且特别是相对于WT组的CK/InsR DKO组；(b)相对于WT组，CKO组中的Fas、Nox2和Chop mRNA以及ROS将较低，且特别是相对于WT组的CK/InsR DKO组；以及(c)相对于WT组，胰岛素抗性组中的Serca2b和Bcl2将较低且Ikbe较高，且将引起关注的是观察这些趋势在CK/InsR DKO组中是否逆转。
表征肝CaMKIIγ缺乏改善肥胖症的代谢紊乱所凭借的机制以及测定肝特异性 CaMKIIγ缺乏是否将遏制肥胖小鼠的动脉粥样硬化。
HC CaMKIIγ—在ER应激诱导的细胞凋亡中起关键作用的相同酶—的缺乏改善肥胖症中的致动脉粥样化代谢紊乱。CaMKIIγ是小鼠和人肝中的主要CaMKII亚型且相较于瘦对照，作为CaMKIIγ活化状态的量度的p-CaMKIIγ在ob/ob小鼠、膳食诱导的(DIO)小鼠(5.24千卡/g，60％卡路里来自脂肪，x20周)和病态肥胖人的肝中增加(图8A-B)。与这些数据和肥胖导致肝ER应激(34)的事实一致，由氮杂环丁烷或棕榈酸盐达成的ER应激活化增加HC中的p-CaMKIIγ，且DIO小鼠中的CaMKIIγ缺乏遏制UPR活化，从而表明像CaMKIIγ在中表现的一样，它参与HC中的UPR正反馈循环(参见图16)。通过发现相较于DIO WT小鼠，尽管重量无差异，但CaMKIIγ缺乏的DIO小鼠具有显著较低血浆胰岛素且对胰岛素介导的葡萄糖降低的响应性更大来显示CaMKIIγ在肥胖症中的功能性重要性(图9A-D)。在葡萄糖耐受性测试期间，小鼠的血糖也有改善。通过使用被验证抑制肝CaMKII的腺-K43A-CaMKII对肝CaMKII进行急性抑制得到类似结果(图9E-F)，所述腺-K43A-CaMKII是激酶不活化显性阴性形式的CaMKII123。在腺-K43A-CaMKII处理的ob/ob小鼠的肝中，糖异生(GNG)基因G6Pase和PEPCK的mRNA降低(图9G)。
如同也在CaMKII抑制的肝中降低的Igfbp1一样，两种基因均是FoxO1的靶标。这些数据与遏制FoxO1核定位的CaMKII抑制一致(参见下文)。CaMKIIγ缺乏的DIO小鼠也具有降低的(a)肝甘油三酯(TG)含量(图10A)；(b)SERBP-1c诱导的脂肪生成mRNA而非与脂肪酸氧化相关的mRNA；和(c)血浆胆固醇和TG(图10B)。高脂肪膳食诱导的血脂异常涉及由作用于残余人胰岛素受体的血胰岛素过多而刺激mTORC1-pS6K途径，从而导致遏制分拣蛋白1(Sort)。Sort降低已与人血脂异常遗传关联，且机制似乎是Sort介导的LDL apoB-100降解降低，所述降解或许是通过Sort侣伴蛋白介导的溶酶体降解途径124。这个途径通过CaMKII抑制而部分受阻(图10C)。最后，相对于WTDIO肝，Camkg2g-/-肝中的肝Tnfa mRNA降低约50％(图10D)。
肝细胞CaMKIIγ缺乏通过涉及核外排FoxO1的机制降低糖异生(GNG)和肝葡萄糖 产生(HGP)来减轻高胰岛素血症和继发血脂异常(图18)。
这个分析基于(a)HGP升高在促进肥胖症中的高胰岛素血症中的作用和高胰岛素血症在驱动血脂异常中的重要性；(b)肥胖小鼠中的CaMKII抑制降低FoxO1诱导的GNG基因和FoxO1靶标Igfbp1的研究结果(图8G)；和(c)关于禁食瘦小鼠中的肝CaMKIIγ、FoxO1和GNG之间的关联的数据。
将使用本文所述的目前与α1-抗胰蛋白酶Cre(A1atcre+/-)小鼠杂交以缺失HC中的CaMKIIγ的Camk2g小鼠125。四组雄性小鼠将在4周龄开始喂食DIO膳食20周：DIO/Camk2gfl/fl(DIO/WT)和标准膳食喂食对照(瘦/WT)；和DIO/Camk2gfl/flA1atcre+/-(DIO/Li-CK KO)；和标准膳食喂食对照(瘦/Li-CK KO)。为排除生殖系敲除的补偿效应，一组DIO/Li-CK KO小鼠将用腺-T287D-CaMKII(相对于腺-LacZ对照)“恢复”，所述腺-T287D-CaMKII是所述激酶的组成型活性形式(123)，其应逆转DIO/Li-CK KO小鼠中的预测有益代谢作用。将监测食物摄取和体重，且将每4周获得空腹血浆葡萄糖和胰岛素。在喂食时期结束时，小鼠将被禁食6小时，称重且处死。鉴于昼夜节律与代谢的关联(126-128)，将严格依从12小时光照/黑暗循环，且所有小鼠都将在一天的相同时间被处死。尽管Camk2g-/-小鼠会在无明显形态学或功能性异常(包括与肝相关的异常)的情况下发育至成年期48，但将获得血浆以测定下述代谢和脂质参数以及作为HC功能障碍的量度的丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)。肝将接着立刻移除，快速冷冻在液氮中，且储存在-80oC下。CaMKIIγ的缺失将通过RT-PCR和免疫印迹确认，且将通过对脑、心脏、肾、脂肪组织、骨骼肌和肠的快速冷冻样本进行类似分析来测定肝缺失的特异性。也将通过免疫印迹分析肝的p-CaMKII、p–JNK134和UPR标记物(34)，且在肝炎症的情形下，通过QPCR分析肝的Tnfa。在不受理论束缚下，相对于瘦WT，DIO/WT组中的这些终点将升高，但在DIO/Li-CKKO组中受遏制。
HC CaMKIIγ缺乏改善葡萄糖和脂质代谢
各组中的8只小鼠将经受完整高胰岛素血症性-血糖正常钳夹研究，所述研究将进一步评估胰岛素敏感性且定量外周组织(例如，骨骼肌、脂肪组织)中的基本和胰岛素刺激的肝葡萄糖产生(HGP)以及胰岛素刺激的葡萄糖摄取、糖酵解和糖原合成(129)。相对于瘦WT组，DIO/WT组应显示葡萄糖输注降低、HGP增加和外周组织葡萄糖处置降低，从而反映这些小鼠中的胰岛素抗性。相对于DIO/WT小鼠，DIO/Li-CK KO小鼠中的这些参数将改善(即，葡萄糖输注增加和HGP降低)。每组8只小鼠可具有80％效力来显示DIO/Li-CK KO组与DIO/WT组之间的统计显著差异(P<0.05)。
相较于DIO/WT小鼠，DIO/Li-CK KO小鼠将具有较小致动脉粥样化脂质分布，所述分布将通过测定血浆TG、总胆固醇、HDL-胆固醇、FPLC脂蛋白分布以及致动脉粥样化性来测试且在胰岛素抗性状态下升高(130)。为补充血浆研究，将分析来自小鼠的肝样本的TG含量、LDL受体蛋白质和mRNA，以及分析mRNA的Srebp1c和它的转录靶标。相对于DIO/小鼠，DIO/Li-CK KO小鼠中的富含TG的血浆脂蛋白的预测降低可归因于肝分泌降低或肝清除增加。为测定TG分泌，将进行曲通WR-1339研究(131)。简而言之，禁食的小鼠将用[35S]-甲硫氨酸注射以通过代谢标记apoB且用曲通WR-1339注射以阻断脂蛋白清除。将在整个注射后2小时时期期间收集血浆且分析血浆的TG含量和VLDL，且将依次通过SDS-PAGE和放射自显影来测定apoB100和apoB48。标记的apoB标记的脂蛋白在2小时时期期间的升高速率是分泌速率的量度。CaMKIIγ缺乏使胰岛素抗性环境中的肝Sort表达增加(去阻遏)(图10C)。目标在于确定使DIO/Li-CK KO小鼠中的肝Sort沉默是否增加VLDL分泌。DIO小鼠的脂肪肝因CaMKIIγ缺乏而得以显著改善(图10A)。将测量TG含量且染色4组小鼠的肝试样中的油红O阳性脂质小滴。如果DIO/Li-CK KO小鼠显示肝TG积累降低，那么将通过测定脂肪生成基因，包括Srebf1、Fasn、Acaca、Scd1；脂肪酸氧化中涉及的基因，包括Ppara和Acox1；以及鉴于它在FoxO KO小鼠肝中的脂肪变性中的作用的Nampt的表达来探测机制(132)。跟踪研究将探究使CaMKII与正面研究结果关联的分子机制，如由以上实验的结果所指导。例如，初步数据支持UPR效应子ATF3与mTORC1-SORT遏制途径之间的关联，且因此给予CaMKIIγ扩增UPR的能力。
肥胖症由CaMKIIγ磷酸化促进
在中，ER应激通过涉及CHOP诱导的ER Ca2+储库释放的途径活化CaMKIIγ(48,68)。鉴于在肥胖症中，肝ER应激和CHOP受诱导(34)(上文)以及CHOP在ER应激诱导的肝脂肪变性中的原因性作用(94)，将测试CHOP是否为肥胖症中的CaMKIIγ活化所必需。已制备以纯C57BL6/J为背景的Chopfl/fl小鼠。当小鼠与外源基因清除(deletor)-Cre小鼠杂交时，发生CHOP缺失。这些小鼠将与A1atcre+/-小鼠杂交以测试相较于对照Chopfl/fl小鼠，这些小鼠是否在DIO膳食下具有较少肝p-CaMKIIγ(参见图8)。如果是这样的话，且如果在使用以上测定下，这些小鼠中的葡萄糖和脂质代谢得以改善，那么它们将用组成型活性腺-T287D-CaMKII转导以显示肝CHOP缺乏的有益作用被逆转。跟踪代谢和机制实验将随后进行，结果待定。
GNG由CaMKII促进。
禁食促进CaMKIIγ的磷酸化且这通过再喂食而降低(图19A)。与这些数据一致，胰高血糖素(和毛喉素)促进原代HC中的CaMKIIγ磷酸化。通过禁食Camk2g-/-小鼠或用腺-K43A-CaMKII处理以更急性抑制肝CaMKII的WT小鼠中的禁食和丙酮酸刺激的血糖降低以及肝G6pc和Pck1mRNA降低来显示体内功能性重要性(图19B-D)。禁食肝或血清饥饿HC中的CaMKIIγ缺乏或抑制也导致核FoxO1显著降低(图19E-F)，且组成型活性T287D CaMKII使核FoxO1(图19F)、血浆葡萄糖和胰岛素、以及肝G6pc和Pck1mRNA增加。CaMKIIγ缺乏对G6pcmRNA的遏制作用通过用组成型核FoxO1-ADA转导而得以废除(图19G)，此与CaMKII缺乏的作用需要核外排FoxO1的想法一致。考虑到Akt诱导的在T24、S316和S253处的FoxO1磷酸化反其道而行，可似乎不一致的是激酶可促进核FoxO1(133)。实际上，CaMKIIγ缺乏不促进在这些位点处的磷酸化。然而，LC-MS磷酸肽定位研究(134)显示FoxO1中的两个其它位点—Ser284和295—在来自WT小鼠的血清饥饿HC中磷酸化但在来自Camk2g-/-小鼠的HC中完全未磷酸化(图19H)。因此，在不受理论束缚下，CaMKII缺乏的HC中不存在pSer284/295促进FoxO1核外排且由此遏制GNG。
将测定4组小鼠中的G6pc和Pck1mRNA以及核FoxO1。相对于DIO/WT小鼠，两者在DIO/Li-CK KO小鼠中均将受遏制。来自小鼠的FoxO1将经受免疫沉淀以进行磷酸肽定位。CaMKII缺乏将与不存在pSer284/295-FoxO1相关联。S284/295A-FoxO1可模拟CaMKIIγ抑制的作用(↓核FoxO1以及G6pc和Pck1mRNA)，而S284/295DFoxO1应对CaMKIIγ抑制的作用具有抗性。具有降低的GNG125的肝特异性FoxO1KO小鼠的HC将用GFP标记的WT或突变FoxO1构建体±腺-K43A-CaMKII转导以抑制CaMKII，且接着将测定FoxO1定位以及G6pc和Pck1mRNA。为对使用K43A-CaMKII抑制CaMKII进行补充，来自Li-CK KO的HC将用腺-WT-FoxO1相对于腺-S284/295D-FoxO1转导。在不受理论束缚下，这个突变体将组成型地处于核中且对CaMKIIγ缺乏遏制GNG的能力具有显性阴性作用。为概述：
表2
ad.，腺病毒；对照，ad-LacZ；K43A，显性阴性CaMKII；S→A FoxO1，组成型脱磷酸模型；S→D FoxO1，组成型“磷酸”模型
这些预测将转移至用以上腺病毒构建体转导的DIO喂食的L-FoxO1小鼠。终点将为肝G6pc和Pck1mRNA；可适用时核FoxO1；血浆葡萄糖(包括丙酮酸激发后)和胰岛素；以及上述脂质和脂蛋白参数。预测类似于表中的那些，其中GNG基因的降低将伴有葡萄糖和脂质/脂蛋白代谢的改善。在HGP受影响但G6pc和Pck1不受影响的不大可能的情形下，将测定GNG基因Pdk4、Fbp1和Gck。
肥胖人的肝中的CaMKIIγ的活化。
将检查来自经受肥胖症治疗手术的肥胖受试者和来自经受一般手术的瘦受试者的快速冷冻新鲜肝活检试样。将不存在患者识别符，但将存在针对各受试者的编码清单，其包括重量、腰:臀比、年龄和性别；糖尿病/代谢药品；空腹血浆葡萄糖、胰岛素、HbA1c和游离脂肪酸；以及基于组织学分析，脂肪变性和脂肪性肝炎的程度(根据量表自1至5分级)。对试样进行免疫印迹以测定p-CaMKIIγ和总CaMKIIγ以及ER应激标记物，包括CHOP和Sort。数据将相对于装载对照，通过密度计量分析来定量。主要目标在于确定相对于瘦受试者，来自肥胖受试者的肝中的p-CaMKII是否较高且在肥胖组内是否存在p-CaMKII随胰岛素抗性恶化而增加。次要目标在于确定高水平的p-CaMKII是否与高水平的CHOP和低水平的Sort相关联。本文所述的结果(图8B)显示每个瘦肝样本的p-CaMKII水平低于每个肥胖样本，且因此，用于肥胖肝和瘦肝的n＝20的计划样本大小应具有>95％效力来显示瘦源性试样与肥胖源性试样之间在p-CaMKII的水平方面存在统计显著差异(P<0.05)。对于肥胖肝内p-CaMKII与胰岛素抗性之间以及p-CaMKII与CHOP和Sort表达之间的关联，20个肥胖肝样本将提供80％效力来发现相关系数0.6具有统计显著性。进一步研究将由机制研究(例如，与先前章节中的FoxO相关的那些)指导。
肝 中的CaMKIIγ在肥胖症环境中的胰岛素抗性以及葡萄糖和脂质代谢中起 作用。
肥胖小鼠中的HC表达吸引新骨髓细胞的趋化因子CCL2(MCP-1)，所述骨髓细胞随后通过促进脂肪酸酯化和TG积累中涉及的基因转录而在肝脂肪变性中起重要作用(45)。此外，包括库柏法细胞的活化的肝可通过旁分泌机制遏制HC脂肪酸氧化(44)。尽管HCCaMKIIγ可有助于吸引新，但在不受理论束缚下，CaMKIIγ可在介导的对HC脂质代谢的作用中起重要作用。具体来说，可在肥胖肝中所暴露于的饱和脂肪酸活化中的UPR且UPR活化与炎症相关联(72,111)。如果是这样的话，且考虑到CaMKIIγ在介导和扩大中的ER应激过程中的作用(图16)，肝CaMKIIγ可对肥胖症环境中的HC脂质代谢和胰岛素抗性具有重要影响。如本文所述，在CaMKII受抑制的肥胖肝中，TNFα降低(图10D)，且CaMKIIγ缺乏与炎症减轻相关联(53,54)。将进行类似DIO研究，其中将替代A1at-Cre小鼠使用LysMCre小鼠。如果CaMKIIγ缺乏改善肥胖症环境中的代谢参数，包括脂肪变性，那么将检查机制。主要概念是ER应激诱导的炎症可较轻，且因此，将通过LCM-RT-QPCR测定肝UPR和细胞因子mRNA。理论上，如果例如CaMKIIγ缺乏使单核细胞趋化因子受体表达降低，那么也可存在肝的数目降低。因此，将使用IHC定量肝含量。进一步机制研究将由数据驱动。举例而言，有证据表明PPARδ活化可为肥胖症环境中的肝中的一种改善过程(44)，其将激起研究来自不同组小鼠的肝中的CaMKII、ER应激、炎症和PPARδ途径之间的关联的实验。
与肝CaMKIIγ相关的动脉粥样硬化研究。
肝CaMKIIγ缺乏通过改善血脂异常和可能其它参数(例如，炎症、循环FFA、血胰岛素过多的动脉壁作用和高血糖)，将减轻胰岛素抗性环境中的动脉粥样硬化。西方膳食(WD)喂食Ldlr-/-小鼠为致动脉粥样化脂蛋白表型所需。在C57BL/6背景上，喂食脂肪含量仅适度低于DIO膳食的WD导致胰岛素抗性135和如图20中所示的肝CaMKIIγ的磷酸化。为评估这个模型，将使小鼠繁殖以获得以下2组：Camk2gfl/flLdlr-/-(LDLR KO)和Camk2gfl/flA1atcre+/-Ldlr-/-(Li-CK LDLR DKO)。在用WD8、12、16和20周之后，将测定代谢参数、血浆和炎症性细胞因子以及FFA。用WD8周是足以在这个模型中发展胰岛素抗性的时间(135)。将集中于可由这些因素加剧的病变终点。对于病变起始，将测定内皮活化(例如，乙酰胆碱依赖性血管舒张、VCAM-1表达、p-eNOS、ROS和单核细胞对内皮的粘着)和积累。这些是已与血脂异常(136)、高血糖(137)以及增加的FFA和胰岛素抗性对内皮的作用(130,138,139)相关联的过程。对于斑块进展，将测定斑块细胞(尤其)中的炎症性细胞因子表达28；可由饱和FA和胰岛素抗性触发的细胞凋亡(72,73)；在肥胖症中可由饱和FA恶化的缺陷型胞葬(140)；以及已与糖尿病的血脂异常相关联的晚期斑块中的斑块内出血(141)。
肝中不存在CaMKIIγ可改善胰岛素敏感性以及葡萄糖和脂质代谢。在那个情况下，LysMCre模型可具有两种用于改善动脉粥样硬化的机制。因此，将测试与HCCaMKIIγ两者的缺乏是否将对所有阶段的动脉粥样硬化具有显著保护作用。出于这个目的，将额外2组添加至本文所述的研究中，其中Li-CK LDLR DKO小鼠用来自相对于Camk2gfl/flLysmcre+/-小鼠的WT小鼠的骨髓移植。这将通过测试动脉粥样硬化和代谢的所有方面进行评估。
表3
小鼠模型和终点预测的概述：
关于KO模型，将通过包括腺-T287D-CaMKII→DIO/Li-CK KO组来添加对照。如果FoxO1Ser284/295的磷酸化不涉及于介导CaMKII的代谢作用中，那么将探究参数，包括影响FoxO1定位中涉及的核输入/输出机构的那些，如与14-3-3位点的相互作用(142)；以及与CaMKIIγ对肝胰岛素受体信号传导途径的可能作用相关的那些。如果Ser284/295磷酸化重要，那么未来研究将探讨(a)CaMKIIγ是否直接涉及或是否它诱导另一激酶以达成这个目的(143)；以及(b)这些位点的缺陷型磷酸化如何可促进核输出FoxO1。将产生FoxO1-S284/293A小鼠以研究这些p-Ser残基在肝葡萄糖和脂质代谢中的作用。减轻CaMKIIγ缺乏环境中的ER应激可改善HC对急性胰岛素的响应。例如，遏制ER应激可降低IRS1的Ser207磷酸化，此改善胰岛素信号传导(34)。
实施例8：通过CaMKII进行的钙信号传导调控处于禁食和肥胖症时的肝葡萄糖产生
肝葡萄糖产生(HGP)对于葡萄糖体内平衡而言至关重要，但潜在机制尚未完全阐明。此处显示的是钙感受性酶CaMKII在原代HC中由cAMP和胰高血糖素且在体内由胰高血糖素和禁食以钙和IP3R依赖性方式活化。CaMKII的遗传缺乏或抑制通过影响FoxO1的磷酸化来阻断FoxO1的核易位，损害禁食和胰高血糖素/cAMP诱导的糖原分解和糖异生，且降低血糖水平，而组成型活性CaMKII具有相反作用。重要的是CaMKII缺乏对葡萄糖代谢的遏制作用通过用组成型核FoxO1进行转导而得以废除，从而指示CaMKII缺乏的作用需要核外排FoxO1。这个相同途径也涉及于肥胖症环境中的过度HGP中。这些结果揭示FoxO1核定位和肝葡萄糖体内平衡中涉及钙介导的信号传导途径。
要点包括：
·禁食和胰高血糖素以PKA-IP3R1-Ca2+i依赖性方式活化肝CaΜΚΙΙ
·CaMKII促进禁食/胰高血糖素诱导的肝葡萄糖产生(HGP)
·CaMKII促进为CaMKII介导的HGP刺激所需的核FoxO1。
·CaMKII-FoxO1途径也涉及于肥胖症环境中的过度HGP中。
肝是负责在营养丧失条件下维持血糖正常的主要器官。在禁食的早期阶段期间，肝使用糖原储库来调动葡萄糖(Radziuk和Pye,2001)。随着禁食进展，葡萄糖自非碳水化合物前体的重新合成(糖异生)变为肝葡萄糖产生(HGP)的主要促成过程(Lin和Accili,2011)。这些变化响应于直接激素信号传导而快速发生。此外，胰岛素与胰高血糖素两者均影响糖异生与糖原分解两者中涉及的葡萄糖-6-磷酸酶(G6pc)和也调控HGP的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(Pck1)的转录(Pilkis和Granner,1992；Burgess等,2007)。在禁食期间，如FoxO(1、3和4)和Crct2的“葡萄糖生成性”转录因子的亚细胞定位的变化活化这些基因的表达(Lin和Accili,2011)。此外，如过氧化物酶体增殖物活化的受体-γ共活化子-1α(PGC-1α)和CBP的不同共活化子被认为与cAMP响应的组分(包括CREB、肝核因子4α(HNF4α)、Sirt1和时钟基因)相互作用，从而导致糖异生基因的转录增加(Hall等,1995；Matsumoto等,2007；Puigserver等,2003；Rhee等,2003)。除过度胰高血糖素信号传导在禁食期间刺激HGP中的作用之外，它也被认为在2型糖尿病中的高血糖中起重要作用(Sorensen等,2006；Unger和Cherrington,2012；Saltiel,2001)。
胰高血糖素刺激一般而言HGP转录因子，且具体而言用以刺激HGP的FoxO1的核易位所通过的细胞内信号转导途径未被充分了解。在这个情形下，对使细胞内钙(Ca2+ i)与糖异生的调控相关联的先前报道感兴趣(Friedmann和Rasmussen,1970；Kraus-Friedmann和Feng,1996；Marques-da-Silva等,1997)。例如，胰高血糖素和cAMP可增加Ca2+ i，且已显示Ca2+ i螯合会降低胰高血糖素诱导的HGP基因表达和葡萄糖产生(Bygrave和Benedetti,1993；Staddon和Hansford,1989；Mine等,1993)。基于这些未提供使Ca2+ i与肝葡萄糖代谢相关联的分子机制的先前研究，在不受理论束缚下，暗示Ca2+ i感受性酶CaMKII具有作用。
钙钙调蛋白依赖性激酶II(CaMKII)是一种作为细胞中的Ca2+ i信号传导的重要介导物的丝氨酸-苏氨酸激酶(Couchonnal和Anderson,2008；Singer,2011)。存在四种CaMKII亚型—α、β、γ和δ—各自由单独基因编码。α和β亚型主要在神经元中，而CaMKIIγ和CaMKIIδ在广泛多种组织中表达。在结合钙/钙调蛋白复合物之后，Thr287上的自体磷酸化产生钙/钙调蛋白非依赖性活性(Couchonnal和Anderson,2008；Singer,2011)。关于CaMKII的大多数研究已在神经元和心肌细胞中进行，且对其它组织中的CaMKII仅存在有限了解，其中迄今为止没有与葡萄糖代谢相关的了解。在目前研究中，显示CaMKII活性由cAMP和胰高血糖素增加且在体内也响应于禁食而增加。进一步说明的是CaMKII在糖原分解和糖异生的调控中起主要作用。具体来说，提供以下证据：CaMKII在体外和在体内以调控两种关键酶G6pc和Pck1的表达的方式对FoxO1核定位具有深远影响。最后，呈现指示这个相同途径涉及于肥胖症环境中的过度HGP中的证据。
结果
胰高血糖素和禁食以IP3R和Ca2+ i依赖性方式活化肝CaMKII
已显示胰高血糖素增加肝细胞(HC)中的细胞内钙(Ca2+ i)(Staddon和Hansford,1989)，此近来得以验证(Y.Wang,G.Li,J.Goode,J.C.Paz,R.Screaton,W.H.Fischer,I.Tabas和M.Montminy，手稿提交供发表)。为确定胰高血糖素是否活化Ca2+ i感受性酶CaMKII，将原代鼠HC用胰高血糖素处理各种时期且接着测定CaMKII酶活性和在Thr287处的CaMKII磷酸化，所述磷酸化是CaMKII活化状态的量度(Couchonnal和Anderson,2008；Singer,2011)。两种测定的结果均显示CaMKII活性随胰高血糖素处理时间而增加(图1A-B)。胞质液钙螯合剂1,2-双[2-氨基苯氧基]乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸四[乙酰氧基甲酯](BAPTA-AM)用于确定Ca2+ i对CaMKII活化的作用且发现BAPTA-AM显著降低胰高血糖素诱导的CaMKII磷酸化(图1C)。
位于内质网(ER)中的1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP3R)通道响应于IP3结合而释放Ca2 +，且在细胞内Ca2+ i体内平衡中起主要作用。其它研究已揭示胰高血糖素诱导的PKA使IP3R磷酸化且增加IP3R活性，从而导致Ca2+ i增加(Y.Wang,G.Li,J.Goode,J.C.Paz,R.Screaton,W.H.Fischer,I.Tabas和M.Montminy，手稿提交供发表)。也已显示胰高血糖素会诱导磷脂酶C介导的IP3释放(Hansen等,1998)。为研究IP3R在胰高血糖素诱导的CaMKII活化中的作用，使用IP3R抑制剂光溜海绵素C处理的来自Ip3r1fl/fl小鼠的HC以及作为补充方法，腺-Cre处理的来自Ip3r1fl/fl小鼠的HC。光溜海绵素C处理与Cre介导的IP3R1缺失两者均导致胰高血糖素诱导的CaMKII磷酸化显著降低，从而说明IP3R在这个过程中具有关键作用(图1D)。
胰高血糖素受体信号传导，包括Ca2+ i增加中涉及的信号传导(Staddon和Hansford,1989)，是通过活化腺苷酸环化酶以产生cAMP，随后活化作为HGP中涉及的关键酶的蛋白质激酶A(PKA)来介导。在这个情形下，发现用8-溴-cAMP处理HC模拟胰高血糖素的作用且导致磷酸CaMKII显著增加(图1E)。此外，当在添加胰高血糖素之前，用PKA抑制剂H89处理HC时，胰高血糖素介导的磷酸CaMKII增加受显著抑制(图1F)。这些数据支持存在一种途径，其中胰高血糖素-cAMP-PKA信号传导通过它对IP3R介导的细胞内Ca+2释放的作用来促进CaMKII的磷酸化/活化。
为检查CaMKII在体内是否由胰高血糖素调控，小鼠用腹膜内(i.p.)胰高血糖素的大丸剂激发。与在培养的HC中观察到的作用一致，肝CaMKII磷酸化由胰高血糖素处理诱导(图1G)。发现低至1μg kg-1的胰高血糖素剂量能够使肝中的CaMKII磷酸化(图28A)。为获得IP3R在胰高血糖素介导的CaMKII磷酸化的调控中是重要的体内证据，小鼠用光溜海绵素C腹膜内处理4天。接着用胰高血糖素激发小鼠，且测定肝提取物的p-CaMKII。如图1H中所示，光溜海绵素C处理显著降低胰高血糖素诱导的CaMKII磷酸化。接着，比较在自喂食至禁食状态的过渡期间的肝CaMKII磷酸化，已知所述时期会使血浆胰高血糖素升高(Lin和Accili,2011)(图28B)。数据显示在禁食后，肝CaMKII磷酸化显著增加，而CaMKII的总量似乎不受营养状态影响(图1I)。此外，在再喂食后，肝中的p-CaMKII的水平减小(图1J)。如同胰高血糖素处理一样，禁食诱导的CaMKII的磷酸化由光溜海绵素C处理小鼠而受遏制(图28C)。这些数据显示肝CaMKII的活性由营养状态以与在禁食诱导的HGP中的潜在作用一致的方式调控。
CaMKII促进原代HC中的葡萄糖产生
CaMKIIγ是HC中的主要CaMKII亚型，且在缺乏γ亚型的HC中，其它亚型不被诱导(图22A)。鉴于肝CaMKII活性在体内由胰高血糖素和禁食调控，测定来自WT小鼠和Camk2g-/-小鼠的HC中的葡萄糖产生。在基本条件下以及在用毛喉素刺激之后检查细胞，所述毛喉素是胰高血糖素模拟物和强力腺苷酸环化酶活化剂(Harano等,1985)。数据显示在CaMKIIγ缺乏的HC中，基本条件诱导的葡萄糖产生与毛喉素诱导的葡萄糖产生两者均受遏制(图22B)。接着检查用表达组成型活性CaMKII的腺病毒(腺-CA-CaMKII)、表达“激酶失活(kinase-dead)”显性阴性CaMKII的腺病毒(腺-KD-CaMKII)(Pfleiderer等,2004)、或表达LacZ对照的腺病毒转导的WT HC中的葡萄糖产生。CA-CaMKII具有氨基酸取代T287D，其模拟在T287处的自体磷酸化且在不存在结合的钙/钙调蛋白下产生自主活性，而KD-CaMKII在激酶结构域中具有失能性突变(Pfleiderer等,2004)。观察到用腺-CA-CaMKII转导的细胞中的基本条件诱导的葡萄糖释放与毛喉素诱导的葡萄糖释放两者均增加(图22C和28D)。用腺-KD-CaMKII转导的HC显示毛喉素诱导的葡萄糖产生降低(图22C)，所述转导导致CaMKII活性降低约40％(图28E)。
CaMKII对HGP的作用激起我们研究对编码调控HGP的酶，即葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的两种基因的转录影响。为此，测定上述模型中的G6pc和Pck1mRNA水平(图22D-E)。在所有情况下，敲除或KD-CaMKII介导的CaMKII抑制都降低毛喉素或胰高血糖素诱导的基因表达，而CA-CaMKII增加基因表达。在不存在毛喉素或胰高血糖素下，WT HC中的G6pc和Pck1mRNA的表达水平比激素处理的WT HC中的表达水平低得多，但甚至在这些条件下，CaMKIIγ缺乏也导致基因表达降低(图28F)。此外，腺-KD-CaMKII不降低缺乏CaMKIIγ的HC中的毛喉素诱导的G6pc mRNA的较低但可检测的水平(图28G)，此与图22E中KD-CaMKII对G6pc的遏制作用是由于CaMKII抑制的前提一致。
总之，CaMKII缺乏和抑制数据显示内源性CaMKII在葡萄糖产生和Pck1/G6pc基因表达中的重要性，而关于CA-CaMKII的数据显示当酶在高水平下表达时，它可在不存在激素的情况下推动这些过程或在激素存在的情况下增强这些过程。
体内肝葡萄糖产生受CaMKIIγ缺乏损害且由组成型活性CaMKII刺激
为评估CaMKII在体内肝葡萄糖代谢中的功能性作用，检查WT小鼠和Camk2g-/-小鼠中的空腹血糖水平。与体外数据一致，观察到相对于WT小鼠，禁食Camk2g-/-小鼠中的血糖水平适度但统计显著降低(图23A)。相对于WT小鼠，在敲除小鼠中，空腹葡萄糖浓度的差异不与循环胰岛素增加或胰高血糖素浓度降低相关(图29A，左侧)。突变小鼠也显示响应于丙酮酸激发测试，血浆葡萄糖较低(图23B)。与原代HC数据一致，禁食Camk2g-/-小鼠的肝中的G6pc和Pck1mRNA水平存在降低(图23C)。在用胰高血糖素处理的小鼠中获得类似数据(图23D)。
与这些数据一致，用腺-KD-CaMKII处理C57BL/6小鼠降低空腹血糖(图23E)，所述处理使肝CaMKII活性抑制约45％(图29B)。如上，在对照组与实验组之间，血浆胰高血糖素和胰岛素并不不同(图29A，右侧)。与血糖数据一致，在用KD-CaMKII注射的小鼠中，G6pc和Pck1mRNA的肝表达较低(图23F)。因为CaMKII抑制降低关键糖原分解酶葡萄糖-6-磷酸酶的mRNA的水平，所以检查急性和慢性CaMKII抑制对肝糖原含量的影响，且作为糖原的另一指标，也检查过碘酸-希夫(PAS)阳性细胞的百分比。数据显示腺-KD-CaMKII或CaMKII基因靶向增加禁食小鼠中的肝糖原(图23G)。
接着通过用腺-CA-CaMKII处理小鼠来检查小鼠中的组成型活性肝CaMKII的作用。CA-CaMKII组具有在丙酮酸激发之后升高的血糖水平、增加的肝G6pc和Pck1mRNA水平和增加的肝糖原含量(图29C-E)。CA-CaMKII施用不改变血浆胰高血糖素或胰岛素。这些组合的体内数据显示CaMKII影响血浆葡萄糖水平、丙酮酸转化成葡萄糖和肝葡萄糖代谢基因的表达。
CaMKII促进FoxO1的核定位
HGP中涉及的一种主要转录因子是FoxO1，其主要由它在细胞质与核之间的定位变化调控(Accili和Arden,2004)。相对于Camk2g-/-小鼠，测定转导至自WT小鼠分离的HC中的GFP标记的FoxO1的分布。在血清饥饿条件下，在WT HC中，大多数GFP-FoxO1处于核中，而Camk2g-/-HC显示GFP-FoxO1主要定位在胞质液中(图24A)。此外，当HC用腺-CA-CaMKII转导时，FoxO1变为主要处于核中，而用腺-KD-CaMKII转导导致FoxO1主要处于细胞质中(图24B)。应注意的是在此处使用的“基础”细胞培养条件下，培养的HC中的核FoxO1是大量的，且因此用CA-CaMKII获得的倍数增加有限。因此，使用与胰岛素一起进行的短暂孵育，基本核FoxO1被降低，所述孵育接着揭示用CA-CaMKII使核FoxO1显著增加(图24C)。尽管这个实验是使用高水平的总CaMKII蛋白质表达来进行(参见图28D)，但使用较低MOI的CA-CaMKII的类似实验显示在与内源性CaMKII类似的总CaMKII蛋白质水平下，核FoxO1增加(图30A)。为显示体内相关性，测试禁食小鼠中的CaMKIIγ缺乏或抑制的影响。在禁食条件下，肝中的核FoxO1是突出的(图24D，顶部印迹)，且在Camk2g-/-小鼠或用腺-KD-CaMKII转导的小鼠中，它显著减少(图24D，中间2个印迹)。喂食使核FoxO1减少，且在这些条件下，核FoxO1由CA-CaMKII与胰高血糖素两者增加(图24D，底部印迹)。
在原代肝细胞中，cAMP介导的对G6pc mRNA的诱导由Foxo1 shRNA遏制>50％，从而指示FoxO1在内源性环境中具有重要作用(Matsumoto等,2007)。与这些数据一致，发现当使三个共有FoxO结合位点突变时，对人G6PC启动子下游的荧光素酶的诱导被钝化(Ayala等,1999；von Groote-Bidlingmaier等,2003)(图30B)。然而，这个肝细胞瘤细胞系—报道体构建实验不区分cAMP作用与地塞米松(dexamethasone)作用且不能准确反映内源性情形。例如，此处报道体诱导的强健程度比原代肝细胞中的实际G6pc mRNA诱导小得多(Matsumoto等,2007)，且鉴定的启动子元件可能不是为调控所需的唯一位点。因此，替代推行这个模型进一步作为评估FoxO1在CaMKII介导的G6pc表达中的功能性重要性的方式，研究原代肝细胞中的对内源性G6pc的诱导，且最重要的是体内研究对内源性G6pc的诱导。为开始研究，相对于肝中缺乏FoxO1的L-Foxo1KO小鼠，比较CA-CaMKII诱导来自WT小鼠的HC中的G6pc的能力(Matsumoto 等,2007)。与先前研究(Puigserver等,2003；Matsumoto等,2007)一致，在不存在FoxO1的情况下，毛喉素诱导的G6pc表达受遏制(图25A，右图)。最重要的是由CA-CaMKII达成的G6pc mRNA表达增加由FoxO1缺乏显著钝化。在不存在毛喉素的情况下，如所预期，基因表达低得多(图25A，左图；注意Y轴尺度)，但甚至此处CA-CaMKII诱导的基因表达也几乎完全依赖于FoxO1。最后，证明这样的事实：HGP中涉及的两种其它转录因子CREB和Crtc2的核定位不由CaMKII抑制或缺乏降低(图30C-D)。这些组合的数据与其中CaMKII促进FoxO1核定位，此接着导致G6pc受诱导的模型一致。
为进一步验证FoxO1在由CaMKII缺乏或抑制造成的损害HGP中的重要性，用含有磷酸化缺陷型组成型核FoxO1突变体(FoxO1-ADA)的腺病毒转导来自Camk2g-/-小鼠的HC(Nakae等,2001)。观察到CaMKIIγ缺乏对毛喉素诱导的G6pc和Pck1mRNA表达的遏制作用通过用腺-FoxO1-ADA转导而得以废除(图25B)。注意此处使用的FoxO1-ADA的水平足够低以使不增加毛喉素处理的WTHC中的G6pc或Pck1，且Camk2g-/-+ADA组中的核FoxO1的水平类似于WT+LacZ组中的内源性水平(插图，图25B)。鉴于发现FoxO1的生殖系敲低不影响Pck1诱导(Nakae等,2002；Barthel等,2001)，图25B中的Pck1结果以及图22-23中的那些结果是引起关注的。然而，FoxO1的更剧烈沉默会遏制Pck1(Matsumoto等,2007)，且因此操纵CaMKII可能更对应于那个环境。与FoxO1-ADA对HGP基因表达的影响一致，用腺-FoxO1-ADA腺病毒处理小鼠挽救了腺-KD-CaMKII处理的小鼠中的葡萄糖体内平衡的损害(图25C-E)。注意这个结果不能通过在ADA组中用腺-KD进行的缺陷型转导来解释(插图，图25E)。总之，这些结果与其中CaMKII通过促进FoxO1的核定位来促进HGP的模型一致。
非AKT-磷酸FoxO1位点和p38MAP激酶在CaMKIIγ介导的FoxO1核定位中的作用
胰岛素/Akt通过使T24、S253和S316(鼠残基)磷酸化来促进FoxO1核外排(Brunet等,1999)。尽管CaMKII是一种激酶，但它可活化磷酸酶且由此通过间接降低在这些位点处的磷酸化来促进FoxO1的核定位。然而，发现在来自Camk2g-/-小鼠的肝中，在这三个位点处的磷酸化不改变(图31A)。也可影响HC中的FoxO1定位和活性(Accili和Arden,2004)的FoxO1乙酰化也不受CaMKII缺乏影响(图31B)。
FoxO1也可在其它Ser/Thr残基处由如p38MAP激酶的其它激酶加以磷酸化(Asada等,2007)，且这些磷酸化事件可能促进FoxO1核定位而非外排。为评估CaMKII在非Akt位点的磷酸化中的可能作用，使用图24A中显示的模型，即，血清饥饿WT HC和用也携带FLAG标签的GFP-FoxO1转导的Camk2g-/-(KO)HC。使用抗FLAG对FoxO1进行免疫纯化，随后还原、烷基化以及使用由MacCoss等(MacCoss等,2002)开发的三蛋白酶方案进行蛋白水解消化。通过TiO2色谱富集磷酸化肽且接着通过使用MS基散弹枪(shotgun)蛋白质组学方法进行的LC-MS/MS(Cantin等,2007)和通过光谱计数进行的无标记定量(Cantin等,2007)进行分析。以约70％序列覆盖率鉴定了FoxO1蛋白质，且鉴定了WT样本的总计57种磷酸肽以及KO样本的总计63种磷酸肽(在http://fields.scripps.edu/published/foxo1_Tabas_2012/处的表S1和S2，所述表以引用的方式整体并入本文)。肽错误发现率(FDR)小于1个百分比。使用严格选择准则以使所有鉴定的磷酸肽都将具有高置信度。
使用磷酸肽分析工具Debunker和Ascore(Lu等,2007；Beausoleil等,2006)进一步验证的这些准则使得能够鉴定11个磷酸化位点：S284、S295、S326、S467、S475、T24、S246、S253、S413、S415和T553(对于鼠FoxO1序列，参见图31C)。图26A显示来自KO样本和WT样本的这11种FoxO1磷酸肽各自的光谱计数、Debunker计分和A计分。大多数磷酸化位点远远高于分别对于Debunker和Ascore的高置信度截断值0.5和12。使Debunker计分或A计分的值略微较低的5个位点经历手动验证，且它们的注解串联质谱显示于图32D-E(针对KO肽4和5)和以上提及的网址(针对WT肽7、10和11)中。磷酸位点的特征b离子和/或y离子都被鉴定。计分较低最可能归因于低丰度片段离子或由于这些肽的氨基酸序列的性质而缺乏磷酸的中性丢失。
仅对于KO样本和WT样本中的组合光谱计数高于10的肽计算的光谱KO:WT计数比用于获得鉴定的磷酸化肽的相对表达的量度。通过这个分析，基于截断值<0.5，在KO中，仅S295、S467、S475(肽2、4和5)的磷酸化显著较低，其中KO相对于WT的光谱计数比分别是0.45、0.38和0.5。尽管含有p-S246的肽具有组合光谱计数7，且因此未达到>10的预先指定准则，但相对于WT，它在KO中显示较低趋势(2对5，0.4)。相反，S326(肽3)具有比率1.65，从而指示相对于WT，在KO中上调。
作为在KO中较低的一些位点的初始功能测试，使用编码在7个Ser残基(包括Ser295和475以及Ser246)处具有S-A突变的FoxO1(7A-FoxO1)的可用质粒(Asada等,2007)。当在类似水平上于Foxo1-/-HC中转染时，响应于胰高血糖素，7A-FoxO1显示明显地少于WTFoxO1的核定位，而用突变FoxO1转染的细胞中的细胞质FoxO1较高(图26B)。也测试具有与7A中相同的7个S-A突变加S326和S467中的2个额外S-A突变的构建体(突变体9A)(Asada等,2007)。这个突变体显示类似缺陷型核定位(图31F)。此外，尽管与图24D中的数据一致，腺-CA-CaMKII转导增加核WT-FoxO1，但CA-CaMKII不增加核7A-FoxO1(图26C)。这些组合的数据与其中CaMKII以促进FoxO1核定位的方式直接或间接改变FoxO1中的某些Ser残基的磷酸化的模型一致。
Asada等(Asada等,2007)发现在用上游p38激酶MKK6转染的HEK293T细胞中，FoxO1在包括Ser284、295、467和475的若干位点处被磷酸化的证据。因为p38已牵涉于HGP的刺激中(Cao等,2005)，且当于神经元中研究时，CaMKII可活化p38(Blanquet,2000)，所以考虑HGP中涉及的CaMKII→p38→FoxO1磷酸化/核定位途径。首先确认在禁食小鼠的肝中，p38被磷酸化(所述磷酸化是p38活化的量度)(图32A)且由高亲和力竞争性抑制剂SB202190抑制p38阻断G6pc和Pck1在胰高血糖素刺激的HC中的表达(图32B，左侧)。使用腺-Cre转导的自来自P38afl/fl小鼠的肝分离的HC确认抑制剂数据(图32B，右侧)。为测试CaMKII与p38之间的潜在关联，比较来自WT小鼠和Camk2g-/-小鼠的血清饥饿HC且发现CaMKIIγ缺乏的HC中的磷酸p38显著降低(图32C)。接着通过比较用媒介物对照和SB202190处理的禁食小鼠来确定p38是否涉及于体内肝FoxO1核定位中。在各组中的7只小鼠之间，在p-MK2(反映p38活性的p38激酶靶标)的基本水平与由SB202190抑制MK2磷酸化的程度两方面均存在某一程度的可变性。因此，将所有14只小鼠的核FoxO1相对于p-MK2绘图。数据显示小鼠中的核FoxO1随p38抑制而明确降低，即如通过较低p-MK2所指示(图32D)。此外，p38抑制剂降低用胰高血糖素处理的HC中的核GFP-FoxO1(图32E)。这些组合的数据与其中CaMKII通过p38活化促进FoxO1核定位的模型一致。p38是否通过直接使FoxO1中的以上提及的Ser残基(Asada等,2007)磷酸化来在CaMKII诱导的FoxO1核定位中起作用仍然待定。
CaMKII在肥胖症中的肝葡萄糖代谢中的作用
部分归因于胰高血糖素对胰岛素信号传导的不平衡的HGP升高促成肥胖症中和其它胰岛素抗性状态下的空腹高血糖(Sorensen等,2006；Unger和Cherrington,2012；Saltiel,2001)。为测试CaMKIIγ在肥胖症环境中的肝葡萄糖代谢中的作用，在两个肥胖症小鼠模型中寻求肝CaMKIIγ活化的证据。发现在ob/ob小鼠与以高脂肪高卡路里膳食方式放置20周的WT小鼠(膳食诱导的肥胖症；DIO)两者的肝中，p-CaMKII而非总CaMKII的水平均显著较高(图27A)。抗p-CaMKII与抗CaMKII两者在肥胖肝中的抗体特异性由肥胖Camk2g-/-小鼠中不存在免疫印迹条带显示。接着通过比较用腺-KD-CaMKII和腺-LacZ对照转导的ob/ob小鼠中的空腹血浆葡萄糖和肝FoxO1靶标基因表达来测试功能性重要性。用腺-KD-CaMKII处理的小鼠具有较低空腹葡萄糖、在丙酮酸激发之后较低血糖、以及包括G6pc和Pck1的三种FoxO1靶标基因的较低表达(图27B-D)。这些变化不与腺-KD-CaMKII处理的小鼠中的较高血浆胰岛素或较低重量相关联。因此，在肥胖小鼠的肝中，肝CaMKII被活化且调控肝葡萄糖代谢和FoxO1靶标基因表达。
讨论
这个报道中的数据提供钙介导的对HGP的调控是可如下概述的途径的一部分的证据：胰高血糖素/禁食→cAMP/PKA→IP3R1→Ca2+ I→CaMKII→核FoxO1→HGP。CaMKII也介导肥胖小鼠中的HGP升高(图27)，且尽管在这个领域中需要更多研究，但有可能的是此处驱动力也是胰高血糖素(Sorensen等,2006；Unger和Cherrington,2012；Saltiel,2001)。因此，本研究结果对于与HGP相关的三个基本领域具有影响：胰高血糖素和禁食以及肥胖症/胰岛素抗性刺激HGP所凭借的分子机制；细胞内钙与HGP之间的分子关联；和FoxO1核转运的调控。对后述问题特别感兴趣，因为尽管已存在许多报道关于胰岛素/AKT-介导的FoxO1磷酸化以及FoxO1乙酰化如何促进核外排FoxO1(Lin和Accili,2011；van der Horst和Burgering,2007)，但对在不存在胰岛素的情况下或在胰岛素抗性环境中发生的FoxO1核进入的调控的强调较少。
CaMKII途径在cAMP/PKA的下游，且因此它将天然地补充刺激HGP的其它胰高血糖素-PKA途径。迄今为止，本文数据指示这些其它途径与CaMKII途径并行存在而非也在CaMKII的下游。例如，胰高血糖素-PKA直接使cAMP响应元件结合(CREB)蛋白质磷酸化，所述蛋白质通过转录诱导FoxO1转录辅因子PGC1α(Herzig等,2001)，但相对于KD-CaMKII小鼠，来自腺-LacZ小鼠的肝中的核CREB不存在差异(图30B)。这是重要的研究结果，因为存在神经元中以及RANKL处理的RAW264.7细胞中的体外数据表明CaMKII可使某些环境中的CREB活化/磷酸化(Dash等,1991；Sheng等,1991；Ang等,2007)。也发现CaMKII缺乏不影响核Crtc2(图30C)，所述Crtc2是HGP中涉及的另一转录活化子。这些数据指示肝中的CaMKII与共同实现一系列适当转录因子的核定位以介导HGP的这些其它途径并行起作用。关于Crtc2的情况特别引起关注，因为胰高血糖素/PKA介导的IP3R活化和ER钙释放通过另一钙感受性酶钙调神经磷酸酶促进Crtc2核定位。实际上，发现就遏制毛喉素诱导的G6pc mRNA而言，抑制CaMKII和钙调神经磷酸酶是累加性的。因此，共同近端信号传导途径导致两种关键HGP转录因子Crtc2和FoxO1的核进入由不同远端机制协调。就此而言，有趣的是注意到先前研究显示促进钙穿过质膜进入的药物实际上降低HC中的Pck1mRNA(Valera等,1993)，此可指示钙进入细胞质中的途径是决定下游事件的因素。
FoxO1在Thr24、Ser253和Ser316(鼠序列编号)处由胰岛素/生长因子通过Akt磷酸化以促进它的核外排。CaMKII促进FoxO1核定位，但在不受理论束缚下，CaMKII可活化使这些位点脱磷酸的磷酸酶。然而，CaMKIIγ缺乏不影响这三个残基的磷酸化，且它也不影响FoxO1乙酰化(图31A-B)。相反，发现有证据表明CaMKII介导FoxO1上的其它Ser残基的磷酸化，且Ser-Ala FoxO1突变体实验指示该作用在CaMKII介导的FoxO1核定位中起作用。
CaMKII与FoxO1磷酸化之间的关联可为直接的或间接的。间接机制，即，CaMKII活化另一激酶所凭借的机制，可与其它激酶可以促进FoxO核保留的方式在非Akt位点上使FoxO磷酸化的先前研究结果相关联(Essers等,2004；Chiacchiera和Simone,2010)。基于本文p38抑制剂和基因靶向数据以及Asada等(Asada等,2007)的研究，在不受理论束缚下，p38MAPK也能够执行这个功能，且实际上可为CaMKII诱导的FoxO1核定位的介导物。支持这个的是CaMKII与p38之间以及p38与HGP之间存在关联的报道(Cao等,2005；Blanquet,2000)。尽管尚不存在直接证据表明p38使FoxO1磷酸化且由此活化FoxO1，但糖皮质素促进大鼠心肌细胞中的FoxO1核定位的能力与核p38的活化/磷酸化相关，并且免疫荧光显微术和IP/免疫印迹数据指示p-P38与FoxO1可彼此相互作用(Puthanveetil等,2010)。引起关注的是有证据表明FoxO1能够活化HC中的p38(Naimi等,2007)，且因此有可能的是FoxO1-p38前馈途径可扩大此处指示的CaMKII-p38途径对FoxO1核定位的作用。然而，需要更多研究来确定p38的作用以及进一步阐明CaMKII促进FoxO1核定位所凭借的机制。
发现钙-CaMKII在HGP中的作用不仅提供对针对空腹低血糖的生理防御的了解，而且也可揭示针对存在于胰岛素抗性环境中的受干扰葡萄糖代谢的治疗靶标，如通过图27中的数据所指示。实际上，在2型糖尿病中，不成比例的HGP和胰高血糖素相对于胰岛素信号传导的不平衡促成空腹高血糖(Sorensen等,2006；Saltiel,2001)。此外，胰高血糖素信号传导也牵涉于1型糖尿病中(Unger和Cherrington,2012)。在这个情形下，未来研究将进一步阐明肝CaMKIIγ在肥胖症、胰岛素抗性和糖尿病中的病理生理作用和机制且由此评估它作为这些病症中的治疗靶标的潜力。
实验程序
CaMKII活性的测量
根据制造商说明书，使用来自Promega的CaMKII测定试剂盒测定CaMKII活性。在如图例中所指示处理HC之后，通过暴露于含1％曲通-X100的50mM HEPES、150mM NaCl、10mM焦磷酸钠、10mMEDTA、10mM EGTA、1mM Na3VO4、50mM NaF、1mM PMSF和5μg ml-1亮肽素5分钟来使它们溶解。接着，将[γ-32P]ATP和生物素化CaMKII肽底物添加至溶解产物或免疫沉淀的复合物中(参见下文)。在30℃下孵育10分钟之后，使用SAM生物素捕集膜使[32P]-磷酸化底物与残余[32P]ATP分离且接着使用闪烁计数器定量。在±钙调蛋白下进行测定，且自在存在钙调蛋白的情况下获得的活性值减去在不存在钙调蛋白的情况下的活性值。
原代HC中的葡萄糖产生
如所述进行葡萄糖产生测定(Yoon等,2001)。简而言之，在如上所述收集和培养原代小鼠HC之后，将细胞培养基转换成补充有20mM乳酸钠和2mM丙酮酸钠的无葡萄糖和苯酚的DMEM(pH7.4)。在培养16小时之后，收集500μl培养基，且使用比色葡萄糖测定试剂盒(Abcam)测量葡萄糖含量。接着相对于全细胞溶解产物中的总蛋白量使读数标准化。
小鼠实验
如先前所述产生Camk2g-/-小鼠(Backs等,2010)且杂交于C57BL6/J背景上。ob/ob小鼠自Jackson实验室获得。对于图27中的实验，小鼠用标准膳食或60％kcal来自脂肪的高脂肪膳食喂食，且按照12小时光照-黑暗循环加以供养。通过尾部静脉注射递送重组腺病毒(1.5×109个斑块形成单位/小鼠)，且在5天之后开始实验。使用葡萄糖测量计(One TouchUltra,Lifescan)测量在自由获取水下禁食12-14小时的小鼠中的空腹血糖。在禁食17小时之后，以腹膜内注射2g kg-1体重的丙酮酸来进行丙酮酸耐受性测试。历经随后2小时测量血糖水平。通过在10pmol g-1的剂量下持续4天进行每日腹膜内注射来向小鼠施用光溜海绵素C。如先前所述产生P38afl/fl小鼠(Engel等,2005)。
肝糖原测量
使50-100mg冷冻肝在具有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的1ml H2O中均质化。接着使样本与KOH(1:2)混合，煮沸25分钟且用70％乙醇洗涤。干燥沉淀且将其溶解于100μl H2O中，并根据制造商说明书，使用糖原测定试剂盒(Abcam)评估糖原含量。数据代表平均值±SEM。
小鼠肝切片的PAS染色
将肝样本固定在10％中性缓冲福尔马林中24小时且包埋在石蜡中。根据制造商说明书，使用过碘酸-希夫(PAS)染色剂(Sigma)染色切片(5微米)中的糖原。接着用苏木精对比染色切片且通过光学显微术加以检查。对于PAS染色的定量，随机选择来自4个不同切片的5个区域，且对PAS阳性细胞的数目计数并表示为细胞总数的百分比(Hammad等,1982)。对样本的身份不知情的2个独立研究者进行分析。
质谱数据的分析
使用ProLuCID、DTASelect2、Census、DeBunker和Ascore，用集成蛋白质组学流水线-IP2(Integrated Proteomics Applications,Inc.,San Diego,CA.http://www.integratedproteomics.com/)进行蛋白质和磷酸肽鉴定、定量和磷酸化分析。使用RawExtract1.9.9(http://fields.scripps.edu/downloads.php)将光谱原始文件自原始文件提取至ms1和ms2文件中(McDonald等,2004)，且相对于EBI IPI小鼠蛋白质数据库(http://www.ebi.ac.uk/IPI/IPImouse.html，2010年3月24日发布)搜寻串联质谱。为准确估计肽概率和错误发现率，使用含有附于靶标数据库的所有蛋白质的逆转序列的诱饵数据库(Peng等,2003)。使用ProLuCID(Xu等,2006)算法，在50ppm肽质量容差下使串联质谱与序列匹配。在于Linux操作系统下运行的Intel Xeon集群上进行ProLuCID搜寻。搜寻空间包括属于质量容差窗内的所有完全和半部胰蛋白酶肽候选物。半胱氨酸的脲基甲基化(+57.02146Da)被视为静态修饰，而丝氨酸、苏氨酸和酪胺酸上的磷酸化(+79.9663)被视为可变修饰。
使用两种SEQUEST(Eng等,1994)确定的参数，即交叉关联计分(XCorr)和交叉关联计分的标准化差异(δCN)，在DTASelect(Tabb等,2002；Cociorva等,2007)中评估肽/光谱匹配(PSM)的正确性。将搜寻结果根据电荷状态(+1、+2、+3和大于+3)和胰蛋白酶状态(完全胰蛋白酶性、半部胰蛋白酶性和非胰蛋白酶性)分组，从而产生12个不同的子组。在这些子组的每一者中，获得(a)直接和(b)诱饵数据库PSM的Xcorr、δCN和δ质量值的分布，且接着通过判别分析分开直接子组和诱饵子组。通常不可能完全分开直接PSM子组和诱饵PSM子组；因此，基于直接和诱饵计分分布的非参数拟合来计算肽匹配概率。肽置信度99.5％被设置为最小临限值，且仅接受δ质量小于10ppm的磷酸肽。错误发现率计算为逆转诱饵PSM在通过99.5％置信度临限值的所有PSM中的百分比。在这个最后过滤步骤之后，估计蛋白质错误发现率与肽错误发现率两者均低于0.1％。在数据库搜寻和DTASelect2过滤之后，用使用Ascore(Beausoleil等,2006)和Debunker(Lu等,2007)的IP2磷酸化分析工具分析磷酸肽。使用光谱计数方法定量肽和磷酸肽(Liu等,2004)。
统计分析
所有结果都呈现为平均值±SEM。使用学生t检验(student's t-test)计算正态分布数据的P值且使用曼-惠特尼(Mann-Whitney)秩和检验计算非正态分布数据的P值。
附加实验程序
试剂和抗体
胰高血糖素、丙酮酸、毛喉素、H89和8-溴-cAMP和SB202190来自Sigma。BAPTA-AM和抗核磷酸蛋白(Np)抗体来自Invitrogen。光溜海绵素C来自EMD Chemicals。抗磷酸Thr287CaMKII抗体来自Imgenex和Novus；抗总CaMKII、抗FoxO1和抗Ac-FoxO1抗体来自Santa Cruz Biotechnology Inc。抗β-肌动蛋白和抗磷酸S316FoxO1抗体来自Abcam。抗磷酸p38、抗磷酸MK2、抗磷酸CREB、抗p38、抗MK2、抗CREB、抗磷酸T24FoxO1、抗磷酸S253FoxO1、抗HA和抗FLAG抗体来自Cell Signaling。抗CRTC2抗体是MarcMontminy博士的馈赠。先前描述了编码LacZ、CA-CaMKII、KD-CaMKII、GFP-FoxO1和Cre的腺病毒(Pfleiderer等,2004；Tanaka等,2009；Akagi等,1997)且由Viraquest,Inc.(North Liberty,IA)扩增。如所述构建编码FoxO1突变体7A和9A的质粒(Asada等,2007)。
原代肝细胞
原代小鼠HC是如先前所述自8至12周龄小鼠分离(Matsumoto等,2002)。对于大多数实验，通过在含有0.5％胎牛血清的培养基中孵育来使HC经受过夜血清耗竭，且接着于无血清培养基中孵育5小时，其中图例中指示个别处理。在接种之后12小时，用腺病毒构建体转导HC，且在转导之后24小时进行实验。根据制造商说明书，使用jetPEITM-肝细胞DNA转染试剂(Polyplus-transfection,Inc.)进行用WT、7A-和9A-Foxo1转染。
免疫沉淀
通过暴露于含1％曲通-X的50mM HEPES、150mM NaCl、10mM焦磷酸钠、10mM EDTA、10mM EGTA、1mM Na3VO4、50mMNaF、1mM PMSF和5μg/ml亮肽素5分钟来使细胞溶解。用含有0.3–0.6μg抗体和80μl琼脂糖珠粒的溶解缓冲液使溶解产物(500μg蛋白质)达到总体积1ml。在4℃下在1.5ml微量离心管中旋转混合物14小时。通过在16,000g下离心来收集免疫复合物且用冷冻溶解缓冲液洗涤3次。
Ip3r1flox小鼠的产生
如下产生Ip3r1flox小鼠品系：通过使用含有染色体6的片段的BAC克隆RP24-245H16(CHORI)进行重组工程改造来产生靶向构建体，所述片段涵盖来自C57Bl/6J小鼠的IP3R1的外显子1至9(Liu等,2003；Warming等,2005)。质粒pL451、pL452和pL253是由NealCopeland博士(NCI,NIH)友情提供。简而言之，将Frt-Neo-Frt-loxP盒(来自质粒pL451)插入外显子4(第二编码外显子)的上游，接着通过琼脂糖诱导的flp重组移除Neo盒。通过插入loxP-Neo-loxP盒(来自载体pL452)来将第二和第三loxP位点引入外显子4的下游。最后，将含有胸苷激酶的DTA盒(来自质粒pL253)插入第三loxP位点的更下游。所有中间BAC构建体和最终构建体都通过PCR加以筛选，且最终构建体通过Acc65I消化进行“指纹分析”并测试loxP功能性。通过测序确认关键接合位点。将所得修饰的BAC电穿孔至嵌合ES细胞(CSL3细胞系，源于129S6/SvEvTac小鼠品系)中。将正确重组ES细胞注射至C57BL/6胚泡阶段的小鼠胚胎中。使嵌合雄性小鼠与C57BL/6雌性小鼠育种以建立杂交品系。生殖系传递产生Ip3r13xflox小鼠，且使雌性与EIIa-cre雄性杂交以产生其中消除floxed Neo盒的Ip3r1flox小鼠。随后使这些小鼠与C57BL/6J小鼠杂交以育除EIIa-cre等位基因。通过杂合育种获得最终Ip3r1fl/fl品系。
免疫印迹和RT-qPCR
如先前所述进行免疫印迹和RT-qPCR测定(Timmins等,2009)。使用RNeasy试剂盒(Qiagen)自HC提取总RNA。使用寡聚(dT)和Superscript II(Invitrogen)自2μg总RNA合成cDNA。根据制造商说明书，使用来自Panomics的核提取试剂盒进行自肝提取核。关于抗Thr287-p和总CaMKII免疫印迹，通常观察到在CaMKIIγ缺乏的HC中不存在的2个条带且有时3个条带。它们的来源是选择性剪接抑或翻译后修饰仍然待定。
FoxO1磷酸肽的质谱测定
在MOI为2下用腺-FLAG-FoxO1转导来自WT小鼠和Camk2g-/-小鼠的HC。使细胞经受过夜血清耗竭且接着在无血清培养基中孵育5小时。使用抗FLAG对FoxO1进行免疫纯化。通过混合1体积的样本溶液(冷)与1/3体积的100％(w/v)TCA(6.1N，Sigma)来使于冰冷Tris缓冲生理盐水中的FLAG-FoxO1沉淀。在冰上3小时之后，在4℃下离心样本30分钟，且吸出上清液，从而在管中留下约5-10μl以使不干扰沉淀。用冰冷丙酮洗涤沉淀两次(每次500μl)。在各次洗涤之后，将溶液离心10分钟。接着在Speed-vac上干燥最终沉淀1-2分钟。
通过如所述进行蛋白水解来产生肽(Delahunty和Yates,III,2005；MacCoss等,2002)。将TCA沉淀溶解于60μl含有8M脲的100mMTris-HCl(pH8.5)中，且接着通过添加500mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)直至最终浓度5mM来还原蛋白质。在室温下孵育20分钟之后，通过添加500mM碘乙酰胺以达成最终浓度10mM来使半胱氨酸残基羧甲基化。在室温下在黑暗中孵育溶液30分钟且接着等分至3个管中。在一个管中，接着通过添加相等体积的100mM Tris-HCl(pH8.5)来将脲的浓度稀释2倍(至4M)，且接着在约1:100酶:底物比(wt:wt)下添加枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)(Promega)并在37℃下在黑暗中孵育4小时。将另外2个样本稀释4倍(至2M)，且在约1:100酶:底物比(wt:wt)下添加弹性蛋白酶(elastase)和胰蛋白酶(Promega)，并接着在37℃下在黑暗中将2个样本孵育过夜。将来自3个消化液的所得肽合并至一个管中且溶解于90％甲酸中以获得在10％乙腈中的最终浓度2％。在TiO2富集和LC-MS/MS分析之前，将样本储存在-20℃下。
如由Cantin等(Cantin等,2007)所述对磷酸肽进行TiO2富集。通过将TiO2(5μpartisphere，Whatman,Clifton,NJ)以压力匀浆方式填充至熔融二氧化硅毛细管(250μmi.d.)中直至5cm长度来制备TiO2柱，且将肽混合物压力装载于柱上。柱用缓冲液A和B(对于缓冲液组成，参见以下章节)连续洗涤，且接着使用250 mM碳酸氢铵(pH 9)将磷酸肽直接洗脱至具有5 cm 5 μm反相的100 μm i.d. Kasil烧结端填充柱(Gemini C18，Phenomenex,Torrance, CA)中，所述柱连接于具有15cm相同反相的床体积的牵拉尖端(pulled-tip)分析柱。该第二柱与Agilent1200四元HPLC泵(Palo Alto, CA)串联以进行质谱测定分析。
所用HPLC缓冲溶液是作为缓冲液A的水/乙腈/甲酸(95:5:0.1，v/v/v)和作为缓冲液B的水/乙腈/甲酸(20:80:0.1，v/v/v)。洗脱梯度如下：10分钟100％缓冲液A、5分钟自0至15％缓冲液B的梯度、65分钟自15至45％缓冲液B的梯度、15分钟自45至100％缓冲液B的梯度、和5分钟100％缓冲液B。用LTQ-Velos-Orbitrap质谱仪(ThermoFisher, San Jose, CA)进行数据依赖性串联质谱测定(MS/MS)分析。在应用远端2.5 kV喷雾电压下将自LC柱洗脱的肽直接电喷雾至质谱仪中。获得一个完整扫描MS光谱(m/z 300-1800)的循环，继之以在35％标准化碰撞能量下依序产生的有关选自完整MS光谱的第1至第20个最强烈离子的20个MS/MS事件。对于MS扫描与MS/MS扫描两者而言，显微扫描的数目均是1，且最大离子注射时间分别是25 ms和50 ms。所用动态排除设置如下：重复计数，1；重复持续时间，30秒；排除清单大小，500；和排除持续时间，120秒。MS扫描功能和HPLC溶剂梯度由Xcalibur数据系统(ThermoFisher)控制。
G6PC启动子-荧光素酶测定
FAO肝细胞用编码融合于荧光素酶的人G6PC启动子的核苷酸-1227至+57的构建体(-1227 WT)或3个共有FoxO结合位点突变的相同构建体(-1227 Mut)转染，所述结合位点是-187至-183(GTTT →CGAG)；-171(G → C)；和-164 (A → C)，从而破坏G6PC启动子中的共有IRS序列T(G/A)TTT(Ayala等, 1999；von Groote-Bidlingmaier等,2003)。在位置-164处的末个突变在cAMP响应元件(CRE；-161至-152)上游，从而使CRE不受影响(Barthel等,2001)。用含0.1 mM cAMP和1μM地塞米松的具有1％BSA的无血清培养基处理肝细胞16小时，随后溶解并分析荧光素酶活性。相对于各组中的未处理细胞使荧光素酶单位(RLU)标准化。
实施例9：InsP3受体调控处于禁食和糖尿病时的肝糖异生
在禁食状态下，循环胰高血糖素增加通过诱导糖异生程序来促进肝葡萄糖产生。触发cAMP途径通过使CREB共活化子CRTC2脱磷酸来增加糖异生基因表达(1)。胰高血糖素部分地通过PKA介导的对CRTC2激酶SIK2的抑制来促进CRTC2脱磷酸。许多Ser/Thr磷酸酶似乎能够使CRTC2脱磷酸(2,3)，但激素信号调控这些酶所依据的机制仍不明确。此处显示的是胰高血糖素通过调动细胞内钙储库且活化钙/钙调蛋白依赖性Ser/Thr磷酸酶钙调神经磷酸酶/PP2B来刺激肝细胞中的CRTC2脱磷酸。胰高血糖素通过PKA介导的1,4,5-三磷酸肌醇受体(InsP3R)的磷酸化来增加胞质液钙，此处显示此与CRTC2相关联。在InsP3R活化之后，InsP3R通过促进钙调神经磷酸酶介导的CRTC2脱磷酸来增强糖异生基因表达。在喂食期间，胰岛素信号传导增加通过AKT介导的InsP3R失活来降低CRTC2活性。在糖尿病中，InsP3R活性增加，从而导致糖异生程序上调。因为肝InsP3R和钙调神经磷酸酶下调改进胰岛素抗性中的循环葡萄糖水平，所以这些结果说明在InsP3受体调节禁食条件下和糖尿病中的肝葡萄糖产生的层面上，cAMP与钙途径之间如何相互影响。
结果和讨论
测试一系列Ser/Thr蛋白质磷酸酶(PP)抑制剂阻断响应于胰高血糖素的CRTC2活化的能力。暴露于PP2B/钙调神经磷酸酶抑制剂环孢菌素A(CsA)使胰高血糖素诱导的CRTC2脱磷酸和核易位受破坏，但作为PP1、PP2A和PP4的抑制剂的冈田酸(okadaic acid，OA)并非如此(图33A、图37A)。CsA和其它钙调神经磷酸酶抑制剂也降低CRE-荧光素酶(luc)报道体活性(图33A、图37B)，但它们在表达磷酸化缺陷型(Ser171、275Ala)形式且因此活性形式的CRTC2的细胞中没有作用(图37C-E)。
基于CsA干扰CRTC2活化的能力，考虑的是钙调神经磷酸酶是否可促进响应于胰高血糖素的CRTC2脱磷酸。支持这个想法的是CRTC2含有2个介导与钙调神经磷酸酶缔合的共有(PXIXIT)基元(3,4)(图38A、B)。此外，突变两个基元使CRTC2的胰高血糖素依赖性脱磷酸受破坏(图33B)且阻止其核易位(图38C)，由此下调CRE-luc活化(图33B)。
基于这些结果，测试钙调神经磷酸酶是否调节糖异生程序的表达。在肝细胞中，腺病毒过度表达钙调神经磷酸酶催化亚单位使响应于胰高血糖素的CRTC2脱磷酸、CRE-luc活性和葡萄糖分泌加强，尽管钙调神经磷酸酶敲低具有相反作用(图33C)。尽管钙调神经磷酸酶可原则上通过对cAMP信号传导的作用来间接调节CRTC2活性，但钙调神经磷酸酶过度表达或敲低不改变暴露于胰高血糖素的细胞中的细胞PKA底物的磷酸化(图38D)。
接着检查钙调神经磷酸酶是否调节体内肝糖异生。在肝中适度(2倍)过度表达钙调神经磷酸酶使糖异生基因表达、肝CRE-luc活性和空腹血糖浓度增加(图33D、图39A)。相反，敲低肝钙调神经磷酸酶使糖异生程序的表达降低且使循环葡萄糖水平降低(图33D、图39B)，从而说明该磷酸酶促进肝中的禁食适应。钙调神经磷酸酶似乎通过CREB途径刺激糖异生；耗竭CRTC2使钙调神经磷酸酶过度表达在这个环境中的作用受阻断(图40)。
认识到钙调神经磷酸酶活性依赖于细胞内钙增加，所以测试cAMP途径是否刺激钙移动。使原代肝细胞暴露于胰高血糖素触发细胞游离钙快速增加(图34A、图41A)；通过用PKA抑制剂H89共处理，这些作用得以部分逆转(图41B)。细胞内钙升高似乎对CRTC2活化是关键的，因为与钙螯合剂BAPTA共孵育使响应于胰高血糖素的CRTC2脱磷酸和CRE-luc活化受破坏(图34B)。与钙对cAMP信号传导的作用相反的是暴露于BAPTA不阻断响应于胰高血糖素的PKA介导的CREB磷酸化。
在不受理论束缚下，cAMP可通过PKA依赖性细胞内钙通道磷酸化来增加钙移动。在用以鉴定响应于胰高血糖素，经受由PKA进行磷酸化的蛋白质的质谱测定研究中，自磷酸PKA底物抗血清的免疫沉淀回收1,4,5-三磷酸肌醇受体1(InsP3R1)(图41C)。InsP3R1和它的相关家族成员(InsP3R2、InsP3R3)是在它们响应于细胞外信号活化之后，促进内质网(ER)钙储库移动的钙释放通道(5-9)。此外，也已显示cAMP激动剂会通过PKA介导的磷酸化来增强InsP3R受体活性。
通过使肝细胞暴露于光溜海绵素C(Xc)或通过敲低所有3种InsP3R来抑制InsP3R使响应于胰高血糖素和毛喉素的胞质液钙移动和钙调神经磷酸酶活化受破坏(图34A、图42A)。此外，Xc处理和InsP3R敲低也阻断胰高血糖素对CRTC2脱磷酸、CRE-luc活化和诱导糖异生程序的作用(图34C、图42A、B)。使用来自InsP3R2敲除小鼠的肝细胞(10)确认InsP3R耗竭的影响(图42C-E)，所述InsP3R2是这些细胞中的主要InsP3R亚型。
基于这些结果，在不受理论束缚下，InsP3R也可调节体内空腹葡萄糖产生。通过敲低肝中的所有3种Insp3R或通过靶向破坏InsP3R2基因来降低肝InsP3R表达使禁食CRE-luc活性、糖异生基因表达和循环葡萄糖浓度降低，从而说明这些受体在葡萄糖体内平衡中的重要性(图34D、图43)。
测试胰高血糖素是否通过PKA介导的磷酸化调节InsP3R活性。根据用磷酸PKA底物抗血清进行的免疫印迹测定，使肝细胞暴露于胰高血糖素使InsP3R1以及InsP3R2和InsP3R3的磷酸化增加；这些作用由PKA抑制剂H89阻断(图35A、图44A)。此外，在InsP3R1中的共有PKA位点处的丝氨酸残基(Ser1589、Ser1756)突变成丙氨酸使响应于胰高血糖素的InsP3R1磷酸化完全受破坏(图35B)。因此，过度表达PKA缺陷型(S1589、1756A)InsP3R1干扰钙移动和钙调神经磷酸酶活化，且此降低CRE-luc活化以及葡萄糖自暴露于胰高血糖素的肝细胞的分泌(图35B-D)。
与胰高血糖素类似，禁食也刺激在Ser1589和Ser1756处的肝InsP3R1磷酸化(图44B)。且过度表达PKA缺陷型InsP3R1降低禁食CRE-luc诱导、钙调神经磷酸酶活化和糖异生基因表达，从而导致循环葡萄糖浓度较低(图35E、图44C、D)。总之，这些结果支持PKA介导的InsP3R磷酸化在肝糖异生中的重要作用。
在不受理论束缚下，CRTC2邻近于钙信号传导机构对于它的活化可为重要的。支持这个见解的是发现在共免疫沉淀测定中，CRTC2通过它的N末端CREB结合结构域(CBD)与InsP3R1缔合(图35F、图45A-D)。此外，CRTC2富含于含有ER的高密度微粒体(HDM)部分中，所述部分也含有InsP3R(图45E)。InsP3R:CRTC2缔合似乎对在核周间隙中的CRTC2定位是关键的，因为RNA介导的InsP3R敲低导致CRTC2再分布于细胞质中(图45F)。通过缺失CRTC2中的CBD或通过添加使CRTC2靶向质膜的N末端豆蔻酰化信号来破坏CRTC2:InsP3R相互作用使响应于胰高血糖素的CRTC2脱磷酸和CRE-报道体活化受阻断(图45G-I)。总之，这些结果指示CRTC2与InsP3R缔合增强其对禁食信号的敏感性。
在喂食条件下，胰岛素部分地通过增加CRTC2磷酸化来抑制糖异生。检查胰岛素是否干扰InsP3R对CRTC2活化的作用。支持这个想法的是已显示AKT通过使InsP3R在Ser2682(在InsP3R1中)处磷酸化来阻断钙移动(11)。实际上，根据用磷酸AKT底物抗血清进行的免疫印迹分析，使肝细胞暴露于胰岛素使InsP3R磷酸化增加(图46A)；使Ser2682(在InsP3R1中)突变成丙氨酸使这些作用受阻断。胰岛素处理也降低表达野生型InsP3R1的细胞中的胰高血糖素依赖性钙移动增加和钙调神经磷酸酶活化，但此在表达AKT缺陷型(S2682A)InsP3R1的细胞中没有作用(图46B)。因此，相较于野生型，在表达(S2682A)-InsP3R的肝细胞中，CRTC2脱磷酸、CRE-luc活性和葡萄糖输出升高(图46C)。
接着检查InsP3R1由AKT磷酸化在调控体内肝葡萄糖产生中是否重要。喂食增加在Ser2682处的肝InsP3R1磷酸化(图44B)。此外，过度表达AKT缺陷型InsP3R1部分遏制喂食诱导的CRE-luc活性降低和糖异生基因表达，从而导致循环葡萄糖浓度升高(图46D)。总之，这些结果指示在喂食期间AKT介导的InsP3R磷酸化通过阻断钙调神经磷酸酶依赖性CRTC2脱磷酸来抑制肝糖异生。
检查肝InsP3R信号传导是否促进胰岛素抗性环境中的糖异生增加。在ob/ob糖尿病动物与db/db糖尿病动物两者中，肝钙调神经磷酸酶活性均增强，从而导致CRE-luc活性增加(图36A、图47A、B)。指出InsP3R的作用的是这些糖尿病小鼠中的肝PKA磷酸化活性InsP3R的量增加，而AKT磷酸化非活性InsP3R的量降低(图36B)。相应地，敲低db/db小鼠中的钙调神经磷酸酶或InsP3R使CRE-luc活性、糖异生基因表达和肝糖异生降低(图36C、图47C)。
总之，本文结果说明胰高血糖素通过触发导致钙调神经磷酸酶活化的细胞质钙增加来促进禁食期间的CRTC2脱磷酸(图48)。胰高血糖素能够通过PKA介导的InsP3R磷酸化来增加钙信号传导说明在肝和也许其它胰岛素敏感性组织中，在cAMP与钙信号传导途径之间存在用于达成相互影响的重要调控节点。钙进入受PKA抑制剂H89部分抑制也指出存在可发挥响应于胰高血糖素与PKA一起增加InsP3R活性的作用的其它调控输入(12,13)。也已发现CRTC2通过上调肝(14,15)和肌肉(16)中的核激素受体共活化子PGC1α来刺激代谢基因表达。基于钙信号传导在PGC1α依赖性转录中具有被充分认识的作用，InsP3R也可在这个环境中起重要作用。
方法
通过尾部静脉注射来递送腺病毒(17)。使用IVIS成像系统观察肝CRE-luc活性。在注射CRE-luc腺病毒之后3-5天，将小鼠成像。对禁食过夜且用丙酮酸(2g kg-1)腹膜内注射的小鼠进行丙酮酸耐受性测试。已描述Insp3r2敲除小鼠(10)。如所报道制备培养的原代小鼠肝细胞(18)。使用原代小鼠肝细胞进行细胞分级分离研究(18)。使用CCD照相机对用fura-2染料装载的原代肝细胞进行钙成像实验。对自HEK293T细胞制备的CRTC2免疫沉淀和自暴露于胰高血糖素的原代肝细胞制备的磷酸PKA底物抗血清的免疫沉淀进行质谱测定研究。抗InsP3R1(A302-158A)和InsP3R3(A302-160A)抗体自Bethyl实验室购买，抗InsP3R2(ab77838)抗血清来自Abcam，抗钙调神经磷酸酶(610260)来自BD Biosciences，抗GRP78(ADISPA-826-F)来自EnzoLife Sciences，抗磷酸PKA底物(RRXS/T，9624)、抗磷酸AKT底物(RXXS/T，9614)和CRTC2(pS171，2892)来自Cell Signaling。如所述使用磷酸(Ser275)CRTC2抗体(19)。以下包括细节。
小鼠品系和腺病毒
通过尾部静脉注射来将腺病毒(1X108个斑块形成单位(pfu)GFP、钙调神经磷酸酶、InsP3R1、InsP3R1DM(S1589A/S1756A)、非特异性(US)RNAi、钙调神经磷酸酶RNAi、Insp3r1RNAi、Insp3r2RNAi、Insp3r3RNAi、Crtc2RNAi、1X109pfu CRE-luc报道体、5X107pfuRSVβ-gal)递送至8-10周龄雄性C57BL/6J,B6.V-lep<ob>/J,B6.Cg-m+/+Lepr<db>/J中(17)。先前描述了Insp3r2敲除小鼠(10)。在研究之前使所有小鼠都适应它们的环境1周且在温度控制的环境中在12小时光照/黑暗循环下舍饲在群体笼中。对于体内成像实验，在腺病毒递送之后第3-5天将小鼠成像。先前已描述野生型CRTC2、CRTC2(S171A)、GFP、非特异性RNAi、Crtc2RNAi、CRE-luc和RSVβ-gal腺病毒(17,20)。自InsP3R1质粒产生含有大鼠InsP3R1、InsP3R1DM和InsP3R1(S2682A)的腺病毒。使用小鼠钙调神经磷酸酶质粒(Addgene)构建钙调神经磷酸酶腺病毒。CRTC2ΔCBD(51-692aa)、S275A和S171A/S275A腺病毒由小鼠CRTC2制得。用融合于来自Src的N末端豆蔻酰化标签(MGSSKSKPKDPSQR)的小鼠CRTC2产生豆蔻酰化CRTC2(Myr-CRTC2)腺病毒。分别使用序列5’-GGGTACCGCATGTACAGGAAAA-3’、5’-GGGTACTGGAATAGCCTCTTCC-3’、5’-GGGTAACAAGCACCACCATCCC-3’和5’-GGGCAAGCTGCAGGTGTTCCTG-3’构建钙调神经磷酸酶RNAi、Insp3r1 RNAi、Insp3r2 RNAi、Insp3r3 RNAi腺病毒。这个研究中使用的所有表达的构建体都通过测序进行确认。
体内分析
对于体内成像，如所述(17,20)在任意喂食条件下或在禁食6小时之后将小鼠成像。对于丙酮酸激发实验，将小鼠禁食过夜且用丙酮酸(2g kg-1)腹膜内注射。使用LifeScan自动糖度计测定血糖值。对于免疫印迹，超声处理小鼠组织，离心且保留上清液以进行蛋白质测定和SDS–PAGE分析。
细胞培养、细胞分级分离、荧光素酶测定、钙调神经磷酸酶活性和cAMP测量
在含有10％ FBS(HyClone)、100 mg ml–1青霉素-链霉素的DMEM中培养HEK293T(ATCC)细胞。如先前所述分离和培养小鼠原代肝细胞(18)。如先前所报道进行细胞分级分离研究(18)。对于报道体研究，使Ad-CRE-luc感染的肝细胞(每个细胞1 pfu)暴露于胰高血糖素(Gcg，100 nM)2至4小时。对于环孢菌素A(CsA，10 μM)或冈田酸(OA，100 nM)或细胞可渗透钙调神经磷酸酶自体抑制性肽(10 μM)或CN585(100 μM)或花萼海绵体诱癌素A(Calyculin A)(10 nM)或光溜海绵素C(Xc，2 μM)或H89( 30 μM)或BAPTA(50 μM)抑制，用抑制剂预处理肝细胞1小时。相对于腺病毒编码的RSV β-gal的β-半乳糖苷酶活性使荧光素酶活性标准化。根据制造商说明书，测量钙调神经磷酸酶活性(测试试剂盒来自Enzo LifeSciences)和细胞cAMP水平(测试试剂盒来自Cayman Chemical Company)。
钙成像
将小鼠原代肝细胞涂铺在玻璃盖玻片上且在含0.025％(w/v)普洛尼克(pluronic)F127(Sigma-Aldrich)的培养基199(Mediatech)存在的情况下用5 μM Fura-2乙酰氧基甲酯(Molecular Probes)装载30分钟。将盖玻片安置在层流灌注室(WarnerInstruments Corp.)上且用培养基199或100 nM胰高血糖素于培养基199中的溶液灌注。在激发波长在340 nm与380 nm之间交替下用冷却CCD照相机收集Fura-2装载的细胞的图像。在减去背景荧光之后计算在两种激发波长下的荧光强度比。使用Fura-2钙成像校准试剂盒(Invitrogen)计算[Ca2+]I(胞质液游离钙浓度)。使用MetaFluor软件包(UniversalImaging Corp.)收集和分析图像。图表示由代表性单次试验获得的来自各组30-40个个别细胞的平均响应。条形图表示每种条件来自150-200个细胞的平均响应(超过平均基线的倍数)。所有实验都重复至少3次，获得类似结果。
免疫印迹、免疫沉淀、免疫染色
如所述进行免疫印迹、免疫沉淀和免疫染色测定(18)。先前描述CRTC2、pCREB(Ser133)、CREB、pAKT(Thr308)、AKT、微管蛋白、HA和FLAG抗体(18)。抗体抗InsP3R1(A302-158A)和InsP3R3(A302-160A)自Bethyl实验室购买，抗InsP3R2(ab77838)来自Abcam，抗钙调神经磷酸酶(610260)来自BD Biosciences，抗GRP78(ADI-SPA-826-F)来自Enzo LifeSciences，抗磷酸PKA底物(RRXS/T，9624)、抗磷酸AKT底物(RXXS/T，9614)和CRTC2(pS171，2892)来自Cell Signaling。如所述采用CRTC2(pS275)抗体(19)。
定量PCR
使用RNeasy试剂盒(Qiagen)提取来自整个肝或来自原代肝细胞的总细胞RNA且用于以SuperScript II酶(Invitrogen)产生cDNA。如所述，通过定量PCR分析cDNA(18)。
质谱测定
制备用于如先前所报道的质谱测定研究(21)的来自HEK293T细胞的内源性CRTC2的免疫沉淀和来自胰高血糖素刺激的肝细胞的磷酸PKA底物抗血清的免疫沉淀，且通过在Thermo LTQ Orbitrap仪器上进行电喷雾离子化串联质谱测定进行分析。
统计分析
所有研究都在至少3个独立场合进行。结果报道为平均值±s.e.m。使用双尾不配对学生t检验进行不同组的比较。在P<0.05下，差异被视为具有统计显著性。
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实施例10：用于治疗和预防代谢疾病的p38和MK2/3抑制剂
在CaMKII的下游存在两种可介导CaMKII的不利作用的激酶—p38和MK2(参见图51)。尽管阻断如IP3受体和CaMKII的更上游靶标的药物可涵盖更多途径，但它们也可更具毒性。相反，靶向更下游介导物可导致脱靶效应较小。MK2和MK3极类似，且阻断MK2的试剂(DN-MK2和MK2抑制剂)阻断MK2与MK3两者。如果仅阻断它们中的一者，那么另一者将起补偿作用。
因此，p38抑制剂和MK2/3抑制剂也可用于治疗由肥胖症诱发的代谢疾病，如1型糖尿病、2型糖尿病、胰岛素抗性和代谢综合征。
图52-56中所述的研究使用原代鼠肝细胞(HC)。对于p38实验，标记为“Cre”或“腺-Cre”或“ad-Cre”的样本中的p38被缺失且这个的对照是腺-LacZ(有时标记为ad-LacZ或LacZ)。(HC具有一种形式的p38基因，其当暴露于使用腺病毒载体递送的Cre重组酶时被缺失。对照是编码称为LacZ的无关蛋白质的腺病毒载体。)
图52直接使p38与CaMKII的关键远端后果，即FoxO1核定位相关：在p38存在的正常HC(LacZ)中，组成型活性(CA)CaMKII推动FoxO1进入核中，但在缺乏p38的HC(Cre)中，它不能这样做。
图53使用MK2抑制剂来显示MK2在核FoxO1与诱导肝葡萄糖产生中涉及的基因两者中的重要性。MK-2抑制剂来自Calbiochem(目录号475864)：2-(2-喹啉-3-基吡啶-4-基)-1,5,6,7-四氢-4H-吡咯并-[3,2-c]吡啶-4-酮。
图54使用模拟其中肝细胞经受内质网(ER)应激的肥胖症和2型糖尿病中的过程的实验模型(称为衣霉素(tunicamycin)的蛋白质错误折叠诱导剂)。ER应激由'PERK/PKR'和'ATF4/CHOP'(下部右侧分支)表示(参见图51)。图54中显示的是p38为衣霉素(ER应激)诱导的p-PERK(它的活性形式)和CHOP增加所需。也将观察到在缺乏p38的HC(Cre)中，p58IPK略微但一致升高—这也符合图51的下部右侧分支。
图55使用模拟肥胖症和糖尿病中的肝ER应激的另一实验模型(称为棕榈酸盐的脂肪酸)。如图54中，p38为CHOP和p-PERK增加所需。
图56如果注视图51的右侧分支的底部，那么将观察到读数是p-Akt对胰岛素的响应。图56中的所有HC都接受急性剂量的胰岛素以测试胰岛素活化(磷酸化)Akt的能力。此处用于模拟肥胖症/糖尿病的模型是图55中使用的棕榈酸盐模型。可观察到在p38正常的HC(Ad-LacZ)中，胰岛素给予强健p-Akt信号(前2个泳道)但这由棕榈酸盐(“palm”)降低。面对棕榈酸盐的这个“胰岛素抗性”模拟肥胖症和2型糖尿病中发生的情况。如果接着注视无p38的HC(Ad-Cre)，那么胰岛素活化Akt(p-Akt)的能力得以改善。这与图51中所示的p38-p-Akt关联一致。
图86、87和88涉及抑制CaMKII、p38或MK2/3如何导致胰岛素信号传导改善，即，这些抑制剂如何防止胰岛素抗性。其中数据支持以下机制：CaMKII、p38或MK2/3的抑制剂降低Tribble3(Trb3)，此接着改善胰岛素使AKT磷酸化的能力(Trb3是AKT磷酸化的内源性抑制剂)。
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Claims (7)

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2.如权利要求1所述的用途，其中所述治疗或预防影响所述受试者的糖原分解或糖异生。
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4.如权利要求1所述的用途，其中所述治疗或预防包括向所述受试者施用降低编码所述MK2/3蛋白质的基因的表达的反义RNA的步骤。
5.如权利要求1所述的用途，其中所述治疗或预防包括向所述受试者施用特异性结合所述MK2/3蛋白质的肽或多肽的步骤。
6.如权利要求1所述的用途，其中所述治疗或预防包括向所述受试者施用小分子的步骤。
7.如权利要求6所述的用途，其中所述小分子是MK2/3抑制剂。
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