CN103926414B - 鸭疫里默氏杆菌表面抗原d15截短重组蛋白致敏乳胶试剂及其制备方法和应用 - Google Patents

鸭疫里默氏杆菌表面抗原d15截短重组蛋白致敏乳胶试剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸭疫里默氏杆菌(RA)表面抗原D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂，为表面包被有氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的RA表面抗原D15截短重组蛋白的乳胶颗粒，该致敏乳胶试剂可通过乳胶凝集试验对RA抗体进行快速检测，且检测特异性、重复性和敏感性良好，可用于制备RA抗体检测试剂特别是RA抗体乳胶凝集检测试剂盒；本发明还公开了RA表面抗原D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂的制备方法，并对偶联条件(如羧化乳胶偶联浓度、RA表面抗原D15截短重组蛋白偶联浓度、偶联时间、封闭液浓度等)进行了探索和优化，所建立的制备方法偶联效率高，产品凝集效果好。

Description

鸭疫里默氏杆菌表面抗原D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程和检测技术领域，涉及一种致敏乳剂试剂及其制备方法和应用。
背景技术
鸭疫里默氏杆菌(Riemerella Anatipestifer,RA)病是一种主要侵害鸭、火鸡和多种其它鸟类的接触性传染疾病，又称为新鸭病、鸭疫综合症、鸭疫巴氏杆菌病和鸭传染性浆膜炎等，是目前危害养鸭业的主要传染病之一。该病呈急性或慢性败血症过程，病理变化主要是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、干酪性输卵管炎等。1-8周龄鸭高度敏感，恶劣的环境条件或并发感染更易引起该病的发生和流行，死亡率高。耐过鸭常生长不良，增重缓慢，失去饲养价值，而且该病在发病场能持续存在，引起不同批次的鸭感染发病，难于根治，给养鸭业造成严重的经济损失。
除药物防治以外，目前已成功研制出弱毒疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗来控制RA病。因用药物防治易造成菌株的耐药性，鸭群反复发病，难于根治，而用疫苗来免疫接种，可以获得较好的预防效果。由于RA的血清型多而复杂，国际公认有21个血清型，我国也存在10多个血清型，且各血清型之间缺乏有效的交叉免疫保护，这给RA的疫苗防治带来一定困难。比较有效的方法是针对当地主要流行血清型，选取相应菌株研制疫苗，以达到更有效的防治效果。
外膜蛋白(OMPs)是革兰阴性菌特有的一种结构蛋白，很多革兰阴性菌的OMPs具有良好的免疫原性，是亚单位疫苗的候选组成部分，是目前的研究热点。RA的D15蛋白与副猪嗜血杆菌和流感嗜血杆菌外膜蛋白D15一样，均属于Omp85家族。Omp85为暴露于细菌表面且相对保守的外膜蛋白，为其他外膜蛋白的定位和折叠于外膜所必需；除细菌外膜外，Omp85在真核生物线粒体和叶绿体的外膜中也存在。Omp85家族蛋白在结构上具有两个重要特征：氨基酸序列N端位于周质区，富含多肽转运相关区域片段(polypeptide transport-associateddomain,POTRA)；而其C端的β桶状区域则包埋于外膜中。多杀性巴氏杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、杜克雷嗜血杆菌、痢疾杆菌等细菌均有属于Omp85家族的外膜蛋白，并且在氨基酸序列上具有较高的相似性。近十年来，属于Omp85家族的多种细菌外膜蛋白被确认与致病机理和免疫性相关。
对RA抗体的检测是评价RA疫苗免疫效果及制定合理的免疫程序的关键。乳胶凝集试验是以乳胶颗粒为载体，将抗原或抗体通过物理吸附法或化学交联法等固定至载体上制得致敏乳胶试剂，再用以检测对应抗体或抗原的方法。由于具有快速敏感、简单易行、无需昂贵仪器等优点，该方法已广泛用于多种动物疾病抗原抗体的检测和流行病学调查。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种RA表面抗原D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂，可通过乳胶凝集试验检测RA抗体，检测具有特异性、重复性和敏感性；目的之二在于提供该致敏乳胶试剂的制备方法，偶联效率高，产品凝集效果好；目的之三在于提供该致敏乳胶试剂在制备检测试剂中的应用。
经研究，本发明提供如下技术方案：
1.RA表面抗原D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂，为表面包被有RA表面抗原D15截短重组蛋白的乳胶颗粒，所述RA表面抗原D15截短重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.RA表面抗原D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂的制备方法，是利用水溶性碳二亚胺将RA表面抗原D15截短重组蛋白偶联到羧化乳胶颗粒的表面而得。
进一步，所述RA表面抗原D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂的制备方法具体包括以下步骤：取10wt％乳胶原液，用0.1mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液离心洗涤，再用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液离心洗涤并重悬，加入2wt％EDAC溶液，37℃振摇反应使乳胶颗粒表面的羧基活化，离心弃上清，沉淀用0.01mol/L、pH8.0的硼酸盐缓冲液离心洗涤并重悬至浓度为0.5～2wt％，再加入等体积0.1125～0.225mg/mL的RA表面抗原D15截短重组蛋白溶液，37℃振摇反应2～12小时使羧化乳胶与RA表面抗原D15截短重组蛋白偶联，加入0.1mol/L甘氨酸终止反应，离心弃上清，沉淀用1wt％牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭后，悬浮于含有稳定剂、封闭剂和防腐剂的缓冲液中，即得RA表面抗原D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂。
进一步，所述RA表面抗原D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂的制备方法具体包括以下步骤：取10wt％乳胶原液，用0.1mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液离心洗涤，再用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐离心洗涤并重悬，加入2wt％EDAC溶液，37℃振摇反应使乳胶颗粒表面的羧基活化，离心弃上清，沉淀用0.01mol/L、pH8.0的硼酸盐缓冲液离心洗涤并重悬至浓度为1wt％，再加入等体积0.225mg/mL的RA表面抗原D15截短重组蛋白溶液，37℃振摇反应6小时使羧化乳胶与RA表面抗原D15截短重组蛋白偶联，加入0.1mol/L甘氨酸终止反应，离心弃上清，沉淀用1wt％BSA溶液封闭后，悬浮于含有5vol％甘油、1wt％BSA和0.1wt％叠氮钠的0.01M、pH7.4的磷酸盐缓冲液中，即得RA表面抗原D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂。
进一步，所述RA表面抗原D15截短重组蛋白采用以下方法制备：将核苷酸序列如SEQID No.2所示的RA表面抗原D15截短重组蛋白的编码基因克隆入原核表达质粒pET28a(+)中得到重组表达载体，将该重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中得到工程菌，将该工程菌接种于含卡那霉素即Kan的LB液体培养基中，37℃培养过夜，次日取菌液按体积比1:50接入含Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.4，加入IPTG至终浓度为0.6mmol，37℃诱导培养4小时，收集菌液，离心，沉淀用20mmol pH8.0的Tris-HCl缓冲液悬浮，置-20℃过夜后，加溶菌酶至终浓度为1mg/mL，4℃搅拌30分钟，冰浴条件下超声波间歇破碎菌体，离心，沉淀用洗液离心洗涤后，用尿素溶液溶解，进行镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化，以含有300mmol咪唑的洗脱缓冲液为洗脱剂，收集蛋白洗脱液，透析复性，获得携带组氨酸标签的RA表面抗原D15截短重组蛋白。
3.RA表面抗原D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂在制备RA抗体检测试剂中的应用。
4.RA抗体乳胶凝集检测试剂盒，含有RA表面抗原D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂。
本发明的有益效果在于：本发明将RA表面抗原D15截短重组蛋白通过化学交联法与羧化乳胶偶联，制备了RA表面抗原D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂，该致敏乳胶试剂可通过乳胶凝集试验对RA抗体进行快速检测，且检测特异性、重复性和敏感性良好，可用于制备RA抗体检测试剂特别是RA抗体乳胶凝集检测试剂盒；本发明对RA表面抗原D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂的制备方法特别是偶联条件(如羧化乳胶偶联浓度、RA表面抗原D15截短重组蛋白偶联浓度、偶联时间、封闭液浓度等)进行了探索和优化，所建立的制备方法偶联效率高，产品凝集效果好。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为D15截短基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中1为D15截短基因PCR产物，M为DNA Marker。
图2为重组质粒pJET1.2-tD15的琼脂糖凝胶电泳图；其中M为DNA Marker，1为pJET1.2-tD15用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的产物，2为PCR产物。
图3为重组表达质粒pET28a-tD15的酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中M为DNAMarker，1为pET28a-tD15用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的产物。
图4为重组表达质粒pET28a-tD15转化菌株表达的RA表面抗原D15截短重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中1为用IPTG诱导的pET-28a-tD15转化菌株BL21经超声破碎后收集的上清；2为用IPTG诱导的pET-28a-tD15转化菌株BL21经超声破碎后收集的沉淀；3为用IPTG诱导的pET-28a-tD15转化菌株Rosetta经超声破碎后收集的上清；4为用IPTG诱导的pET-28a-tD15转化菌株Rosetta经超声破碎后收集的沉淀；5为用IPTG诱导的pET-28a-tD15转化菌株PlysS经超声破碎后收集的上清；6为用IPTG诱导的pET-28a-tD15转化菌株PlysS经超声破碎后收集的沉淀；7为蛋白质Marker；8为空载体pET28a(+)转化菌株BL21未用IPTG诱导；9为用IPTG诱导的空载体pET28a(+)转化菌株BL21经超声破碎后收集的上清；10为用IPTG诱导的空载体pET28a(+)转化菌株BL21经超声破碎后收集的沉淀。
图5为不同IPTG浓度下pET28a-tD15转化菌株BL21表达RA表面抗原D15截短重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中M为蛋白质Marker，1-6的IPTG终浓度依次为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mmol/L。
图6为不同诱导温度下pET28a-tD15转化菌株BL21表达RA表面抗原D15截短重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中M为蛋白质Marker，1-3的诱导温度依次为37、30、25℃。
图7为不同诱导时间下pET28a-tD15转化菌株BL21表达RA表面抗原D15截短重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中M为蛋白质Marker，1-6依次为诱导6、5、4、3、2、0小时。
图8为Western blot检测RA表面抗原D15截短重组蛋白的特异性，其中1为RA表面抗原D15截短重组蛋白，2为空载体pET-28a(+)的IPTG诱导产物，M为蛋白质Marker。
图9为镍琼脂糖凝胶(Ni2+-NAT)亲和层析纯化RA表面抗原D15截短重组蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白质Marker，1为纯化前的蛋白，2为纯化后的RA表面抗原D15截短重组蛋白。
图10为羧化乳胶最佳偶联浓度的选择，其中从左至右依次为乳胶浓度2％、乳胶浓度1％、阴性对照。
图11为RA表面抗原D15截短重组蛋白最佳偶联浓度的选择，其中a从左至右依次为蛋白浓度0.9mg/mL、空白对照、蛋白浓度0.45mg/mL；b从左至右依次为蛋白浓度0.225、0.1125、0.05625mg/mL。
图12为封闭液最佳浓度的选择，其中a从左至右依次为0％BSA封闭、0.01％BSA封闭、空白对照；b从左至右依次为0.1％BSA封闭、1％BSA封闭、空白对照。
图13为最佳偶联时间的选择，其中a从左至右依次为偶联2h、4h、6h；b从左至右依次为偶联8h、10h、12h。
图14为RA表面抗原D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂与不同RA阳性血清的凝集反应，其中从左至右依次为RA ATCC11845株鸭阳性血清、抗RA表面抗原D15截短重组蛋白鸭阳性血清、RA CH-1株鸭阳性血清。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照试剂制造厂商所建议的条件进行。
主要材料：质粒pJET1.2-T购自加拿大富酶泰斯(fermentas)公司；质粒pET28a(+)为Novagen公司产品；克隆宿主菌E.coli DH5α、表达宿主菌E.coli BL21(DE3)和鸭疫里默氏杆菌RA CH-1株(血清1型)由四川农业大学禽病研究中心提供。鸭疫里默氏杆菌RA ATCC11845株(血清6型)购自ATCC。
本实施例中出现的“％”除特别说明外，均为质量百分比(wt％)。vol％表示体积百分比。
实施例1、RA表面抗原D15截短重组蛋白的制备
本发明拟制备的RA表面抗原D15截短重组蛋白(命名为tD15)的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示(即登录号为AFR36094.1的RA D15第94位至第384位氨基酸序列)，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示(即登录号为CP003787的RA D15基因第280位至第1152位核苷酸序列)。
1、RA tD15基因的克隆
根据RA tD15基因序列设计引物，上游引物RA tD15-F：5’-CGGATCCACAGAATATA-TGACCTACCCTAAC-3’(SEQ ID NO.3，划线部分为BamHⅠ位点)；下游引物RA tD15-R：5’-CCAAGCTTGGCGCCTATACATCTAAAATAC-3’(SEQ ID NO.4，划线部分为HindⅢ位点)。
提取RA基因组DNA：将RA CH-1株接种于含5％牛血清的胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)平板培养基中，37℃恒温培养过夜，挑单个菌落于含5％牛血清TSB液体培养基中，37℃剧烈振荡培养12h，取l-3mL培养液，5000g离心l0min，弃上清，沉淀加入567μL TE，反复吹打，再加入30μL10％SDS和3μL20mg/mL蛋白酶K溶液，混匀，37℃水浴lh，再加入100μL5M NaCl，混匀，65℃水浴l0min，再加入等体积氯仿/异戊醇，混匀，12000r/min离心5min，上清再加入等体积酚/氯仿/异戊醇，混匀，12000r/min离心5min，上清再加入0.6倍体积异丙醇，轻轻混匀，沉淀DNA30min，12000r/min离心15min，弃上清，用lmL75vol％乙醇洗涤DNA，12000r/min离心5min，弃上清，37℃干燥后，用50μL TE溶解，-20℃保存备用。
以RA基因组DNA为模板，采用前述上、下游引物PCR扩增RA tD15基因。PCR反应体系为：ddH2O7μL，2×PCR mastermix10μL，模板DNA1μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，总体积为20μL。PCR反应参数为：首先95℃5min，然后94℃50s、58.4℃1min、72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。取PCR产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示，获得了一条约873bp的特异性DNA条带，与目标DNA片段大小相符。将PCR产物用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行切胶回收纯化。
将纯化的PCR产物在T4DNA连接酶的作用下与质粒pJET1.2-T连接，连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，抽提质粒，获得重组质粒pJET1.2-tD15。对重组质粒pJET1.2-tD15进行BamHⅠ/HindⅢ双酶切鉴定，结果如图2所示，pJET1.2-tD15用BamHⅠ和HindⅢ双酶切得到三条DNA片段，其中一条DNA片段与873bp的目的DNA片段大小相符，另一DNA小片段与pJET1.2-tD15上另一个HindⅢ位点酶切下来的片段大小相符。将酶切鉴定正确的重组质粒pJET1.2-tD15送上海英骏生物有限公司进行测序，结果显示，T克隆所得的RA tD15基因序列如SEQ ID NO.2所示，与目标序列完全一致。
2、重组表达质粒的构建
用BamHⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒pJET1.2-tD15，回收目的DNA片段，与经相同酶切的原核表达载体pET28a(+)连接，连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，抽提质粒，获得重组表达质粒pET28a-tD15。对重组表达质粒pET28a-tD15进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，结果如图3所示，pET28a-tD15经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后得到两条DNA片段，其中DNA小片段与873bp的目的DNA片段大小相符。
3、重组表达工程菌的构建
挑取含重组表达质粒pET28a-tD15的DH5α大肠杆菌，划线接种于含Kan的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，次日取单个菌落接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养10～16小时，离心收集菌液，抽提质粒，转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，获得含重组表达质粒pET28a-tD15的BL21工程菌。
同法，将重组表达质粒pET28a-tD15分别转化表达宿主菌E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞与E.coli BL21(DE3)plysS感受态细胞，获得含重组表达质粒pET28a-tD15的Rosetta工程菌与含重组表达质粒pET28a-tD15的PlysS工程菌。
4、重组表达工程菌的诱导表达
取含重组表达质粒pET28a-tD15的工程菌，同时设置空载体pET28a(+)转化菌株为对照，接种于含Kan的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，次日取菌液按体积比1:50转接种于含Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.4时，加入IPTG诱导培养，收集培养菌液，4℃、13000r/min离心5min，弃上清，菌体沉淀用20mL20mmol Tris-HCl(pH8.0)悬浮，置-20℃过夜后，加溶菌酶至终浓度为1mg/mL，4℃搅拌30min，超声波(冰浴)间歇破碎菌体(600w，30sec/次，10次)，4℃、10000r/min离心10min，取上清备用；沉淀用10mL洗液(10mmol/L PBS+2mol/L尿素+0.2％Triton X-100)于4℃、10000r/min离心洗涤10min，重复洗涤三次后，用尿素溶液(10mmol/L PBS+8mol/L尿素)溶解备用。分别取前述备用的上清和用尿素溶液溶解的沉淀，加入40μL超纯水和10μL10×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性10min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色。结果如图4所示，空载体pET28a(+)转化菌株BL21未用IPTG诱导时没有特异性蛋白条带出现，用IPTG诱导后也没有特异性蛋白条带出现，说明载体本身很小(可忽略不计)；pET28a-tD15转化菌株Rosetta用IPTG诱导后也没有特异性蛋白条带出现，而pET28a-tD15转化菌株BL21与pET28a-tD15转化菌株PlysS用IPTG诱导后均在约34kDa处出现一条特异性蛋白条带，与重组tD15/His-tag融合蛋白大小相符(由于pET28a(+)载体在多克隆位点的N端有6个His-tag，因此pET28a-tD15的表达产物实际为tD15与His-tag的融合蛋白)，其中pET28a-tD15转化菌株BL21的重组tD15/His-tag融合蛋白表达量较高，说明E.coli BL21(DE3)为优选的表达宿主菌；此外，由于重组tD15/His-tag融合蛋白主要存在于经超声波破碎后收集的沉淀中，说明重组tD15/His-tag融合蛋白在菌体中是以不溶的包涵体形式存在。
IPTG浓度优化：取含重组表达质粒pET28a-tD15的BL21工程菌，接种于含Kan的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，次日取菌液按体积比1:50转接种于含Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.4时，加入IPTG至不同终浓度(分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mmol/L)，37℃诱导培养4h，收集1mL培养菌液，4℃、13000r/min离心2min，弃上清，沉淀加入40μL超纯水和10μL10×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性10min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳。结果如图5所示，随IPTG浓度的增高，重组tD15/His-tag融合蛋白的诱导量有明显变化，其中用0.6mmol/L IPTG诱导时表达量最高，因此优选0.6mmol/L作为IPTG诱导表达浓度。
诱导温度优化：取含重组表达质粒pET28a-tD15的BL21工程菌，接种于含Kan的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，次日取菌液按体积比1:50转接种于含Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.4时，加入IPTG至终浓度为0.6mmol/L，不同温度(分别为25、30、37℃)诱导培养4h，收集1mL培养菌液，4℃、13000r/min离心2min，弃上清，沉淀加入40μL超纯水和10μL10×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性10min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳。结果如图6所示，重组tD15/His-tag融合蛋白的表达量在诱导温度为25℃时较少，在诱导温度为30℃和37℃时较高，因此，按照本领域通常的培养习惯，优选37℃作为诱导温度。
诱导时间优化：取含重组表达质粒pET28a-tD15的BL21工程菌，接种于含Kan的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，次日取菌液按体积比1:50转接种于含Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.4时，加入IPTG至终浓度为0.6mmol/L，37℃诱导培养不同时间(分别为0h、2h、3h、4h、5h、6h)，收集1mL培养菌液，4℃、13000r/min离心2min，弃上清，沉淀加入40μL超纯水和10μL10×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性10min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳。结果如图7所示，诱导培养4h即有大量的重组tD15/His-tag融合蛋白表达，继续增加诱导时间，蛋白表达量变化不大，因此优选4h作为诱导时间。
5、重组tD15/His-tag融合蛋白的Western-blot鉴定
取含重组表达质粒pET28a-tD15的BL21工程菌的IPTG诱导培养菌液，同时设置空载体pET28a(+)转化菌株BL21的IPTG诱导培养菌液为对照，4℃、13000r/min离心，弃上清，沉淀加入40μL超纯水和10μL10×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性10min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后将蛋白质样品从PAGE凝胶中转移至PVDF膜上，加入12ml3％BSA转膜缓冲液于36℃轻摇2h进行膜封闭，TBST洗膜3次，再加入0.5％BSA/PBST稀释的兔抗RA(血清1型)血清作为一抗，37℃温和摇动1h，弃一抗，PBST洗膜2次，再加入10ml1:5000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗，37℃孵育1h，PBST洗膜3次，DAB显色。结果见图8，空载体pET28a(+)转化菌株BL21的IPTG诱导产物与RA血清无特异性的反应条带，而含重组表达质粒pET28a-tD15的BL21工程菌所表达的重组tD15/His-tag融合蛋白与RA血清有特异性的反应条带。
6、重组tD15/His-tag融合蛋白的大量制备、纯化与复性
取含重组表达质粒pET28a-tD15的BL21工程菌，接种于含Kan的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，次日取菌液按体积比1:50转接种于含Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.4时，加入IPTG至终浓度为0.6mmol/L，37℃诱导培养4h；取诱导表达的菌液500mL，4℃、10000r/min离心10min，菌体沉淀用40mL20mmol Tris-HCl(pH8.0)悬浮，置-20℃过夜后，加溶菌酶至终浓度为1mg/mL，4℃搅拌30min，超声波(冰浴)间歇破碎菌体(200w，30sec/次，5～10次)，4℃、10000r/min离心10min，沉淀用20mL洗液(10mmol/LPBS+2mol/L尿素+0.2％Triton X-100)悬浮，4℃、10000r/min离心10min，沉淀用尿素溶液(10mmol/L PBS+8mol/L尿素)溶解，4℃保存备用。
根据重组tD15/His-tag融合蛋白中His-tag对镍离子的特殊亲和作用，将前述沉淀的尿素溶液进行镍琼脂糖凝胶(Ni2+-NAT)亲和层析纯化。具体操作步骤为：用镍琼脂糖凝胶装柱，柱床体积约为40mL；用平衡缓冲液Ⅰ约5个柱床体积平衡层析柱，流速为1mL/min；将前述沉淀的尿素溶液约5mL加入层析柱中，流速为0.5mL/min；用平衡缓冲液Ⅱ洗2-5个柱床体积，流速为1mL/min；分别用含50、300、500mmol咪唑的洗脱缓冲液进行梯度洗脱，流速为1mL/min，收集各梯度洗脱峰，用SDS-PAGE检测蛋白的分子量大小和纯度。结果如图8所示，300mmol咪唑洗脱峰中含有大量高纯度的重组tD15/His-tag融合蛋白。
将纯化的重组tD15/His-tag融合蛋白进行透析复性，用Bradford法测定蛋白浓度，稀释至1mg/mL，分装备用。
实施例2、RA表面抗原D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂的制备与质量鉴定
RA表面抗原D15截短重组蛋白可以作为抗原制备致敏乳胶试剂，再通过乳胶凝集试验检测RA抗体。
1、乳胶凝集试验方法及结果判定
在一块洁净的凹载玻片上滴1滴(约20μL)待检样品溶液，再加1滴(约20μL)致敏乳胶试剂，搅拌混匀，摇动玻片使形成直径为1.5～2.0cm的液面，3～5min内置黑色背景下肉眼观察，同时设置阳性对照和阴性对照。++++为100％乳胶凝集，颗粒较大并聚集在液滴边缘，液体完全透明；+++为75％乳胶凝集，颗粒明显，液体稍有混浊；++为50％乳胶凝集，颗粒较细，液体较混浊；+为少许乳胶凝集，液体混浊；－为不凝集，液滴成原有的均匀乳状；最终以出现++以上者判为阳性。
2、致敏乳胶试剂的制备
取0.5mL10％乳胶原液(乳胶直径0.8μm)于1.5mL离心管中，用1mL0.1mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液离心洗涤3次(每次14000g离心6min)，再用1mL0.01mol/L、pH7.4的PBS同法离心洗涤3次，然后用0.625mL0.01mol/L、pH7.4的PBS重悬，转移至2.5mL离心管中，逐滴加入0.625mL2％EDAC(以PBS为溶剂)，置水平摇床37℃低速作用不同时间后，14000g离心6min，弃上清，沉淀用1mL0.01mol/L、pH8.0的BBS离心洗涤3次(每次14000g离心6min)后，用相同BBS重悬至不同浓度，再加入等体积不同浓度的重组tD15/His-tag融合蛋白溶液，置水平摇床37℃低速作用不同时间后，加入0.05mL0.1mol/L甘氨酸(以BBS为溶剂)终止反应，最后14000g离心10min，收集上清进行蛋白测定，沉淀用1mL不同浓度的BSA溶液(以BBS为溶剂)封闭后，悬浮于0.5mL储存液(0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液+5vol％甘油+0.01％BSA+0.1％叠氮钠)中，即得重组tD15/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂。
(1)羧化乳胶最佳偶联浓度的选择
将与EDAC作用后的羧化乳胶用BBS重悬至不同浓度(3％、2％、1％、0.5％、0.1％)后与重组tD15/His-tag融合蛋白偶联，按前述方法制备重组tD15/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂。再以该致敏乳胶试剂与RA阳性血清进行乳胶凝集试验，通过测定偶联效率和观察凝集效果选择羧化乳胶最佳偶联浓度。偶联效率通过偶联反应前后溶液中的蛋白浓度变化求得，即偶联效率＝(初始蛋白浓度-离心上清中蛋白浓度)/初始蛋白浓度×100％。结果如表1和图10所示，当羧化乳胶浓度为1％时，与重组tD15/His-tag融合蛋白的偶联效率最高，凝集效果最好。
表1羧化乳胶最佳偶联浓度的选择
羧化乳胶浓度(％) 是否自凝 偶联效率(％) 凝集程度
3.0 是 92.10 -
2.0 否 92.05 +++
1.0 否 92.21 +++
0.5 否 92.14 ++
0.1 否 92.11 -
(2)RA表面抗原D15截短重组蛋白最佳偶联浓度的选择
将与EDAC作用后的羧化乳胶与不同浓度(0.9、0.45、0.225、0.1125、0.05625、0.028mg/mL)的重组tD15/His-tag融合蛋白偶联，按前述方法制备重组tD15/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂，再以该致敏乳胶试剂与RA阳性血清进行乳胶凝集试验，通过测定偶联效率和观察凝集效果选择RA表面抗原D15截短重组蛋白最佳偶联浓度。结果如表2和图11所示，当RA表面抗原D15截短重组蛋白浓度为0.225mg/mL时，与羧化乳胶的偶联效率较高，凝集效果最好。
表2RA表面抗原D15截短重组蛋白最佳偶联浓度的选择
序号 初始蛋白浓度(mg/mL) 偶联后上清蛋白浓度(mg/mL) 偶联效率(％) 是否自凝 凝集程度
1 0.9 0.047 94.78 是 ++++
2 0.45 0.020 95.56 是 +++
3 0.225 0.018 92.00 否 +++
4 0.1125 0.017 84.89 否 ++
5 0.05625 0.009 84.00 否 +
6 0.028 0.008 71.43 否 -
(3)封闭液最佳浓度的选择
将偶联反应终止后离心得到的沉淀用不同浓度(0％、0.01％、0.1％、1％)的BSA溶液封闭，按前述方法制备重组tD15/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂，再以该致敏乳胶试剂与RA阳性血清进行乳胶凝集试验，通过观察凝集效果选择封闭液最佳浓度。结果如图12所示，当BSA溶液的浓度为1％时，凝集效果最好。
(4)最佳偶联时间的选择
将与EDAC作用后的羧化乳胶用BBS重悬，加入重组tD15/His-tag融合蛋白溶液，置水平摇床37℃低速作用不同时间，按前述方法制备重组tD15/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂，再以该致敏乳胶试剂与RA阳性血清进行乳胶凝集试验，通过测定偶联效率和观察凝集效果选择最佳偶联时间。结果如表3和图13所示，当偶联时间为6h时，偶联效率较高，凝集效果最好。
表3最佳偶联时间的选择
偶联时间(h) 偶联效率(％) 凝集程度
2 87.4 ++
4 87.9 ++
6 92.3 ++++
8 94.1 +++
10 95.2 ++
12 92.9 ++
2、致敏乳胶试剂的质量鉴定
(1)自凝性
将采用前述最佳条件制备的重组tD15/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂，分别与PBS、BBS、生理盐水进行乳胶凝集试验，观察致敏乳胶试剂是否发生自凝。结果显示，重组tD15/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂与PBS、BBS、生理盐水反应均呈阴性，即不发生自凝。
(2)特异性
将采用前述最佳条件制备的重组tD15/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂分别与9种阳性血清(RA阳性血清、RA CH-1株鸭阳性血清、RA ATCC11845株鸭阳性血清、鸭传染性肿头症阳性血清、鸭病毒性肝炎阳性血清、鸭流行性感冒阳性血清、鸭大肠杆菌病阳性血清、鸭沙门氏菌病阳性血清、鸭病毒性肠炎阳性血清)进行乳胶凝集试验，考察致敏乳胶试剂的特异性。结果显示，重组tD15/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂与RA阳性血清、RA CH-1株鸭阳性血清、RA ATCC11845株鸭阳性血清均产生明显的凝集，而与鸭传染性肿头症阳性血清、鸭病毒性肝炎阳性血清、鸭流行性感冒阳性血清、鸭大肠杆菌病阳性血清、鸭沙门氏菌病阳性血清、鸭病毒性肠炎阳性血清均不发生凝集，说明重组tD15/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂具有良好的特异性。
(3)重复性
将采用前述最佳条件制备的同一批次的重组tD15/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂于4℃保存，每隔1个月与RA阳性血清进行乳胶凝集试验，考察重组tD15/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂的批内重复性；将采用前述最佳条件制备的不同批次的重组tD15/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂，分别与抗重组tD15/His-tag融合蛋白鸭阳性血清、RA CH-1株鸭阳性血清、RAATCC11845株鸭阳性血清进行乳胶凝集试验，考察重组tD15/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂的批间重复性。结果显示，同一批次制备的重组tD15/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂在3个月内均与RA阳性血清保持很好的凝集；而3批不同批次制备的重组tD15/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂与抗重组tD15/His-tag融合蛋白鸭阳性血清、RA CH-1株鸭阳性血清、RA ATCC11845株鸭阳性血清均产生明显的凝集(图14)；说明重组tD15/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂具有良好的重复性。
(4)敏感性
将RA阳性血清分别按1:2、1:4、1:8、1:16、l:64、1:128、1:256、1:512进行体积倍比稀释，再与采用前述最佳条件制备的重组tD15/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂进行乳胶凝集试验，考察重组tD15/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂的敏感性。结果显示，重组tD15/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂最低可检测到的RA阳性血清的稀释倍数为1:256，说明重组tD15/His-tag融合蛋白致敏乳胶试剂具有良好的敏感性。
3、乳胶凝集试验与ELISA法的对比
取血清1型和6型的RA阳性血清各5份，分别用本发明的致敏乳胶试剂进行乳胶凝集试验检测和ELISA法检测，观察不同方法检测结果的符合率。结果10份RA阳性血清用本发明的致敏乳胶试剂进行乳胶凝集试验检测显示8份为阳性，2份为阴性，而用ELISA法检测显示10份均为阳性，即两种方法的阳性血清检出符合率为80％。
上述优选实施例中将RA表面抗原D15截短重组蛋白设计为与His-tag融合表达的形式，主要是便于蛋白纯化，且本领域认为，标签蛋白通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能和性质，当然不采取上述融合表达形式同样可以达到本发明目的。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.鸭疫里默氏杆菌表面抗原 D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂，其特征在于，为表面包被有鸭疫里默氏杆菌表面抗原 D15截短重组蛋白的乳胶颗粒，所述鸭疫里默氏杆菌表面抗原 D15截短重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌表面抗原 D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂的制备方法，其特征在于，是利用水溶性碳二亚胺将鸭疫里默氏杆菌表面抗原 D15截短重组蛋白偶联到羧化乳胶颗粒的表面而得。
3. 如权利要求2所述的鸭疫里默氏杆菌表面抗原 D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：取10 wt%乳胶原液，用0.1mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液离心洗涤，再用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液离心洗涤并重悬，加入2 wt%EDAC溶液，37℃振摇反应使乳胶颗粒表面的羧基活化，离心弃上清，沉淀用0.01mol/L、pH8.0的硼酸盐缓冲液离心洗涤并重悬至浓度为0.5~2 wt%，再加入等体积0.1125~0.225mg/mL的鸭疫里默氏杆菌表面抗原 D15截短重组蛋白溶液，37℃振摇反应2~12小时使羧化乳胶与鸭疫里默氏杆菌表面抗原 D15截短重组蛋白偶联，加入0.1mol/L甘氨酸终止反应，离心弃上清，沉淀用1 wt%牛血清白蛋白溶液封闭后，悬浮于含有稳定剂、封闭剂和防腐剂的缓冲液中，即得鸭疫里默氏杆菌表面抗原 D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂。
4. 如权利要求3所述的鸭疫里默氏杆菌表面抗原 D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：取10 wt%乳胶原液，用0.1mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液离心洗涤，再用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐离心洗涤并重悬，加入2 wt%EDAC溶液，37℃振摇反应使乳胶颗粒表面的羧基活化，离心弃上清，沉淀用0.01mol/L、pH8.0的硼酸盐缓冲液离心洗涤并重悬至浓度为1 wt%，再加入等体积0.225mg/mL的鸭疫里默氏杆菌表面抗原 D15截短重组蛋白溶液，37℃振摇反应6小时使羧化乳胶与鸭疫里默氏杆菌表面抗原 D15截短重组蛋白偶联，加入0.1mol/L甘氨酸终止反应，离心弃上清，沉淀用1 wt%牛血清白蛋白溶液封闭后，悬浮于含有5 vol%甘油、1 wt%牛血清白蛋白和0.1 wt%叠氮钠的0.01M、pH7.4的磷酸盐缓冲液中，即得鸭疫里默氏杆菌表面抗原 D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂。
5.如权利要求2至4任一项所述的鸭疫里默氏杆菌表面抗原 D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂的制备方法，其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌表面抗原 D15截短重组蛋白采用以下方法制备：将核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的鸭疫里默氏杆菌表面抗原 D15截短重组蛋白的编码基因克隆入原核表达质粒pET28a(+)中得到重组表达载体，将该重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中得到工程菌，将该工程菌接种于含卡那霉素即Kan的LB液体培养基中，37℃培养过夜，次日取菌液按体积比1:50接入含Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600=0.4，加入IPTG至终浓度为0.6 mmol/L，37℃诱导培养4小时，收集菌液，离心，沉淀用20mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液悬浮，置-20℃过夜后，加溶菌酶至终浓度为1mg/mL，4℃搅拌30分钟，冰浴条件下超声波间歇破碎菌体，离心，沉淀用洗液离心洗涤后，用尿素溶液溶解，进行镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化，以含有300mmol咪唑的洗脱缓冲液为洗脱剂，收集蛋白洗脱液，透析复性，获得携带组氨酸标签的鸭疫里默氏杆菌表面抗原 D15截短重组蛋白。
6.权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌表面抗原 D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂在制备鸭疫里默氏杆菌抗体检测试剂中的应用。
7.鸭疫里默氏杆菌抗体乳胶凝集检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌表面抗原 D15截短重组蛋白致敏乳胶试剂。
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