CN103923193B - 鸭疫里默氏杆菌表面抗原d15截短重组蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

鸭疫里默氏杆菌表面抗原d15截短重组蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的鸭疫里默氏杆菌(RA)表面抗原D15截短重组蛋白，其编码基因、重组表达载体、工程菌、利用工程菌制备该截短重组蛋白的方法；该截短重组蛋白具有与天然D15蛋白相似的免疫反应活性，能够与RA抗体特异性结合，与其它6种常见毒株或菌株阳性血清不产生交叉反应，可作为检测RA全菌抗体的检测抗原应用，且由于该截短重组蛋白非全细菌，用其进行检测时无散毒危险；此外，该截短重组蛋白的制备方法简单，适于工业化大规模生产，能够实现产品的标准化，利于不同实验室之间的结果比较。

Description

鸭疫里默氏杆菌表面抗原D15截短重组蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种截短重组蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
鸭疫里默氏杆菌(Riemerella Anatipestifer,RA)病是一种主要侵害鸭、火鸡和多种其它鸟类的接触性传染疾病，又称为新鸭病、鸭疫综合症、鸭疫巴氏杆菌病和鸭传染性浆膜炎等，是目前危害养鸭业的主要传染病之一。该病呈急性或慢性败血症过程，病理变化主要是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、干酪性输卵管炎等。1-8周龄鸭高度敏感，恶劣的环境条件或并发感染更易引起该病的发生和流行，死亡率高。耐过鸭常生长不良，增重缓慢，失去饲养价值，而且该病在发病场能持续存在，引起不同批次的鸭感染发病，难于根治，给养鸭业造成严重的经济损失。
除药物防治以外，目前已成功研制出弱毒疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗来控制RA病。因用药物防治易造成菌株的耐药性，鸭群反复发病，难于根治，而用疫苗来免疫接种，可以获得较好的预防效果。由于RA的血清型多而复杂，国际公认有21个血清型，我国也存在10多个血清型，且各血清型之间缺乏有效的交叉免疫保护，这给RA的疫苗防治带来一定困难。比较有效的方法是针对当地主要流行血清型，选取相应菌株研制疫苗，以达到更有效的防治效果。
外膜蛋白(OMPs)是革兰阴性菌特有的一种结构蛋白，很多革兰阴性菌的OMPs具有良好的免疫原性，是亚单位疫苗的候选组成部分，是目前的研究热点。RA的D15蛋白与副猪嗜血杆菌和流感嗜血杆菌外膜蛋白D15一样，均属于Omp85家族。Omp85为暴露于细菌表面且相对保守的外膜蛋白，为其他外膜蛋白的定位和折叠于外膜所必需；除细菌外膜外，Omp85在真核生物线粒体和叶绿体的外膜中也存在。Omp85家族蛋白在结构上具有两个重要特征：氨基酸序列N端位于周质区，富含多肽转运相关区域片段(polypeptide transport-associated domain,POTRA)；而其C端的β桶状区域则包埋于外膜中。多杀性巴氏杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、杜克雷嗜血杆菌、痢疾杆菌等细菌均有属于Omp85家族的外膜蛋白，并且在氨基酸序列上具有较高的相似性。近十年来，属于Omp85家族的多种细菌外膜蛋白被确认与致病机理和免疫性相关。
对RA抗体的检测是评价RA疫苗免疫效果及制定合理的免疫程序的关键。酶联免疫吸 附测定(ELISA)可用于检测血清中RA抗体。例如，Hatfield(1987)建立ELISA用于检测鸭血清中RA抗体，其抗原为II型RA。程安春等(2004)应用超声波裂解法制备的血清4型RA裂解物作为抗原包被酶标板，成功建立了4型RA抗体检测的间接ELISA法。Huang等(2002)采用RA潜在抗原P45的N末段片段重组蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA法，在用RA血清1、10、15、19型和标准株ATCC11845免疫的血清中能够检测出P45抗体，对免疫过RA的鸭和没有免疫过的鸭也能区分，同时与免疫过其它几种革兰氏阴性和阳性菌的血清不发生交叉反应。因此，研制一种新型抗原，对建立特异敏感的RA抗体检测方法进而防控RA十分重要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种RA表面抗原D15截短重组蛋白，其具有与天然D15蛋白相似的免疫反应活性，能够与RA抗体特异性结合；目的之二在于提供该D15截短重组蛋白的制备方法；目的之三在于提供该D15截短重组蛋白在制备检测试剂中的应用。
经研究，本发明提供如下技术方案：
1.RA表面抗原D15截短重组蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.RA表面抗原D15截短重组蛋白的编码基因。
进一步，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.含有所述编码基因的重组表达载体。
进一步，所述重组表达载体是将核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的RA表面抗原D15截短重组蛋白的编码基因克隆入原核表达质粒pET28a(+)中而得到。
4.含有所述重组表达载体的工程菌。
进一步，所述工程菌是将重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中而得到，所述重组表达载体是将核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的RA表面抗原D15截短重组蛋白的编码基因克隆入原核表达质粒pET28a(+)中而得到。
5.利用所述工程菌制备RA表面抗原D15截短重组蛋白的方法，包括以下步骤：将工程菌接种于含卡那霉素即Kan的LB液体培养基中，37℃培养过夜，次日取菌液按体积比1:50接入含Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.4，加入IPTG至终浓度为0.6mmol，37℃诱导培养4小时，收集菌液，离心，沉淀用20mmol pH8.0的Tris-HCl缓冲液悬浮，置-20℃过夜后，加溶菌酶至终浓度为1mg/mL，4℃搅拌30分钟，冰浴条件下超声波间歇破碎菌体，离心，沉淀用洗液离心洗涤后，用尿素溶液溶解，进行镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化，以含有300mmol咪唑的洗脱缓冲液为洗脱剂，收集洗脱液，透析复性，获得携带组氨酸标签(His-tag) 的RA表面抗原D15截短重组蛋白。
6.RA表面抗原D15截短重组蛋白在制备鸭疫里默氏杆菌抗体检测试剂中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明选取RA表面抗原D15基因编码蛋白的主要抗原域(94aa-384aa)，利用原核表达系统，成功制得了RA表面抗原D15截短重组蛋白，该截短重组蛋白具有与天然D15蛋白相似的免疫反应活性，能够与RA抗体特异性结合，而与鸭瘟病毒(DPV)阳性血清、鸭病毒性肝炎(DHV)阳性血清、禽流感病毒(AIV)阳性血清，鸭传染性肿头症(DSHS)阳性血清、鸭沙门氏菌(SB)阳性血清、鸭大肠杆菌(E.coli)阳性血清等不产生交叉反应，可作为检测RA全菌抗体的检测抗原应用，且由于该截短重组蛋白非全细菌，应用其进行检测时无散毒危险；此外，该截短重组蛋白的制备方法简单，适于工业化大规模生产，能够实现产品的标准化，利于不同实验室之间的结果比较。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为D15截短基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中1为D15截短基因PCR产物，M为DNA Marker。
图2为重组质粒pJET1.2-tD15的琼脂糖凝胶电泳图；其中M为DNA Marker，1为pJET1.2-tD15用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的产物，2为PCR产物。
图3为重组表达质粒pET28a-tD15的酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中M为DNAMarker，1为pET28a-tD15用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的产物。
图4为重组表达质粒pET28a-tD15转化菌株表达的RA表面抗原D15截短重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中1为用IPTG诱导的pET-28a-tD15转化菌株BL21经超声破碎后收集的上清；2为用IPTG诱导的pET-28a-tD15转化菌株BL21经超声破碎后收集的沉淀；3为用IPTG诱导的pET-28a-tD15转化菌株Rosetta经超声破碎后收集的上清；4为用IPTG诱导的pET-28a-tD15转化菌株Rosetta经超声破碎后收集的沉淀；5为用IPTG诱导的pET-28a-tD15转化菌株PlysS经超声破碎后收集的上清；6为用IPTG诱导的pET-28a-tD15转化菌株PlysS经超声破碎后收集的沉淀；7为蛋白质Marker；8为空载体pET28a(+)转化菌株BL21未用IPTG诱导；9为用IPTG诱导的空载体pET28a(+)转化菌株BL21经超声破碎后收集的上清；10为用IPTG诱导的空载体pET28a(+)转化菌株BL21经超声破碎后收集的沉淀。
图5为不同IPTG浓度下pET28a-tD15转化菌株BL21表达RA表面抗原D15截短重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中M为蛋白质Marker，1-6的IPTG终浓度依次为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mmol/L。
图6为不同诱导温度下pET28a-tD15转化菌株BL21表达RA表面抗原D15截短重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中M为蛋白质Marker，1-3的诱导温度依次为37、30、25℃。
图7为不同诱导时间下pET28a-tD15转化菌株BL21表达RA表面抗原D15截短重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中M为蛋白质Marker，1-6依次为诱导6、5、4、3、2、0小时。
图8为Western blot检测RA表面抗原D15截短重组蛋白的特异性，其中1为RA表面抗原D15截短重组蛋白，2为空载体pET-28a(+)的IPTG诱导产物，M为蛋白质Marker。
图9为镍琼脂糖凝胶(Ni2+-NAT)亲和层析纯化RA表面抗原D15截短重组蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白质Marker，1为纯化前的蛋白，2为纯化后的RA表面抗原D15截短重组蛋白。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照试剂制造厂商所建议的条件进行。
主要材料：质粒pJET1.2-T购自加拿大富酶泰斯(fermentas)公司；质粒pET28a(+)为Novagen公司产品；克隆宿主菌E.coli DH5α、表达宿主菌E.coli BL21(DE3)和鸭疫里默氏杆菌RA CH-1株(血清1型)由四川农业大学禽病研究中心提供。
实施例1、RA表面抗原D15截短重组蛋白的制备
本发明拟制备的RA表面抗原D15截短重组蛋白(命名为tD15)的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示(即登录号为AFR36094.1的RA D15第94位至第384位氨基酸序列)，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示(即登录号为CP003787的RA D15基因第280位至第1152位核苷酸序列)。
1、tD15基因的克隆
根据tD15基因序列设计引物，上游引物RA tD15-F：5’-CGGATCCACAGAATATATGA-CCTACCCTAAC-3’(SEQ ID NO.3，划线部分为BamH Ⅰ位点)；下游引物RA tD15-R：5’-CCAAGCTTGGCGCCTATACATCTAAAATAC-3’(SEQ ID NO.4，划线部分为HindⅢ位点)。
提取RA基因组DNA：将RA CH-1株接种于含5％牛血清的胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)平板培养基中，37℃恒温培养过夜，挑单个菌落于含5％牛血清TSB液体培养基中，37℃剧烈振荡培养12h，取l-3mL培养液，5000g离心l0min，弃上清，沉淀加入567μL TE，反复吹打，再加入30μL10％SDS和3μL20mg/mL蛋白酶K溶液，混匀，37℃水浴lh，再加入100μL 5M NaCl，混匀，65℃水浴l0min，再加入等体积氯仿/异戊醇，混匀，12000r/min离心5min，上清再加入等体积酚/氯仿/异戊醇，混匀，12000r/min离心5min，上清再加入0.6倍体积异丙醇，轻轻混匀，沉淀DNA30min，12000r/min离心15min，弃上清，用lmL75％乙醇洗涤DNA，12000r/min离心5min，弃上清，37℃干燥后，用50μL TE溶解，-20℃保存备用。
以RA基因组DNA为模板，采用前述上、下游引物PCR扩增tD15基因。PCR反应体系为：ddH2O7μL，2×PCR mastermix10μL，模板DNA1μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，总体积为20μL。PCR反应参数为：首先95℃5min，然后94℃50s、58.4℃1min、72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。取PCR产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示，获得了一条约873bp的特异性DNA条带，与目标DNA片段大小相符。将PCR产物用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行切胶回收纯化。
将纯化的PCR产物在T4DNA连接酶的作用下与质粒pJET1.2-T连接，连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，抽提质粒，获得重组质粒pJET1.2-tD15。对重组质粒pJET1.2-tD15进行BamHⅠ/HindⅢ双酶切鉴定，结果如图2所示，pJET1.2-tD15用BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切得到三条DNA片段，其中一条DNA片段与873bp的目的DNA片段大小相符，另一DNA小片段与pJET1.2-tD15上另一个HindⅢ位点酶切下来的片段大小相符。将酶切鉴定正确的重组质粒pJET1.2-tD15送上海英骏生物有限公司进行测序，结果显示，T克隆所得的RA tD15基因序列如SEQ ID NO.2所示，与目标序列完全一致。
2、重组表达质粒的构建
用BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切重组质粒pJET1.2-tD15，回收目的DNA片段，与经相同酶切的原核表达载体pET28a(+)连接，连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，抽提质粒，获得重组表达质粒pET28a-tD15。对重组表达质粒pET28a-tD15进行BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切鉴定，结果如图3所示，pET28a-tD15经BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切后得到两条DNA片段，其中DNA小片段与873bp的目的DNA片段大小相符。
3、重组表达工程菌的构建
挑取含重组表达质粒pET28a-tD15的DH5α大肠杆菌，划线接种于含Kan的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，次日取单个菌落接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养10～16小时，离心收集菌液，抽提质粒，转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，获得含重组表达质粒pET28a-tD15的BL21工程菌。
同法，将重组表达质粒pET28a-tD15分别转化表达宿主菌E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞与E.coli BL21(DE3)plys感受态细胞，获得含重组表达质粒pET28a-tD15的Rosetta工程菌与 含重组表达质粒pET28a-tD15的PlysS工程菌。
4、重组表达工程菌的诱导表达
取含重组表达质粒pET28a-tD15的工程菌，同时设置空载体pET28a(+)转化菌株为对照，接种于含Kan的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，次日取菌液按体积比1:50转接种于含Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.4时，加入IPTG诱导培养，收集培养菌液，4℃、13000r/min离心5min，弃上清，菌体沉淀用20mL20mmol Tris-HCl(pH8.0)悬浮，置-20℃过夜后，加溶菌酶至终浓度为1mg/mL，4℃搅拌30min，超声波(冰浴)间歇破碎菌体(600w，30sec/次，10次)，4℃、10000r/min离心10min，取上清备用；沉淀用10mL洗液(10mmol/L PBS+2mol/L尿素+0.2％Triton X-100)于4℃、10000r/min离心洗涤10min，重复洗涤三次后，用尿素溶液(10mmol/L PBS+8mol/L尿素)溶解备用。分别取前述备用的上清和用尿素溶液溶解的沉淀，加入40μL超纯水和10μL10×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性10min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色。结果如图4所示，空载体pET28a(+)转化菌株BL21未用IPTG诱导时没有特异性蛋白条带出现，用IPTG诱导后也没有特异性蛋白条带出现，说明载体本身很小(可忽略不计)；pET28a-tD15转化菌株Rosetta用IPTG诱导后也没有特异性蛋白条带出现，而pET28a-tD15转化菌株BL21与pET28a-tD15转化菌株PlysS用IPTG诱导后均在约34kDa处出现一条特异性蛋白条带，与重组tD15/His-tag融合蛋白大小相符(由于pET28a(+)载体在多克隆位点的N端有6个His-tag，因此pET28a-tD15的表达产物实际为tD15与His-tag的融合蛋白)，其中pET28a-tD15转化菌株BL21的重组tD15/His-tag融合蛋白表达量较高，说明E.coli BL21(DE3)为优选的表达宿主菌；此外，由于重组tD15/His-tag融合蛋白主要存在于经超声波破碎后收集的沉淀中，说明重组tD15/His-tag融合蛋白在菌体中是以不溶的包涵体形式存在。
IPTG浓度优化：取含重组表达质粒pET28a-tD15的BL21工程菌，接种于含Kan的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，次日取菌液按体积比1:50转接种于含Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.4时，加入IPTG至不同终浓度(分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mmol/L)，37℃诱导培养4h，收集1mL培养菌液，4℃、13000r/min离心2min，弃上清，沉淀加入40μL超纯水和10μL10×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性10min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳。结果如图5所示，随IPTG浓度的增高，重组tD15/His-tag融合蛋白的诱导量有明显变化，其中用0.6mmol/L IPTG诱导时表达量最高，因此优选0.6mmol/L作为IPTG诱导表达浓度。
诱导温度优化：取含重组表达质粒pET28a-tD15的BL21工程菌，接种于含Kan的LB 液体培养基中，37℃振摇培养过夜，次日取菌液按体积比1:50转接种于含Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.4时，加入IPTG至终浓度为0.6mmol/L，不同温度(分别为25、30、37℃)诱导培养4h，收集1mL培养菌液，4℃、13000r/min离心2min，弃上清，沉淀加入40μL超纯水和10μL10×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性10min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳。结果如图6所示，重组tD15/His-tag融合蛋白的表达量在诱导温度为25℃时较少，在诱导温度为30℃和37℃时较高，因此，按照本领域通常的培养习惯，优选37℃作为诱导温度。
诱导时间优化：取含重组表达质粒pET28a-tD15的BL21工程菌，接种于含Kan的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，次日取菌液按体积比1:50转接种于含Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.4时，加入IPTG至终浓度为0.6mmol/L，37℃诱导培养不同时间(分别为0h、2h、3h、4h、5h、6h)，收集1mL培养菌液，4℃、13000r/min离心2min，弃上清，沉淀加入40μL超纯水和10μL10×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性10min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳。结果如图7所示，诱导培养4h即有大量的重组tD15/His-tag融合蛋白表达，继续增加诱导时间，蛋白表达量变化不大，因此优选4h作为诱导时间。
5、重组tD15/His-tag融合蛋白的Western-blot鉴定
取含重组表达质粒pET28a-tD15的BL21工程菌的IPTG诱导培养菌液，同时设置空载体pET28a(+)转化菌株BL21的IPTG诱导培养菌液为对照，4℃、13000r/min离心，弃上清，沉淀加入40μL超纯水和10μL10×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性10min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后将蛋白质样品从PAGE凝胶中转移至PVDF膜上，加入12ml3％BSA转膜缓冲液于36℃轻摇2h进行膜封闭，PBST洗膜3次，再加入0.5％BSA/PBST稀释的兔抗RA(血清1型)血清作为一抗，37℃温和摇动1h，弃一抗，PBST洗膜2次，再加入10ml1:5000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗，37℃孵育1h，PBST洗膜3次，DAB显色。结果见图8，空载体pET28a(+)转化菌株BL21的IPTG诱导产物与RA血清无特异性的反应条带，而含重组表达质粒pET28a-tD15的BL21工程菌所表达的重组tD15/His-tag融合蛋白与RA血清有特异性的反应条带。
6、重组tD15/His-tag融合蛋白的大量制备、纯化与复性
取含重组表达质粒pET28a-tD15的BL21工程菌，接种于含Kan的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，次日取菌液按体积比1:50转接种于含Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.4时，加入IPTG至终浓度为0.6mmol/L，37℃诱导培养4h；取诱导表达的菌液500mL，4℃、10000r/min离心10min，菌体沉淀用40mL20mmol Tris-HCl(pH8.0)悬 浮，置-20℃过夜后，加溶菌酶至终浓度为1mg/mL，4℃搅拌30min，超声波(冰浴)间歇破碎菌体(200w，30sec/次，5～10次)，4℃、10000r/min离心10min，沉淀用20mL洗液(10mmol/LPBS+2mol/L尿素+0.2％Triton X-100)悬浮，4℃、10000r/min离心10min，沉淀用尿素溶液(10mmol/L PBS+8mol/L尿素)溶解，4℃保存备用。
根据重组tD15/His-tag融合蛋白中His-tag对镍离子的特殊亲和作用，将前述沉淀的尿素溶液进行镍琼脂糖凝胶(Ni2+-NAT)亲和层析纯化。具体操作步骤为：用镍琼脂糖凝胶装柱，柱床体积约为40mL；用平衡缓冲液Ⅰ约5个柱床体积平衡层析柱，流速为1mL/min；将前述沉淀的尿素溶液约5mL加入层析柱中，流速为0.5mL/min；用平衡缓冲液Ⅱ洗2-5个柱床体积，流速为1mL/min；分别用含50、300、500mmol咪唑的洗脱缓冲液进行梯度洗脱，流速为1mL/min，收集各梯度洗脱峰，用SDS-PAGE检测蛋白的分子量大小和纯度。结果如图9所示，300mmol咪唑洗脱峰中含有大量高纯度的重组tD15/His-tag融合蛋白。
将纯化的重组tD15/His-tag融合蛋白进行透析复性，用Bradford法测定蛋白浓度，稀释至1mg/mL，分装备用。 
实施例2、RA表面抗原D15截短重组蛋白在制备RA抗体检测试剂中的应用
RA表面抗原D15截短重组蛋白可以作为包被抗原，通过间接ELISA法检测RA抗体。
1、间接ELISA法
将纯化的重组tD15/His-tag融合蛋白用包被液稀释后加入酶标板中，l00μL/孔，4℃包被过夜；弃液体，洗涤三次，每孔加入200μL封闭液，37℃封闭30min；弃液体，洗涤三次，每孔加入l00μL用抗体稀释液稀释的待检血清，37℃孵育30分钟；弃液体，洗涤三次，每孔加入100μL稀释的羊抗鸭IgG-HRP酶标二抗(购自美国KPL公司)，37℃孵育30分钟；弃液体，洗涤三次，每孔加入100μL四甲基联苯胺(TMB)，避光显色10分钟，再每孔加入50μL终止液，轻拍混匀，用酶标仪测定OD450值。
2、抗原最佳包被浓度及抗体最适稀释倍数的确定
将纯化的重组tD15/His-tag融合蛋白用包被液倍比稀释后包被酶标板，100μL/孔；将RA阳性血清(血清1型RA的鸭血清)和阴性血清分别用抗体稀释液倍比稀释(体积比1:40、1:80、1:160、1:320、1:640)后加入酶标板，100μL/孔；其余按前述间接ELISA法操作，以方阵法进行试验，选择P/N(阳性血清OD450值/阴性血清OD450值)最大，且P在1.0左右的抗原包被浓度和血清稀释倍数作为抗原最佳包被浓度和抗体最适稀释倍数。
结果如表1和表2所示，当抗原包被浓度为0.625μg/mL，血清稀释体积倍数为1:160时， RA阳性血清OD450值为0.748，RA阴性血清OD450值为0.196，P/N值最大(3.829)。因此，抗体捕获剂最佳包被浓度为0.625ug/mL，抗体最适体积稀释倍数为1:160。
表1RA阳性血清检测结果
表2RA阴性血清检测结果
3、酶标抗体最佳工作浓度的确定
将提纯的鸭IgG用包被液稀释至100μg/mL后加入酶标板中，l00μL/孔，4℃包被过夜；将羊抗鸭IgG-HRP酶标二抗倍比稀释(体积比1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400)后加入酶标板，100μL/孔；其余按前述间接ELISA法操作，每个稀释度重复测定3次，取平均值。
结果如表3所示，当羊抗鸭IgG-HRP酶标二抗的稀释体积倍数为1:800时，平均OD450值最接近1.0，因此，酶标抗体最佳体积稀释倍数为1:800。
表3酶标抗体最佳工作浓度的确定
4、阴阳性临界值判定标准的确定
取30份RA阴性血清，按前述间接ELISA法进行检测。将30份阴性样品的平均OD450值和3倍标准方差之和(X+3SD)作为阴性样品值的上限，则待检血清样品的OD450值大于该上限时判定为阳性，反之为阴性。
结果如表4所示，30份阴性样品的平均OD450值为0.149，SD值为0.034，阴性样品值的上限X+3SD＝0.149+3×0.034＝0.252，因此，当待检血清样品的OD450值大于0.252时判定为阳性，小于或等于0.252时判定为阴性。
表4RA阴性血清检测结果
编号 OD450 编号 OD450 编号 OD450 编号 OD450
1 0.204 9 0.109 17 0.192 25 0.213
2 0.171 10 0.077 18 0.103 26 0.202
3 0.125 11 0.123 19 0.152 27 0.189
4 0.14 12 0.186 20 0.142 28 0.179
5 0.121 13 0.171 21 0.135 29 0.151
678 0.1360.1160.098 141516 0.1520.1490.131 222324 0.1560.1160.179 30 0.154
5、特异性试验 
以纯化的重组tD15/His-tag融合蛋白作为包被抗原，采用前述优化后的间接ELISA法分别检测鸭瘟病毒(DPV)阳性血清、鸭病毒性肝炎(DHV)阳性血清、禽流感病毒(AIV)阳性血清，鸭传染性肿头症(DSHS)阳性血清、鸭沙门氏菌(SB)阳性血清、鸭大肠杆菌(E.coli)阳性血清、血清1型鸭疫里默式杆菌(RA-CH-1)阳性血清、血清6型鸭疫里默式杆菌(ATCC11845株)阳性血清，考察方法的特异性。
结果如表5所示，2种RA阳性血清样品的OD450值均大于0.252，表明本发明的重组tD15/His-tag融合蛋白及以其为抗原建立的RA抗体间接ELISA检测法至少可以用于血清1型和6型RA的抗体检测；而除RA外的6种阳性血清样品的OD450值均小于0.252，表明除RA阳性血清外，重组tD15/His-tag融合蛋白不与上述6种阳性血清发生交叉反应，由此说明本发明的重组tD15/His-tag融合蛋白及以其为抗原建立的RA抗体间接ELISA检测法具有良好的特异性。
表5特异性试验结果
阳性血清 血清1型RA 血清6型RA DPV DHV AIV DSHS SB E.coli
平均OD450值 0.709 0.8593 0.1285 0.154 0.0725 0.0952 0.0765 0.0705
6、重复性试验 
以同一批次制备的纯化的重组tD15/His-tag融合蛋白作为包被抗原，采用前述优化后的间接ELISA法分别检测三份血清样品(阳性血清为血清1型RA的鸭血清)，每份样品重复3孔，每孔重复检测4次，考察方法的批内重复性。另以不同批次制备的纯化的重组tD15/His-tag融合蛋白作为包被抗原，采用前述优化后的间接ELISA法分别检测三份血清样品(阳性血清为血清1型RA的鸭血清)，每份样品重复3孔，每孔重复检测4次，考察方法的批间重复性。
结果如表6所示，批内重复试验三组血清样品的变异系数均低于10％，批间重复试验三组血清样品的变异系数也均未超过10％，由此说明本发明以重组tD15/His-tag融合蛋白为抗原建立的RA抗体间接ELISA检测法具有良好的重复性。
表6重复性试验结果
7、敏感性试验 
以纯化的重组tD15/His-tag融合蛋白作为包被抗原，将RA阳性血清(血清1型RA的鸭血清)分别按1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、l:6400、1:12800、1:25600进行体积倍比稀释，采用前述优化后的间接ELISA法进行检测，考察方法的敏感性。
结果如表7所示，随着RA阳性血清稀释度的增加，OD450值也明显随之下降，当稀释倍数大于1:6400时，OD450值低于0.252，表明最低可检测到的RA阳性血清稀释倍数为1:6400，由此说明本发明以重组tD15/His-tag融合蛋白为抗原建立的RA抗体间接ELISA检测法具有良好的敏感性。
表7敏感性试验结果
上述优选实施例中将RA表面抗原D15截短重组蛋白设计为与His-tag融合表达的形式，主要是便于蛋白纯化，且本领域认为，标签蛋白通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能和性质，当然不采取上述融合表达形式同样可以达到本发明目的。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.鸭疫里默氏杆菌表面抗原D15截短重组蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌表面抗原D15截短重组蛋白的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，是将核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的鸭疫里默氏杆菌表面抗原D15截短重组蛋白的编码基因克隆入原核表达质粒pET28a(+)中而得到。
6.含有权利要求4或5所述重组表达载体的工程菌。
7.如权利要求6所述的工程菌，其特征在于，是将重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中而得到，所述重组表达载体是将核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的鸭疫里默氏杆菌表面抗原D15截短重组蛋白的编码基因克隆入原核表达质粒pET28a(+)中而得到。
8.利用权利要求7所述工程菌制备鸭疫里默氏杆菌表面抗原D15截短重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：将工程菌接种于含卡那霉素即Kan的LB液体培养基中，37℃培养过夜，次日取菌液按体积比1:50接入含Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.4，加入IPTG至终浓度为0.6mmol，37℃诱导培养4小时，收集菌液，离心，沉淀用20mmol pH8.0的Tris-HCl缓冲液悬浮，置-20℃过夜后，加溶菌酶至终浓度为1mg/mL，4℃搅拌30分钟，冰浴条件下超声波间歇破碎菌体，离心，沉淀用洗液离心洗涤后，用尿素溶液溶解，进行镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化，以含有300mmol咪唑的洗脱缓冲液为洗脱剂，收集洗脱液，透析复性，获得携带组氨酸标签的鸭疫里默氏杆菌表面抗原D15截短重组蛋白。
9.权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌表面抗原D15截短重组蛋白在制备鸭疫里默氏杆菌抗体检测试剂中的应用。
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