CN103926364B

CN103926364B - 一种治疗心脑血管疾病的中药注射液的指纹图谱测定方法

Info

Publication number: CN103926364B
Application number: CN201410185466.3A
Authority: CN
Inventors: 赵涛; 赵超
Original assignee: Shandong Danhong Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shandong Danhong Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2014-05-05
Filing date: 2014-05-05
Publication date: 2015-12-02
Anticipated expiration: 2034-05-05
Also published as: CN103926364A

Abstract

本发明涉及一种治疗心脑血管疾病的中药注射液的指纹图谱测定方法，该方法包括：供试品溶液的制备，对照品溶液的配制，色谱条件：Agilent？ZORBAX？Extend-C₁₈色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.05％三氟乙酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，流速0.8ml/min，柱温40℃，检测波长288nm，测定，得到该中药注射液的指纹图谱。本发明具有方法简便、重现性良好、准确可靠等特点，建立的指纹图谱能有效地控制该中药注射液的质量。

Description

一种治疗心脑血管疾病的中药注射液的指纹图谱测定方法

技术领域

本发明涉及一种治疗心脑血管疾病的中药注射液的指纹图谱测定方法，具体来说是一种用高效液相色谱法指纹图谱方法来测定中药注射液中的有效物质成分，属于医药技术领域。

背景技术

中药注射剂是一个创新剂型，由于具备作用迅速、疗效确切等优点，能弥补传统中药见效慢的缺点，因而发展迅速，目前在心脑血管和抗肿瘤类中成药市场份额中居前10位的产品中，中药注射剂产品已经占有半数，并且已成为中药领域中市场份额最大的剂型。但由于近年来，中药注射液的不良反应报道也逐年增多，为此，建立能够被国际医药行业接受的中药注射液的质量控制体系是目前医药领域的研究热点之一。中药质量控制是中药现代化的重要内容，指纹图谱技术被认为是中药质量控制研究的有效手段。中药指纹图谱能比较全面地反映中药复方中化学物质的种类与数量，且指纹图谱中对多个目标成分尤其是有效成分进行准确定量，尤其对中药注射液进行指纹图谱质量控制显得尤为重要，能更真实反映中药注射液的有效成分数量和含量组成，使得产品质量控制更加准确，进一步保证产品的内在质量。

丹红注射液是由菏泽步长制药有限公司独家生产，在临床中治疗心脑血管疾病效果显著，该制剂是由丹参、红花药材制备而成，具有活血化瘀，通脉舒络的功效。可以用于瘀血闭阻所致的胸痹及中风，并见胸痛，胸闷，心悸，口眼歪斜，言语蹇涩，肢体麻木，活动不利等症；冠心病、心绞痛、心肌梗塞，瘀血型肺心病、缺血性脑病、脑血栓患者。对于该中药注射液我们先申请了公开号CN102233001A的专利，其公开了处方制备工艺及质量检测方法，由于本发明中药注射液有良好的临床效果且市场销售前景广阔，而目前对该制剂的质量标准中仅对丹参素钠、原儿茶醛和总黄酮含量进行控制，这显然对控制中药注射液内在质量是远远不够的。

近年来，指纹图谱技术已经成为中药复方质量控制与评价的重要手段，该技术已经在本领域中运用的比较成熟，成为当下对中药复方质量新的控制点，因此本发明所述的技术方案，意在提高所述产品的质量标准，保证中药注射液质量的安全性和疗效的有效性。

发明内容

本发明目的在于提供一种能够全面、有效、可靠的控制丹红注射液的质量的指纹图谱检测方法，通过该方法获得比较全面的多种成分的指纹图谱信息，从而能为更好评价中药注射液内在质量全面控制提供参考依据。该方法具有简便、准确，重现性及稳定性良好等特点。

本发明本品指所述的中药注射液，均是指由菏泽步长制药有限公司生产的丹红注射液。

该中药注射液具体的制备方法如下：取丹参750g，红花50g，加水煎煮二次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20～1.30(65℃)的清膏，放冷，加乙醇使含醇量达75～80％，冷藏，取上清液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.20～1.30(65℃)的清膏，放冷，加乙醇使含醇量达80～85％，冷藏，取上清液，加入约为投料量1％的活性炭，搅拌30分钟，静置，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加注射用水至配置量，搅匀，加热煮沸40～50分钟，冷藏，滤过，滤液浓缩至配置量的1/3，冷藏，滤过，滤液用NaOH溶液调节pH值至6.5～7.5，加热煮沸40～50分钟，加入约为药液量0.5％的活性炭，搅匀，药液温度降至50℃，静置，滤过，滤液经超滤后，加入约为药液量0.5％的活性炭，滤过，滤液加注射用水至1000ml，调节pH值至6.5～7.5，滤过，灌封，灭菌，即得。

以下是对上述中药注射液该检测方法所建立的指纹图谱测定方法，该方法包括如下的步骤：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％三氟乙酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.8ml，柱温为40℃；检测波长为288nm。理论板数按丹酚酸A峰计算应不低于200000。

表1各流动相配比表

参照物溶液的制备：取丹参素钠对照品、原儿茶醛对照品、4-香豆酸对照品、迷迭香酸对照品、丹酚酸B对照品和丹酚酸A对照品适量，置棕色量瓶中，精密称定，加0.2％冰乙酸的10％甲醇溶液制成每1ml含丹参素钠0.25mg、原儿茶醛30μg、4-香豆酸10μg、迷迭香酸30μg、丹酚酸B40μg和丹酚酸A30μg的混合溶液，即得。

供试品溶液的制备：精密量取本品2ml，置10ml量瓶中，加0.2％冰醋酸的10％甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法分别精密吸取上述两种溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。

本发明技术方案中所述的0.2％冰醋酸的10％甲醇溶液具体配制方法如下：取100体积份的甲醇，加入900体积份的纯净水混合摇匀，即得10％甲醇溶液，并加入2体积份的冰醋酸混合摇匀，即得。

依据上述技术方案所建立的指纹图谱测定方法在丹红注射液的真伪鉴别及成分检测中的应用。

按照上述所建立的指纹图谱测定方法，测定本发明中药制剂得到的指纹图谱，经比对分析得到有10个共有峰，并以丹酚酸A吸收峰为参照，得到的相对保留时间为：1号峰：0.151±0.460％，2号峰：0.202±0.472％，3号峰：0.225±0.287％，4号峰：0.335±0.442％，5号峰：0.461±0.330％，6号峰：0.574±0.513％，7号峰：0.781±0.263％，8号峰：0.849±0.296％，9号峰：0.936±0.274％，10号峰：1±0.321％。

更进一步地，利用对照品与本发明所建立指纹图谱中的主要共有峰进行分析确定：3号峰为丹参素钠，4号峰为原儿茶醛，6号峰为4-香豆酸，8号峰为迷迭香酸，9号峰为丹酚酸B，10号峰为丹酚酸A。

供试品指纹图谱中应呈现与相应的参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.85。

本发明所建立的中药注射液的测定方法，具有重现性良好、稳定性可靠的特点，可以作为中药制剂的真伪鉴别及成分检测中的应用，具体有以下有益效果：

1、用本发明提供的方法建立的指纹图谱，能有效地表征中药注射液特征图谱中有10个特征峰，其中6个指标有效成分分别为丹参素钠、原儿茶醛、4-香豆酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A，有利于体现中药注射液内在质量。

2、考察了本发明中药注射液溶液的稳定性，结果表明，本发明中药注射溶液在24h内，保持稳定，且测定的相对保留时间和峰面积的精密度、重复性、稳定性试验结果良好(RSD在0.0148％～2.1463％)；经过对10批本发明中药注射液的指纹图谱相似度进行计算，发现其相似度0.927以上。说明本发明所建立的治疗质控方法，操作简便，方法可靠，可以对本发明中药注射液的质量进行科学、有效地评价，并且证实能够运用于实际生产中质量控制，满足企业对产品质量控制的需求。

3、本发明技术方案选择以丹酚酸A为参照，是因为在本发明所述中药制剂中丹酚酸A含量较高，且得到的指纹图谱中的保留时间和峰面积比较稳定，重现性良好。现代药理学实验表明，丹酚酸A心绞痛及急性心肌梗塞。用于脑血栓形成的后遗症亦有效。这与本发明中药注射液的具有活血化瘀的功能相类似，也能对中药注射液中有效物质成分进行定性和定量检测。本发明所建立的指纹图谱质量测定方法，为企业提高质量标准提供参考依据。

附图说明

图1为本发明所述中药注射液对照特征指纹图谱。取10不同批次的中药注射液，按照优选的色谱条件”，记录90min色谱图，将数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》各图谱叠加并进行自动匹配，时间窗宽度为0.5min，共标定了10个共有色谱峰，中位数法生成对照特征谱图。

具体实施方式

为了更加充分理解本发明的实施，下面通过典型的实施例对本发明做进一步的说明。

除非另作定义，本发明专利申请说明书以及权利要求书中使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

实施例1：本发明中药注射液指纹图谱测定方法的建立

1.1仪器与试药

仪器：安捷伦1100系列高效液相色谱仪(AgilentChemstation工作站)，电子分析天平(型号BP211D，d＝0.01mg，德国赛多利斯天平有限公司)；超声波清洗器(型号：KQ-250DE型，昆山市超声仪器有限公司)；AgilentZORBAXExtend-C₁₈色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)。1.2试药

10批本发明中药注射液均由菏泽步长制药有限公司生产，10批样品编号分别为Y₁、Y₂、Y₃、Y₄、Y₅、Y₆、Y₇、Y₈、Y₉、Y₁₀，国药准字Z20026866，为注射液。水为娃哈哈牌纯净水，其他试剂均为分析纯。

1.3供试品溶液的制备精密量取注射液2ml，置10ml量瓶中，加0.2％冰醋酸的10％甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

1.4对照品溶液的制备取丹参素钠对照品、原儿茶醛对照品、4-香豆酸对照品、迷迭香酸对照品、丹酚酸B对照品和丹酚酸A对照品适量，置棕色量瓶中，精密称定，加0.2％冰乙酸的10％甲醇溶液制成每1ml含丹参素钠0.25mg、原儿茶醛30μg、4-香豆酸10μg、迷迭香酸30μg、丹酚酸B40μg和丹酚酸A30μg的混合溶液，即得。

1.5色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流速为每分钟0.8ml，柱温为40℃；检测波长为288nm，理论板数按丹酚酸A峰计算应不低于200000，以乙腈为流动相A，以0.05％三氟乙酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；

其中梯度洗脱如下：

0～65min时，乙腈所占的体积比为2→30％，以0.05％三氟乙酸溶液占的体积比为98→70％；65～75min时，乙腈所占的体积比为30％，以0.05％三氟乙酸溶液占的体积比为70％；

75～76min时，乙腈所占的体积比为30→2％，以0.05％三氟乙酸溶液占的体积比为70→98％。

精密吸取供试品溶液和对照品溶液5μl注入液相色谱仪，在上述“1.5色谱条件”下测定：记录90min色谱图，得到本发明注射液及对照品溶液的指纹图谱。

1.6共有峰的确定

取10不同批次的中药注射液的样品，按“1.3”项下方法制得溶液，按“1.5项下色谱条件”各进样1次，记录色谱图，将数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》对色谱峰进行差异性评价和整体相似性评价，考察色谱峰相似度的一致性。以共有模式的10个共有峰作为参照，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积。

实验结果显示：供试品特征图谱中呈现10个特征峰，其中6个峰应分别与相应的参照峰保留时间相同；与丹酚酸A参照物峰相应的峰为S峰，丹酚酸A的保留时间为61.116min，峰面积为1238.560。计算其特征峰的相对保留有时间，其相对保留时间应为规定值的±5％之内。

按照上述所建立的指纹图谱测定方法，测定本发明中药注射液得到的指纹图谱，经比对分析得到有10个共有峰，并以丹酚酸A吸收峰为参照，得到的相对保留时间为：1号峰：0.151±0.460％，2号峰：0.202±0.472％，3号峰：0.225±0.287％，4号峰：0.335±0.442％，5号峰：0.461±0.330％，6号峰：0.574±0.513％，7号峰：0.781±0.263％，8号峰：0.849±0.296％，9号峰：0.936±0.274％，10号峰：1±0.321％。

1.6方法学考察：

1.6.1精密度试验

取本发明中药注射液样品Y5，按“1.3”项下方法制得溶液，按“1.5”项下条件重复进样6次，记录色谱峰保留时间及峰面积。计算得该6次特征图谱的相似度均高于0.998，结果见表2；以峰10(丹酚酸A)为参照峰，各共有色谱峰的相对保留时间的RSD在0.0287％～0.2879％之间；相对峰面积的RSD在0.0361％～1.1302％之间，符合测定要求，表明仪器精密度良好。

表2中药注射液HPLC特征图谱精密度试验相似度分析结果

1.6.2重复性试验

取同一批号的本发明中药注射液6份，按“1.3”项下方法制得溶液，按“1.5”项下条件各进样1次，记录色谱图，以峰10(丹酚酸A)为参照峰，计算得该6次特征图谱的相似度均高于0.998，结果见表3；各共有色谱峰的相对保留时间的RSD在0.0325％～0.268％之间；相对峰面积的RSD在0.0148％～1.046％之间，符合测定要求，表明方法的重复性良好。

表3中药注射液HPLC特征图谱重复性试验相似度分析结果

1.6.3稳定性试验

取编号为Y₅的样品，按“1.3”项下方法制得溶液，按“1.5”项下条件，分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h，记录色谱峰面积，计算得该6次特征图谱的相似度为0.998，结果见表4；以峰10(丹酚酸A)为参照峰，各共有色谱峰的相对保留时间的RSD在0.0453％～0.378％之间；相对峰面积的RSD在0.0194％～2.1463％之间，符合测定要求，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

表4中药注射液特征图谱稳定性试验相似度分析结果

实施例2本发明中药注射液指纹图谱的确立

2.1供试品溶液的制备

取10个不同批号的中药注射液内容物约2ml，置10ml量瓶中，加0.2％冰醋酸的10％甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2色谱条件：

KromasilC₁₈(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.05％三氟乙酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.8ml，柱温为40℃；理论板数按丹酚酸A峰计算应不低于200000。

表5流动相配比表

检测波长：检测波长为288nm。

精密吸取10个不同批次的供试品溶液，分别注入液相色谱仪，按照上述“2.2色谱条件”测定，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》，各图谱叠加并进行自动匹配，时间窗宽度为0.5min，共标定了6个共有色谱峰，中位数法生成对照特征谱图，以此为基准，计算10批样品图谱与对照图谱的相似度，评价批次间稳定性。结果表明，10批样品的相似度良好，均在0.927以上，符合规定。

以上的实验结果表明，该方法稳定性可靠，可以作为控制本品质量控制及真伪的鉴别方法。

最后应说明的是：本发明并不局限于上述的具体实施方案，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下，但凡在本发明的精神和实质范围内，所作的任何改变、等同替换和改进，均在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种治疗心脑血管疾病的中药注射液的指纹图谱测定方法，所述的治疗心脑血管疾病的中药注射液为丹红注射液，其特征在于，所述的指纹图谱测定方法如下：

(a)供试品溶液的制备：精密量取所述的注射液2ml，置10ml量瓶中，加0.2％冰醋酸的10％甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得；

(b)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％三氟乙酸溶液为流动相B，其流动相所采用的线性梯度洗脱条件为：

0～65min时，乙腈所占的体积比为2％→30％，以0.05％三氟乙酸溶液占的体积比为98％→70％；65～75min时，乙腈所占的体积比为30％，以0.05％三氟乙酸溶液占的体积比为70％；75～76min时，乙腈所占的体积比为30％→2％，以0.05％三氟乙酸溶液占的体积比为70％→98％；进行梯度洗脱，流速为每分钟0.8ml，柱温为40℃；检测波长为288nm，理论板数按丹酚酸A峰计算应不低于200000，精密吸取上述供试品溶液5μl，注入液相色谱仪。

2.如权利要求1所述的指纹图谱测定方法，其特征在于，依照该方法生成的指纹图谱中有10个特征峰，并以丹酚酸A吸收峰为参照，得到的相对保留时间为：1号峰：0.151±0.460％；2号峰：0.202±0.472％；3号峰：0.225±0.287％；4号峰：0.335±0.442％；5号峰：0.461±0.330％；6号峰：0.574±0.513％；7号峰：0.781±0.263％；8号峰：0.849±0.296％；9号峰：0.936±0.274％；10号峰：1±0.321％。

3.如权利要求2所述的指纹图谱测定方法，其特征在于，依照该方法生成的指纹图谱中有10个特征峰，3号峰为丹参素钠，4号峰为原儿茶醛，6号峰为4-香豆酸，8号峰为迷迭香酸，9号峰为丹酚酸B，10号峰为丹酚酸A。

4.如权利要求1所述的指纹图谱测定方法在丹红注射液的真伪鉴别及成分检测中的应用。