CN103923912A - 一种与猪木乃伊胎数性状相关的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于猪分子标记制备与应用技术领域，具体涉及一种猪IGFBP1基因内含子基因片段作为猪木乃伊胎数性状的分子标记。本发明通过制备得到一种与猪木乃伊胎数性状相关的分子标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，在序列表SEQ ID NO:1第124bp处存在一个T/C碱基突变，该突变导致PCR-BsmFⅠ-RFLP多态性。本发明还公开了该分子标记的制备方法及其在猪木乃伊胎数性状关联分析中的应用。为猪木乃伊胎数性状标记检测提供了新的标记资源。

Description

一种与猪木乃伊胎数性状相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及猪分子标记制备技术领域，具体涉及一种与猪木乃伊胎数性状相关的分子标记及其应用，利用猪IGFBP1基因编码区SNP作为猪木乃伊胎数性状相关的分子标记，它包括猪IGFBP1基因编码区序列突变位点的检测方法与应用。 

背景技术

猪肉是我国居民日常生活中的主要肉类制品，产仔数与产活仔数是决定猪肉产量的重要繁殖性状。陈克飞等研究发现，在中国母猪单胎产仔数增加1头，将额外为相关产业带来190亿的利润(陈克飞and李宁,2000)。木乃伊胎是影响产活仔数的关键因子，也是制约我国养猪业健康发展的重要因素。 

胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是一种拥有类似胰岛素分子结构的促生长因子。它能够介导生长激素促进胎儿生长的作用。胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)能够结合并调节IGF-1，IGFBP存在于人体不同的器官组织之中并发挥着不同的生理作用。按照发现时间的先后，IGFBP家族被依次命名为IGFBP1-6和IGFBPrp(Ferry Jr et al.,1999)。IGFBPs同源性很高，其中IGFBP1的作用尤为突出，它能够运输IGF-1与受体结合并在结合过程中发挥调节作用。IGFBP1自身也能对血管、生殖器官的发育及其疾病的发生发展产生较大影响猪IGFBP1基因定位于18号染色体，全长5607bp，含有四个外显子，三个内含子。mRNA长度为837bp。IGFBP1在母体中浓度的改变是蜕膜化的重要标志，蜕膜化对于胚胎成功植入子宫内膜非常关键。IGFBP1与IGF-2一起调节子宫细胞的增殖分化过程，影响着胎盘发育。两者能在胚胎植入时期的母胎界面细胞中高表达，以实现胚胎滋养层与子宫内膜蜕膜之间的信息交流。在妊娠早期，IGFBP1通过抑制IGF-2的活性以及限制整合素α5β1的作用阻止胚泡滋养层侵入子宫内膜蜕膜。IGFBP1对IGF-2的调节作用需要协同HOXA10基因和转录因子FKHR一起完成。而在胎盘发育过程中，IGFBP1通过上调基质金属蛋白酶(MMP)的水平来完成对胎盘中IGF活性的调节以控制胎盘组织发育过程(Coppock et al.,2004)。IGFBP1还能影响胎儿发育。Street等发现，胎儿出生时的体重与妊娠晚期母体血清中IGFBP1的水平呈负相关(Street et al.,2006)。IGFBP1是一种生长抑制剂，它与IGFs共同参与调节胎儿生长发育。Fang Q等通过检测怀孕6-10周妇女血清中IGFBP1表达水平发现，表达水平较高的妇女分娩时出现畸形胎的几率较高。这表明，母体IGFBP1表达情况与畸形胎的形成及个数存在某种联系。IGFBP1在血清中的表达水平可以用来预测胚胎发育是否正常。在蜕膜化早期，基质细胞中IGFBP1的异 常表达能够使胚胎绒毛滋养细胞侵入子宫内膜过浅，引起母胎物质交换减少，胚胎无法摄入必要营养物质。在妊娠中后期，IGFBP1与IL-6表达量过高会抑制IGF-1的胰岛素样活性进而降低胚胎对外周葡萄糖的吸收和利用，这会造成胚胎营养摄入不足。在母猪妊娠过程中，胎盘生长停滞，胚胎摄入营养不足是导致木乃伊胎的重要原因。Linville等发现，催乳素受体基因(PRLR)等位基因A可以降低木乃伊数，这表明基因型是影响木乃伊数的因素之一(Linville et al.,2001)。而IGFBP1可以作为研究猪木乃伊胎数的候选基因。 

大部分繁殖性状的遗传结构是非常复杂的。目前，标记辅助选择(MAS)已作为常规选择法的辅助手段而被广泛应用，大大提高了繁殖性状的改良速度。标记辅助选择(MAS)包括随机引物扩增多态性(RAPD)标记、微卫星标记、PCR-RFLP标记等(赵西彪,2008)。其中PCR-RFLP因检测不受发育阶段、性别等外部条件的影响，所标记的变异数目不受限制，实用可靠而得到广泛的应用。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，获得一种与猪木乃伊胎数性状相关的分子标记，克隆IGFBP1基因编码区序列，寻找突变位点以及基因多态性的检测方法，为猪木乃伊胎数性状检测提供一种分子标记和应用检测方法。 

本发明的技术方案如下所述： 

申请人通过克隆得到一种与猪木乃伊胎数性状相关的分子标记，它包含猪(国外血缘猪大白猪和中国地方猪血缘猪陆川猪、隆林猪)IGFBP1基因757bp的序列，该分子标记的核苷酸序列如下所示： 

CCAGGCTTCCACAAATGCGCCTGTGGCTACTTCAGAAGCAAAACCACAGGGCACTCTGGCCAAGCCTGAGGTTTACTATT TTCCCAGAACAGAACTGGCCTTGCCGTTGGGTCATCCCTGTCCRCCGAAACCATCAGAAGTTCCTTTAAAGGGGGAGGAG GCGGTAGTCTGGGTCAGCACAAGCATCCTGTCCTGGTCTGGTTCTGCACGAAGGGAGGCACCTGTCAGTGGCGGCAAATG CTTGGCAGAGGGGCTCATGGGCTTTTGACTTTCTGTTTTCAGAGACAAAGGACCCCGCTGCCCCAGAGACTACGTCCCCT GAGAGCACAGAGATGACCCAGGAGCAGCTCCTGGACAGTTTCCACCTGATGGCCACGTCCAGCGAAGACCTGCCCATCCT TTGGAACGCCATCAATAATTATGAGAGCATGAAGGCTCTCGAGGCCACCGACATCAAGAAGTGGAAGGTGAGGCCCCGGG GCAGGTGGACTCTTTCGCTTGGACCTGCTGGGCGGTGCTGGTCCGGTTCTGAGCCCTGGATAGAAACACGTTTCCTCCCA AAGACATCTCTCAGCTTAGCTTTGTTGAGCTTTTAACACCAGCGCTTTCAGCAGAGGAGGCTGCTGGATGGAAAGAAAAT GCAGCTTGTCCTGTGCAACTTGAGATGTATTATCTCATGTCTCTGAGCTCATCTCTAAAATCAGGGTATCGGTCTTCATA ATAAAAGTTAGCATTTTTACCATTCAGTGGCACTCCC 

上述序列第124bp处的R是T或C，导致PCR-BsmFⅠ-RFLP多态性。 

申请人设计了一种扩增上述基因片段和检测该基因片段多态性的的引物对，其DNA序列如如下所示： 

正向引物：CCAGGCTTCCACAAATGCG， 

反向引物：GGGAGTGCCACTGAATGGTAAA。 

申请人提供了一种与猪木乃伊胎数性状相关的分子标记的制备方法，其特征在于下列步骤: 

从大白猪、陆川猪、隆林猪耳缘组织中提取基因组DNA，在位于猪IGFBP1基因突变位点附近设计一对引物，该引物对的DNA序列如序列表SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，对猪基因组DNA进行PCR扩增和序列测定，得到如序列表SEQ ID NO:1所示的基因片段，通过序列比对，筛查SNP，再利用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增获得的片段进行BsmFⅠ酶切分型及检测。 

本发明的分子标记可以在猪木乃伊胎数性状标记辅助选择中的应用。 

显然本发明设计的引物对也可以在猪木乃伊胎数性状标记辅助选择中的应用。 

本发明提供了鉴定上述序列124bp处T/C变异的BsmFⅠ-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法。 

进一步本发明提供了利用BsmFⅠ-RFLP方法确定的不同基因型个体与木乃伊胎数性状间的关联分析。 

更详细的发明方案见《具体实施方式》所述。 

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是本发明扩增的国外血缘猪种“大白猪”和中国地方血缘猪种“陆川猪”、“隆林猪”的核苷酸序列，序列长度为757bp，在该序列的124bp处存在一个T/C等位基因突变。 

序列表SEQ ID NO:2是本发明制备SEQ ID NO:1特异基因片段所用的正向引物，也是实施猪T/C变异BsmFⅠ-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的正向引物。 

序列表SEQ ID NO:3是制备SEQ ID NO:1特异基因片段所用的反向引物，也是实施猪T/C变异BsmFⅠ-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的反向引物。 

图1：为本发明三个猪种IGFBP1基因序列测序结果和SNP位点。 

图2：为本发明猪IGFBP1基因扩增所得目的片段的琼脂糖凝胶电泳图谱。琼脂糖凝胶浓度为2％，图中标记：M泳道为DNA Marker DL2000，泳道1为序列表SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物在不同猪种中的扩增片段，片段大小为757bp。 

图3：为猪IGFBP1基因BsmFⅠ-RFLP检测结果。琼脂糖凝胶浓度为3％，图中标记：M泳道为DNA Marker DL2000，CC基因型片段大小分别为457bp、176bp和124bp，TT基因型片段大小分别为457bp、300bp，而杂合基因型TC片段大小分别457bp、300bp、176bp和124bp。 

图4：为本发明扩增的猪的核苷酸序列(即本发明制备的分子标记)，在该序列的124bp 处存在一个等位基因突变(图4所示序列中的124bp处的R是T或C)。 

具体实施方式

实施例1：IGFBP1基因片段的获得及多态性检测方法的建立 

猪IGFBP1基因序列扩增 

(1)采集耳组织样 

选择一个国外血缘猪种(大白猪)和两个中国地方猪血缘猪种(陆川猪、隆林猪，上述品种来自翔猪基因公司西江泰和猪场)为试验材料，采取猪的耳缘组织； 

(2)基因组DNA提取 

从猪的耳缘组织中提取猪的基因组DNA，DNA样品全部采用北京天根生化技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit，按该试剂盒说明书进行操作)提取。 

(3)引物设计 

根据猪IGFBP1基因(登录号Gene ID:397270)突变位点附近序列，设计一对特异引物。其中 

正向引物为IGFBP1-1F(5'-CCAGGCTTCCACAAATGCG-3')， 

反向引物为IGFBP1-1R(5'-GGGAGTGCCACTGAATGGTAAA-3')； 

(4)聚合酶链式反应 

采用PCR法，以抽提的大白猪、陆川猪和隆林猪基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系：2×GCBufferⅡ7.5ul，dnTP(2.5mM)2.6ul，上述制备的正向引物(10uM)0.6ul，反向引物(10uM)0.6ul，DNA模板(50ng/ul)1.1ul，laTaqDNA聚合酶0.15ul，ddH2O2.5ul。PCR扩增程序：94℃预变性1min，94℃变性30s，55.7℃退火30s，72℃延伸50s(步骤2-4循环30次)，72℃延伸10min，4℃保存。对长度为757bp的PCR产物进行序列测定，得到如SEQ ID NO:1所述的核苷酸序列。将不同猪种的PCR产物序列测序峰图结果见图1。位于该片段的124bp处的T/C变异引起了BsmFⅠ酶切位点(GGGAC(N)10')多态性。 

(5)限制性内切酶酶切反应，多态位点限制性片段酶切多态性(RLFP)检测 

采用BsmFⅠ-RFLP方法对猪IGFBP1基因SNP进行基因分型，酶切反应条件：PCR产物6ul，10×NEBuffer2.11ul，BsmFⅠ(2U/ul)1ul，50×SAM0.2ul，ddH2O2.8ul，37℃酶切4h。取5ul酶切产物在3％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，之后进行基因型分析和鉴定。此扩增片段大小为757bp，BsmFⅠ酶切多态性位点位于该片段的124bp处，当该处变异位点为C碱基时，会产生限制性内切酶BsmFⅠ的酶切位点(GGGAC(N)10')，由于在扩增片段457p存在另外一个BsmFⅠ酶切位点，所以BsmFⅠ消化PCR产物后会产生3个片段(457bp、176bp和124bp)，其基因型为CC；当该处变异位点为T碱基时，则不存在BsmFⅠ酶切位点，BsmFⅠ消化PCR产物后会产生2个片段(457bp、300bp)，其基因型为TT；当该处变异位点为T/C杂合基因型 时，BsmFⅠ消化PCR产物后会产生4个片段(457bp、300bp、176bp和124bp)，其基因型为TC。 

实施例2：本发明制备的分子标记在不同猪群中的多态性分布检测 

采用常规PCR-RFLP的方法对PCR-BsmFⅠ-RFLP多态性位点在国内外7个品种共445头猪中的基因型与等位基因频率分布情况进行了检测，其结果见表1。其包括中国地方猪血缘猪种为陆川猪、隆林猪、恩施黑猪、梅山猪和通城猪，国外血缘猪猪种包括大白猪与杜洛克猪。检测结果表明，IGFBP1基因在大白群体中CC型略多于TC型和TT型，C基因频率略高于T基因频率；在陆川猪群体中CC型分布较广，TT型很少(只有3个)，优势等位基因为C；在隆林猪群体中，TT型分布较多，TC型分布较少，T基因频率高于C基因频率；在恩施黑猪群体中，CC型分布较多，TT型分布较少，C基因频率高于T基因频率；在梅山猪群体中，CC型分布较广，TT型很少(只有1个)，没有TC型，优势等位基因为C；在通城猪群体中，CC、TT型分布较多，TC型分布较少，T基因频率略高于C基因频率；在杜洛克群体中，TT型分布较广，TC型很少，没有CC基因型，优势等位基因为T。见表1。 

表1IGFBP1基因的基因型频率和基因频率 

实施例3：本发明制备的分子标记与木乃伊胎数性状的关联分析 

为了确定猪IGFBP1基因PCR-BsmFⅠ-RFLP与猪表型差异是否相关，本申请人采用SAS软件对猪IGFBP1基因PCR-BsmFⅠ-RFLP多态性位点与广东清远大白猪场大白母猪130头的产仔数和产活仔数等繁殖性状进行了初步的关联分析。所用模型为： 

yi＝μ+αi+bj+pk+ei 

yi代表性状值，μ代表总体平均数，αi代表基因型效应值(i＝TT,TC,CC)， 

bj代表品种效应，pk代表第k个胎次固定效应，ei代表随机误差。 

表2猪IGFBP1基因2247T/C SNP位点与经产胎次繁殖性状关联分析结果 

注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。表中性状均值组成为平均数±标准误。 

Note：*represents P<0.05，**represents P<0.01.Values of traits were Means±SE. 

从表2可以看出，IGFBP1基因与初产胎次木乃伊数差异显著(P<0.05)，TC型大于CC型，差异显著，TC型大于TT型，差异显著；初产胎次中，CC型初生窝重大于TC型，差异显著。 

参考文献 

1.Coppock HA,White A,Aplin JD,Westwood M.Matrix metalloprotease-3and-9proteolyze insulin-like growth factor-binding protein-1.Biology of reproduction,2004,71:438-443 

2.Ferry Jr RJ,Cerri RW,Cohen P.Insulin-like growth factor binding proteins:new proteins,new functions.Hormone Research in Paediatrics,1999,51:53-67 

3.Linville R,Pomp D,Johnson R,Rothschild M.Candidate gene analysis for loci affecting litter size and ovulation rate in swine.Journal of Animal Science,2001,79:60-67 

4.Street M,Seghini P,Ziveri M,Fieni S,Volta C,Neri T,Viani I,Bacchi-Modena A,Bernasconi S.Interleukin-6and insulin-like growth factor system relationships and differences in the human placenta and fetus from the35th week of gestation.Growth hormone&IGF research,2006,16:365-372 

5.陈克飞,李宁.猪FSHβ及ESR合并基因型对猪产仔数性状的影响.科学通报,2000,45:1963-1966 

6.赵西彪:AREG,ESR和FSHβ亚基基因与猪产仔数关系研究.扬州大学；2008。

Claims (5)

1.一种与猪木乃伊胎数性状相关的分子标记，其核苷酸序列如下所示：

CCAGGCTTCCACAAATGCGCCTGTGGCTACTTCAGAAGCAAAACCACAGGGCACTCTGGCCAAGCCTGAGGTTTACTATTTTCCCAGAACAGAACTGGCCTTGCCGTTGGGTCATCCCTGTCCRCCGAAACCATCAGAAGTTCCTTTAAAGGGGGAGGAGGCGGTAGTCTGGGTCAGCACAAGCATCCTGTCCTGGTCTGGTTCTGCACGAAGGGAGGCACCTGTCAGTGGCGGCAAATGCTTGGCAGAGGGGCTCATGGGCTTTTGACTTTCTGTTTTCAGAGACAAAGGACCCCGCTGCCCCAGAGACTACGTCCCCTGAGAGCACAGAGATGACCCAGGAGCAGCTCCTGGACAGTTTCCACCTGATGGCCACGTCCAGCGAAGACCTGCCCATCCTTTGGAACGCCATCAATAATTATGAGAGCATGAAGGCTCTCGAGGCCACCGACATCAAGAAGTGGAAGGTGAGGCCCCGGGGCAGGTGGACTCTTTCGCTTGGACCTGCTGGGCGGTGCTGGTCCGGTTCTGAGCCCTGGATAGAAACACGTTTCCTCCCAAAGACATCTCTCAGCTTAGCTTTGTTGAGCTTTTAACACCAGCGCTTTCAGCAGAGGAGGCTGCTGGATGGAAAGAAAATGCAGCTTGTCCTGTGCAACTTGAGATGTATTATCTCATGTCTCTGAGCTCATCTCTAAAATCAGGGTATCGGTCTTCATAATAAAAGTTAGCATTTTTACCATTCAGTGGCACTCCC

上述序列第124bp处的R是T或C，导致PCR-BsmFⅠ-RFLP多态性。

2.一种扩增如权利要求所述分子标记的引物对，其DNA序列如如下所示：

正向引物：CCAGGCTTCCACAAATGCG，

反向引物：GGGAGTGCCACTGAATGGTAAA。

3.一种与猪木乃伊胎数性状相关的分子标记的制备方法，其特征在于下列步骤：

从大白猪、陆川猪、隆林猪耳缘组织中提取基因组DNA，在位于猪IGFBP1基因突变位点附近设计一对引物，该引物对的DNA序列如序列表SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，对猪基因组DNA进行PCR扩增和序列测定，得到如序列表SEQ ID NO:1所示的基因片段，通过序列比对，筛查SNP，再利用SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增获得的片段进行BsmFⅠ酶切分型及检测。

4.权利要求1所述的分子标记在猪木乃伊胎数性状选择中的应用。

5.权利要求2所述的引物对在猪木乃伊胎数性状选择中的应用。