CN103923888B - 棉花GhMAX2b基因、其编码蛋白及应用 - Google Patents
棉花GhMAX2b基因、其编码蛋白及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及棉花GhMAX2b基因及其编码的蛋白，其序列分别如SEQ？ID？No.2和1所示。通过转化拟南芥max2突变体，发现棉花GhMAX2b基因可以使突变体恢复分枝的表型，因而GhMAX2b基因具有控制植物（拟南芥、棉花等）分枝的功能，有望对棉花各类分枝的形成进行调控，进而对株型定向设计，以提高棉株生产力。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及棉花GhMAX2b基因、其编码蛋白及应用。
背景技术
棉花是世界上最主要的纤维作物之一，是纺织和精细化工等工业的原料。由于棉花具有果枝、营养枝和赘芽组成的复杂分枝模式和顶芽无限生长的习性，在生产上需要耗费大量劳动力进行打顶、打杈等整枝管理。对棉花分枝机制的研究有着极其重要的意义。
近年来对植物分枝发育的研究取得了很大进展，对分枝的发育机制进行了生理生化及基因组学等多方面的研究。在豌豆、拟南芥、矮牵牛、水稻、番茄和玉米中获得很多与分枝发育相关的突变体。这些突变的基因有的促进侧枝的形成，有的则抑制侧枝的伸长。如Ls/LAS/MOC1和Blind/RAX1抑制叶腋处形成分生组织；MAX2/RMS4/D3﹑MAX3/RMS5/HTD1和MAX4/RMS1/DAD1控制腋芽向外生长。SPS/BUS﹑TB1等则与腋生分生组织的形成和生长有关。了解植物分枝机理不仅具有重要的理论意义，而且它还直接影响到农业生产。在生产中需要人工对棉花进行整枝、果树进行修剪等。如能利用分子生物学方法控制植物的分枝，将会节约劳动成本，产生巨大的经济效益。
调控已知基因的转录水平的蛋白称为转录因子。通常转录因子通过序列特异DNA结合位点调控基因的表达。转录因子是转录起始过程中RNA聚合酶所需的辅助因子。真核生物基因在无转录因子时处于不表达状态，RNA聚合酶自身无法启动基因转录，只有当转录因子结合在其识别的DNA序列上后，基因才开始表达。植物的生长发育是有大量的转录因子，包括NAC、AP2、GRAS、YABBY、ARF和TCP等参与调控的过程。而调控植物分枝的转录因子主要有两大类GRAS家族和TCP家族。
侧枝的形成取决于腋芽的形成和生长，这一过程受植物本身激素和环境双重作用调控。众所周知，生长素和细胞分裂素在侧枝的形成方面起着重要的调控作用。近年来，对一些分枝明显增多的突变体的研究表明，存在一种新型的激素，能抑制侧芽的形成。这些突变体包括豌豆的ramosus(rms)突变体，拟南芥的moreaxillarygrowth(max)突变体，矮牵牛的decreasedapicaldominance(dad)突变体，水稻的dwarf(d)突变体。双突变体研究及对这些基因的克隆及分析等实验结果表明，这种激素由类胡萝卜素合成，向上运输抑制侧芽的形成。研究表明，MAX3﹑RMS5和HTD1/D17编码CAROTENOIDCLEAVAGEDIOXYGENASE7(CCD7)﹑MAX4﹑RMS1，D10和DAD1编码CCD8。CCD7和CCD8可能具有催化类胡萝卜素分解的功能，但目前对于它们的催化底物和催化功能的机理还不是十分清楚。MAX1是细胞色素P450的单氧酶，可能在更下游的生物合成过程中发挥作用。MAX2﹑RMS4和D3属于F-box(LRR)家族同源基因，它们可能在泛素水解中起着重要的作用。
发明内容
本发明的目的是提供棉花GhMAX2b基因、其编码蛋白及应用。
为了实现本发明目的，本发明的一种棉花GhMAX2b基因编码的蛋白，其具有SEQIDNo.1所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能（控制棉花分枝的功能）的氨基酸序列。
本发明还提供棉花GhMAX2b基因，其具有SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。
本发明还提供含有棉花GhMAX2b基因的载体以及含有该载体的宿主细胞。
本发明还提供含有棉花GhMAX2b基因的转化植物细胞。
本发明进一步提供棉花GhMAX2b基因在促进植物分枝发育中的应用，优选所述的植物为拟南芥、水稻、棉花等。
本发明首次提供棉花GhMAX2b基因（SEQIDNo.2）及其编码的蛋白（SEQIDNo.1），通过转化拟南芥max2突变体，发现棉花GhMAX2b基因可以使突变体恢复分枝的表型，因而GhMAX2b基因具有控制植物（拟南芥、棉花等）分枝的功能，有望对棉花各类分枝的形成进行调控进而对株型定向设计，以提高棉株生产力。
附图说明
图1为本发明实施例1中棉花GhMAX2b同源基因编码的氨基酸序列比较和进化分析结果。
图2为本发明实施例2中棉花GhMAX2b基因转化拟南芥后植物的生长情况；其中，WT为Col-0；max2-1为max2突变体；Line1-Line3为GhMax2a-pBI121载体转化突变体；Line4-Line6为GhMax2b-pBI121载体转化突变体。
图3为本发明实施例3中GhMAX2b基因在棉花不同部位半定量PCR结果；其中，R为根；S为茎；L为叶；AB为顶芽；LB为侧芽；FB为花芽。
图4为本发明实施例4中为GhMAX2b基因在洋葱细胞中的表达位置；其中，白色箭头分别表示出三个基因在共聚焦显微镜下观察到的GFP绿色荧光、明场中的细胞核，以及绿色荧光和细胞核的叠加效果。
图5为本发明实施例5中GhMAX2b基因的F-box、LRRs区域和全长分别与拟南芥ASK1基因相互作用的结果。
图6为本发明实施例4中表达载体pCAMBIA1205GFP的质粒图谱。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中使用的陆地棉（Gossypiumhirsutum）品种新陆早13号为市售商品。
实施例1棉花GhMAX2b基因的获得
本发明的GhMAX2b基因是采用同源序列法从陆地棉（Gossypiumhirsutum）品种新陆早13号中克隆得到的。将拟南芥MAX2蛋白的氨基酸序列(NP_565979)在NCBI的dbEST数据库中进行TBLASTN搜索，二倍体棉种亚洲棉中一个833bp的EST(BE054448.2）被分析出来，它与MAX2的N末端具有很高的同源性。根据此棉花的EST序列，设计特异性引物GhMAX25RGSP1、GhMAX25RGSP2、GhMAX23RGSP1和GhMAX23RGSP2，使用Clontech公司的SMARTerTMRACEcDNAAmplificationKit(CatalogNo.634923)做5’RACE和3’RACE获得全长cDNA序列。以棉花顶芽和侧芽的总RNA为模板分离了该基因的5’端和3’端cDNA片段。5’RACE后得到了383bp长的片段，3’RACE后得到了1205bp长的片段。根据扩增所得的中间保守区序列、5’RACE和3’RACE侧翼序列，将这三个片段拼接后得到全长2462bp的核苷酸序列。根据拼接序列设计引物GhMAX2FLF﹑GhMAX2FLR，分别以cDNA和基因组DNA为PCR模板，用高保真TaqDNA聚合酶扩增获得了该基因的全长cDNA片段和基因组DNA，并将这两个片段分别进行克隆和序列测定。将所测得的序列和在NCBI网站上公布的同源序列进行Blast比较分析，发现该基因与MAX2家族基因同源性极高，将该基因命名为陆地棉MAX2基因，简称GhMAX2。共得到两个高度同源的GhMAX2基因序列；它们之间的编码区有31bp碱基的差异，并且在蛋白水平上有15个氨基酸的差异；分别命名为GhMAX2a和GhMAX2b，它们的氨基酸序列分别如SEQIDNo.3和1所示，其编码基因的核苷酸序列分别如SEQIDNo.4和2所示。
PCR反应体系如下（20μL）：
PCR反应条件如下：94℃3min；94℃30s，45℃30s，72℃1min，5个循环；94℃30s，50℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。
为了获得全长基因序列，根据核心片段的序列设计了5’RACE引物GhMAX25RGSP1和GhMAX25RGSP2以及3’RACE引物GhMAX23RGSP1和GhMAX23RGSP2，以棉花侧芽的总RNA为模板分离了该基因的5’端和3’端cDNA片段。5’RACE后得到了383bp长的片段，3’RACE后得到了1205bp长的片段。根据扩增所得的中间保守区序列、5’RACE和3’RACE侧翼序列，将这三个片段拼接后得到全长2463bp的核苷酸序列。
5’RACE操作步骤：
（1）准备第一链cDNA的合成：
总RNA1-3μL（相当于50ng-1μg）
5'-CDS引物1μL
SMARTIIAoligo1μL
加入去RNA酶双蒸水至5μL，混匀后快速离心。
（2）70℃温育2min，然后移至冰上放置2min，快速离心。
（3）加入反应物：
混匀后快速离心。
（4）42℃金属浴孵育1.5h，加入20μLTricine-EDTA缓冲液稀释第一链反应产物。
（5）72℃温育7min，反转产物可于-20℃保存。
（6）配制PCR反应液：
混匀后快速离心。
（7）反应条件如下：94℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，68℃30s，72℃3min，25个循环。
（8）以上述PCR产物为模板，用内侧引物NUP和GhMAX25RGSP2进行两轮PCR，两轮PCR后，电泳检测PCR产物，回收目的条带。
3’RACE操作步骤：
（1）反转录反应
反应体系及反应条件如下：
反应条件：42℃60min；70℃15min。反应结束后可以进行下一步实验或将反应液保存于-20℃。
（2）套式PCR反应
OuterPCR反应，反应体系及反应条件如下：
反应条件：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃3min，30个循环；72℃10min。
InnerPCR反应，反应体系及反应条件如下：
反应条件：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃3min，30个循环；72℃10min。取5-10μL的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认3’RACEPCR扩增产物，回收目的条带。
根据扩增所得的中间保守区序列、5’RACE和3’RACE侧翼序列，将三段序列用DNAStar软件进行拼接，根据拼接序列设计引物GhMAX2FLF和GhMAX2FLR，以基因组DNA为PCR模板，用高保真Taq酶扩增获得了该基因的全长基因组DNA，并将这个片段进行克隆和序列测定。
反应体系如下：
反应程序为：98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸2.5min，35个循环。PCR产物经电泳检测后，回收目的条带。
将所测得的序列与NCBI网站上公布的同源序列进行Blast比较分析，发现该基因与MAX2家族基因同源性极高，将该基因命名为陆地棉MAX2基因，简称GhMAX2。GhMAX2基因组DNA序列总长2463bp，5’UTR区长为56bp，3’UTR区长为298bp，无内含子，其开放阅读框长度为2109bp核苷酸，编码702个氨基酸。
用GeneDoc将棉花GhMAX2b基因编码的氨基酸序列（SEQIDNo.1）与NCBI中其它植物MAX2同源基因编码的氨基酸序列进行多重比较，可以发现具有很高的同源性。这表明在进化过程中，植物MAX2b蛋白是高度保守的。
将GhMAX2b与已克隆的植物F-box/LRR家族成员进行了进化分析，使用的氨基酸序列包括：蒺藜状苜蓿MtMAX2(XP_003607592.1);豌豆RMS4(ABD67495.1);大豆GmMAX2(XP_003540983.1);拟南芥MAX2(NP_565979.1);盐芥ThMAX2(BAJ33992.1);蓖麻RcMAX2(XP_002528551.1);葡萄VvMAX2(CAN59822.1);三角叶杨PtMAX2(XP_002320412.1);短柄草BdMAX2(XP_003564315.1);水稻D3(NP_001174608.1);高粱SbMAX2(XP_002436499.1);玉米ZmMAX2(AFW85799.1);北美云杉PsMAX2(ABR16482.1);江南卷柏SmMAX2(XP_002989898.1)。结果显示GhMAX2基因与控制侧枝伸长的AtMAX2等基因位于同一个大的进化枝上，与RcMAX2的遗传距离最近（图1b）。F-box/LRR家族同源序列蛋白比对结果如图1a所示。
实施例1中涉及的引物序列如表1所示。
表1实施例1中涉及的引物序列
| 引物名称 | 引物序列 |
| GhMAX23RGSP1 | 5’-GGGACGCTGGTGGAGTTCTTCTCTGGC-3’ |
| GhMAX23RGSP2 | 5’-GGAGGAACGTCAGGGATACTTCCATGG-3’ |
| GhMAX25RGSP1 | 5’-GTAGACCGTCAAGGACGTGACCGCAGG-3’ |
| GhMAX25RGSP2 | 5’-TCTGCGGAGGCGATGGGCCAAAAGCTG-3’ |
| GhMAX2FLF | 5’-CCTTCAATTGCCTACTCCATG-3’ |
| GhMAX2FLR | 5’-CCTTCAATTGCCTACTCCATG-3’ |
实施例2棉花GhMAX2b基因转化拟南芥
将GhMAX2b基因克隆至植物表达载体pBI121，并在大肠杆菌DH5α中扩繁。通过农杆菌介导转化方法，将pBI121携带的GhMAX2b基因转入拟南芥。
将基因克隆至载体，载体在大肠杆菌DH5α中扩繁以及农杆菌介导转化的过程如下：
1、载体的构建
先用SacI酶切质粒载体pBI121，产生3’突出末端，使用T4DNA聚合酶将3’突出末端抹成平端，将T4DNA聚合酶失活；再用BamHI酶切，应切下1894bpGUS基因片段，回收大片段作为载体，再与目的基因连接。
连接体系：
2、载体在大肠杆菌DH5α中扩繁过程如下：
质粒载体和外源片段按1:3摩尔比混合。连接过夜后转入DH5α内，用含卡那霉素抗性的平板进行阳性筛选。鉴定正确，得到的质粒用酶切鉴定，用BamHI和EcoRI双酶切鉴定，得到4条带：393bp、997bp、1323bp及载体大片段，最后将构建好的载体质粒转化农杆菌GV3101，用于转化拟南芥max2突变体。
3、转化农杆菌感受态细胞的步骤如下：
（1）取-70℃保存的农杆菌于含50μg/mL利福平(Rifampicin)的YEP平板上划线，28℃培养2～3d。
（2）挑取单菌落接种于5mLYEP液体培养基中，220rpm28℃振荡培养12～16h。
（3）取2mL菌液转接于100mLYEP液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.4～0.6。
（4）转入无菌离心管，5000rpm离心5min,弃上清。
（5）每50mL菌液加入5mL预冷的0.1MCaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。4℃5000rpm离心5min，弃上清。
（6）每50mL菌液加入2mL预冷的含15%甘油的0.1MCaCl2溶液，轻轻悬浮细胞。
（7）将农杆菌悬浮液分装于1.5mL无菌的EP管中，每管100μL（可冻存于-70℃）。
（8）取约1μg质粒DNA加入到100μL农杆菌感受态细胞中，混匀后冰浴30min。
（9）液氮速冻5min,再于37℃水浴5min。
（10）立即冰浴2min,加入800μLYEP液体培养基，28℃175rpm振荡培养2～4h后，涂含50μg/ml卡那霉素的YEP固体平板，28℃培养2～3d至形成单菌落。
（11）挑取单菌落，PCR验证。阳性克隆用于转化植物。
4、农杆菌接到的拟南芥转化过程如下：
拟南芥受体材料准备：拟南芥移栽后，其主苔长至10～15cm，生成1～2个角果时即可用于转化试验。为得到较多花序，可将顶芽除去，促使更多侧芽生长，转化前剪去已开花的花蕾和已长成的角果。
挑取已活化并含有目的载体的GV3101单菌落于5mLYEB液体培养基（Kan50mg/L，Rif50mg/L）中，28℃220rpm震荡培养12～16h，取20～60μL菌液涂与含相应抗生素的平板上28℃黑暗培养2～3d，收集菌体与30mL液体YEB使OD600值达到2.0，将菌液加入到含120mL转化介质的塑料袋中用于转化。
将花序浸入转化液10s，轻轻抖落多余菌液，侧放并避光保湿处理16～24h，将转化好的植株放到培养架上继续光照培养。1周后以同样的方法重新转染一次。收集T1代种子。
5、转基因阳性苗的筛选过程如下：
T1代种子经消毒后，重悬与0.05%的琼脂溶液中（40μL种子/ml琼脂）。在含卡纳霉素90×90×25mm的MS培养基平板铺种1mL混合物，4℃冰箱春化3d，转基因阳性苗（T1代植株）可以长成真叶，而不含目的基因片段的幼苗则不能成活，将阳性苗移栽。
用棉花GhMAX2b基因转化拟南芥max2突变体，观察莲座叶片处分枝情况（图2），转基因苗同野生型拟南芥相似，在莲座叶出长出侧枝，对照（含有空载体pBI121的转化拟南芥d3突变体）没有侧枝长出。表明GhMAX2b基因能够恢复拟南芥d3突变体分枝的表型。
实施例3棉花GhMAX2b基因半定量PCR
1、使用购自北京百泰克生物技术有限公司的通用植物总RNA提取试剂盒（离心柱型），提取生长85天的新陆早13号棉花根、茎、叶、顶芽、侧芽、花蕾的总RNA，具体操作步骤如下：
（1）取100mg植物组织在液氮中快速充分研磨，研磨过程中需保持研钵中始终有液氮。
（2）将研磨成匀浆的样品转移至1.5mLRNasefree离心管中，加入1mL裂解液颠倒混匀，65℃温育5min以使核蛋白体完全分解。4℃，12000rpm离心10min，取上清移至RNasefree过滤柱。
（3）4℃，10000rpm离心45s，收集下滤液于收集管。
（4）在收集管加入1倍体积70%乙醇混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱中。
（5）4℃，10000rpm离心45s，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。
（6）向吸附柱中央加入80μL的DNaseI工作液，室温放置15min。
（7）加入500μL去蛋白液，4℃12000rpm离心45s，弃掉废液。
（8）加入700μL漂洗液，4℃12000rpm离心45s，弃掉废液。
（9）加入500μL漂洗液，4℃12000rpm离心45s，弃掉废液。
（10）将吸附柱放回空收集管中，4℃12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。
（11）取出吸附柱放入无RNase离心管中向吸附膜中间位置滴加适量65℃温育的RNasefreewater，室温放置2min后，12000rpm离心1min收集RNA。
2、以棉花各部位的cDNA为模板，做半定量RT-PCR，检测基因在植株各部位的表达情况。
（1）cDNA第一链的合成
①在RNasefree离心管配制下列混合液：
RNA模板1μg
Oligo（dT）15（50μΜ/mL）5μL
去RNA酶双蒸水补至15μL
②70℃保温5min后迅速在冰上急冷2min以上；离心数秒混合液聚集于管底部；
③加入其它反转录反应液：
④42℃，60min。得到cDNA溶液稀释1-100倍后用于PCR扩增。
（2）半定量RT-PCR
以棉花polyubiquitin基因（GhUBI）（AY189972）作为RT-PCR反应的内标，使用引物GhMAX2RTF和GhMAX2RTR进行扩增。设计的基因特异性引物序列如下：
GhUBIF：5’-AAGACCTACACCAAGCCCAA-3’
GhUBIR：5’-AAGTGAGCCCACACTTACCA-3’
GhMAX2RTF：5’-GTGCAATGGCACACTCTACG-3’
GhMAX2RTR：5’-CTAGCCAAGCTACTAGAGCA-3’
先扩增内标，调整PCR反应体系模板加入量，使扩增内标扩增产物的量相同。再用相应的模板量扩增检测目的基因的转录表达水平。PCR的反应体系如下（20μL）：
反应条件如下：94℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，25-40个循环；72℃10min。其中polyubiquitin基因（GhUBI）扩增25个循环，GhMAX2b基因扩增35循环。用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。
半定量PCR结果显示（图3），GhMAX2b基因在各个组织器官中均有表达。
实施例4GhMAX2b蛋白的亚细胞定位
将GhMAX2b基因克隆至植物表达载体pCAMBIA1205GFP中，该载体经过室改造，带有绿色荧光蛋白（GFP）。用基因枪将构建好的绿色荧光蛋白融合表达载体转化到洋葱表皮细胞中，培养过夜后，用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光在细胞中的位置，检测三个基因在细胞中的表达位置。
将基因克隆至载体，用基因枪把构建好的绿色荧光蛋白融合表达载体转化洋葱表皮细胞的过程如下：
1、载体的构建
将2.1kb的GhMAX2b编码区插入到植物表达载体pCAMBIA1205GFP的XbaI和EcoRI位点之间。插入片段与GFP蛋白融合表达，通过检测荧光对目的蛋白进行亚细胞定位检测。该载体的构建采用同源重组的方法进行。载体构建过程中的阳性克隆筛选，采取酶切的方法。由于GhMAX2b基因内部含有EcoRI位点，因此，用EcoRI单酶切，得到大小为393bp、909bp的片段及载体大片段。检测结果与预期酶切结果相吻合，说明重组植物表达载体构建成功。
2、转化洋葱表皮细胞
（1）选取洋葱第五或者第六层（包含最外表皮），撕下内表面一层膜，约3×3cm，内表面向上，即光滑的外表面附着在培养基上，平铺于MS培养基中心位置，可先在中心画一个直径为3cm的圆，于25℃培养约4h。
（2）金粉的处理：取100mg直径为1.0μM的金粉放入1.5离心管中，加入1ml无水乙醇，充分振荡3min，以12000rpm离心1min，去上清，再加入1ml无菌水充分混匀后悬浮于1ml超纯水中，-20℃保存备用。
（3）制备微粒子弹：取6μg重组质粒DNA(约10μl)加入直径为1.0μM的金粉悬液6μl（50mg/μl）、0.1M亚精胺（spermidine）4μl和2.5MCaCl26μl，每加入一种物质，振荡1min，以保证完全混匀。将金粉、DNA、亚精胺和氯化钙全部加入后，混合振荡3min，冰上静止15min。12000rpm离心10s（指转速达到12000rpm后10s），弃上清，加入140μl无水乙醇，粗振荡后（打散金粉）12000rpm离心10s，去上清收集金粉沉淀。20μl无水乙醇重悬沉淀，点膜。
（4）基因枪轰击受体材料：选用一定压力的可裂膜（本实施例中用1100psi），与轰击膜一起，在70%的酒精中浸泡20-30min，取出置于滤纸上晾干；金属小托板和金属小滤网用酒精浸泡，在酒精灯上灭菌，基因枪的超净台紫外灭菌；将晾干的轰击膜小心地完全防御金属小托板的最底部，保证完全放平，尽量不留缝隙；取20μl上述制备好的金粉-质粒复合体，均匀涂布于轰击膜的中间位置，不要涂于整个膜，大小与载体固定圈上的孔径范围一致，晾干，然后将金属小滤网和金属小挡板固定在载体固定圈上，将上述载体固定圈防御发射架的最上槽；将放有洋葱表皮细胞的MS培养基放在样品盘中间，将样品盘放置在轰击室的适当位置，关上轰击室门。按下VAC开关（上挡）抽真空。当真空表读数为所需值时（27-28in,Hg），开关打到HOLD开关处（下档），然后按住FIRE开关，当达到适当压力，可裂膜自动破裂后（可听见“啪”一声），松开FIRE开关。开关打到VENT处（中间档），以释放轰击室内的真空（否则轰击室门打不开）。打开轰击室门，取出样品盘。取出微粒发射装置，卸下微粒载膜和阻挡网。旋下可裂膜挡盖，清除可裂膜碎片。若PDS-1000/He不再使用时，关掉氦气瓶的主阀，按住FIRE开关，放掉气体加速管内的氦气压力，最后关闭电源。
3、亚细胞定位
利用基因枪将构建好的GhMAX2bCDS-1205GFP和pCAMBIA1205GFP绿色荧光蛋白融合表达载体转化到洋葱表皮细胞中，培养过夜后，用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光在细胞中的位置，来检测三个基因在细胞中的表达位置，结果如图4所示。白色箭头分别表示出了三个基因在共聚焦显微镜下观察到的GFP绿色荧光（B、E）、明场中的细胞核（A、D)、以及绿色荧光和细胞核的叠加效果图(C、F)，结果显示，GhMAX2b基因在细胞核中表达，与之前的推测相吻合。
实施例5酵母双杂验证棉花GhMAX2b与拟南芥ASK1之间的相互作用
将GhMAX2b基因全长、GhMAX2b基因F-Box结构域、LRRS结构域连接到酵母双杂交诱饵载体pGADT7中的GAL4转录因子的DNA激活结构域（GAL4AD)，将ASK1基因连接到酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中的GAL4转录因子的DNA结合结构域（GAL4BD），以验证是否能够激活GAL4调控的报告基因的表达。结果表明，棉花基因GhMAX2b与拟南芥ASK1之间可以发生相互作用。
1、载体的构建
先用EcoRI和BamHI双酶切pGADT7和pGBKT7，然后连入目的片段。连接过夜后转入DH5α内，涂到含相应氨苄霉素的平板进行阳性筛选。
筛选的阳性克隆用酶切鉴定，EcoRI和BamHI双酶切得到2463kb、189bp、2274bp、1116bp的条带及载体大片段。最后将构建好的载体质粒转化酵母菌AH109、Y187。
2、酵感受态的制备
（1）首先将酵母菌AH109、Y187在YPDA平板上划线，30℃培养3d至出现单菌落。
（2）挑取直径为2～3mm单菌落至3mL液体YPDA，用15mL离心管，30℃振荡培养8～12h。
（3）取10μL菌液接种与50mL液体YPDA，230～250rpm振荡培养16～20h至OD600为0.15～0.3。700g室温离心5min，弃上清。
（4）加100mL液体YPDA30℃250rpm振荡培养3～5h，至OD600为0.4～0.5。700g室温离心5min，弃上清。
（5）加60mL无菌水吹吸混匀，700g室温离心5min，弃上清。
（6）加1.1倍TE/LiAc3mL，吹吸混匀后分装到2个1.5mLEP管，最大转速离心15s，弃上清。
（7）每管加入1.1倍TE/LiAc600μL，室温储存。
3、转化酵母感受态
（1）取0.1～1μg质粒DNA和5μLHerringTestesCarrierDNA加入50μL酵母感受态细胞，轻轻涡旋混匀。
（2）加PEG/LiAc溶液0.5ml轻轻涡旋混匀。
（3）30℃温育30min每10min混匀1次。
（4）加20mLDMSO混匀，42℃水浴15min每5min轻轻涡旋混匀1次。
（5）冰浴10min，最大转速离心15s，弃上清。
（6）加200μL0.9%(w/v)NaCl重悬细胞。
（7）涂菌与SD/-Trp平板，30℃培养3～6d。
将转化得到的含有pGADT7-GhMAX2b、pGADT7-F-Box、pGADT7-LRRs和pGBKT7-ASK1的酵母分别点到SD/-Trp-Leu和SD/-Trp-Leu-His+55mM3-amino-1,2,4-triazole平板上做倍比稀释，结果如图5所示，GhMAX2bCDS、GhMAX2F-Box与ASK1相互作用，GhMAX2LRRs不能与ASK1相互作用，与预期的结果一致。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.棉花GhMAX2b基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.含有权利要求4所述载体的工程菌。
6.权利要求2或3所述的基因在促进拟南芥或棉花分枝发育中的应用。
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