CN103922981A

CN103922981A - 一种化合物及其应用

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Publication number: CN103922981A
Application number: CN201410160598.0A
Authority: CN
Inventors: 郑计岳; 许芝祥; 郑龙太; 马海阔; 镇学初; 张小虎
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2014-04-21
Filing date: 2014-04-21
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2034-04-21
Also published as: CN103922981B

Abstract

本发明提供了一种化合物。该化合物及其药学上可接受的盐、各种同位素、各种晶型或各种异构体，具有通式Ⅰ所示的结构：A-L-B（Ⅰ），其中，A为非甾体类抗炎药物化合物单体；B为硫化氢释放体或抗氧化化合物；L为将A和B连接在一起的基团或官能团。本发明还提供所述化合物在作为抑制神经炎症的药物中的应用，及与其他药物在作为抑制神经炎症的药物中的联合应用。本发明运用双前药的思想，能够将非甾体抗炎药与硫化氢释放体或抗氧化化合物共价连接到一起形成多靶点化合物，能够有效的抑制脂多糖诱引的小胶质细胞的炎症反应，从而可以用于治疗或预防各种神经退行性疾病。

Description

一种化合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种化合物及其应用，尤其涉及一种具有抑制神经炎症作用的化合物及其应用，属于药物合成技术领域。

背景技术

神经退行性病变是包括帕金森病、多发硬化症以及阿尔茨海默病在内的各种神经退行性疾病的最重要的病理特征。尽管不同的神经退行性疾病的发病机制各有不同，但小胶质细胞异常激活是其共有的特征（Block ML等，Nat.Rev.Neurosci.,2007,8(1):57-69）。例如在帕金森病研究中发现，退行性病变存在的黑质区域中有大量被活化的小胶质细胞。

小胶质细胞是中枢神经中最小的一种胶质细胞，约占胶质细胞总量的15%，是中枢神经系统中最重要的免疫防线。在正常状态下，小胶质细胞处于静息状态，当中枢神经系统遭遇损伤时，小胶质细胞被迅速激活，进行增殖、迁移并变化成吞噬细胞样形态；同时分泌大量细胞因子和细胞毒性物质。小胶质细胞激活一方面可以参与吞噬细胞碎片，发挥神经保护功能，合成和分泌神经营养因子，有利于神经元的营养和修复；另一方面可以产生大量促炎症细胞因子包括白介素-1β(IL-1β)、干扰素-γ(IF-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及活性自由基等（Streit WJ等Neurol.Res.2005,27(7):685-691）。研究发现IL-1β和TNF-α在神经炎症的起始阶段起重要作用，研究还发现IL-1β可刺激β-淀粉样蛋白(Aβ)前体合成、下调Aβ清除相关的基因表达促进Aβ蓄积、引起tau蛋白的磷酸化并促进神经纤维缠结产生；而过量产生的TNF-α能够直接与神经元上的TNF受体结合，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）依赖的级联反应导致神经元凋亡或促进兴奋性氨基酸（如谷氨酸）释放，导致兴奋性中毒；诱生型一氧化氮合酶(iNOS)是过量NO的主要来源，高水平的NO抑制神经元线粒体细胞色素氧化酶可直接导致神经元凋亡，或诱导神经元去极化以及谷氨酸释放导致兴奋性中毒；而活性氧簇（ROS）主要由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPHoxidase)催化生成，ROS以及ROS与NO反应产生的亚硝酸离子通过线粒体呼吸链损伤、脂质过氧化、蛋白质硝化和DNA损伤等机制导致神经元损伤及凋亡。

大量研究表明，抑制小胶质细胞炎症反应和氧化应激能够减轻神经损伤的程度。非甾体抗炎药（NSAIDs）被广泛地应用于治疗各种疼痛和炎症，其良好药效很大程度上是由于它们通过抑制环氧合酶-1（COX-1）和环氧合酶-2（COX-2）来实现抑制前列腺素合成。然而长期服用非甾体抗炎药会刺激白细胞粘附，减少胃粘膜的血流量，从而造成胃肠道的损伤。虽然选择性的抑制环氧合酶-2（COX-2）可以降低药物胃肠道的副作用，但有研究指出其可能会引起心血管并发症。

研究表明硫化氢作为一种内源性物质，在其生理浓度下可以有效的发挥氧化（Tamizhselvi R等，J.Cell Mol.Med.2007,11:315-326）和镇痛活性。此外硫化氢可以有效地抑制白细胞粘附到血管内皮细胞，减轻非甾体抗炎药的胃肠道副作用。

发明内容

鉴于上述现有技术存在的缺陷，本的目的是提出一种化合物及其应用，能够将非甾体抗炎药与硫化氢释放体或抗氧化化合物共价连接到一起形成多靶点化合物，能够有效的抑制脂多糖诱引的小胶质细胞的炎症反应，从而可以用于治疗或预防各种神经退行性疾病。

本发明的目的通过以下技术方案得以实现：

一种化合物，及其药学上可接受的盐、各种同位素、各种晶型或各种异构体，具有通式Ⅰ所示的结构：

A-L-B（Ⅰ）

其中，A为非甾体类抗炎药物化合物单体；B为硫化氢释放体或抗氧化化合物；L为将A和B连接在一起的基团或官能团，包括直接的化学键、杂原子、羧基、烷代酯基、烷代酰胺、烷代巯基酰胺基、烷代醚基、烷代硫醚基、烷代胺基、烷基、烯基、炔基或烷氧基。

上述的化合物中，优选的，所述A包括：

其中，R₁为一元取代、二元取代、三元取代、四元取代或五元取代，R₁选自氢原子、卤素、烷代卤素、氰基、烷代氰基、三氟甲基、烷基、烯基、炔基、芳基、氨基、芳胺基、羟基、巯基、氰基、硝基、酰基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、羧基、脂基、砜基、亚砜基、磺胺基、叠氮基、烷代烯基、烷代炔基、烷代氨基、烷代羟基、烷代脂基、烷代砜基、烷代亚砜基、烷代磺胺基、烷代叠氮基、环状烷基、环状烯基、饱和或非饱和的3元-8元的环基或杂环基中的一个到五个基团；所述杂环基为带有1个或2个杂原子的饱和或非饱和的3元-8元的环；

X包括氮、氧或硫。

上述的化合物中，优选的：

所述烷基为具有或不具有取代基的1-8个碳原子组成的饱和的直链、支链、环状、双环状或螺环状的烃基；

所述烯基为具有或不具有取代基的1-8个碳原子组成的含有至少一个碳碳双键的直链、支链、环状、双环状或螺环状的烃基；

所述炔基为具有或不具有取代基的1-8个碳原子组成的含有至少一个碳碳三键的直链、支链、环状、双环状或螺环状的烃基；

所述芳香环基为具有或不具有取代基的芳香性的单环、多环或杂环取代基，或者为具有取代基的饱和环；

所述杂环基为具有或不具有取代基的非芳香性的含氮原子、氧原子、硫原子中至少一个原子的单环、双环、三环或螺环取代基，及它们的各种氧化态形式的环状取代基；

含杂原子的取代基为含F、Cl、Br或I的卤代基、或含氮、氧、硫、磷中至少一个的取代基，包括它们的各种氧化态，以及氮的季铵盐。

上述的化合物中，优选的，所述A选自下列基团中的任一种：

上述的化合物中，优选的，所述B选自下列基团中的任一种：

上述的化合物中，优选的，该化合物包括：

本发明的化合物还包括化合物在药学上可以接受的盐，各种晶型，各种覆盖化合物的各种异构体，包括但不局限于，立体异构体，顺反异构体，互变异构体等。

本发明还提供上述的化合物在作为抑制神经炎症的药物中的应用。

本发明还提供上述的化合物与拟多巴胺药、胆碱受体阻断剂、中枢抗胆碱药、胆碱酯酶抑制剂、抗淀粉样蛋白药中的一种或几种的组合在作为抑制神经炎症的药物中的联合应用。

本发明还提供上述的化合物、其药学上可接受的盐、各种同位素、各种晶型或各种异构体在作为抑制神经炎症的药物中的应用，以及与拟多巴胺药、胆碱受体阻断剂、中枢抗胆碱药、胆碱酯酶抑制剂、抗淀粉样蛋白药中的一种或几种的组合在作为抑制神经炎症的药物中的联合应用。

上述的应用中，优选的，所述神经炎症包括小胶质细胞炎症。

上述的应用中，优选的，所述神经炎症包括癫痫，阿尔兹海默症，帕金森综合症，脑炎，脑膜炎，脑缺血和脑中风中的一种或几种的组合。

本发明的突出效果为：

运用双前药的思想，能够将非甾体抗炎药与硫化氢释放体或抗氧化化合物共价连接到一起形成多靶点化合物，能够有效的抑制脂多糖诱引的小胶质细胞的炎症反应，从而可以用于治疗或预防各种神经退行性疾病。

附图说明

图1是实施例4药物组与对照组细胞上清液NO释放量比较图；

图2是实施例4对照组与药物组细胞生存率的比较图；

图3是实施例4不同浓度药物组与对照组细胞液NO释放量比较图；

图4是实施例4不同浓度药物组与对照组细胞抑制率比较图；

图5是实施例4药物组iNOS mRNA表达检测结果图；

图6是实施例4药物组TNF-αmRNA表达检测结果图；

图7是实施例4药物组COX-2蛋白表达检测结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

以下实施例中，所用溶剂和药品均为分析纯或化学纯；溶剂在使用前均经过重新蒸馏；无水溶剂均按照标准方法或文献方法进行处理。柱层析硅胶(100-200目)和薄层层析硅胶(GF254)为青岛海洋化工厂和烟台化工厂产品；如未特别说明，均采用石油醚(60-90℃)/乙酸乙酯(v/v)作为洗脱剂；显色剂用碘或磷钼酸的乙醇溶液；所有萃取溶剂未经说明均用无水Na₂SO₄干燥。1H NMR用Bruck-400型核磁共振仪记录，TMS为内标。LC-MS用美国Agilent公司1100型高效液相色谱-离子阱质谱联用仪(LC-MSD Trap)记录，二极管阵列检测器(DAD)，检测波长214nm和254nm，离子阱质谱(ESI源)。HPLC柱为Agela Durashell C18(4.6×50mm，3.5μm)；流动相为0.1%NH₄HCO₃水溶液：乙腈(5分钟内从5：95到95：5)；流速为1.8mL/min。

实施例1

本实施例提供一种化合物，其合成的流程如下：

1)中间体Ra-012-1的合成

将半胱氨盐酸盐Ra-016（2.0g,44mmol）和Boc酸酐（3.5g,16mmol）溶于二氯甲烷（20mL），冰水浴下慢慢加入三乙胺（2.5mL,18mmol），加完升到常温反应16小时，依次用0.5N HCl洗，饱和氯化钠洗，有机相干燥旋干，得无色油状物（2.7g,得率95%）。经过核磁解析得到的无色油状物为Ra-012-1。核磁数据如下：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.93(br s,1H),3.32-3.28(m,2H),2.64(t,J=6.8Hz,2H),6.43(s,1H),6.25(d,J=8.0Hz,1H),1.44(s,9H)。

2)中间体Ra-012-2的合成

冰水浴下，将双氯芬酸Ra-009（100mg,0.34mmol）和Ra-012-1溶于二氯甲烷（5mL），催化量的DMAP(4mg)和DCC(140mg,0.68mmol)依次加入。升到常温，反应18小时。加入乙酸乙酯（10mL），过滤，滤液旋干。残留物经胶柱层析（石油醚:乙酸乙酯=10:1）得白色固体（110mg）混合物，含有少量双氯芬酸自身缩合的副产物，直接用于下一步。

3)产物Ra-012的合成

将得到的110mg白色固体混合物加入到3M氯化氢/乙酸乙酯溶液(2mL)中，常温搅拌过夜。加入10mL乙醚，抽滤，所得的白色沉淀用乙酸乙酯洗两次，减压干燥，核磁测定，经过解析，所得的白色沉淀物为Ra-012(89mg,产率67%)。核磁数据如下：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.28(br s,3H),7.32(d,J=8.4Hz,2H),7.28(d,J=7.2Hz,1H),7.13-7.06(m,1H),7.00-6.89(m,2H),6.49(d,J=8.0Hz,1H),4.08(s,2H),3.24-3.14(m,4H)。

实施例2

本实施例提供一种化合物，其合成的流程如下：

产物Ra-014的合成：

将Ra-009(50mg,1.7mmol)溶于10mL二氯甲烷和10mL二氧六环，冰浴下加入Ra-015(770mg,3.4mmol)、二环己基碳二亚胺(420mg,3.4mmol)和4-二甲氨基吡啶(700mg,3.4mmol)。常温下搅拌反应24小时，硅藻土过滤，减压浓缩后硅胶柱层析得白色固体(260mg,产率29%)，对该白色固体进行核磁测定，经过解析，该白色固体为Ra-014。核磁数据如下：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.79(s,1H),9.67(s,1H),7.54(d,J=8.0Hz,2H),7.40(d,J=8.4Hz,2H),7.31(d,J=6.8Hz,1H),7.22(t,J=8.0Hz,1H),7.13-7.06(m,2H),7.03(d,J=16.0Hz,1H),6.93-6.86(m,2H),6.82-6.74(m,4H),6.43(s,1H),6.25(d,J=8.0Hz,1H),4.07(s,2H)。

实施例3

本实施例提供一种化合物，其合成的流程如下：

1)中间体Ra-018-1的合成

将Ra-009(1.0g,3.3mmol)溶于20mL二氯甲烷和20mL水，加入碳酸氢钠(1.05mg,1.25mmol)和四丁基硫酸氢铵(110mg,0.33mmol)，搅拌5min后，将氯甲基氯磺酸酯(600mg,3.63mmol)溶于10mL二氯甲烷中并滴加到上述溶液中，常温下搅拌1小时后，用二氯甲烷(30mL)和水(20mL)萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，加入20mL丙酮溶解后，加入碘化钠(2.0g,13.2mmol)，常温下搅拌24小时，旋除丙酮，加入20mL二氯甲烷，硅藻土过滤，有机层减压浓缩后得黄色固体(1.3g,得率90%)。

2）中间体Ra-018-2和Ra-019-1的合成

将Ra-015(5.0g,21.9mmol)溶于20mLN,N-二甲基甲酰胺中，冰浴下加入叔丁基二甲基氯硅烷(3.5g,23mmol)和咪唑(1.9g,27mmol)，常温下搅拌12h后，再加入叔丁基二甲基氯硅烷(3.5g,23mmol)和咪唑(1.9g,27mmol)，再在常温下搅拌12小时，用乙酸乙酯(100mL)和水(100mL)萃取3次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤(100mL×3次)，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后硅胶柱层析（洗脱液：石油醚:乙酸乙酯=10:1)得无色油状物(3.5g,35%)，即Ra-018-2和Ra-019-1的混合物。

3)产物Ra-018和Ra-019的合成

将Ra-018-2和Ra-019-1混合物(1.0g,2.2mmol)溶于60mL乙腈中，冰浴下加入碳酸银(2.4g,8.8mmol)，将Ra-018-1(1.9g,4.4mmol)溶于20mL乙腈中缓慢滴加到上述溶液，常温下反应过夜，硅藻土过滤，滤液减压蒸馏。经柱层析得无色油状物800mg。加入无水四氢呋喃，再加入乙酸(330mg,5.5mmol)和四丁基氟化铵(1M四氢呋喃溶液,2.2mL,2.2mmol)，常温下反应0.5小时，用乙酸乙酯(50mL)和饱和碳酸氢钠溶液(50mL)萃取3次，合并有机相，用饱和食盐水(50mL)洗涤3次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后经柱层析得两种物质，经过核磁测定并解析，这两种物质分别是白色固体Ra-018(150mg,产率25%)、白色固体Ra-019(120mg,产率20%)。核磁数据如下：

Ra-018:¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.71(s,2H),7.51(d,J=8.0Hz,2H),7.36(d,J=8.8Hz,2H),7.22-7.16(m,2H),7.04-6.95(m,3H),6.85-6.72(m,4H),6.62(d,J=6.4Hz,2H),6.32(s,1H),6.21(d,J=8.0Hz,1H),5.78(s,2H),3.88(s,2H)；

Ra-019:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.38(d,J=8.8Hz,2H),7.33(d,J=8.0Hz,2H),7.22(d,J=7.6Hz,1H),7.14(t,J=7.6Hz,1H),7.02-6.93(m,5H),6.83(d,J=16.4Hz,1H),6.66(s,1H),6.58-6.54(m,3H),6.26(s,1H),5.83(s,2H),4.89(s,2H),3.87(s,2H)。

实施例4

本实施例对实施例1-3所得的化合物对小胶质细胞的影响进行测定。

1.细胞培养

复苏：用镊子从液氮罐中取出冻存管，迅速置于37℃的水浴中，持续振荡使之溶化；吸取5ml DMEM培养基，再吸出冻存液，共置于15ml的离心管中，1200rpm，离心5min；吸出上清液，加入含10%小牛血清（FBS）的DMEM完全培养基5ml于离心管中，轻微混匀后，将BV-2小胶质细胞悬液加入细胞培养皿中，轻微吹打均匀，置于37℃，5%CO₂的培养箱培养。

传代：从培养箱中取出贴壁生长近100%的细胞，吸出上清液，加入0.5-1.0ml的0.25%胰蛋白酶，静置2-3min，至BV-2细胞开始部分回缩；吸去瓶中的培养液，加入10%FBS的DMEM完全培养基混匀，以1:5种入新的培养皿，置于37℃，5%CO₂的培养箱培养。

2.受试化合物对BV-2小胶质细胞NO释放量的检测

受试化合物：

化合物Ra-012,Ra-014,Ra-018,Ra-019。

化合物的配制：所有化合物均用DMSO溶解至10mM，然后用培养液稀释至工作浓度。

实验方法：

取对数增长期BV-2细胞制成细胞悬液，以5×10⁴个细胞/孔接种于96孔板，每孔100μL，过夜。给药分为四组：(1)空白对照组加100μL培养液；(2)LPS组加脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）100ng/mL；(3)化合物对照组加20μM受试化合物；(4)LPS+化合物组同时加入LPS100ng/mL和受试化合物20μM。24小时后取50μL样品试样和50μL Griess在96孔板中混合，25℃下孵化10min；在分光光度计上测定570nm下吸光度；NaNO₂用作计算NO₂ ^-浓度的标准。

NO释放量结果如图1（药物组与对照组细胞上清液NO释放量比较图）所示，图中的对照组中白色棒图为空白对照组、黑色棒图为LPS组，图中的化合物组中白色棒图为化合物对照组、黑色棒图为LPS+相应化合物组；可以看出：(1).与空白对照组相比，LPS明显诱导小胶质细胞NO释放；(2).与LPS组相比，LPS+受试化合物组明显抑制LPS诱导的NO释放；(3).在所有受试化合物中，Ra-012抑制效果最为明显。

3.MTT法检测细胞生存率

受试化合物：

化合物Ra-012,Ra-014,Ra-018,Ra-019。

实验方法：取对数增长期BV-2细胞制成细胞悬液，以5×10⁴个细胞/孔接种于96孔板，每孔100μL，过夜。给药分为四组：(1)空白对照组加100μL培养液；(2)LPS组加LPS100ng/mL；(3)化合物对照组加5μM受试化合物；(4)LPS+化合物组同时加入LPS100ng/mL和受试化合物5μM。24h后弃上清，加入MTT(0.5μg/mL)继续培养4h，用酶标仪检测570nm处吸光度值OD570，按下列公式计算抑制率(IR)：IR(%)=(1-给药孔平均OD值/对照孔平均OD值)×100%，每组设三个复孔。

测试结果如图2（对照组与药物组细胞生存率的比较图）所示，图中的对照组中白色棒图为空白对照组、黑色棒图为LPS组，图中的化合物组中白色棒图为化合物对照组、黑色棒图为LPS+相应化合物组；可以看出：化合物对小胶质细胞生存率无明显影响。

4.不同剂量受试化合物对BV-2小胶质细胞NO释放量的检测

受试化合物：

化合物Ra-012,Ra-014,Ra-018,Ra-019。

实验方法与结果：

方法：取对数增长期BV-2细胞制成细胞悬液，以5×10⁴个细胞/孔接种于96孔板，每孔100μL，过夜。给药分为四组：(1)空白对照组加100μL培养液；(2)LPS组加LPS100ng/mL；(3)化合物对照组加受试化合物（1.25-20μM）；(4)LPS+化合物组同时加入LPS100ng/ml和受试化合物（1.25-20μM）。24小时后取50μL样品试样和50μL Griess在96孔板中混合，25℃下孵化10min；在分光光度计上测定570nm下吸光度；NaNO₂用作计算NO₂ ^-浓度的标准。

测试结果如图3（不同浓度药物组与对照组细胞液NO释放量比较图）所示，图中的对照组中白色棒图为空白对照组、黑色棒图为LPS组，图中的化合物组中白色棒图为化合物对照组、黑色棒图为LPS+相应化合物组；可以看出：受试化合物剂量依赖性抑制LPS诱导的小胶质细胞NO分泌，其中Ra-012的有效剂量最小，在5μM就有很明显的效果。

5.MTT检测细胞毒性

受试化合物：

化合物Ra-012,Ra-014,Ra-018,Ra-019。

实验方法与结果：

方法：取对数增长期BV-2细胞制成细胞悬液，以5×10⁴个细胞/孔接种于96孔板，每孔100μL，过夜。给药分为四组：(1)空白对照组加100μL培养液；(2)LPS组加LPS100ng/mL；(3)化合物对照组加受试化合物（1.25-20μM）；(4)LPS+化合物组同时加入LPS100ng/ml和受试化合物（1.25-20μM）。24h后弃上清，加入MTT(0.5μg/ml)继续培养4h，用酶标仪检测490nm处吸光度值OD490，按下列公式计算抑制率(IR)：IR(%)=(1-给药孔平均OD值/对照孔平均OD值)×100%，每组设三个复孔。

测试结果如图4（不同浓度药物组与对照组细胞抑制率比较图）所示，图中对照组中白色棒图为空白对照组、黑色棒图为LPS组，图中的化合物组中白色棒图为化合物对照组、黑色棒图为LPS+相应化合物组；可以看出：受试化合物浓度为1.25-20μM时，对小胶质细胞生存率无明显影响。

6.RT-PCR法检测iNOS和TNF-αmRNA表达

受试化合物：

化合物Ra-012用DMSO溶解至10mM，然后用培养液稀释至工作浓度。

实验方法与结果：

方法：取对数增长期BV-2细胞制成细胞悬液，以5×10⁴个细胞/孔接种于6孔板，每孔2ml，过夜。给药分四个组：(1)空白对照组加2ml培养液；(2)化合物Ra-0125μM受试化合物；(3)LPS组加LPS100ng/mL；(4)LPS+化合物，加入LPS100ng/ml和受试化合物Ra-0121.25、2.5和5.0μM。药物作用8h之后，收集细胞并加入1.0mL TRIzolReagent提取总RNA，用逆转录试剂盒(Invitrogen公司)合成cDNA，具体操作按试剂盒说明书中的建议进行。利用一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)，肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）或β-actin的引物，PCR扩增在94℃30s，53.5℃30s，72℃1min，重复25个循环，接着72℃孵化7min。

引物的核苷酸序列为iNOS forward：CCC TTC CGA AGT TTC TGG CAG CAG C；iNOS reverse：GGC TGT CAG AGC CTC GTG GCT TTG G；TNF-Forward：CAT CTTCTC AAA ATT CGT GAC AA；TNF-αReverse：ACT TGG GCA GAT TGA CCT CAG；β-actin Forward：ATC CTG AAA GAC CTC TAT GC；β-actin reverse：AAC GCA GCTCAG TAA CAG TC。β-actin被用作内参来评估iNOS、TNF-α的相对表达。

RT-PCR法检测结果如图5（药物组iNOS mRNA表达检测结果）、图6（药物组TNF-αmRNA表达检测结果）所示，从上述药物组与空白组的iNOS、TNF-αmRNA表达检测结果图中可以看出：化合物Ra-012明显抑制脂多糖诱导BV-2细胞炎症炎症相关基因iNOS和TNF-α的表达。

7.Western blot法检测COX-2表达

受试化合物：化合物Ra-012用DMSO溶解至10mM，然后用培养液稀释至工作浓度。

实验方法：

方法：取对数增长期BV-2细胞制成细胞悬液，以5×10⁴个细胞/孔接种于6孔板，每孔2mL，过夜。给药分四个组：(1)空白对照组加2mL培养液；(2)化合物Ra-0125.0μM受试化合物；(3)LPS组加LPS100ng/mL；(4)LPS+化合物,加入LPS100ng/ml和受试化合物Ra-0121.25、2.5和5.0μM。药物作用24小时之后，细胞裂解液提取细胞总蛋白，定量后取40g样本行SDS-PAGE电泳分离，然后将蛋白转移至PVDF膜上，将膜在封闭液中封闭2小时，分别与环氧酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）以及α-tubulin的一抗4°C孵育过夜。洗膜后再与二抗室温孵育1小时；TBST室温洗膜5分钟×3次；将膜转入新鲜配制的ECL化学发光孵育液中，室温孵育5分钟；转入X光暗盒中曝光5分钟，显影，定影。α-tubulin被用作内参来评估COX-2的相对表达。检测结果如图7（药物组COX-2蛋白表达检测结果）所示，可以看出：化合物Ra-012明显抑制LPS诱导炎症相关蛋白COX-2的表达。

由上可见，本发明化合物能够有效的抑制脂多糖诱引的小胶质细胞的炎症反应，从而可以用于治疗或预防各种神经退行性疾病。

Claims

1.一种化合物，及其药学上可接受的盐、各种同位素、各种晶型或各种异构体，具有通式Ⅰ所示的结构：

A-L-B（Ⅰ）

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述A包括：

X包括氮、氧或硫。

3.根据权利要求1或2所述的化合物，其特征在于：

4.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于：所述A选自下列基团中的任一种：

5.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述B选自下列基团中的任一种：

6.根据权利要求1-5任一项所述的化合物，其特征在于：该化合物包括：

7.权利要求1-6任一项所述的化合物在作为抑制神经炎症的药物中的应用。

8.权利要求1-6任一项所述的化合物与拟多巴胺药、胆碱受体阻断剂、中枢抗胆碱药、胆碱酯酶抑制剂、抗淀粉样蛋白药中的一种或几种的组合在作为抑制神经炎症的药物中的联合应用。

9.权利要求1-6任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐、各种同位素、各种晶型或各种异构体在作为抑制神经炎症的药物中的应用，以及与拟多巴胺药、胆碱受体阻断剂、中枢抗胆碱药、胆碱酯酶抑制剂、抗淀粉样蛋白药中的一种或几种的组合在作为抑制神经炎症的药物中的联合应用。

10.根据权利要求7-9任一项所述的应用，其特征在于：所述神经炎症包括小胶质细胞炎症；优选的，所述神经炎症包括癫痫，阿尔兹海默症，帕金森综合症，脑炎，脑膜炎，脑缺血和脑中风中的一种或几种的组合。