背景技术
环核苷酸(cAMP和cGMP)是细胞内重要的第二信使,在各种细胞内调节许多生物活性,包括细胞成长、分化及移行、基因表达、介质分泌、平滑肌收缩、神经递质引起的各种生物反应、神经突触功能、脂质及糖质代谢等。环核苷酸磷酸二酯酶(phosphodiesterases,PDE)是环核苷酸的惟一细胞内分解途径,因而PDE抑制剂通过阻碍环核苷酸的分解,从而调节一系列的生物功能。PDE大家族共包括l1个家族(PDE1-11),具有不同的cAMP和/或cGMP特异性[FRANCISSH,TURKOIV,CORBINJD.Cyclicnucleotidephosphodiesterases:relatingstructureandfunction.ProgNucleicAeidResMolBio,2001,65:1-52.]。PDE的体内分布(在组织和细胞中的表达)各不相同。人类至少有44种PDE,其中PDE4在炎症和免疫调节中起特别重要的作用[CONTIM,JINSLC.Themolecularbiologyofcyclicnucleotidephosphodiestemses.ProgNucleicAcidResMolBiol,1999,63:1-38.]。
PDE4抑制剂可作为一种新的治疗药物用于治疗由炎症引起的呼吸道疾病,如哮喘和慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisease,COPD)。
哮喘是一种呼吸道黏膜炎症,其特征是嗜酸性粒细胞浸润,TH2相对于TH1数量增加,激活的肥大细胞数量增加以及呼吸道结构上改变。目前最有效的治疗方法是吸入β2-AR激动剂和皮质激素,这能控制约95%的病症,但是一旦停止治疗症状又会出现。此外还会出现严重的糖皮质激素依赖和抵抗症状。PDE4抑制剂可以抑制相关炎症细胞的招募和激活,抑制结构细胞如呼吸道平滑肌细胞,上皮细胞以及感觉和胆碱能神经细胞的增生和肥大[BarnesPJ.Newdrugsforasthma.NatRevDrugDiscov,2004,3(10):831-44.]。
COPD是一种支气管和肺部的慢性炎症,这种炎症由于各种蛋白酶的作用如中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophilelastase,NE)和基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs),表现为阻塞性细支气管炎和肺气肿。COPD与哮喘不同,它的炎症是由巨噬细胞、中性粒细胞和CD8+T淋巴细胞引起的,因此COPD的治疗着重于抑制这些细胞的招募活化以及它们产物的拮抗。目前的药物并不十分有效。PDE4抑制剂可以抑制炎性细胞,阻止前炎症介质的释放,提高抗炎介质的释放,减少ASM细胞有丝分裂,减少支气管收缩,从而起到治疗COPD的作用[BarnesPJ.COPD:istherelightattheendofthetunnel?.CurrOpinPharmacol,2004,4(3):263-72]。另外,组织损伤与MMPs的过量表达有关,近期研究表明PDE4抑制剂可有效地抑制由TNFα诱导的pro-MMP-1和pro-MMP-2分泌[SotoFJ,HananiaNA.Selectivephosphodiesterase-4inhibitorsinchronicobstructivelungdisease.CurrOpinPulmMed,2005,11(2):129-34]。
PDE4抑制剂可作为一种新的治疗药物用于治疗炎性肠病(IBD),IBD主要包括溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,UC)和克隆氏病(Crohn'sdisease,CD),二者发病机制和临床症状基本相同,治疗药物也类似。
IBD是由多种因素引起的肠黏膜免疫异常反应。目前的治疗是用氨基水杨酸盐和类固醇,但这种治疗副作用强烈并且有类固醇抵抗现象。实验表明PDE4抑制剂用于治疗IBD在动物模型中是有效的。炎症本身会引起组织损伤改变血管和肠平滑肌的收缩,造成黏膜的血流量减少,最终导致肠腔的通透性丧失。这造成肠内容物内流,进一步造成炎症反应,减少黏膜血流,组织损伤加剧。许多机制造成流向肠的血流量改变:①由微血栓造成的黏膜血管阻塞;②由前炎症介质造成的血管扩张能力降低;③由前炎症介质造成的血管和肠平滑肌缩窄;④由炎症介质造成的肠平滑肌异常收缩导致的血管收缩。PDE4抑制剂可以改善除了①以外的上述情况,改善血流,可以增加cAMP水平从而抑制前炎症介质的释放,使肠和血管平滑肌舒张,从而抑制组织损伤[BannerKH,TrevethickMA.PDE4inhibition:anovelapproachforthetreatmentofinflammatoryboweldisease.TrendsPharmacolSci,2004,25(8):430-6]。
除了上述疾病,PDE4抑制剂在其它炎症的动物模型上也显示出体内活性,如急性肺损伤、败血症、关节炎、皮肤疾病、多发性硬化症、炎性疼痛、骨质疏松、肾脏疾病、同种异体移植排斥反应和全身性红斑狼疮等。
紫草为常用中药,为紫草科多年生草本植物,因其根呈紫色得名,最早记载于《神农本草经》,具有清热凉血,活血,解毒透疹之功效。
经研究,紫草的主要成分有两大类:一类是水溶性成分,目前研究比较少,初步认为主要是多糖和糖蛋白的混合物,另一类是脂溶性成分,包括紫草萘醌类、酚酸类、生物碱类、苯酚、黄酮类等。其中最值得注意的是紫草萘醌类化合物。研究表明,紫草中的萘醌类化合物主要为阿卡宁类衍生物,结构如下:
紫草萘醌类化合物是紫草的主要有效成分,其含量占3-6.5%,具有多种生理和药理活性,如愈伤抗炎、抗菌抗病毒、解热、止血、抗肿瘤、保肝、降血糖、镇静和调节免疫等作用[VassiliosP.Papageorgiouetal,Angew.Chem.Int.Ed.1999,38,270–300;V.P.Papageorgiouetal,CurrentOrganicChemistry,2006,10,2123-2142;V.P.Papageorgiou,K.C.Nicolaouetal.TheChemistryandBiologyofAlkannin,Shikonin,andRelatedNaphthazarinNaturalProducts[J].Angew.Chem.Int.Ed.1999,38,270-300]。
但紫草萘醌类化合物对PDE4的抑制作用,以及对哮喘和慢性阻塞性肺疾病的治疗作用,对炎性肠病,尤其是溃疡性结肠炎、克隆氏病治疗作用未见报道。
实施例1所获得的紫草提取物经过硅胶柱层析,分别用石油醚:乙酸乙酯=100:1;100:1;100:2;100:4比例洗脱,所得洗脱液蒸干溶剂后再分别用石油醚或石油醚-乙酸乙酯和甲醇以一定的比例重结晶,分别得到红褐色颗粒状结晶-乙酰阿卡宁、鲜红色鳞片状结晶-去氧阿卡宁、红褐色片状状结晶-β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁。α-甲基丁酰阿卡宁与异戊酰阿卡宁在硅胶柱层析上无法分离,为一个斑点(色带),可通过制备液相进行分离,分离条件是:流动相:THF:H2O=45:55;流速:1ml/min;检测波长:515nm。可分离得到的红色粘稠物α-甲基丁酰阿卡宁和红色粘稠物异戊酰阿卡宁。
试验例1对PDE4活性的抑制作用
4.1材料
受试样品:紫草萘醌类化合物,按实施例2制备
4.2方法与结果
PDE4酶的提取方法参照文献方法获得[陈武,姜代勋,杨柳,等.猪嗜中性粒细胞cAMP磷酸二酯酶的提取与活性检测[J].北京农学院学报,2003,18(4):242-244.],即参照上述文献方法制备猪嗜中性粒细胞,粒细胞用Ca/MgPBS稀释至约1011个/L,再将该稀释液在冰浴中用玻璃匀浆器制成匀浆,显微镜下确认细胞被粉碎均匀,即得富含PDE4的酶样。
首先测定酶的活性:cAMP用Ca/MgPBS配成100μmol.L-1,酶样设4个取样量,用Ca/MgPBS定容至100μL,加样过程在冰浴中进行,具体加样量见表2.加样后各管置35℃中恒温孵育30min,然后于100℃水浴中2-3min终止反应,各管于4℃15000r/min离心30min,取上清70μL,用超纯水稀释5倍(加入280μlddH2O),HPLC进样20μL,254nm波长下检测,流动相为甲醇:磷酸缓冲液=10:90。实验结果详见图1。
表2:酶反应的加样量
PDE活性以底物的水解百分率表示:
其次是测定紫草提取物对PDE活性的影响:酶反应在Ca/MgPBS中进行,cAMP用缓冲液配成100μmol.L-1,反应时取65μL,酶样量30μL,药物分五个不同浓度,用量为1μL,对照管和样品管加入提取的PDE4酶样,空白对照管加入灭活的酶样,用缓冲液定容至100μL,加样顺序见表3。
表3酶反应加样顺序及剂量
加样后各管置35℃中恒温孵育30min,然后于100℃水浴中2-3min终止反应,各管于4℃15000r/min离心30min,取上清70μL,用超纯水稀释5倍(加入280μlddH2O),HPLC进样20μL,254nm波长下检测,流动相为甲醇:磷酸缓冲液=10:90。结果详见表4。
表4紫草萘醌化合物对PDE4活性的影响
4.3试验结论:紫草萘醌类化合物对PDE4具有抑制活性。
试验例2
紫草萘醌单体化合物及含有通式(I)一种或几种的紫草提取物对大鼠炎性肠病的治疗作用
一、实验仪器与材料
动物:Wistar大鼠,雄性,SPF级,体重180-200g,购自北京大学实验动物中心,合格证号:SCXK(京)2006-2008,饲养于SPF级实验室,保持室温23士2℃,相对湿度50士10%,人工光照时间12小时/日,自动抽风,自由饮水和进食,适应7天后使用。
硫酸葡聚糖(DSS):分子量5000,购自Sigma公司;
柳氮磺胺嘧啶(SASP):购自上海信谊制药有限公司,纯度大于95%;
紫草提取物(CAN3)按实施例1制备
乙酰阿卡宁(CAN1)、β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁(CAN2),按实施例2制备;
大鼠血清TNF-α测定试剂盒:购自美国R&DSystem公司;
大鼠MPO测定试剂盒:购自南京建成生物技术有限公司
二、实验方法
1、大鼠肠炎模型的建立
将DSS溶于蒸馏水中,配制3%(W/W)的DSS水溶液,替代饮用水由Wistar大鼠(SPF级,雄性,体重180-200g)自由饮用7天。
2、动物分组及给药
7天的适应期后,Wistar大鼠(SPF级,雄性)称重后,随机分为6组,每组8只,分别为正常组(normal)、模型组(model)、阳性药组(SASP,50mg·kg-1)、乙酰阿卡宁组(CAN1,10mg·kg-1)、β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁组(CAN2,20mg·kg-1)、紫草提取物组(CAN3,40mg·kg-1)。正常组给以正常饮水,自由饮用;模型组、阳性药组、给药组分别给以3%DSS水溶液,自由饮用;同时模型组、阳性药组、给药组按上述剂量灌胃给药,每日一次;模型组及正常组灌以生理盐水。各组均正常进食。
3、疾病(进展程度)活跃情况的评估
3.1、体重
分别于造模前及造模后每日称大鼠体重,观察各组大鼠体重变化。
3.2、疾病指数(diseaseactivityindex,DAI)
观察大鼠的大便性状和隐血情况,按下列原则进行评分,得出每只大鼠的DAI。
Criteriaforscoringdiseaseactivityindex(DAI)
Diseaseactivityindex(DAI)=combinedscore(stoolconsistency+bleeding).
*Normal=well-formedpellets;loosestools=pastystoolthatdoesnotsticktoanus;
diarrhoea=liquidstoolsthatsticktoanus.
4、结肠长度
给药7天后,各组大鼠以10%水合氯醛(60mg·kg-1)腹腔注射麻醉。腹主动脉取血完毕后,分离结肠,沿肠系膜剪开肠腔,以冰冻生理盐水清洗两次,在滤纸上展开,以游标卡尺测量结肠长度。
5、免疫组织化学染色
取上述测量完长度的结肠组织,取约0.5cm溃疡附近的组织,保存于10%的福尔马林溶液中,由青岛医学院附属医院暨烟台市毓璜顶医院病理科制片染色,其余组织样本于超低温冰箱中-80℃冻存。采用计算机图像分析系统。染色后的组织标本通过显微摄像系统放大40-100倍,摄取图像。
6、结肠组织髓过氧化物酶(MPO)活性的测定
取上述取样过的结肠组织,称重,按1∶19加匀浆介质制成5%的组织匀浆,按试剂盒说明书检测并计算MPO活力。MPO活性定义为37℃时每分钟降解1μmol过氧化氢的能力,单位为:U·g-1。
抑制率计算公式如下:
7、血清TNF-α含量的测定
大鼠血清中TNF-α的测定按照R&D公司商用ELISA试剂盒的说明书测定,单位为ng·L-1。
8、数据处理
数据用平均数±标准差(MEAN±SEM)表示,采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析(ANOVA),随之各组间的差异比较用Tukey′st检验,P<0.05为差异有显著性。
三、实验结果
1、体重
如图1所示,DSS诱导形成溃疡性结肠炎后大鼠体重增长缓慢,随着病程的延长,体重逐渐下降。与模型组比较,CAN3组(40mg·kg-1)从第三天起可显著抑制大鼠体重的下降(P<0.05),CAN1、CAN2组从第5天起可显著抑制大鼠体重的下降(P<0.01)。
2、DAI指数
如图2所示,给药7天后,阳性药组及CAN3、CAN2组与模型组比较,DAI计分明显降低,
3、结肠长度
给药7天后,模型组结肠长度较正常组明显缩短。阳性药组及给药组与模型组比较,结肠长度有显著性差异。
4、结肠组织髓过氧化物酶(MPO)活性
与正常组相比,模型组结肠组织中的MPO活性明显增高,但给药组CAN3、CAN2组及阳性药组均可显著降低结肠组织中MPO含量。
5、大鼠血清中TNF-α水平
与正常组比较,给以3%DSS水溶液的各组大鼠血清中的TNF-α水平明显升高,但与模型组比较,阳性药组及给药组TNF-α水平显著性降低,可抑制DSS诱导的大鼠血清中TNF-α的含量的升高。
四、结论
紫草萘醌化合物及含有通式(I)一种或几种的紫草提取物对硫酸葡聚糖诱导的大鼠炎性肠病具明显的保护作用。结果表明,口服上述药物可以显著降低溃疡的严重程度,减轻结肠的萎缩程度,其作用与阳性药柳氮磺胺嘧啶相当。
试验例3.紫草萘醌化合物及紫草提取物对胶原诱导大鼠关节炎的影响
3.1材料
受试样品:紫草提取物,按实施例1制备。α-甲基丁酰阿卡宁+异戊酰阿卡宁β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁,按实施例2制备。
3.2方法与结果
70只雄性Wistar大鼠按体重随机分为7组,分别为:正常组、模型组、益赛普组(0.8mg/kg)、雷公藤多甙组(30mg/kg)、α-甲基丁酰阿卡宁+异戊酰阿卡宁组(CAN1,10mg/kg)、β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁组(CAN2,10mg/kg)、紫草提取物组(CAN3,20mg/kg),每组10只。造模时于每只大鼠左足足垫皮内注射牛Ⅱ型胶原(CIA)乳剂0.1ml;初次免疫10天后每只大鼠距尾根部2-3cm处皮下同等剂量加强免疫一次;14d后造模成功开始给药,连续给药28d;造模前用足趾容积测量仪测所有大鼠左右足的足趾容积,造模后每天测量CIA大鼠左足容积(原发肿胀),并同时于造模后10d开始隔天测对侧足足趾容积;造模后12d开始关节炎指数评分,每隔2d评分1次,连续32d;末次给药后1h,称取大鼠的体质量,腹主动脉取血,测定TNF-ɑ含量。
实验结果表明,紫草提取物可抑制CIA大鼠的足爪肿胀(图6、7),改善大鼠体重降低(图8),降低多发性关节炎指数评分(图9),减轻CIA大鼠的炎症表现,减轻大鼠血清中TNF-ɑ含量。
紫草提取物对CIA大鼠血清中TNF-ɑ含量的影响
与正常组比较ΔP<0.01;与模型组比较*P<0.05,**P<0.01.
结论:紫草提取物对胶原诱导大鼠关节炎有明显的治疗作用。
试验例4:
紫草提取物及紫草萘醌类化合物对大鼠COPD的作用
1材料与方法
1.1材料
健康SD大鼠40只,鼠龄4~8W,体重(210±20)g,雌雄不限,由山东中医药大学实验动物中心提供。香烟为烤烟型八喜牌(青州卷烟厂出品,焦油量15mg,烟气烟碱量1.1mg);LPS(美国Sigma公司);肿瘤坏死因子TNF-α试剂盒(天津九鼎医学生物工程有限公司);紫草提取物(按实施例1制备),乙酰阿卡宁,β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁(按实施例2制备)。
1.2动物分组和模型建立
健康SD大鼠40只,雌雄不限,随机分成5组,每组8只,正常对照组(对照组):在正常环境下饲养,将大鼠于第1、14天气管内注入生理盐水0.2ml,第8天起每天腹腔注射生理盐水0.05ml/kg,至28天处死;慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型组(模型组):将大鼠于第1、14天气管内注入脂多糖(LPS)各200μg/200μl,第2~13天、5~28天在自制吸烟染毒箱(70cm×50cm×50cm,右上方带有1.5cm×1.5cm通气孔)内熏香烟2次/d,吸烟量为14支/次,其中每次吸烟时间1h,两次吸烟间隔为1h。第8天起每天腹腔注射生理盐水0.05ml/kg,至第28天处死;治疗组1(紫草提取物组):气管内注入LPS及熏香烟过程同模型组,第8天起每天口服灌胃给药160mg/kg,至第28天处死。治疗组2(乙酰阿卡宁组)、治疗组3(β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁组):气管内注入LPS及熏香烟过程同模型组,第8天起每天口服灌胃给药80mg/kg,至第28天处死。
1.3支气管肺泡灌洗液(BALF)的采集
将大鼠用2%的戊巴比妥(25mg/kg)麻醉后仰卧固定于操作台,切开胸部,暴露出气管和双肺,结扎右主支气管,在隆突上用套管针穿刺至左肺,缓慢注入无菌生理盐水3ml,每次注入后立即回吸得到BALF,重复3次。灌洗液纱布过滤,回收率为60%~70%。吸取1ml该BALF到血细胞计数器上,计数白细胞总数及多形核中性粒细胞(PMN)数。余BALF4℃1500r/min离心10min,取其上清液置入EP管保存于-20℃冰箱中待检TNF-α浓度。
1.4TNF-α浓度检测
应用TNF-α检测试剂盒,按说明书用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定TNF-α的浓度。
1.5病理标本制备和形态定量分析
取每只大鼠的隆突上2~3mm处的气管及中叶肺组织5mm3大小,10%福尔马林固定,酒精梯度脱水,浸蜡,包埋,切片,HE染色,光镜观察。将经过4%戊二醛固定的1mm3右肺组织漂洗,用2%四氧化锇后固定,丙酮梯度脱水,包埋,聚合,切片,醋酸铀-枸橼酸铅电子染色,透射电镜观察,并应用显微-微机图像处理系统,测量下列指标:①肺平均内衬间隔(MLI),其数值反映肺泡平均直径。
②平均肺泡数(MAN),其数值反映肺泡密度。
1.6统计学处理
以SPSS12.0统计软件,计量资料以表示,两组间比较用q检验,三组间比较用单因素方差分析。
2结果
2.1肺组织形态学定量分析
与对照组比较,模型组MLI升高,MAN降低,差异非常显著(均P<0.01);与模型组比较,治疗组MLI降低,MAN升高,差异非常显著(均P<0.01),见表5。
2.2BALF细胞计数和PMN数
与对照组比较,模型组BALF中白细胞总数及PMN数增加,差异非常显著(均P<0.01);与模型组比较,治疗组BALF中白细胞总数及PMN数明显下降,差异非常显著(均P<0.01),见表5。
2.3BALF中TNF-α水平的变化
与对照组比较,模型组BALF中TNF-α浓度升高,差异非常显著(P<0.01);与模型组比较,治疗组TNF-α浓度降低,差异非常显著(P<0.01),见表5。表5各组大鼠BALF细胞总数、PMN数、TNF-α的水平及肺组织MLI、MAN比较(±s,n=8)
与对照组比较:*P<0.01,#P<0.01
3结论
本实验通过熏吸香烟加气管内注射LPS法建立COPD大鼠模型,能类似地反映人类疾病的病理形成过程。同时,分析显示,模型组反映肺泡平均直径的MLI较对照组增高,而反映肺泡密度的MAN较对照组显著降低,两个指标的差异显著,说明动物模型制作成功。
本结果显示,治疗组大鼠病理学检查提示肺组织损伤较模型组大鼠减轻,MLI较模型组降低,MAN较模型组升高,说明治疗组在一定程度上可减轻COPD肺损伤,对肺气肿结构的改建起到了一定的防治、缓解作用。同时治疗组大鼠BALF中TNF-α浓度、白细胞总数、PMN数较模型组明显下降,提示治疗组可减少肺内PMN的浸润,抑制由TNF-α和LPS引起的细胞黏附分子-1(ICAM-1)表达,使TNF-α水平下降,减轻肺水肿,保护肺微血管内皮细胞,改善微循环。
实验证明,紫草提取物及紫草萘醌类化合物对于治疗慢性阻塞性肺疾病具有一定的疗效。
试验例5:
紫草提取物及紫草萘醌类化合物对哮喘大鼠的治疗作用
1材料与方法
1.1材料
Wistar大鼠由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,体重180~200g,卵清蛋白(OVA)由美国Sigma公司生产,IgE、IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ检测试剂盒购自晶美生物工程有限公司,紫草提取物按实施例1制备,乙酰阿卡宁、β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁按实施例2制备。
1.2动物分组及模型制备
60只SPF级健康雄性大鼠采用随机数字表法分成健康对照组(I组)、哮喘模型组(II组)、紫草提取物治疗组(III组)、乙酰阿卡宁治疗组(IV组)、β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁(V组)、哮喘治疗阴性对照组(VI组),10只/组。II-VI组大鼠用OVA氢氧化铝混合液1ml(OVA100mg+氢氧化铝100mg+生理盐水lm1)。第1天腹腔注射致敏,第7天重复1次加强致敏,第14天置入无色、透明、密闭玻璃箱中,用1%OVA(OVA100mg+生理盐水10m1)雾化吸人激发(雾粒直径2.5-5μm),1次/d,30min/次,连续2周,I组大鼠腹腔注射致敏用等体积生理盐水代替OVA氢氧化铝混合液,超声雾化吸入激发用等体积生理盐水代替OVA,III组大鼠每次激发前1h灌胃给药120mg/kg,IV、V组大鼠每次激发前1h灌胃给药60mg/kg。VI组大鼠每次激发前用等体积生理盐水代替治疗组灌胃给药。所有大鼠在末次激发后6h用3%戊巴比妥钠(1ml/kg)腹腔注射麻醉,仰卧位固定后开胸,取中心静脉血2ml测定IgE含量,于左肺主支气管切开一小口,插入直径3mm塑料软管后固定,用4℃生理盐水行支气管肺泡灌洗,每次用量2ml,连续灌洗3次,回收率>70%,将支气管肺泡灌洗液(BALF)4℃离心,1200r/min,10min,取细胞沉渣用于细胞计数与分类,上清液-20℃保存用于细胞因子的检测。
1.3BALF细胞计数与分类
BALF离心后细胞沉渣用2mlHanks稀释,取lm1于血细胞计数器测定白细胞总数,取0.2ml作细胞涂片,瑞氏染色,400倍显微镜下至少数200个细胞,行细胞分类计数,计算各类细胞含量。
1.4静脉血IgE及BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ含量测定
均采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(SandwichELISA)测定,按试剂说明书进行操作。
1.5统计学处理
采用SPSS13.0统计软件对数据进行统计学处理,数据用表示,采用独立样本t检验分别进行组间比较,P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1大鼠激发后反应
II、VI组大鼠激发后约5min开始烦躁不安,抓鼻,随后呼吸加深加快,点头呼吸,口鼻发绀,活动明显减少,I组大鼠无上述反应,III、IV、V组大鼠反应较轻。
2.2BALF细胞计数与分类
II组BALF中中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞计数显著高于I组(P<0.01),与II组比较,III、IV、V组能显著降低BALF中中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞(P<0.01),II组与VI组中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及单核巨噬细胞计数差异均无统计学意义(P>0.05),见表6。
表6各组大鼠BALF细胞分类与计数(×105个/L,
与I组比较,*P<0.01;与II组比较,&P<0.01
2.3静脉血IgE及BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ含量
II组静脉血IgE及BALF中IL-4、IL-5、IL-13含量显著高于I组(P<0.01),与II组比较,III-V组能够显著降低静脉血中IgE及BALF中IL-4、IL-5、IL-13,显著升高BALF中的IFN-γ(P<0.01);II组与VI组IgE、IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ含量差异无统计学意义(P>0.05),见表7。
表7各组大鼠静脉血IgE及支气管肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ含量比较
与I组比较,*P<0.01;与II组比较,&P<0.01
3讨论
本研究成功制备了支气管哮喘大鼠模型,研究发现,哮喘大鼠急性期肺组织中IL-4、IL-5、IL-13产生增多,IFN-γ产生减少,伴有中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞浸润,IgE合成增多;而灌胃给药紫草治疗组(III、IV、V)能减少哮喘大鼠肺组织中IL-4、IL-5、IL-13的产生,促进IFN-γ的生成,减轻中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞浸润,使IgE合成减少,明显缓解大鼠哮喘发作程度。灌胃给药紫草后Th细胞调节因子IL-4下降,IFN-γ上升,提示紫草可能阻止Th0细胞分化为Th2细胞,促进Th0细胞分化为Thl细胞;IL-5、IL-13和IgE的产生减少提示紫草还可以调节炎症反应,减轻I型超敏反应的发生。
综上所述,紫草提取物及紫草萘醌类化合物能减轻气道炎症,降低气道高反应性,从而达到防治哮喘发作的目的。