CN113577115B - 黄金茶挥发油在制备lps诱导急性肺损伤保护药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了黄金茶挥发油在制备LPS诱导急性肺损伤保护药物中的应用，属于医药用途技术领域，本发明使用实验手段考察了黄金茶挥发油对脂多糖(LPS)诱导急性肺损伤的保护作用。黄金茶挥发油显著改善LPS诱导的肺组织病理损伤；并进一步确认其药理作用是通过恢复LPS所致白细胞数量减少的现象，降低胸腺和脾脏肿大程度，下调血清促炎因子的水平，增强抗氧化防御能力以及提高短链脂肪酸含量实现的。基于黄金茶挥发油以上新性质，本发明确定了利用其制备由LPS所诱导的急性肺损伤保护药物的新用途，其疗效好，毒副作用小，具有良好的前景价值。

Description

黄金茶挥发油在制备LPS诱导急性肺损伤保护药物中的应用

技术领域

本发明属于医药用途技术领域，进一步涉及物质的新的医药用途，具体涉及黄金茶挥发油在制备LPS诱导急性肺损伤保护药物中的应用。

背景技术

近年来，由于空气污染加重及人类生活习惯的转变，急性肺损伤的发病率逐年上升，其发病率约为34/10万，死亡率约34％-58％。急性肺损伤是以肺部急性炎症为特征的一种失控性炎症疾病，是败血症、严重创伤等危重疾病的并发症。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁的一种主要组分，是导致急性肺损伤常见的诱因。因此在本技术中采用腹腔注射LPS建立大鼠急性肺损伤模型。当肺部暴露于LPS时，LPS可以与细胞表面膜受体(Toll样受体和NOD样受体)结合，并激活炎症反应的相关信号通路，导致促炎细胞因子，如白细胞介素1β(IL-1β)等过量的产生，促进急性肺损伤的发生和发展。因此，研发具有抗炎作用的药物对急性肺损伤的防治是十分紧急且重要的。

本实验室黄金茶由山腊梅嫩叶，并制备而成。黄金茶的活性成分繁复，主要含有挥发油、多糖、生物碱、黄酮、香豆素、鲨肌醇、东莨菪苷、异嗪皮啶等物质。挥发油被认为是黄金茶中的主要活性物质之一，从黄金茶挥发油中鉴定出21种化学物质，其中，(1-甲基-4-丙-1-烯-2-基环己基)乙酸酯的含量达到50.67％，其次是α-蒎烯(6.92％)、α-乙酸松油酯(5.77％)、环氧化蛇麻烯II(3.96％)、伪柠檬烯(3.21％)和右旋大根香叶烯(3.12％)等。现代临床实验证实，黄金茶挥发油具有良好的止咳平喘、免疫调节、促进消化、减少体脂等作用。但是有关黄金茶挥发油对LPS诱导的急性肺损伤作用是未见报道。

发明内容

针对现有技术中的不足与难题，本发明旨在提供一种黄金茶挥发油在制备LPS诱导急性肺损伤药物中的应用。

本发明通过以下技术方案予以实现：

本发明提供黄金茶挥发油的一种新用途，其用于制备LPS诱导急性肺损伤保护药物中的应用。

作为优选，所述保护药物是缓解由LPS所致的全身性炎症损伤。

作为优选，所述保护药物是改善LPS诱导的肺组织病理损伤实现的。

作为优选，所述保护药物是通过调节大鼠血液中白细胞数量至正常水平实现的。

作为优选，所述保护药物是通过降低由LPS所引起胸腺和脾脏肿大程度实现的。

作为优选，所述保护药物是通过降低血清和肺组织中促炎因子(IL-1β)水平实现的。

作为优选，所述保护药物是增强肺组织中SOD活性以及降低MDA含量实现的。

作为优选，所述保护药物是通过增强肠道提高短链脂肪酸含量实现的。

作为优选，所述保护药物用于抵抗和缓解由LPS所致急性肺损伤，其通过减轻肺组织结构损伤及炎症细胞浸出实现的。

作为优选，所述药物药物的剂型是口服剂。

与现有技术相比，本发明有益效果包括：

(1)本发明考察了黄金茶挥发油对脂多糖(LPS)诱导急性肺损伤的保护作用。黄金茶挥发油显著改善LPS诱导的肺组织病理损伤；并进一步确认其药理作用是通过恢复LPS所致白细胞数量减少的现象，降低胸腺和脾脏肿大程度，下调血清促炎因子的水平，增强抗氧化防御能力以及提高短链脂肪酸含量实现的。

(2)基于黄金茶挥发油新性质，本发明确定了利用其制备由LPS所诱导的急性肺损伤保护药物的新用途，其疗效好，毒副作用小，具有良好的前景价值。

附图说明

图1是本发明黄金茶挥发油的总离子流色谱图。

图2是本发明具体实施方式中不同实验组之间血清中WBC含量；

图3是本发明具体实施方式中不同实验组之间胸腺指数(A)和脾脏指数(B)；

图4是黄金茶挥发油对LPS诱导急性肺损伤模型大鼠肺组织形态学变化的影响；图中CON为正常对照组，LPS为LPS模型组(腹腔注射800μg/kg浓度的LPS水溶液)；DEX组为地塞米松阳性组(腹腔注射5μg/kg浓度的地塞米松磷酸钠水溶液)；在10倍×4倍倒置显微镜下观察组织损伤病变的情况；

图5是本发明具体实施方式中不同实验组之间血清中IL-10水平(A)、IL-1β水平(B)对比图；

图6是本发明具体实施方式中不同实验组之间肺组织中SOD活力(A)以及MDA含量(B)对比图；

图7是本发明具体实施方式中不同实验组之间盲肠内容物中短链脂肪酸对比图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明作进一步地说明。

1、实验材料

1.1材料与试剂

黄金茶由江西省婺源县专业合作社栽培采集的山蜡梅嫩叶制备而成。黄金茶挥发油提取通过如下方法所得：称取600g黄金茶。浸泡于超纯水(1∶40，w/v)，微波处理10min，用水蒸气蒸馏提取5小时，加入无水硫酸钠，干燥后得到黄金茶挥发油，并储存在4℃冰箱里。黄金茶挥发油主要为酯类和萜类化合物，其中(1-甲基-4-丙-1-烯-2-基环己基)乙酸酯的含量达到50.67％，其次是α-蒎烯(6.92％)、α-乙酸松油酯(5.77％)、环氧化蛇麻烯II(3.96％)、伪柠檬烯(3.21％)、右旋大根香叶烯(3.12％)等。

LPS(美国Sigma公司，来源于大肠杆菌055：BS)，地塞米松磷酸钠溶液(河南润弘制药股份有限公司)，大鼠IL-10、IL-1B试剂盒购自于武汉博士德公司，SOD、MDA试剂盒购自于南京建成生物工程研究所。

实验动物：清洁级大鼠Wistar雄性大鼠，体重180-200g，资格证号：SCXK(Jing)2016-0006。购自于北京维通利华公司。

1.2主要仪器设备

Sysmex XE-2100全自动血细胞分析仪日本公司；高速台式离心机德国sigma公司；全波长扫描式多功能读数仪(多功能酶标仪)美国Thermo公司；超纯水仪美国Millipore公司；M1-L201B型微波炉购于美的制冷家电集团；SKM型数显恒温电热套购于山东鄄城华鲁电热仪器有限公司；生化培养箱上海森信实验仪器公司；Agilent 6890N气相色谱系统美国Agilent Technologies公司。

2、实验方法

2.1 GC-MS分析黄金茶挥发油组成

精密量取最优工艺条件下制备的黄金茶挥发油7.5μL，加入1.5mL正己烷，并用无水硫酸钠除水，5000r/min离心10min，取上清液得到待测溶液，通过0.22μm有机滤膜过滤后直接进样分析。色谱条件：HP-5MS毛细管色谱柱(250μm×30m，0.25μm)，载气为高纯氮气，柱流量为1.0mL·min-1，进样量为1μL，分流进样，分流比20∶1，进样口温度280℃，升温程序：柱温70℃，保持2min，10℃·min-1的速率升至100℃，随后以2℃·min-1的速率升至123℃并保持3min，再以5℃·min-1的速率升至160℃，10℃·min-1的速率升至220℃，2℃·min-1的速率升至230℃并保持5min。质谱条件：接口温度280℃，电子轰击(EI)能量70eV，离子源温度230℃，MS回级杆温度150℃溶剂延迟7min，全扫描，质荷比20～500amu，通过GC-MS对黄金茶挥发油进行分析的总离子流色谱图如图1所示。结合NIST数据库并查阅文献对挥发油组分进行鉴定，采用峰面积归一化法计算各组分的相对百分含量。

2.2动物实验设计

选取36只健康清洁级大鼠Wistar雄性大鼠，体重180-200g，资格证号：SCXK(Jing)2016-0006。购自于北京维通利华公司。许可证号：SCXK(赣)2018-0003。大鼠饲养于干燥、通风、安静的环境中，适应性喂养一周。按体重随机分成5组，每组7只，随机分为6组：正常组(CON)、阳性对照组(地塞米松组，DEX，5mg/kg)、模型组(LPS，800μg/kg)、LPS+黄金茶挥发油低剂量(CEOL，25mg/kg)、LPS+黄金茶挥发油中剂量(CEOM，50mg/kg)、LPS+黄金茶挥发油高剂量(CEOH，100mg/kg)。黄金茶挥发油组的大鼠均通过灌胃方式给予前处理7天。正常组和LPS组的大鼠通过灌胃方式给予相同体积的0.5％DMSO。DEX组的大鼠通过灌胃方式给予相同体积的0.5％DMSO最后一天腹腔注射DEX(5mg/kg)。末次灌胃后0.5h，腹腔注射LPS溶液800μg/kg建立急性肺损伤模型，6h后处死，进行各相关指标的测定。

动物实验过程中选用的DEX(地塞米松)是临床上一种广泛运用抗炎药物，已有大量研究报道，DEX作为一种糖皮质激素，具有抗炎、抗内毒素、抑制免疫、抗休克及增强应激反应等药理作用，可以有效的减弱LPS所导致的机体损伤，减弱机体过度炎症反应，维护免疫系统的平衡，因此本发明中选用DEX作为阳性对照组是合适的。

2.3实验样品采集

血清样品的制备：腹腔注射LPS溶液造模6h后，用异氟烷进行麻醉。采用眼眶取血，取全血500μL于抗凝管，用于白细胞数量检测。其余血加入10mL离心管中，室温静置2h，以3000r/min，4℃离心分离10min，收集上层血清样本，于-80℃冰箱保存备用。

收集大鼠脾脏、胸腺和肺，称重记录，计算脏器指数。

肺组织病理切片：取约2cm*2em的肺片于盛满10％福尔马林固定液的4mL EP管中，并进行常规梯度脱水、包埋、切片、拷片，HE染色，镜下观察组织损伤病变的情况。

血清中炎症介质的测定

IL-10、IL-1B采用酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒检测。按照试剂盒说明书上的操作步骤进行检测和计算。

肺组织中抗氧化防御能力的测定

SOD、MDA采用试剂盒检测。按照试剂盒说明书上的操作步骤进行检测和计算。

盲肠内容物中短链脂肪酸的测定

取100mg盲肠内容物样品于2mL EP管中，按照1∶7比例加入超纯水，60HZ，60s振动混匀，冰浴超声10min后静置20min，4℃下离心，取上清过膜，测定短链脂肪酸。

统计学处理

实验数据采用平均值士标准误差(mean±SEM)表示，组间差异采用SPSS23.0进行单因素ANOVA分析，并通过LSD检验5％的置信水平，GraphPadPrism 7作图。

3、结果与分析

3.1 GC-MS结果分析。

对黄金茶挥发油进行GC-MS检测分析，共分离出23个峰，并采用面积归一化法计算黄金茶挥发油各组分相对含量。数据显示，有21种成分被鉴定出，鉴定出的物质成分占总峰的93.27％，黄金茶挥发油主要以萜类化合物为主，是该挥发油香气的主要成分。在鉴定出的化合物中，相对含量在1％以上的有15种，占被检测物质总量的88.75％，其中(1-甲基-4-丙-1-烯-2-基环己基)乙酸酯的含量达到50.67％，其次是α-蒎烯(6.92％)、α-乙酸松油酯(5.77％)、环氧化蛇麻烯II(3.96％)、伪柠檬烯(3.21％)、右旋大根香叶烯(3.12％)等。

3.2黄金茶挥发油对急性肺损伤模型大鼠血清中白细胞数量的影响

如图2所示，与正常组相比，模型组大鼠血液中白细胞数量显著降低，表明LPS处理大鼠的免疫系统是紊乱的。与模型组相比，黄金茶挥发油组和地塞米松组大鼠中的白细胞数量显著增加。与LPS组相比，100mg/kg BW黄金茶挥发油或DEX处理促进白细胞数量的显着增加。

3.3黄金茶挥发油对急性肺损伤模型大鼠免疫器官指数的影响

如图3所示，胸腺和脾脏是重要的免疫器官，其器官指数可作为评估宿主免疫能力的指标。与正常组相比，模型组大鼠的胸腺和脾脏指数均明显增加，且具有显著性差异。黄金茶挥发油预处理后可以显著减轻LPS所诱导脾脏和胸腺肿大，并与正常组相接近。与模型组相比，相似地DEX预处理后，脾脏指数明显降低。

3.4黄金茶挥发油对急性肺损伤模型大鼠肺组织形态学变化的影响

如图4所示，经检测得，正常对照组肺组织结构完整，无异常状态。与正常组相比，模型组肺泡腔变小，肺泡壁增厚，间质水肿且有大量炎症细胞浸润。以上病理变化，表明急性肺损伤模型建立成功。与模型组相比，黄金茶挥发油组和DEX组大鼠肺组织结构较完整，趋于正常且炎性细胞浸润得到缓解。

3.5黄金茶挥发油对急性肺损伤模型大鼠血清中炎症因子IL-10、IL-1β的影响

如图5所示，模型组的血清IL-1β和IL-10的水平明显高于正常组。与模型组相比，DEX组、黄金茶挥发油低剂量组和挥发油中剂量组IL-1β显著下降。DEX组的IL-10显著下降，但各剂量组黄金茶挥发油的结果并不显著。值得注意的是，与LPS组相比，DEX和中等剂量的黄金茶挥发油预处理可以抑制LPS诱导的IL-10和IL-1β的产生。此外，当剂量为50mg/kg BW时，黄金茶挥发油可以明显抑制IL-1β的增强。实验结果表明口服不同浓度的黄金茶挥发油均可有效的减缓LPS所有的临床炎症症状，对血清和促炎因子分泌有抑制作用。

3.6黄金茶挥发油对急性肺损伤模型大鼠肺组织中氧化应激水平的影响。

如图6所示，与正常组相比，模型组肺组织SOD活性显著下降，MDA含量显著增加。在所有的黄金茶挥发油组中，与模型组组相比，中剂量组是在SOD活性方面最有效的。此外，与模型组相比，黄金茶挥发油组导致MDA含量显著降低。我们还发现，黄金茶挥发油中剂量组和高剂量组导致MDA含量较低。同时，DEX组的SOD活性增加，MDA含量降低。实验结果表明口服不同浓度的黄金茶挥发油均可有效的肺组织中增强氧化应激水平。

3.7黄金茶挥发油对急性肺损伤模型大鼠盲肠内容物中短链脂肪酸的影响。

如图7所示，与正常组相比，模型组的短链脂肪酸(丙酸、丁酸、异丁酸和异戊酸)显著下降。然而，在接受黄金茶挥发油治疗后，短链脂肪酸显著增加，但在DEX组中没有观察到，这表明黄金茶挥发油的肺保护可能与其对调节急性肺损伤大鼠的短链脂肪酸的影响有关。

注：在图2、3、5、6、7中，与CON组相比，*表示差异显著(P＜0.05)，**表示差异极显著；与LPS组相比，#表示差异显著(P＜0.05)，##表示极显著性(P＜0.01)，(mean±SEM，n＝6)。

4、实验结论

黄金茶挥发油可显著地抑制白细胞数量的减少，降低胸腺和脾脏指数，使其接近正常对照组的自然水平。实验结果也发现黄金茶挥发油可显著改善LPS诱导的肺组织病理损伤。同时，本实验还发现黄金茶挥发油对LPS所诱导的炎症性介质IL-1β具有确切的抑制作用。此外，黄金茶挥发油对急性肺损伤的这些有益影响被暗示与其抗氧化防御能力有关。此外，黄金茶挥发油能显著改善盲肠内容物中的短链脂肪酸。因此，口服黄金茶挥发油对急性肺损伤的有一定的保护作用。

以上所述仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.黄金茶挥发油在制备LPS诱导急性肺损伤保护药物中的应用，其特征在于：

所述黄金茶挥发油由山蜡梅嫩叶通过超纯水浸泡、微波处理、水蒸气蒸馏提取、加入无水硫酸钠、干燥步骤制备而成，所述黄金茶挥发油的主要组成为酯类和萜类化合物，按照质量百分比从大至小依次包括(1-甲基-4-丙-1-烯-2-基环己基)乙酸酯、α-蒎烯、α-乙酸松油酯、环氧化蛇麻烯II、伪柠檬烯和右旋大根香叶烯；

所述黄金茶挥发油用于调节LPS损伤条件下血液中白细胞数量至正常水平、降低由LPS所引起胸腺和脾脏肿大程度、减轻血清中促炎因子IL-1β水平、增强肺组织中SOD活性以及降低MDA含量、增强肠道提高短链脂肪酸含量。

2.根据权利要求1所述的黄金茶挥发油在制备LPS诱导急性肺损伤保护药物中的应用，其特征在于：所述保护药物用于缓解由LPS所致的全身性炎症损伤。

3.根据权利要求2所述的黄金茶挥发油在制备LPS诱导急性肺损伤保护药物中的应用，其特征在于：所述保护药物用于改善LPS诱导的肺组织病理损伤。

4.根据权利要求3所述的黄金茶挥发油在制备LPS诱导急性肺损伤保护药物中的应用，其特征在于：所述保护药物用于抵抗和缓解由LPS所致急性肺损伤，其通过减轻肺组织结构损伤及炎症细胞浸出实现。

5.根据权利要求1所述的黄金茶挥发油在制备LPS诱导急性肺损伤保护药物中的应用，其特征在于：所述保护药物为口服制剂。

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