CN103898061B - 半固体培养基及其制备方法和杂交瘤细胞筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种半固体培养基，其包括甲基纤维素溶液、2×1640培养基、L-谷氨酰胺溶液、β-巯基乙醇溶液、胎牛血清、青霉素与链霉素混合溶液、HAT溶液及抗原包被的纳米金颗粒溶液。该半固体培养基可直接用于杂交瘤细胞的培养和筛选，不仅能减少培养过程总亚克隆的次数，在很大程度上降低劳动强度，而且可以使单个细胞株之间生长空间相对独立，减少克隆株与克隆株之间的接触抑制备用，同时通过引入包被有抗原的纳米金颗粒，使得能一步筛选到分泌目的抗体的单抗隆细胞株，进一步节省了单克隆筛选的时间。此外，本发明还涉及一种半固体培养基的制备方法以及使用该半固体培养基的杂交瘤细胞筛选方法。
Description
技术领域
本发明涉及细胞工程领域，尤其是涉及一种半固体培养基及其制备方法和杂交瘤细胞筛选方法。
背景技术
抗体主要是由B淋巴细胞合成，每个B淋巴细胞均含有合成一种抗体的遗传基因。当机体受刺激时，抗原分子上的许多抗原决定簇分别激活各个具有不同基因的B淋巴细胞。将激活的单一B淋巴细胞进行培养，得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，称为单克隆。单克隆细胞合成针对一种抗原决定簇的抗体，即单克隆抗体（简称单抗）。
1975年德国学者Kohler和英国学者Milstein将小鼠骨髓瘤细胞核经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞在体外进行两种细胞的融合，形成杂交瘤（hybridoma）细胞，这种细胞继承两种亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞无限繁殖的特性，又具有合成和分泌抗体的能力。用这种来源于单个融合细胞增殖的细胞群，可制备针对一种抗原决定簇的特异性单克隆抗体。时至今日单克隆抗体技术被不断日臻完善，但有一个问题一直困扰着单抗制备的研究人员和制约着单抗的通量化和规模化生产，即如何减少单抗制备过程中的人力成本，缩短单抗制备所需要的时间，从而降低单个单抗制备的成本。
杂交瘤细胞所分泌的抗体-单克隆抗体是目前认为的最为成熟与可靠的分子识别工具，被广泛应用于生物学研究的各个领域。然而由于杂交瘤细胞株的制备周期长，所需的劳动强度高，已经成为制约杂交瘤细胞制备的重要瓶颈之一。单抗制备过程中最重要也是最为需要人力资源的一步是分泌特异性抗体的筛选工作，好的筛选方案是单克隆抗体制备成功与否的关键，传统通用的筛选方法是通过固相酶联免疫（ELISA）法进行筛选，从成千上万个融合后的杂交瘤细胞中筛选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，随着制备过程的进行，有些不稳定的杂交瘤细胞失去了分泌特异性抗体的功能，在制备的末期甚至会失去全部的分泌特异性抗体的杂交瘤，导致单抗制备的失败。几十年来在筛选的方法上也存在众多的改进，如通过流式细胞仪对杂交瘤细胞所分泌的抗体进行筛选，可以筛选出亲和力较高的抗细菌膜抗原的单抗，近年来，蛋白芯片技术的不断成熟也为单抗的筛选提供了一些新的方法，Sawyer利用蛋白芯片结合多蛋白的复合免疫，进行单抗制备，取得了较好的结果。但所有这些改进，对于筛选中工作量的降低都不明显。
单抗制备过程中的另外一个需要工作量较大的部分是克隆化培养，常用的方法是有限稀释法，由于杂交瘤细胞的基因组的不稳定性，使得其在后续的培养中，会发生染色体丢失现象，即使杂交瘤细胞在建株后，仍可能会丢失编码抗体的染色体，使杂交瘤细胞失去分泌特异性抗体的能力。因此，在单抗制备初期，人们总是尽可能多的将所有阳性细胞进行克隆化培养，以期最大限度的保留分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，从而造成了巨大工作量。有限稀释法不仅劳动强度大，周期长，而且也需要很丰富的克隆筛选经验，严格把握好亚克隆的时间，操作繁琐。
发明内容
基于此，有必要提供一种使杂交瘤细胞筛选培养周期较短、操作简便的半固体培养基及其制备方法。
一种半固体培养基，包括如下体积份数的各组分：
浓度为0.4g/ml的甲基纤维素溶液10；
pH7.0~7.4的2×1640培养基18；
浓度为1mol/l的L-谷氨酰胺溶液0.16；
浓度为1mmol/l的β-巯基乙醇溶液0.5；
胎牛血清10；
10000单位/ml的青霉素与10000μg/ml链霉素混合溶液0.4；
50×HAT溶液0.8；及
抗原包被的纳米金颗粒溶液0.1；
其中，每毫升所述抗原包被的纳米金颗粒溶液是通过将1μg的抗原-PEG6-CONHNH2、1ml的纳米金颗粒溶液及1mmol的mPEG-SH分别室温震荡孵育后20min后，2500×g4℃离心30min，用1×PBS缓冲液稀释至990μl，再加入10μl的质量分数为20%的PEG溶液制备得到；其中，所述纳米金颗粒溶液是向沸腾的50ml0.254mM的氯金酸溶液逐滴加入0.94ml38.8mM的柠檬酸三钠溶液继续煮沸5min后冷却而成。
在其中一个实施例中，所述甲基纤维素为4000cp的甲基纤维素。
在其中一个实施例中，所述纳米金颗粒的粒径在10~18nm之间。
一种半固体培养基的制备方法，包括如下步骤：
分别制备浓度为0.4g/ml的甲基纤维素溶液、pH7.0~7.4的2×1640培养基、浓度为1mol/l的L-谷氨酰胺溶液及浓度为1mmol/l的β-巯基乙醇溶液；
向氯金酸溶液中加入柠檬酸三钠溶液进行加热还原反应，制备浓度为0.25mmol/l的纳米金颗粒溶液；
向抗原溶液中加入Na2HPO4溶液，得到抗原混合液，再向所述抗原混合液中加入NaIO4溶液，室温下黑暗环境中孵育30分钟后加入PBS缓冲液终止反应，然后加入PEG6-CONHNH2溶液，孵育1小时后向得到的混合液中加入HEPES溶液，混匀后用10MWCO的超滤管以2000×g的转速在4℃下离心处理至所述超滤管中余留25%溶液，用HEPES重悬超滤管中余留的溶液，制备浓度为100μg/ml的抗原-PEG6-CONHNH2溶液；
按照体积比为1:10的比例将所述抗原-PEG6-CONHNH2溶液加入至所述纳米金颗粒溶液中，室温下震荡孵育20分钟后加入与所述抗原-PEG6-CONHNH2溶液等体积的浓度为10mol/l的mPEG-SH溶液，室温下震荡20分钟后转入离心管中以2500rpm的转速在4℃下离心处理，弃上清，用9.9倍于所述抗原-PEG6-CONHNH2溶液体积的1×PBS缓冲液重悬沉淀，再补加入0.1倍于所述抗原-PEG6-CONHNH2溶液的质量浓度为20%的PEG溶液，得到抗原包被的纳米金颗粒溶液；
向所述甲基纤维素溶液中依次加入所述2×1640培养基、所述L-谷氨酰胺溶液、所述β-巯基乙醇溶液、胎牛血清、10000单位/ml的青霉素与10000μg/ml链霉素混合溶液、50×HAT溶液及所述抗原包被的纳米金颗粒溶液，4℃下搅拌均匀得到所述半固体培养基，其中，所述甲基纤维素溶液、所述2×1640培养基、所述L-谷氨酰胺溶液、所述胎牛血清、所述10000单位/ml的青霉素与10000μg/ml链霉素混合溶液、所述50×HAT溶液及所述抗原包被的纳米金颗粒溶液的体积比为10:18:0.16:0.5:10:0.4:0.8:0.1。
在其中一个实施例中，所述甲基纤维素为4000cp的甲基纤维素。
在其中一个实施例中，所述纳米金颗粒的粒径在10~18nm之间。
此外，还有必要提供一种周期较短、操作简便的杂交瘤细胞筛选方法。
一种杂交瘤细胞的筛选方法，包括如下步骤：
按照上述半固体培养基的制备方法制备所述半固体培养基；
将融合后的杂交瘤细胞与37℃下预培养16~24小时后转入所述半固体培养基中，混匀后，加入碱性成纤维细胞生长因子5ng/ml和杂交瘤细胞融合克隆因子15ul/ml，混匀，分装在37℃、5%体积的CO2条件下培养；
培养7~14天后，待长出肉眼可见的单克隆菌落时，在体式显微镜下用微量移液器将具有颜色反应的克隆株从该培养皿中移至多微孔板中用液体培养的方法放大培养，每孔移入1个克隆进行细胞冻存培养。
上述半固体培养基可直接用于杂交瘤细胞的培养和筛选，不仅能减少培养过程总亚克隆的次数，在很大程度上降低劳动强度，而且可以使单个细胞株之间生长空间相对独立，减少克隆株与克隆株之间的接触抑制备用，同时通过引入包被有抗原的纳米金颗粒，使得能一步筛选到分泌目的抗体的单抗隆细胞株，进一步节省了单克隆筛选的时间。甲基纤维素介质能克服琼脂糖熔点高的缺点，在室温下即可操作，不用担心凝固问题。纳米金颗粒的制备简单，颗粒大小可调。结合纳米金包被的抗原进行杂交瘤细胞的筛选，能更大程度的缩短筛选周期，降低劳动强度。
附图说明
图1为一实施方式半固体培养基的制备流程图。
具体实施方式
下面主要结合附图及具体实施例对半固体培养基及其制备方法和杂交瘤细胞的筛选方法作进一步详细的说明。
一实施方式的半固体培养基，包括如下体积份数的各组分：
浓度为0.4g/ml的甲基纤维素溶液10；
pH7.0~7.4的2×1640培养基18；
浓度为1mol/l的L-谷氨酰胺溶液0.16；
浓度为1mmol/l的β-巯基乙醇溶液0.5；
胎牛血清10；
10000单位/ml的青霉素与10000μg/ml链霉素混合溶液0.4；
50×HAT溶液0.8；及
抗原包被的纳米金颗粒溶液0.1；
其中，每毫升所述抗原包被的纳米金颗粒溶液是通过将1μg的抗原-PEG6-CONHNH2、1ml的纳米金颗粒溶液及1mmol的mPEG-SH分别室温震荡孵育后20min后，2500×g4℃离心30min，用1×PBS缓冲液稀释至990μl，再加入10μl的质量分数为20%的PEG溶液制备得到；其中，所述纳米金颗粒溶液是向沸腾的50ml0.254mM的氯金酸溶液逐滴加入0.94ml38.8mM的柠檬酸三钠溶液继续煮沸5min后冷却而成。
在本实施方式中，甲基纤维素优选为4000cp的甲基纤维素，可以理解，在其他实施方式中还可以选用其他粘度的甲基纤维素，如3000cp的甲基纤维素等。优选的纳米金颗粒的粒径在10~18nm之间，在其他实施方式中，纳米金颗粒的粒径只要不大于50nm即可。
如图1所示，一实施方式的半固体培养基的制备方法，包括如下步骤：
步骤S110，分别制备浓度为0.4g/ml的甲基纤维素溶液、pH7.0~7.4的2×1640培养基、浓度为1mol/l的L-谷氨酰胺溶液及浓度为1mmol/l的β-巯基乙醇溶液。
步骤S120，制备纳米金颗粒溶液：向氯金酸溶液中加入柠檬酸三钠溶液进行加热还原反应，制备浓度为0.25mmol/l的纳米金颗粒溶液。
纳米金颗粒的粒径可控，在本实施方式中，纳米金颗粒的粒径不大于50nm。
步骤S130，制备抗原-PEG6-CONHNH2溶液：
向抗原溶液中加入Na2HPO4溶液，得到抗原混合液，再向抗原混合液中加入NaIO4溶液，室温下黑暗环境中孵育30分钟后加入PBS缓冲液终止反应，然后加入PEG6-CONHNH2溶液，孵育1小时后向得到的混合液中加入HEPES溶液，混匀后用10MWCO的超滤管以2000×g的转速在4℃下离心处理至超滤管中余留25%溶液，用HEPES重悬超滤管中余留的溶液，制备浓度为100μg/ml的抗原-PEG6-CONHNH2溶液。
PEG6-CONHNH2作为连接剂与抗原连接用于后续包被纳米金颗粒。
步骤S140，制备抗原包被的纳米金颗粒溶液：
按照体积比为1:10的比例将抗原-PEG6-CONHNH2溶液加入至纳米金颗粒溶液中，室温下震荡孵育20分钟后加入与抗原-PEG6-CONHNH2溶液等体积的浓度为10mol/l的mPEG-SH溶液，室温下震荡20分钟后转入离心管中以2500rpm的转速在4℃下离心处理，弃上清，用9.9倍于抗原-PEG6-CONHNH2溶液体积的1×PBS缓冲液重悬沉淀，再补加入0.1倍于抗原-PEG6-CONHNH2溶液的质量浓度为20%的PEG溶液，得到抗原包被的纳米金颗粒溶液。
步骤S150，制备半固体培养基：
向甲基纤维素溶液中依次加入2×1640培养基、L-谷氨酰胺溶液、β-巯基乙醇溶液、胎牛血清、10000单位/ml的青霉素与10000μg/ml链霉素混合溶液、50×HAT溶液及抗原包被的纳米金颗粒溶液，4℃下搅拌均匀得到半固体培养基，其中，甲基纤维素溶液、2×1640培养基、L-谷氨酰胺溶液、胎牛血清、10000单位/ml的青霉素与10000μg/ml链霉素混合溶液、50×HAT溶液及抗原包被的纳米金颗粒溶液的体积比为10:18:0.16:0.5:10:0.4:0.8:0.1。
上述溶液均指水溶液。
此外，本实施方式还提供了一种杂交瘤细胞的筛选方法，包括如下步骤：
按照上述半固体培养基的制备方法制备半固体培养基。
将融合后的杂交瘤细胞与37℃下预培养16~24小时后转入半固体培养基中，混匀后，加入碱性成纤维细胞生长因子5ng/ml和杂交瘤细胞融合克隆因子15ul/ml，混匀，分装在37℃、5%体积的CO2条件下培养。
培养7~14天后，待长出肉眼可见的单克隆菌落时，在体式显微镜下用微量移液器将具有颜色反应的克隆株从该培养皿中移至多微孔板中用液体培养的方法放大培养，每孔移入1个克隆进行细胞冻存培养。
上述半固体培养基可直接用于杂交瘤细胞的培养和筛选，不仅能减少培养过程总亚克隆的次数，在很大程度上降低劳动强度，而且可以使单个细胞株之间生长空间相对独立，减少克隆株与克隆株之间的接触抑制备用，同时通过引入包被有抗原的纳米金颗粒，使得能一步筛选到分泌目的抗体的单抗隆细胞株，进一步节省了单克隆筛选的时间。甲基纤维素介质能克服琼脂糖熔点高的缺点，在室温下即可操作，不用担心凝固问题。纳米金颗粒的制备简单，颗粒大小可调。结合纳米金包被的抗原进行杂交瘤细胞的筛选，能更大程度的缩短筛选周期，降低劳动强度。
以下为具体实施例部分：
1、2×1640培养基的配制：取10.4g包装的1640培养基干粉一袋，加入2g/LNaHCO3，0.11g/L丙酮酸钠充分搅拌溶解，制备成2×1640培养基500ml，pH用0.5mol/L盐酸和0.5M氢氧化钠调节至7.0~7.4，用0.22μm的滤膜过滤除菌，制得2×1640培养基。
2、制备L-谷氨酰胺母液：称取L-谷氨酰胺2.8g，加纯水10ml并加热至完全溶解，除菌过滤，制备得1ML-谷氨酰胺母液，按每管1ml分装，冷冻保存。
3、制备β-巯基乙醇母液：取70μlβ-巯基乙醇，加入100ml纯水中，过滤除菌，得到1mmol/Lβ-巯基乙醇母液，-20℃保存。
4、甲基纤维素水溶液配制：取4000cp甲基纤维素0.4g于121~126℃灭菌30min，无菌条件下取10ml无菌超纯水轻轻加入到甲基纤维素中，4℃低温条件下磁力搅拌24h。
5、纳米金包被抗原的制备：
1）纳米金颗粒的制备
①在磁力搅拌器上向装有沸腾中的49ml双蒸水的100ml三角瓶中加入1ml12.7mM的氯金酸溶液；
②待充分混匀后逐滴加入0.94ml38.8mM的柠檬酸三钠溶液，继续加热反应5min后冷却至室温，此时即可产生10~18nm球状分散的纳米金颗粒。2）抗原与连接剂（Linker）连接
①将抗原稀释至终浓度1mg/ml，并加入十分之一体积的1MNa2HPO4溶液，使终体积为100μl；
②加入10μl100mMNaIO4溶液至100μl1mg/ml抗原混合液中，室温黑暗孵育30min，加入500μl1×PBS停止反应；
③加入2μl46.5mMPEG6-CONHNH2（Linker）溶液，室温孵育1h；
④加入1ml40mMHEPES溶液，混匀后用10MWCO的超滤管2000×g4℃过滤离心10min，此时超滤管中还余约25%的溶液；
⑤用40mMHEPES重悬余下溶液至终体积1ml，保证抗体浓度为100μg/ml，可得到抗原-PEG6-CONHNH2溶液100μg/ml。
3）抗原与纳米金颗粒连接反应
①取100μl100μg/ml的抗原PEG6-CONHNH2溶液加至1ml纳米金颗粒溶液中，室温震荡孵育20min；
②加100μl10MmPEG-SH室温震荡孵育20min，2500rpm4℃离心30min；
③弃上清，用1×PBS溶液重悬沉淀至990μl，再加入10μl20%PEG溶液，最终得到具有靶向功能的抗原包被的纳米金颗粒溶液。
6、半固体培养基配制：向步骤4的最终溶液中加入步骤1制备的2×1640培养基液18ml，加入步骤2配制的L-谷氨酰胺母液0.16ml，加入步骤3制备的β-巯基乙醇母液0.5ml，胎牛血清10ml，10000单位/ml青霉素加10000μg/ml链霉素混合水溶液0.4ml，市售50×HAT溶液0.8ml，加入0.1ml包被有抗原的纳米金，4℃磁力搅拌4h，即得到具有抗原包被的纳米金颗粒的半固体培养基，也即能特异性筛选分泌抗原特异性单抗的杂交瘤细胞单克隆化HAT半固体培养基。
7、将融合后的细胞放置于37℃中预培养16~24h，然后收集细胞并用步骤6制备的半固体培养基混匀，加入碱性成纤维细胞生长因子5ng/ml和杂交瘤细胞融合克隆因子15ul/ml，混合均匀，分装至35mm平皿或者6孔细胞培养板中37℃5%CO2条件下培养。
8、培养7~14天，待培养皿中已长出肉眼可见的针尖大小的单克隆菌落时，在体式显微镜下用微量移液器将具有颜色反应的克隆株从该培养皿中移至96孔板中用液体培养的方法放大培养，每孔移入一个克隆进行细胞冻存，代细胞长满孔底1/2~2/3时，吸取培养进行抗体特性鉴定或腹水生产。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种半固体培养基，其特征在于，包括如下体积份数的各组分：
浓度为0.4g/ml的甲基纤维素溶液10；
pH7.0~7.4的2×1640培养基18；
浓度为1mol/l的L-谷氨酰胺溶液0.16；
浓度为1mmol/l的β-巯基乙醇溶液0.5；
胎牛血清10；
10000单位/ml的青霉素与10000μg/ml链霉素混合溶液0.4；
50×HAT溶液0.8；及
抗原包被的纳米金颗粒溶液0.1；
其中，每毫升所述抗原包被的纳米金颗粒溶液是通过将1μg的抗原-PEG6-CONHNH2、1ml的纳米金颗粒溶液及1mmol的mPEG-SH分别室温震荡孵育后20min后，2500×g4℃离心30min，用1×PBS缓冲液稀释至990μl，再加入10μl的质量分数为20%的PEG溶液制备得到；其中，所述纳米金颗粒溶液是向沸腾的50ml0.254mM的氯金酸溶液逐滴加入0.94ml38.8mM的柠檬酸三钠溶液继续煮沸5min后冷却而成。
2.如权利要求1所述的半固体培养基，其特征在于，所述甲基纤维素为4000cp的甲基纤维素。
3.如权利要求1所述的半固体培养基，其特征在于，所述纳米金颗粒的粒径在10～18nm之间。
4.一种半固体培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
分别制备浓度为0.4g/ml的甲基纤维素溶液、pH7.0~7.4的2×1640培养基、浓度为1mol/l的L-谷氨酰胺溶液及浓度为1mmol/l的β-巯基乙醇溶液；
向氯金酸溶液中加入柠檬酸三钠溶液进行加热还原反应，制备浓度为0.25mmol/l的纳米金颗粒溶液；
向抗原溶液中加入Na2HPO4溶液，得到抗原混合液，再向所述抗原混合液中加入NaIO4溶液，室温下黑暗环境中孵育30分钟后加入PBS缓冲液终止反应，然后加入PEG6-CONHNH2溶液，孵育1小时后向得到的混合液中加入HEPES溶液，混匀后用10MWCO的超滤管以2000×g的转速在4℃下离心处理至所述超滤管中余留25%溶液，用HEPES重悬超滤管中余留的溶液，制备浓度为100μg/ml的抗原-PEG6-CONHNH2溶液；
按照体积比为1:10的比例将所述抗原-PEG6-CONHNH2溶液加入至所述纳米金颗粒溶液中，室温下震荡孵育20分钟后加入与所述抗原-PEG6-CONHNH2溶液等体积的浓度为10mol/l的mPEG-SH溶液，室温下震荡20分钟后转入离心管中以2500rpm的转速在4℃下离心处理，弃上清，用9.9倍于所述抗原-PEG6-CONHNH2溶液体积的1×PBS缓冲液重悬沉淀，再补加入0.1倍于所述抗原-PEG6-CONHNH2溶液的质量浓度为20%的PEG溶液，得到抗原包被的纳米金颗粒溶液；
向所述甲基纤维素溶液中依次加入所述2×1640培养基、所述L-谷氨酰胺溶液、所述β-巯基乙醇溶液、胎牛血清、10000单位/ml的青霉素与10000μg/ml链霉素混合溶液、50×HAT溶液及所述抗原包被的纳米金颗粒溶液，4℃下搅拌均匀得到所述半固体培养基，其中，所述甲基纤维素溶液、所述2×1640培养基、所述L-谷氨酰胺溶液、所述胎牛血清、所述10000单位/ml的青霉素与10000μg/ml链霉素混合溶液、所述50×HAT溶液及所述抗原包被的纳米金颗粒溶液的体积比为10:18:0.16:0.5:10:0.4:0.8:0.1。
5.如权利要求4所述的半固体培养基的制备方法，其特征在于，所述甲基纤维素为4000cp的甲基纤维素。
6.如权利要求4所述的半固体培养基的制备方法，其特征在于，所述纳米金颗粒的粒径在10~18nm之间。
7.一种杂交瘤细胞的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
按照权利要求4所述的半固体培养基的制备方法制备所述半固体培养基；
将融合后的杂交瘤细胞于37℃下预培养16~24小时后转入所述半固体培养基中，混匀后，加入碱性成纤维细胞生长因子5ng/ml和杂交瘤细胞融合克隆因子15ul/ml，混匀，分装在37℃、5%体积的CO2条件下培养；
培养7~14天后，待长出可见的单克隆菌落时，在体式显微镜下用微量移液器将具有颜色反应的克隆株移至多微孔板中用液体培养的方法放大培养，每孔移入1个克隆进行细胞冻存培养，即可筛选出所述杂交瘤细胞。
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2012
- 2012-12-26 CN CN201210575548.XA patent/CN103898061B/zh active Active
Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
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| Title |
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| Directional conjugation of antibodies to nanoparticles for synthesis of multiplexed optical contrast agents with both delivery and targeting moieties;S Kumar et al;《NATURE PROTOCOLS》;20080207;第3卷(第2期);314-320 * |
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