CN103897052A - 一种白细胞介素-24突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种白细胞介素-24突变体及其制备方法和应用，白细胞介素-24突变体基因序列如SEQ ID NO：2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；利用如SEQ ID NO：2所示的基因序列，用基因工程菌重组表达白细胞介素-24，发酵所得菌体经破碎离心得到含有白细胞介素-24突变体的包涵体，所得包涵体经包涵体洗涤缓冲液洗涤两次或多次，并对包涵体进行变性与复性，得到白细胞介素-24纯度达79％的白细胞介素-24突变体。与现有技术相比，本发明制备得到了白细胞介素-24突变体，且获得的白细胞介素-24在治疗恶性黑色素瘤疾病表现出较大的应用前景。

Description

一种白细胞介素-24突变体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及白细胞介素，尤其是涉及一种种白细胞介素-24突变体及其制备方法和应用。
背景技术
1995年哥伦比亚大学P.B.Fisher等用差示杂交的方法从人干扰素β和瑞香素(mezerein，MEZ)诱导的人类黑色素瘤细胞cDNA文库中筛选得到一种新型细胞因子，命名为黑色素瘤分化相关基因-7(melanoma differentiation-associated gene7，mda-7)，因其在结构、染色体定位、碱基序列同源性及细胞因子样特性等方面与IL-10家族相近，被归于IL-10家族，正式命名为白细胞介素-24(interleukin-24，IL-24)。MDA-7／IL-24可选择性抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡，包括乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、中枢神经系统等，但对正常细胞没有影响。另外，IL-24还具有抑制肿瘤血管形成和免疫激活作用，在肿瘤细胞转移和系统性肿瘤免疫过程中发挥作用。鉴于MDA-7／IL-24的广谱抗肿瘤特性和独特的免疫调节作用，其已成为抗肿瘤生物药领域的研究热点。
Introgen公司与德克萨斯大学M.D.Anderson Cancer Center合作开发的基因治疗药物重组复制缺陷的腺病毒-IL-24(recombinant replication defectiveadenovirus-IL-24，Ad.IL-24)，商品名为INGN241，已经进入II期临床试验，其体内外实验和临床试验均证实了MDA-7／IL-24显著的抗肿瘤效果。但是腺病毒载体对一些低表达柯萨奇腺病毒受体(CAR)的肿瘤细胞存在转染效率低的问题，限制了其应用范围。另外，腺病毒的基因治疗存在潜在的风险，其应用也受到社会和医学伦理的限制。Fuson等的研究表明MDA-7／IL-24的翻译后的糖基化仅影响其分泌和在胞外环境中的稳定性，对其抗肿瘤活性没有显著影响。因此，MDA-7／IL-24在原核生物工程菌中的重组表达研究也在进行中。但是，目前原核表达系统中非融合的重组IL-24(rIL-24)还没有实现表达。这可能是由于mda-7／IL-24mRNA二级结构的稳定性影响了翻译的起始，抑制了重组蛋白的表达。我们通过对mda-7／IL-24编码基因(不含编码信号肽序列的编码基因)5’-端翻译起始区序列进行结构分析，根据密码子简并性进行序列优化，并构建了相应的优化突变体，旨在实现非融合rIL-24在原核表达系统的高效表达。表达获得的MDA-7／IL-24包涵体经两次洗涤去除大部分杂蛋白，经一步离子交换色谱获得纯度达95％以上的MDA-7／IL-24，避免了纯化过程中标签的去除过程。简化了制备流程，为其进一步的活性研究及应用于癌症的临床治疗奠定基础。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种白细胞介素-24突变体及其制备方法和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种白细胞介素-24突变体，其基因序列如SEQ ID NO：2所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
所述的白细胞介素-24突变体的基因序列由SEQ ID NO：3所示的序列突变而得到。
一种白细胞介素-24突变体的制备方法，利用如SEQ ID NO：2所示的基因序列，用基因工程菌重组表达白细胞介素-24，发酵所得菌体经破碎离心得到含有白细胞介素-24突变体的包涵体，所得包涵体经包涵体洗涤缓冲液洗涤两次或多次，并对包涵体进行变性与复性，得到白细胞介素-24纯度达79％的白细胞介素-24突变体。
如SEQ ID NO：2所示的基因序列是通过以下方法得到的：
在如SEQ ID NO：3所示的序列5’-端TIR序列引入10个突变，所述突变是同义突变，突变位点如下：
Figure BDA0000483004300000021
根据已报道的mda-7／IL-24的基因序列(GenBankAccession No.BT007156.1)，利用Mfold Web Server对目的基因的mRNA TIR二级结构和自由能(△G)进行分析和预测。采用Codon Adaptation Tool Jcat对mRNA TIR密码子进行初步优化，并将优化序列在Mfold软件中模拟，与优化前进行对比，基于对比结果再进行二次优化。最终确定△G较低的mRNA TIR序列作为MDA-7／IL-24的表达基因，即如SEQID NO：2所示的基因序列。将该表达基因序列直接插入翻译起始元件及起始密码子ATG下游，表达载体所表达的MDA-7／IL-24为野生型，不含任何标签蛋白序列。
用基因工程菌重组表达白细胞介素-24时，所采用的突变引物为mIL24-F和IL24-R，表达质粒为pET-32a(+)：
引物mIL24-F含有Nde I酶切位点，序列为：
GGGAATTCCATATGGCTCAAGGTCAAGAATTCCATTTTGGTCCGTGTCAAGTTAAAGGTGTTGTTCCCCAGAAACTGT，划线处CATATG为Nde I酶切位点；
引物IL24-R含有XhoI酶切位点，序列为：
CCGCTCGAGTCAGAGCTTGTAGAATTTCTGC，划线处CTCGAG为Xho I酶切位点。
所述的包涵体洗涤缓冲液共有两种：
洗涤缓冲液I：含有20mM Tris-HCl、体积百分比1.0％Triton X-100及2M Urea，pH为8.5；
洗涤缓冲液II：含有20mM Tris-HCl、体积百分比2.0％Triton X-100及4MUrea，pH为8.5。
对包涵体进行变形的变性缓冲液含有20mM Tris-HCl、8M Urea及0.2M Arg，变性缓冲液的pH为11.0；
对包涵体进行复性采用透析复性法，每间隔4h换一次复性缓冲液，所使用的复性缓冲液如下，
复性缓冲液1：含有20mM Tris-HCl、4M Urea、0.1M Arg、2mM GSH及0.2mMGSSG，pH为10.0；
复性缓冲液2：含有20mM Tris-HCl、3M Urea、0.05M Arg、1mM GSH及0.1mMGSSG，pH为9.0；
复性缓冲液3：含有20mMTris-HCl、2M Urea、0.025M Arg、0.5mM GSH及0.05mM GSSG，pH为8.5；
复性缓冲液4：含有20mM Tris-HCl、1M Urea、0.0125M Arg、0.025mM GSH及0.025mMGSSG，pH为8.5；
复性缓冲液5：含有20mM Tris-HCl，pH为8.5。
一种白细胞介素-24突变体的应用，所述的白细胞介素-24突变体用于抑制人恶性黑色素瘤细胞A375的增殖。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
本发明通过生物软件计算的方法获得了优化的MDA-7／IL-24表达基因，且制备得到了白细胞介素-24突变体，本发明可以实现MDA-7／IL-24在大肠杆菌中的非融合表达，且经包涵体洗涤和阳离子交换色谱纯化之后可获得较高纯度的MDA-7／IL-24，避免了纯化过程中标签蛋白的去除过程。且该方法获得的MDA-7／IL-24在治疗恶性黑色素瘤疾病表现出较大的应用前景。
附图说明
图1为mRNA翻译起始区二级结构模拟图；
图2为MDA-7／TL-24的构建策略；
图3为MDA-7／IL-24的纯化策略；
图4为重组菌菌落PCR(a)和质粒双酶切验证(b)；
图5为重组质粒载体测序结果(mRNATIR)与原始序列的比对；
图6为MDA-7／IL-24在重组菌中的诱导表达；
图7为MDA-7／IL-24的弱阳离子交换色谱CM柱纯化；
图8为MDA-7／I1-24的活性验证。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
获得优化的白细胞介素-24(MDA-7／IL-24)突变体表达基因
本实施例所指MDA-7／IL-24突变体表达基因是通过如下方法优化得到：
根据已报道的mda-7／IL-24的基因序列(GenBank Accession No.BT007156.1，序列如SEQ ID NO：3所示)，利用Mfold Web Server对目的基因的mRNATIR二级结构和自由能(△G)进行分析和预测。采用Codon AdaptationIool Jcat对mRNATIR密码子进行初步优化，并将优化序列在Mfold软件中模拟，与优化前进行对比，基于对比结果再进行二次优化。最终确定△G较低的mRNA TIR序列作为MDA-7／IL-24的表达基因(即白细胞介素-24突变体基因序列)，如SEQ ID NO：2所示。软件计算结果显示(见图l，其中(a)MDA-7／IL-24原始TIR序列二级结构，△G=-22.0kcal／mol；(b)经第一次优化后IL-24ITR-1序列二级结构，△G=-14.80kcal／mol；(c)经第二次优化后aL-24ITR-2序列二级结构，△G=-9.07kcal／mo1)，优化前，mRNA TIR具有由较长片段通过碱基配对形成的发夹结构，△G高达-22.0kcal/mol，结构较为稳定；经Codon Adaptation Tool Jcat对其进行第一次优化后，相互配对的碱基数减少，△G降为-14.80kcal／mol；而经进一步优化之后，mRNATIR的发夹结构明显简化，△G显著下降为-9.07kcal／mol，下降了近2.4倍。综上所述，通过对mRNATIR的优化，显著降低了mRNATIR自由能△G，降低了其二级结构的稳定性，有利于核糖体等翻译起始元件与mRNA的结合，顺利启动mRNA的翻译，提高重组蛋白的表达水平。
白细胞介素-24突变体基因序列如SEQ ID NO：2所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
实施例2
MDA-7／IL-24重组表达载体的构建
含有如SEQ ID NO：2所示的基因序列的表达载体的构建策略，见图2所示。该构建策略是将该表达基因序列直接插入翻译起始元件及起始密码子ATG下游，表达载体所表达的MDA-7／IL-24为野生型，不含任何标签蛋白序列。
MDA-7／IL-24的表达基因如SEQ ID NO：2所示，根据优化结果设计突变引物mIL24-F和IL24-R：
mIL24-F：GGGAATTCCATATGGCTCAAGGTCAAGAATTCCATTTTGGTCCGTGTCAAGTTAAAGGTGTTGTTCCCCAGAAACTGT
IL24-R：CCGCTCGAGTCAGAGCTTGTAGAATTTCTGC
划线处CATATG为酶切位点Nde I，CTCGAG为酶切位点Xho I。突变位点如下：
Figure BDA0000483004300000051
采用PCR法获得目的基因，PCR反应体系为50μl，反应条件如下：95℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min，1个循环；4℃保存。
PCR产物经Cycle-Pure Kit纯化后，用用Nde I和Xho I限制性内切酶进行双酶切，并将酶切产物克隆入经同样双酶的质粒载体pET-32a(+)。将重组表达载体转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，分别进行菌落PCR、质粒双酶切和DNA测序进行验证，实验结果表明重组表达载体成功转入大肠杆菌，且10个突变位点同义替换成功，见图4和图5。图4中：M，Marker；1-3，挑取的单菌落PCR结果；4-5，阳性克隆重组菌提取质粒后的双酶切结果。图5中，(a)mda-7／IL-24的原始序列；(b)引入突变位点之后的mda-7／IL-24序列。
验证正确的阳性克隆即为制备MDA-7／IL-24的基因工程菌。
实施例3
MDA-7／IL-24的重组表达
接种阳性单克隆菌落于LB培养基(100μg／mL氨苄霉素)，置于37℃摇床200rmp培养。当OD600至0.6-0.8时，加入0.5mM诱导剂IPTG，37℃诱导4h。收获发酵液，经离心(8000rpm，15min)收集诱导表达的重组菌菌体，并用Tris-HCl缓冲液(20mM，pH8.5)洗涤一次菌体。将菌体重悬于TE缓冲液(20mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.5)，置于冰上进行超声破碎，超声功率设为300W，超声时间为3×100次(超声3s，暂停6s)。将破碎溶液离心(10000×g，30min，4℃)收获包涵体，并对基因工程菌不同不同表达部分取样进行SDS-PAGE。电泳结果显示，所构建的基因工程菌有目的蛋白MDA-7／IL-24的表达，而对照却未见相应表达条带，结果见图6，图6中，M，Marker；1，未经序列优化的重组菌表达对照；2，非诱导表达对照；3，诱导组全细胞；4，诱导组上清；5，诱导组沉淀。
实施例4
MDA-7／IL-24的纯化
MDA-7／IL-24的纯化策略如图3所示，该策略包括：a)基因工程菌发酵培养，诱导表达；b)收获发酵菌体，超声破碎，离心获得含有MDA-7／IL-24的包涵体；c)用Washing Buffer A和Washing Buffer B对包涵体进行洗涤；d)包涵体的变复性；e)采用弱阳离子交换色谱CM柱对复性的MDA-7／IL-24进行纯化。
所得包涵体经洗涤缓冲液A(20mM Tris-HCl，1.0％Triton X-100,2M Urea，pH8.5)和洗涤缓冲液B(20mM Tris-HCl，2.0％Triton X-100，4M Urea，pH8.5)两次洗涤后重悬于变性缓冲液(20mM Tris-HCl，8M Urea，0.2M Arg，pH11.0)并溶解。采用透析复性法对mrIL-24进行复性，每间隔4h换一次复性缓冲液，复性缓冲液的梯度设置见下表，
复性缓冲液1：含有20mM Tris-HCl、4M Urea、0.1M Arg、2mM GSH及0.2mMGSSG，pH为10.0；
复性缓冲液2：含有20mM Tris-HCl、3M Urea、0.05M Arg、1mM GSH及0.1mMGSSG，pH为9.0；
复性缓冲液3：含有20mMTris-HCl、2M Urea、0.025M Arg、0.5mM GSH及0.05mM GSSG，pH为8.5；
复性缓冲液4：含有20mM Tris-HCl、1M Urea、0.0125M Arg、0.025mM GSH及0.025mMGSSG，pH为8.5；
复性缓冲液5：含有20mM Tris-HCl，pH为8.5。
复性液经离心(10000×g，30min,4℃)后，上样于弱阳离子交换色谱CM柱，采用NaCl浓度梯度进行洗脱，收集洗脱峰。结果显示，经包涵体洗涤和一步离子交换纯化获得了较高纯度的MDA-7／IL-24，见图7，图7中，(a)离子交换梯度洗脱图谱；(b)纯化结果：M，Marker；1，洗脱获得的MDA-7／IL-24；2，纯化前复性获得的MDA-7／IL-24。
实施例5
Mda-7／IL-24的活性测定
取对数生长期的人恶性黑色素瘤细胞A375和正常人胚肺成纤维细胞NHLF，以6×103个／孔的细胞浓度接种于96孔板，培养基为DEME，添加10％胎牛血清，每组设3个复孔，细胞置5％CO2培养箱，37℃培养过夜。细胞贴壁后，加入MDA-7／IL-24，以PBS作为对照，置5％CO2培养箱，37℃培养24h。细胞生长情况的检测：每孔加入20ul5mg/mL的MTT，37℃孵育4h，弃去培养基，每孔加入150ul二甲基亚砜(DMSO)，置摇床溶解10min，在酶联免疫检测仪上测A570值。
实验结果显示MDA-7／IL-24能够显著抑制A375细胞的增殖，且随着MDA-7／IL-24浓度的增加，抑制率逐渐增大，见图8所示，呈剂量依赖型。MDA-7／IL-24对NHLF生长的影响很小。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0000483004300000091
Figure BDA0000483004300000101
Figure BDA0000483004300000111

Claims (8)

1.一种白细胞介素-24突变体，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO：2所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的一种白细胞介素-24突变体，其特征在于，所述的白细胞介素-24突变体的基因序列由SEQ ID NO：3所示的序列突变而得到。
3.一种如权利要求1或2所述的白细胞介素-24突变体的制备方法，其特征在于，利用如SEQ ID NO：2所示的基因序列，用基因工程菌重组表达白细胞介素-24，发酵所得菌体经破碎离心得到含有白细胞介素-24突变体的包涵体，所得包涵体经包涵体洗涤缓冲液洗涤两次或多次，并对包涵体进行变性与复性，得到白细胞介素-24纯度达79％的白细胞介素-24突变体。
4.根据权利要求3所述的一种白细胞介素-24突变体的制备方法，其特征在于，如SEQ ID NO：2所示的基因序列是通过以下方法得到的：
在如SEQ ID NO：3所示的序列5’-端TIR序列引入10个突变，所述突变是同义突变，突变位点如下：
Figure FDA0000483004290000011
5.根据权利要求3所述的一种白细胞介素-24突变体的制备方法，其特征在于，用基因工程菌重组表达白细胞介索-24时，所采用的突变引物为mIL24-F和IL24-R，表达质粒为pET-32a(+)：
引物mIL24-F含有Nde I酶切位点，序列为：
GGGAATTCCATATGGCTCAAGGTCAAGAATTCCATTTTGGTCCGTGTCAAGTTAAAGGTGTTGTTCCCCAGAAACTGT，划线处CATATG为Nde I酶切位点；
引物IL24-R含有Xho I酶切位点，序列为：
CCGCTCGAGTCAGAGCTTGTAGAATTTCTGC，划线处CTCGAG为Xho I酶切位点。
6.根据权利要求3所述的一种白细胞介素-24突变体的制备方法，其特征在于，所述的包涵体洗涤缓冲液共有两种：
洗涤缓冲液I：含有20mM Tris-HCl、体积百分比1.0％Triton X一100及2M Urea，pH为8.5；
洗涤缓冲液II：含有20mM Tris-HCl、体积百分比2.0％Triton X-100及4MUrea，pH为8.5。
7.根据权利要求3所述的一种白细胞介素-24突变体的制备方法，其特征在于，对包涵体进行变形的变性缓冲液含有20mM Tris-HCl、8M Urea及0.2M Arg，变性缓冲液的pH为11.0；
对包涵体进行复性采用透析复性法，每间隔4h换一次复性缓冲液，所使用的复性缓冲液如下，
复性缓冲液1：含有20mM Tris-HCl、4M Urea、0.1M Arg、2mM GSH及0.2mMGSSG，pH为10.0；
复性缓冲液2：含有20mM Tris-HCl、3M Urea、0.05M Arg、1mM GSH及0.1mMGSSG，pH为9.0；
复性缓冲液3：含有20mMTris-HCl、2M Urea、0.025M Arg、0.5mM GSH及0.05mM GSSG，pH为8.5；
复性缓冲液4：含有20mM Tris-HCl、1M Urea、0.0125MArg、0.025mM GSH及0.025mMGSSG，pH为8.5；
复性缓冲液5：含有20mM Tris-HCl，pH为8.5。
8.一种如权利要求l所述的白细胞介素-24突变体的应用，其特征在于，所述的白细胞介素-24突变体用于抑制人恶性黑色素瘤细胞A375的增殖。
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