CN103896959B - 糟醅中黄曲霉毒素b1的提取及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及糟醅中黄曲霉毒素B1的提取方法，属于分析检测领域。本发明提供一种糟醅中黄曲霉毒素B1的提取方法，包括如下步骤：称取烘干的糟醅，过筛，加入甲醇水溶液、二氯甲烷或丙酮超声波震荡后过滤，取滤液备用，用二氯甲烷、乙酸乙酯或丙酮萃取滤液，收集二氯甲烷、乙酸乙酯或丙酮层并烘干即可。本方法可以快速准确的从糟醅中提取出黄曲霉毒素B1，然后利用酶联免疫法对提取出的黄曲霉毒素B1进行检测。本发明的提取和检测方法能够很好地应用于糟醅中黄曲霉毒素B1的提取与检测，为其研究提供了一条更好的途径。
Description
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体涉及糟醅中黄曲霉毒素B1的提取及检测方法。
背景技术
黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类有毒的次生代谢产物，它广泛存在于农作物及食物中，黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。
白酒酿造主要是以粮食为原料，从而存在着被黄曲霉毒素B1污染的可能性，所以在白酒的酿造过程中做好对黄曲霉毒素B1的检测尤为重要。现阶段有关黄曲霉毒素B1的检测主要集中在粮食和食品上，而白酒酿造过程中的酒糟是一种比较复杂的物质，现有的检测方法并不能完全适应酒糟中黄曲霉毒素B1的检测，所以建立一套准确、成本低、操作简便、快速且适应白酒生产过程的毒素检测方法，运用于白酒酿造过程中黄曲霉毒素B1检测，意义重大。
本方法可以快速准确的从糟醅中提取出黄曲霉毒素B1然后利用酶联免疫法（ELISA）对提取出的黄曲霉毒素B1进行检测。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种糟醅中黄曲霉毒素B1的提取方法，该方法快速、准确、易操作。
糟醅中黄曲霉毒素B1的提取方法，包括以下步骤：
a、预处理：称取烘干的糟醅，过筛，在筛下物中加入溶剂A，超声震荡，过滤，滤液备用；其中，所述的溶剂A为甲醇水溶液、二氯甲烷或丙酮中任意一种；
b、萃取：用溶剂B萃取滤液，收集溶剂B相层，烘干后即得到黄曲霉毒素B1；其中所述的溶剂B为二氯甲烷、乙酸乙酯或丙酮中任意一种。
具体的，上述提取方法步骤a中所述的过筛为过20目筛。
优选的，上述提取方法步骤a中所述的溶剂A为甲醇水溶液。
优选的，上述提取方法步骤a中所述的甲醇水溶液体积浓度为45～85%。
进一步优选的，上述提取方法步骤a中所述的甲醇水溶液体积浓度为65%。
具体的，上述提取方法步骤a中糟醅与溶剂A的固液比为1g︰7～10ml。
优选的，上述提取方法步骤a中糟醅与溶剂A的固液比为1g︰10ml。
具体的，上述提取方法步骤a中超声震荡功率为120～200W。
优选的，上述提取方法步骤a中超声震荡功率为180W。
具体的，上述提取方法步骤a中超声震荡时间为10～40min。
优选的，上述提取方法步骤a中超声震荡时间为30min。
优选的，上述提取方法步骤b中所述的溶剂B为二氯甲烷。
最优选的，上述提取方法中所述溶剂A为体积浓度65%的甲醇水溶液，超声震荡功率为180W，超声震荡时间为30min，所述溶剂B为二氯甲烷。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种黄曲霉毒素B1的检测方法。该方法包括以下步骤：
①、通过上述的提取方法提取出黄曲霉毒素B1；
②、在所得黄曲霉毒素B1中加入溶剂C，采用酶联免疫法检测黄曲霉毒素B1的含量；其中所述的溶剂C为甲醇水溶液、二氯甲烷或丙酮中任意一种。
优选的，上述检测方法步骤②中所述的甲醇水溶液体积浓度为40～80%。
进一步优选的，上述检测方法步骤②中所述的甲醇水溶液体积浓度为50%。
优选的，上述检测方法步骤②中溶剂C的加入量为10g糟醅对应加入5～15ml。
更优选的，上述方法步骤②中溶剂C的加入量为10g糟醅对应加入10ml。
本方法利用了超声波提取糟醅中黄曲霉毒素B1，不仅快速、准确、易操作，而且取得的效果比国标方法要好得多，从而使本方法能很好地适应白酒的生产过程。
附图说明
图1不同震荡方式的比较效果
图2甲醇水溶液浓度对提取结果的影响
图3提取温度对提取结果的影响
图4提取时间对提取结果的影响
图5超声波功率对提取结果的影响
具体实施方式
一种糟醅中黄曲霉毒素B1的提取方法，包括以下步骤：
a、预处理：称取烘干的糟醅，过筛，在筛下物中加入溶剂A，超声震荡，过滤，滤液备用；其中，所述的溶剂A为甲醇水溶液、二氯甲烷或丙酮中任意一种；
b、萃取：用溶剂B萃取滤液，收集溶剂B相层，烘干后即得到黄曲霉毒素B1；其中所述的溶剂B为二氯甲烷、乙酸乙酯或丙酮中任意一种。
具体的，上述提取方法步骤a中所述的过筛为过20目筛。
优选的，上述提取方法步骤a中所述的溶剂A为甲醇水溶液。
优选的，上述提取方法步骤a中所述的甲醇水溶液体积浓度为45～85%。
进一步优选的，上述提取方法步骤a中所述的甲醇水溶液体积浓度为65%。
具体的，上述提取方法步骤a中糟醅与溶剂A的固液比为1g︰7～10ml。
优选的，上述提取方法步骤a中糟醅与溶剂A的固液比为1g︰10ml。
具体的，上述提取方法步骤a中超声震荡功率为120～200W。
优选的，上述提取方法步骤a中超声震荡功率为180W。
具体的，上述提取方法步骤a中超声震荡时间为10～40min。
优选的，上述提取方法步骤a中超声震荡时间为15min。
优选的，上述提取方法步骤b中所述的溶剂B为二氯甲烷。
最优选的，上述提取方法所述溶剂A为体积浓度65%的甲醇水溶液，超声震荡功率为180W，超声震荡时间为30min，所述溶剂B为二氯甲烷。
一种黄曲霉毒素B1的检测方法，包括以下步骤：
①通过上述的提取方法提取出黄曲霉毒素B1；
②在所得黄曲霉毒素B1中加入溶剂C，采用酶联免疫法检测黄曲霉毒素B1的含量；其中所述的溶剂C为甲醇水溶液、二氯甲烷或丙酮中任意一种。
优选的，上述检测方法步骤②中所述的甲醇水溶液体积浓度为40～80%。
进一步优选的，上述检测方法步骤②中所述的甲醇水溶液体积浓度为50%。
优选的，上述检测方法步骤②中溶剂C的加入量为原料10g糟醅对应加入5～15ml。
更优选的，上述方法步骤②中溶剂C的加入量为原料10g糟醅对应加入10ml。
由于糟醅中混杂着酸、醇等复杂物质，与普通粮食的成分及含量不同，单纯的国标法只适用于粮食作物，却不完全适用于检测糟醅中的黄曲霉毒素B1。本发明的发明人针对糟醅的特殊成分，做了大量尝试和探索发现，采用甲醇水溶液、二氯甲烷或丙酮作为提取溶剂，配合超声震荡，可以很好地适用于提取糟醅中黄曲霉毒素B1，优选采用甲醇水溶液，效果较好同时无毒。
本发明技术方案的提出是基于以下原理：从糟醅中提取黄曲霉毒素B1主要基于液液萃取的原理，即使用一定浓度的甲醇溶液浸取糟醅中的黄曲霉毒素B1，由于黄曲霉毒素B1在二氯甲烷中溶解度大于甲醇溶液，故再使用二氯甲烷对黄曲霉毒素B1进行萃取，重复一次，以确保充分萃取；再者黄曲霉毒素B1的沸点要远高于二氯甲烷，对萃取后的二氯甲烷相进行水浴烘干，则可以除去一些低沸点的杂质，最后用一定浓度的甲醇溶液溶解烘干后的物质，即为待测样。
试验例1震荡方式的选择
糟醅烘干粉碎后，过20目筛，分别准确称取10g样品于三只250mL锥形瓶中，编号①、②、③，分别加入100mL提取液，①号锥形瓶室温超声提取30min，②号锥形瓶室温漩涡振荡30min，③号锥形瓶室温超声漩涡交替进行30min，用快速定性滤纸过滤于锥形瓶中，吸取10mL滤液于分液漏斗中，加入40mL二氯甲烷，加塞振摇5min，静置分层（约30min），放出下层相，再加入10mL二氯甲烷于分液漏斗中，重复提取，合并二氯甲烷相，经盛有约20g预先用二氯甲烷润湿的无水Na2SO4滤纸漏斗过滤于锥形瓶中，65℃水浴烘干，冷却后加入10mL甲醇-水（1︰1），即为待测样品，用酶联免疫法测定，平行实验三次，确定最佳提取方式，实验结果见图1。
由图1可以看出采用超声波震荡提取黄曲霉毒素B1效果明显高于其它两种震荡方式。
试验例2单因素试验
取10g烘干后的糟醅磨碎，过20目筛，选取提取液甲醇浓度、提取时间、超声波提取功率、提取温度四个因素进行单因素试验，单因素试验设计见表1。
表1单因素试验设计
1）提取液甲醇水溶液浓度的选择
取10g烘干后的糟醅磨碎，过20目筛，在提取时间为15min，温度为20℃，超声功率为180W时，选取上述不同浓度的甲醇水溶液进行试验，结果如图2所示，甲醇浓度为65%（V/V）时黄曲霉毒素B1含量值最大。
2）提取温度的选择
各取10g烘干后的糟醅磨碎，过20目筛，甲醇水溶液浓度为65%（V/V），超声功率为180W，提取时间15min，改变温度，实验结果如图3所示，提取温度对实验结果影响不大，综合考虑，选取20℃进行提取。
3）提取时间的选择
各取10g烘干后的糟醅磨碎，过20目筛，在甲醇水溶液浓度为65%（V/V），超声功率为180W，温度为20℃，改变提取时间，实验结果如图4所示，提取时间30min效果最好。
4）超声波功率的选择
各取10g烘干后的糟醅磨碎，过20目筛，甲醇水溶液浓度为65%（V/V），提取时间为25min，温度为20℃，改变功率，实验结果如图5所示，当超声波功率为180W时提取效果最好。
5）正交试验
在单因素试验结果基础上，选择甲醇浓度（A）、提取时间（B）和超声波功率（C）作为正交实验中的3个影响因素，各因素选取3个水平，然后参照正交表分别选择3因素和3个水平进行正交实验，并将因素、水平随机化列成表2。
表2正交实验的因素与水平
表3正交试验设计试验数据L9(34)
对试验结果进行极差分析和方差分析，见上表3，可知各因素对黄曲霉毒素B1提取影响的大小顺序为A＞C＞B，较好的提取条件为A2B2C3。
同时经过单因素试验和正交设计试验后，可以确定最佳提取条件为：甲醇水溶液浓度65%（V/V）、提取时间为30min、提取温度为20℃、超声波功率为180W。
实施例1
取一定量的糟醅综合样，置于取样袋中，取一定量糟醅烘干粉碎后，过20目筛，称取10g于250ml锥形瓶中，加入45%（V/V）甲醇-水溶液，在温度为20℃，超声波功率为140W下提取15min，过滤，取滤液10ml于250ml锥形瓶中，加入40ml二氯甲烷，震荡5min，倒入分液漏斗中，静置25min，放出下层相，重复萃取一次，将二氯甲烷层在65℃水浴烘干，最后加入50%（V/V）甲醇溶液，待测，使用试剂盒和酶标仪对待测样进行检测，测定结果为2.0μg/kg。
实施例2
取一定量糟醅烘干粉碎后，过20目筛，称取10g于250ml锥形瓶中，加入85%（V/V）甲醇-水溶液，在温度为20℃，超声波功率为200W下提取40min，过滤，取滤液10ml于250ml锥形瓶中，加入40ml二氯甲烷，震荡5min，倒入分液漏斗中，静置25min，放出下层相，重复萃取一次，将二氯甲烷层在65℃水浴烘干，最后加入50%（V/V）甲醇溶液，待测，使用试剂盒和酶标仪对待测样进行检测，测定结果为2.3μg/kg。
实施例3
取一定量糟醅烘干粉碎后，过20目筛，称取10g于250ml锥形瓶中，加入65%（V/V）甲醇-水溶液，在温度为20℃，超声波功率为180W下提取30min，过滤，取滤液10ml于250ml锥形瓶中，加入40ml二氯甲烷，震荡5min，倒入分液漏斗中，静置25min，放出下层相，重复萃取一次，将二氯甲烷层在65℃水浴烘干，最后加入50%（V/V）甲醇溶液，待测，使用酶标仪对待测样进行检测，测定结果为2.9μg/kg。
对比例1国标法提取黄曲霉毒素B1
取一定量的糟醅烘干粉碎后，过筛，称取20g试样于250ml锥形瓶中，用滴管滴加6ml水，使试样润湿，准确加入60ml三氯甲烷，振荡30min，加12g无水硫酸钠，振摇后，静置30min，过滤。取12ml滤液于蒸发皿中，在65℃水浴烘干，准确加入1ml苯-乙腈混合液，用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，再用此滴管吸取上清液转移于2ml具塞试管中，待测，使用试剂盒和酶标仪对待测样进行检测，测定结果为2.6μg/kg。
对比例2本发明方法与国标法的回收率对比结果
对糟醅进行三个不同浓度水平的加标试验：第一组加标AFB1标准品1.5μg/kg，第二组加标AFB1标准品2μg/kg，第三组加标AFB1标准品5μg/kg，提取方法分别按照本发明方法和国标方法进行，实验结果见表4：
表4回收率对比结果
由表4可以看出本发明的提取方法在回收率方面明显要高于国标方法，说明本发明方法能够更有效地提取和检测糟醅中黄曲霉毒素B1。
综上可以看出采用本发明方法不仅简单、易操作，并且在具体的操作过程中所采用的溶剂价格便宜、易得，同时无毒，更重要的是，采用本发明方法检测糟醅中的黄曲霉毒素B1比国标法更准确，从而能够很好地用于检测糟醅中的黄曲霉毒素B1。
Claims (7)
1.糟醅中黄曲霉毒素B1的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、预处理：称取烘干的糟醅，过筛，在筛下物中加入溶剂A，超声震荡，过滤，滤液备用；其中，所述的溶剂A为甲醇水溶液；所述甲醇水溶液体积浓度为65％；超声震荡功率为180W；超声震荡时间为30min；糟醅与溶剂A的固液比为1g︰10mL；
b、萃取：用溶剂B萃取滤液，收集溶剂B相层，烘干后即得到黄曲霉毒素B1；其中所述的溶剂B为二氯甲烷、乙酸乙酯或丙酮中任意一种。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤b中，所述的溶剂B为二氯甲烷。
3.一种黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
①、根据权利要求1或2所述的提取方法提取出黄曲霉毒素B1；
②、在所得黄曲霉毒素B1中加入溶剂C，采用酶联免疫法检测黄曲霉毒素B1的含量；其中所述的溶剂C为甲醇水溶液、二氯甲烷或丙酮中任意一种。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：步骤②中所述的甲醇水溶液体积浓度为40～80％。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：步骤②中所述的甲醇水溶液体积浓度为50％。
6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：步骤②中溶剂C的加入量为10g糟醅对应加入5～15ml。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：步骤②中溶剂C的加入量为10g糟醅对应加入10ml。
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