CN103896898A - 一种柚皮素标准物质及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种从柑橘皮中提取分离高纯柚皮素的方法，该方法通过使用超临界流体萃取技术以及制备型高效液相色谱法制备得到了纯度高达99.5％的高纯柚皮素纯品，满足了标准物质制备的要求。

Description

一种柚皮素标准物质及其制备和应用
技术领域
本发明涉及一种柚皮素的制备方法，特别是一种采用超临界流体萃取技术和制备型高效液相色谱法从柑橘皮中制备高纯柚皮素产品的方法，以及所述制备方法获得的柚皮素产品作为标准物质的用途。 
背景技术
柚皮素为芸香科柑橘属植物中的一种多羟基黄酮类单体成分，是柚皮苷的苷元。柚皮素为白色结晶精细粉末，属二氢黄酮类化合物，白色针状结晶，熔点260℃，柚皮素溶于甲醇、乙醇、乙醚和苯，几乎不溶于水，分子显中极性，分子式为C15H12O5，分子量为272.25，其结构式如下式所示： 
Figure BDA0000474318920000011
由于柚皮素分子内含有苯环、羟基、羰基等官能团，所以在紫外区有吸收。现代药理学研究结果表明，柚皮素具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗溃疡、抗血栓、扩张血管、解痉和利胆等多种药理活性，临床上可将其应用于细菌感染、镇静、癌症等病症的治疗。但是柚皮素在植物中质量分数很低，一般以柚皮苷的形式存在于自然界中，通常可以通过水解糖苷键制备柚皮素。 
截至目前，对柚皮素的开发还较少，柚皮素的提取制备工艺还停留在耗能大、耗时长、提取率低的初级阶段。王晓等(“酶法提取山楂叶中总黄酮的研究”，食品工业科技，2002，23(3)：37-40)将干燥粉碎后的原料用其它方法提取后，用适当的有机溶剂(如乙酸乙酯、正丁醇、石油醚等)进行萃取、过滤，滤液中的溶剂减压蒸馏回收后测定。这是目前国内外使 用较广泛的提取柚皮素的方法，这种方法设备简单，产品得率高，但产品中杂质含量较高。雍技等(“超临界CO2萃取黄酮类物质的研究进展”，安徽化工，2005，135(3)：22-24)利用超临界流体萃取纯化，有显著的产品回收率和纯度，改进了产品质量、降低能耗等优点，但超临界萃取技术操作压力高、设备投资大。任顺成等(“玉米须黄酮类测定方法的研究”，食品科学，2004，24(3)：139-142)利用超声波振动的机械粉碎、搅拌等作用，有利于溶剂渗入生物细胞，加速天然原料中有效成分进入溶剂，从而提高有效成分的提取率。超声波提取法是应用超声波来强化提取黄酮类化合物，是一种物理破碎过程。超声波对媒质主要产生独特的机械振动作用和空化作用。当超声波振动时能产生并传递强大的能量，引起媒质质点以大的速度和加速度进入振动状态，使媒质结构发生变化，促使液体内形成空化泡的现象。在水中当超声波辐射面上的强度达到0.3W/era2时就会产生空化。根据空化泡的变化，超声空化分为稳态空化和瞬态空化，但存在过程间歇、难以产业化放大，且能耗较大的缺点。 
由于绝大多数定量分析方法都是基于直接或间接与已知值比较而进行的，因此提供具有已知组成和性质的参考样品(即标准物质)供准确校正对于定量分析来说是非常必要的，这些标准物质在一种或多种性质方面具有高度一致的值。与常规的实验室试剂不同，在同一标准物质样品内部各部分之间以及同批次标准物质的不同样品之间具有高度一致性，从而使得这些标准物质能够用于在分析过程中校准分析仪器以及分析方法等。 
标准物质通常要求高纯度，其组成与化学式高度一致并且化学稳定。由于对标准物质的这种严格要求，标准物质的制备一般需要在高度受控的条件下制造，以达到这种高纯度，并尽可能避免所含杂质对后续测定的影响。因此，标准物质的制备比常规分析化学试剂往往要复杂得多，经常需要多种高精度的分离纯化操作步骤(如HPLC等)，同时也造成其高的制造成本。 
现有技术中尽管已经有柚皮素标准物质供应，但并未公开这些柚皮素标准物质的制备方法。可以想象，与大多数标准物质一样，这些柚皮素标准物质也都是通过复杂和高成本的多步骤高精度分离纯化方法而制得的。因此，仍需要一种能够通过简单方法制备的柚皮素标准物质。 
发明内容
针对现有技术在提取制备柚皮素过程中存在的上述各种问题，本发明人研究出了一种从柑橘皮中制备高纯柚皮素标准物质的方法，采用本发明的制备方法能够获得纯度高达99.5％以上的柚皮素，能够满足标准物质的纯度要求，很好的解决了柚皮素传统制备纯化工艺中存在的不稳定性等问题。 
本发明的一个目的是提供一种可用作标准物质的柚皮素产品，其含有纯度>99.5％的柚皮素。 
在一个实施方案中，所述柚皮素产品使用柑橘皮作为原料，通过超临界流体技术制备柚皮素粗品，再使用制备型高效液相色谱分离柚皮素纯品而制得。 
本发明的另一个目的是提供一种从柑橘皮中制备高纯柚皮素的方法。 
根据本发明的一个方面，本发明提供了所述方法采用的制备纯化工艺： 
1)采用超临界流体技术制备柚皮素粗品： 
利用超临界流体萃取技术对萃取柑橘皮中柚皮素的工艺条件进行研究：实验考察了样品粒度、萃取温度、萃取压力、夹带剂类型、萃取时间、超临界流体流速以及收集方式等因素对柚皮素粗品回收率的影响。 
在一个实施方案中，所述的超临界流体可以是处于超临界状态的二氧化碳；所述的样品可以是非极性或弱极性的脂溶性有效成分，也可以是极性有效成分；在萃取过程中可以添加夹带剂。 
在一个优选的实施方案中，超临界流体萃取技术采用如下的萃取条件：夹带剂用量为0.1-0.5倍原料质量的10％乙醇溶液，浸泡8-24小时后，在20-40MPa、30-70℃的条件下，静态萃取0.1-0.5小时后再以0.1-2.0L/min动态萃取0.5-5小时。 
2)使用制备型高效液相色谱法分离纯化柚皮素纯品： 
使用制备型高效液相色谱法对萃取得到的柚皮素粗品进行分离，并以柚皮素纯度为目标，对制备色谱条件进行优化。 
在一个优选的实施方案中，采用如下的分离纯化条件： 
制备型高效液相色谱纯化的条件是：C18制备色谱柱，采用水∶甲醇(15-40％∶85-60％)作为流动相，分离得到柚皮素，纯度可达到99.5％。 
采用上述制备纯化工艺所获得的柚皮素产品纯度达到99.5％，可满足纯度标准物质的要求。 
根据本发明的另一个方面，所述高纯柚皮素的制备步骤如下： 
(1)对柑橘皮进行预处理，预处理包括粉碎、过筛、浸泡、脱水、等； 
(2)将步骤(1)处理后的样品加入萃取釜中进行萃取； 
(3)待萃取完成后，收集得到柚皮素萃取物粗品； 
(4)将步骤(3)所得的柚皮素粗品经制备型高效液相色谱纯化，制备得到高纯度柚皮素。 
优选地，所述步骤(1)中的预处理方法可以是低温风干、冷冻干燥等方法，根据具体物质的性质进行操作。 
所述步骤(2)中，超临界流体依次经过冷交换器、高压泵、保温箱后成为超临界流体，进入萃取釜中进行萃取。 
所述步骤(3)中，超临界流体通过压力降低，在收集器上方快速析出。 
所述步骤(4)中，待萃取完成后，关闭升温升压系统以及超临界流体进口阀，并用有机溶剂将出口管路中的萃取物清洗至样品瓶中以备制备液相色谱纯化。 
所述超临界流体可以是处于超临界状态的二氧化碳。 
在一个优选的实施方案中，制备本发明所述高纯柚皮素包括如下步骤： 
(1)将柑橘皮粉碎、过筛、浸泡、脱水； 
(2)向步骤(1)处理后的原料中加入料液重量比为1∶0.2～0.5的10％的乙醇溶液，浸泡8-24小时后，搅拌均匀后加入到萃取釜中，釜中压力为20～40MPa，利用超临界流体萃取技术，在温度30～70℃下，静态萃取0.1～0.5小时后，再以0.1-2.0L/min动态萃取0.5～5小时； 
(3)使用制备型高效液相色谱对柚皮素粗品进行分离，获得纯度高达99.5％的柚皮素。 
在一个更优选的实施方案中，步骤(2)中所述料液重量比优选为 1∶0.3，浸泡时间优选为12小时，所述超临界流体为超临界状态的二氧化碳，所述萃取釜中压力优选为30Mpa，所述温度优选为50℃，所述静态萃取优选为0.3小时，所述动态萃取的条件为1.0L/min及3小时。 
在步骤(3)中，所述制备型高效液相色谱的条件为： 
C18制备色谱柱，采用水∶甲醇(15-40％∶60-85％)作为流动相，分离得到柚皮素，纯度达到99.5％。 
在一个更优选的实施方案中，步骤(3)中所述制备型高效液相色谱的条件为： 
色谱柱：Agilent ZORBAX Extend-C1821.2*150mm； 
流动相：水∶甲醇=15％∶85％； 
检测波长：245nm； 
柱温：35℃； 
进样量：600μL； 
流速：20.0mL/min； 
进样时间：30分钟。 
在一个更优选的实施方案中，步骤(3)中所述制备型高效液相色谱的条件为： 
色谱柱：Agilent ZORBAX Extend-C1821.2*150mm； 
流动相：水∶甲醇=20％∶80％； 
检测波长：245nm； 
柱温：35℃； 
进样量：600μL； 
流速：10.0mL/min； 
进样时间：30分钟。 
在一个更优选的实施方案中，步骤(3)中所述制备型高效液相色谱的条件为： 
色谱柱：Agilent ZORBAX Extend-C1821.2*150mm； 
流动相：水∶甲醇=20％∶80％； 
检测波长：245nm； 
柱温：35℃； 
进样量：600μL； 
流速：20.0mL/min； 
进样时间：30分钟。 
在一个更优选的实施方案中，步骤(3)中所述制备型高效液相色谱的条件为： 
色谱柱：Agilent ZORBAX Extend-C1821.2*150mm； 
流动相：水∶甲醇=30％∶70％； 
检测波长：245nm； 
柱温：35℃； 
进样量：600μL； 
流速：10.0mL/min； 
进样时间：30分钟。 
在一个更优选的实施方案中，步骤(3)中所述制备型高效液相色谱的条件为： 
色谱柱：Agilent ZORBAX Extend-C1821.2*150mm； 
流动相：水∶甲醇=30％∶70％； 
检测波长：245nm； 
柱温：35℃； 
进样量：600μL； 
流速：20.0mL/min； 
进样时间：30分钟。 
在一个更优选的实施方案中，步骤(3)中所述制备型高效液相色谱的条件为： 
色谱柱：Agilent ZORBAX Extend-C1821.2*150mm； 
流动相：水∶甲醇=40％∶60％； 
检测波长：245nm； 
柱温：35℃； 
进样量：600μL； 
流速：10.0mL/min； 
进样时间：30分钟。 
本发明的优势： 
本发明采用的超临界流体萃取技术具有选择性高、传质系数大、操作温度温和、超临界流体溶解能力强且可调、可循环使用等优点，避免了传统的纯化分离技术中引入的其它组成，过程绿色环保，且在无氧、中温等温和条件下进行，排除了过程中影响产品稳定性的因素。本发明通过大量试验摸索得到了从柑橘皮中提取柚皮素的最佳条件，使得柚皮素的得率和纯度都得到了极大的提高。 
附图说明
图1示出了本发明流程示意图 
1：钢瓶；2：净化器，3：冷换热器，4：高压泵，5：空气压缩机，6：空气过滤器，7：入口阀，8：萃取高压釜，9：保温箱，10：放空阀，11：出口阀，12：微量流量计，13：在线固相萃取柱；14：流量计。15：微调阀；16：湿式气体流量计。 
图2示出了柚皮素纯品的HPLC-MS(Scan ESI)谱图 
图3示出了柚皮素产品的HPLC定值谱图(波长288nm) 
本文所述的“超临界流体”是指温度和压力均在临界温度和临界压力之上的流体，其兼具气体和液体的优点。超临界流体萃取的典型区域，即0.95<对比温度(Tr)<1.2，1<对比压力(Pr)<5，CO2在该区域表现高度可压缩性，密度对温度或压力变化敏感。超临界流体具有许多优良的性质， 如相对液体而言粘度低，扩散系数大，而且在近临界区有超常的导热系数。 
本文所述的“超临界流体萃取技术(SFE，Supercritical Fluid Extraction)”是根据相似相容原理，利用超临界流体的溶解能力与流体密度的关系，即利用流体压力与流体温度对其溶解能力的影响而进行的。特别是在临界点附近，温度与压力的微小改变可导致流体密度的巨大改变，即其溶解能力的巨大改变。利用超临界流体密度及溶解能力可以调节的性质，有选择性的溶解目的溶质组分，并可改变条件后将其分离析出，超临界流体的密度与液体密度相当且可根据温度压力调节。利用这一性质，可在较高压力下，使溶质溶解于超临界流体中，然后降压或升温，溶质因超临界流体密度的下降而析出。超临界流体萃取是一项具有精馏和萃取两过程特性的新兴化工分离技术，具有选择性高、传质系数大、操作温度温和、超临界流体溶解能力强且可调、可循环使用等优点。 
本文所述的“制备型高效液相色谱”：液相色谱是将分离填料填装在色谱柱内，以液体流动相进行洗脱，利用药物不同活性成分与填料相互作用力的差异进分离。在液相制备色谱分离中，一般将柱压力低于0.5MPa的称为低压制备色谱，压力0.5～2MPa的称为中压制备色谱压力>2MPa的称为高压制备色谱。 
具体实施方式
下面将结合附图以及进一步的详细说明来举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。 
实施例1.柚皮素的制备 
从柑橘皮中制备纯化柚皮素的方法，其具体步骤如下： 
(1)开启冷却换热器使其温度降至-5℃左右； 
(2)将预处理过的实验原料装填进萃取釜，并密封好； 
(3)检查并确保背压阀关闭，高压泵进口阀等开启； 
(4)操作前30分钟开启保温箱主电源并设定萃取釜和分离釜温度； 
(5)温度符合要求后开启钢瓶阀门； 
(6)开启高压泵，观察电脑屏幕上的压力，确认压力符合要求； 
(7)在压力达到期望值之前，特别是进入10MPa左右时，特别观察各接口阀门等处，确保无泄漏； 
(8)如有泄漏，立即关闭高压泵，开启背压阀放空气体后，调整泄露处；若无，继续下面的操作； 
(9)缓慢升高压力直至实验压力，同时注意温度的变化，因为温度变化也可能导致压力的变化；确保压力与温度均在试验范围内； 
(10)当温度和压力均达到要求后，开始计时1小时；之后，关闭高压泵，开启背压阀，使超临界流体通过喷嘴完成喷射形成结晶，此时特别注意分离釜的温度； 
(11)记录湿式气体流量计的读数，计入数据记录文件； 
(12)关闭保温箱电源，将各阀门关闭，清扫管路和容器；收集得到柚皮素萃取物粗品； 
(13)将柚皮素萃取物粗品经过制备液相色谱纯化，得到高纯的柚皮素纯品。 
其中，超临界流体萃取柚皮素粗品的具体步骤为：称取1kg柑橘皮，干燥粉碎过80目筛，向粉碎的柑橘皮中加入0.2kg10％乙醇，浸泡8小时，搅拌均匀后加入到萃取釜中，釜中压力设为20MPa，利用超临界二氧化碳萃取技术，在温度30℃下静态萃取0.1小时后；再以0.1L/min动态萃取0.5小时；收集得到柚皮素粗品(得率73％，纯度67％)。 
制备型高效液相色谱法对柚皮素粗品进行分离的具体条件包括： 
色谱柱：Agilent ZORBAX Extend-C1821.2*150mm； 
流动相：水∶甲醇=15％∶85％； 
检测波长：245nm； 
柱温：35℃； 
进样量：600μL； 
流速：20.0mL/min； 
进样时间：30分钟。 
收集色谱峰馏分经浓缩干燥后得到柚皮素产品，柚皮素得率达到90％，纯度达到99.5％。 
将由实施例1制备的柚皮素纯品分别用HPLC-MS(Scan ESI-MS)和HPLC定值谱图进行了结构鉴定(如图2和图3所示)，从图中可以看出，采用实施例1的提取分离方法获得了高纯柚皮素。 
实施例2-6 
除下表所列技术参数之外，其他制备方法同实施例1(具体见下表1)。 
表1 
Figure BDA0000474318920000101
同样对实施例2-6制备的柚皮素纯品采用了HPLC-MS(Scan ESI-MS)和HPLC定值谱图进行结构鉴定，均表明采用实施例2-6的提取分离方法获得了柚皮素。 
实施例7.柚皮素标准物质的HPLC分析条件的选择 
7.1供试品溶液配制 
精密称取实施例1制备的柚皮素纯品10mg置于5mL容量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，得浓度为2mg/mL的柚皮素溶液，供确定色谱分离条件以及定值用。 
7.2色谱条件确定 
7.2.1流动相的选择 
分别考察了水：甲醇不同比例组成的流动相，选择了15％∶85％(水∶甲醇)作为流动相。 
7.2.2色谱柱的选择： 
选择C18色谱柱进行试验，最终确定的色谱条件如下： 
色谱柱：Agilent ZORBAX Extend-C1821.2*150mm； 
流速：20.0mL/min； 
检测波长：245nm； 
柱温：35℃。 
实施例8.柚皮素定值试验 
8.1柚皮素纯品的均匀性检查 
从实施例1所制备柚皮素纯品的不同部位抽取5份样品，分别加水配成1mg/mL的溶液，每一份重复测量4次，其测量结果作为瓶间均匀性检验结果。再取5份样品中的任意一份，重复测量4次，其测量结果作为瓶内均匀性检验的结果。将瓶内与瓶间的检验结果用统计方法(F检验)进行统计学计算，判断其均匀性，检验结果见下表2。由检验结果可知，实施例1制备的柚皮素纯品均匀性良好。 
表2柚皮素的均匀性检验结果(％) 
8.2柚皮素溶液的室温放置稳定性检查 
任意取以上制备的柚皮素样品溶液，避光放置于室温下。在七天后进行测定，每一点重复测量3次，其测量结果作为室温放置稳定性检验结果。检验结果见下表3。由检验结果可知，本发明的柚皮素溶液避光室温放置一周内稳定。 
表3柚皮素的室温放置稳定性检验结果(％) 
Figure BDA0000474318920000122
从以上HPLC结果分析来看，我们对柚皮素粗品进行了有效的分离纯化，其在检测波长为245nm情况下均达到了99.5％以上的纯度，且样品 均匀性和稳定性较好，可作为标准物质使用。上述实验结果证明这种制备柚皮素标准物质的方法稳定、可靠、可重复性强。 
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。 

Claims (13)

1.一种从柑橘皮中制备柚皮素产品的方法，其包括以下步骤：
(1)对柑橘皮进行预处理；
(2)将经步骤(1)预处理后的柑橘皮加入超临界流体萃取釜中进行超临界流体萃取；
(3)收集得到柚皮素萃取物粗品；
(4)将步骤(3)所得的粗品经制备型高效液相色谱纯化，制备得到高纯柚皮素。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中所述的预处理包括粉碎、过筛、浸泡和脱水。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的预处理为低温风干或冷冻干燥。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中步骤(2)中所述超临界流体为超临界状态的二氧化碳。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中步骤(2)的萃取步骤为：向经步骤(1)处理后的柑橘皮中加入料液重量比为1∶0.2～0.5的10％的乙醇溶液，浸泡8-24小时后，搅拌均匀后加入到萃取釜中，釜中压力设为20～40MPa，在温度30～70℃下静态萃取0.1～0.5小时后；再以0.1-2.0L/min动态萃取0.5～5小时。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中步骤(4)中制备型高效液相色谱纯化的条件是：C18制备色谱柱，采用水∶甲醇(15-40％∶60-85％)作为流动相，分离得到柚皮素，纯度达到99.5％。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中步骤(4)中制备型高效液相色谱纯化的条件是：
色谱柱：Agilent ZORBAX Extend-C1821.2*150mm；
流动相：水∶甲醇=15％∶85％；
检测波长：245nm；
柱温：35℃；
进样量：600μL；
流速：20.0mL/min；
进样时间：30分钟。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述料液重量比为1∶0.3，浸泡时间为12小时。
9.根据权利要求5-8任一项所述的方法，其中所述釜中压力为30MPa。
10.根据权利要求5-9任一项所述的方法，其中所述温度为50℃。
11.根据权利要求5-10任一项所述的方法，其中所述静态萃取为0.3小时；所述动态萃取的条件为1.0L/min及3小时。
12.根据权利要求1-11任一项所述的方法制备得到的柚皮素样品。
13.根据权利要求1-11任一项所述的方法制备得到的柚皮素样品作为标准物质的用途。
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