CN103880911A - 一种从番石榴叶中分离出的新化合物、制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从番石榴叶中分离出的新化合物、制备方法及用途。化合物的化学名为:3α,22α二羟基齐敦果烷-12-烯-30酸(3α,22α-dihydroxyolean-12-en-30-oicacid),由番石榴叶经过反复硅胶柱层析、薄层层析和结晶分离所得,其结构式由波谱解析法确定,经活性实验证明该化合物具有很好的促葡萄糖摄取作用。
Description
技术领域
本发明涉及医药、功能食品领域,特别是从番石榴叶中制备的新化合物具有降糖功能,从而用于2型糖尿病人的防治。
背景技术
2型糖尿病是多种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的一系列代谢紊乱综合征。世界卫生组织指出,世界范围内的糖尿病形势仍然非常严峻,而发展中国家的形势尤其令人担忧。
番石榴叶作为民间用药用来预防和治疗糖尿病已有悠久的历史,有大量的关于番石榴叶在二型糖尿病病人疾病的防治过程的文献报道,且大量的临床试验证明其疗效确切,因此国内外许多学者对其降糖效果展开了大量的研究,但到目前为止,番石榴叶中降血糖活性成分和作用机制尚未得到确切证实。番石榴叶资源在我国非常丰富,如果对番石榴叶进行深入系统的研究,确定其降糖作用物质基础、鉴定其降糖单体的化学结构、明析其作用机理,并在此基础上开发出防治2型糖尿病发生发展的降糖药物或功能食品,不仅可以充分利用番石榴叶资源,而且还可以减少糖尿病人的痛苦、创造出较大的经济效益和社会效益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从番石榴叶中分离出的新化合物。化合物的化学名称为:3α, 22α二羟基齐敦果烷-12-烯-30酸(3α, 22α-dihydroxyolean-12-en-30-oic acid),经活性实验证明该化合物具有很好的促葡萄糖摄取作用。
本发明提供的新化合物是由番石榴叶经过反复硅胶柱层析、薄层层析和结晶分离所得,其化学结构式由波谱解析法确定如下:
该化合物的制备方法包括以下步骤;
(1)称取粉碎的番石榴叶粉末,加入体积10倍的石油醚,回流提取两次后过滤,滤渣挥干溶剂后加入体积10倍的氯仿在60°C回流提取3次,过滤,氯仿溶液减压回收溶剂得氯仿提取物,备用。
(2)氯仿提取物进行硅胶柱层析分离,采用石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱,石油醚和乙酸乙酯的体积比例依次为50:1,20:1,10:1,5:1,1:1,0:1。经TLC检测,显色,合并相同组分,经甲醇重结晶得该化合物。
该新化合物作为制备降糖药物或降糖保健食品或功能食品添加物的用途。
四、具体实施方式
本发明所述的新化合物是从番石榴叶经过反复硅胶柱层析、薄层层析和结晶等方法分离出来。以下结合实际情况,对本发明的具体实施方式进行详细说明:
1. 提取:称取粉碎的番石榴叶粉末3.2kg,加入体积10倍的石油醚,回流提取两次后过滤,滤渣挥干溶剂后加入体积10倍的氯仿在60°C回流提取3次,过滤,氯仿溶液减压回收溶剂得氯仿提取物21.8g,备用。
2. 柱层析分离及溶剂重结晶: 氯仿提取物进行硅胶柱层析分离,采用石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱,石油醚和乙酸乙酯的体积比例依次为50:1,20:1,10:1,5:1,1:1,0:1,TLC检测,显色,合并相同组分,共分得10粗组分。第四组分1.2g再次经硅胶柱层析,石油醚-乙酸乙酯10:1,5:1梯度洗脱,从石油醚-乙酸乙酯10:1组分经甲醇重结晶得该化合物12.7mg。
3. 化合物结构鉴定:
化合物为无色结晶性粉末,薄层层析展开后,硫酸烘烤显紫红色,另外醋酐-浓硫酸反应阳性,最终显示紫红色,说明该化合物为三萜类化合物。
电子轰击质谱给出分子离子峰472,及大气压化学电离质谱给出准分子离子峰471.2 ([M-H]-)说明化合物的分子量为472 amu。结合化合物的碳谱和DEPT谱共显示其含有7个甲基(δ 15.1, 16.4, 22.2, 24.7, 25.8, 28.2 and 28.6)、9个亚甲基、6个次甲基(其中,2个连氧 δ 73.7 and 74.5, 1个为烯碳,其余三个为sp3杂化)和8个季碳。氢谱碳谱清楚的揭示化合物为一齐敦果烷型三萜类化合物,分子式为C30H48O4 (不饱和度Ω=7),分子中含有两个羟基、一个羧基和一个双键(在12、13位置)。
HMBC中(如下式1)可见,24位甲基上氢(δ 0.77 (3H, s))与 C-3, C-4, C-5 和 C-23相关; 28位甲基上氢(δ 0.81 (3H, s))与C-16, C-17, C-18和C-22远程相关;同时29位甲基上氢与 C-20, C-21 和 C-30相关,以上结果清楚的揭示了两个羟基分别定位在3、22位。
式1. 新化合物HMBC相关图示
与已知化合物“3β, 22α-dihydroxyolean-12-en-30-oic acid”比较碳谱数据,两者在五环三萜母核C、D、E环上的碳谱数据完全一致,因此可知22位的羟基处于α构型,同时羧基定位在30位上。另外,由于新化合物24位碳化学位移值在δ22.2,相对于3β-OH的24位碳化学位移值δ15.6,明显向低场移动,说明3位羟基也处在α构型,综上确定新化合物的结构为3α, 22α-dihydroxyolean-12-en-30-oic acid。
氢谱数据归属如下:δ 5.16 (1H, dd, J = 3.0, 3.6, H-12), 3.14-.3.20 (2H, m, H-3, 22), 0.85 (3H, s, H-23), 0.77 (3H, s, H-24), 0.89 (3H, s, H-25), 0.91 (3H, s, H-26), 1.14 (3H, s, H-27), 0.81 (3H, s, H-28), 1.08 (3H, s, H-29)。
碳谱数据归属如下:δ 32.7 (t, C-1), 25.1 (t, C-2), 73.7 (d, C-3), 36.9 (s, C-4), 48.1 (d, C-5), 17.7 (t, C-6), 32.0 (t, C-7), 39.9 (s, C-8), 46.8 (d, C-9), 36.4 (s, C-10), 25.1 (t, C-11), 121.9 (d, C-12), 143.7 (s, C-13), 41.7 (s, C-14), 22.9 (t, C-15), 19.5(t, C-16), 37.5 (s, C-17), 48.1 (d, C-18), 42.4 (t, C-19), 43.4 (s, C-20), 38.6 (t, C-21), 76.2 (d, C-22), 27.5 (q, C-23), 14.8 (q, C-24), 15.1 (q, C-25), 16.2 (q, C-26), 25.4 (q, C-27), 24.1 (q, C-28), 27.9 (q, C-29), 179.9 (s, C-30)。
4. 本发明中新化合物降糖活性测定:
4.1 葡萄糖消耗降糖脂肪细胞模型
雄性SD大鼠断颈处死,无菌开腹,取附睾外层白色脂肪组织,剔除附带血管,剪碎至约1 mm3大小,加Ⅰ型胶原酶消化1h,收集上层脂肪细胞,加入适量Hanks缓冲液洗涤细胞三次即得原代脂肪细胞。96孔板中建立200μL反应体系:浓度为2×106cells/mL细胞悬液100μL+30μL 6mg/mL葡萄糖+30μL胎牛血清+40μL样品溶液(包括各萃取物或各柱层析洗脱组分),以饱和湿度、37℃、5% CO2培养反应30min,每孔再加入1μL 2mmol/L肾上腺素溶液,再以同样条件培养3h,冰浴终止反应。采用微量葡萄糖氧化酶法显色,酶标仪上读数,测定并计算各孔葡萄糖浓度,并和对照组比较计算各组葡萄糖的消耗浓度,由此评价各萃取物或各柱层析组分的摄取葡萄糖能力,具体计算公式如下:
glucose-uptake level= Cctrl-Ccompound (mmol/L)
其中,Cctrl为对照组葡萄糖的浓度,Ccompound为样品或分离得到的有效成分经过3小时培养后残留培养基中的葡萄糖浓度。
4.2 新化合物降糖实验
在无菌环境下,将单体溶于含DMSO的Hanks缓冲液(DMSO终浓度为0.1%),过0.22μm微孔滤膜,配置成终浓度为10、30、100μmol/L的各单体样品溶液,按照细胞模型进行单体降糖活性分析,并以0.1%DMSO为空白对照组,10nmol/L胰岛素为阳性降糖对照组,结果如下表1所示。
表1. 本发明新化合物对脂肪细胞葡萄糖摄取量的影响(X±SD,n=6)
新化合物浓度 | 葡萄糖摄取量(mmol/L) |
10μmol/L | 0.88±0.074 |
30μmol/L | 1.70±0.083 |
100μmol/L | 2.46±0.107 |
Insulin 10nmol/L | 1.98±0.146 |
以对照组葡萄糖摄取量的基准值为0,表1为单体在不同浓度促葡萄糖摄取吸收的数值,其结果表明,阳性降糖药物胰岛素能够显著促进葡萄糖的摄取吸收,说明该检测模型的可行性。本发明新化合物能够促进葡萄糖的摄取利用,且表现为剂量依赖关系,在10-100μmol/L用量范围内,化合物的浓度越高,降糖效果越明显。
Claims (5)
1.一种从番石榴叶中分离出的新化合物,化学名为:3α, 22α二羟基齐敦果烷-12-烯-30酸(3α, 22α-dihydroxyolean-12-en-30-oic acid),其化学结构式为:
根据权利1要求所述的从从番石榴叶中分离出的新化合物制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)称取粉碎的番石榴叶粉末,加入体积10倍的石油醚,回流提取两次后过滤,滤渣挥干溶剂后加入体积10倍的氯仿在60°C回流提取3次,过滤,氯仿溶液减压回收溶剂得氯仿提取物,备用。
2.(2)氯仿提取物进行硅胶柱层析分离,采用石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱,经TLC检测,显色,合并相同组分,经重结晶得该化合物。
3.根据权利2要求所述的从番石榴叶分离新化合物的制备方法,其特征在于进行梯度洗脱时,石油醚和乙酸乙酯的体积比例依次为50:1,20:1,10:1,5:1,1:1,0:1。
4.根据权利1要求所述的新化合物作为降糖药物的用途。
5.根据权利1要求所述的新化合物作为降糖保健食品或功能食品添加物。
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