CN103877089A - 一种防治鱼类温和气单胞菌病的鱼药及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种治疗温和气单胞菌引起的细菌性鱼病的药物组合，含有治疗有效量的没食子酸和恩诺沙星，适量的酸、碱以及药物学可接受载体，所述适量的酸、碱使其混合物的pH值为为6-8。本发明还涉及该药物组合物的制备方法及在治疗温和气单胞菌引起的细菌性鱼病中的应用，所述的药物组合物采用如下重量配比而成：没食子酸10份、恩诺沙星1份，该药物组合对于治疗温和气单胞菌感染的细菌性鱼病中优点在于组合物简单，疗效显著，能够增强鱼体免疫能力，制备方法简单，有效的解决单一抗生素的抗耐药性，同时对预防细菌性鱼病的复发或感染可产生积极的作用。

Description

一种防治鱼类温和气单胞菌病的鱼药及其应用

技术领域

本发明具体涉及一种药物组合物制备方法及其在治疗温和气单胞菌引起的细菌性鱼病中的应用。 

技术背景

温和气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是常见的兼性厌氧型致病菌，是造成细菌性鱼病的微生物之一，给淡水养殖类造成很大的经济损失。目前，治疗温和气单胞菌引起的细菌性鱼病的方法主要为单纯抗生素治疗，副作用较多，且易造成病原菌抗药性问题，特别是目前水产养殖业中抗生素使用无序，抗药性已经比较普遍。面对日益严峻的病原菌抗药性问题，寻找能够解决的药物已经成为治疗细菌性鱼病的重要课题，但目前尚未发现安全有效的治疗抗药性细菌性鱼病的药物。 

中药具有抗病菌、抗病毒及提高免疫力等作用，克服了化学药物和抗生素类药物的缺陷,同时，中草药还具有营养作用及诱食作用等功能。中药单体与抗生素联合，既可提高治疗效果、降低耐药菌的产生，又可保护环境、减少药物残留，弥补了中药和抗生素单味用药的不足，具有很大的发展前景。 

发明内容

本发明的目的是发明一种防治鱼类温和气单胞菌病的药物组合物，既能抑制致病菌的增长，又能提高鱼体免疫力，同时有效解决耐药性的问题。 

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的： 

一种防治鱼类温和气单胞菌病的药物组合物，包括如下重量配比的原料配制而成：恩诺沙星1-2份，没食子酸10-12份；进一步，由如下重量配比的原料配制而成：恩诺沙星1份，没食子酸10份；进一步，还包括制药上可接受的辅料；进一步，所述制剂为散剂。 

本发明还公开一种制备防治鱼类温和气单胞菌病的药物组合物的方法，其特征在于：含有适量的没食子酸，适量的恩诺沙星，以及药物学可接受载体(适量的酸、碱)，所述适量的酸、碱使其混合以后的药物组合pH值为6-8；所述酸是柠檬酸；所述碱是碳酸氢钠。 

一种药物组合物的制备方法，包括如下步骤： 

（1）包括如下重量配比的原料药配置而成：恩诺沙星1份，没食子酸10份； 

（2）将上述药物与适量的酸、碱混合均匀制成散剂，使其混合物溶解后的pH值为6-8。 

采用上述技术方法，结合下面将要详述的实施例，本发明突出的技术效果在于： 

1、通过在没食子酸和恩诺沙星药物组合中加入酸和碱，并控制药物组合物的pH值为6-8。既适合没食子酸和恩诺沙星的溶解，又能提高药物吸收。另外pH值在6-8范围以内，药物组 合偏中性，不会对鱼体造成刺激。 

2、通过体外药效学试验验证，单一的没食子酸和恩诺沙星及其两种药物以不同比例混合液，对细菌性鱼病的致病菌均有杀菌效果。而且发现，当单一的没食子酸和恩诺沙星及其两种药物以不同比例混合后的浓度达到一定值后（1mg/g），对致病菌的抑制率已达到100%。 

3、通过体内治疗细菌性鱼病实验证实：没食子酸和恩诺沙星药物组合不但具有治疗细菌性鱼病的肯定效果，而且在达到治疗效果的同时，具有抗耐药性的作用，预防了细菌性鱼病的再次感染。 

4、通过体内治疗温和气单胞菌药物引起的细菌性鱼病实验证实：a、没食子酸和恩诺沙星药物组合在产生有效治疗效果的基础上，具明显的增强鱼免疫功能，提高鱼免疫能力的突出优点，对预防细菌性鱼病的复发或感染可产生积极的作用。b、没食子酸和恩诺沙星药物组合提高的鱼免疫能力可以继续发挥其他治疗作用。c、实际应用中没有发现其有明显副作用，可以应用到各个生长时期的鱼，这正是没食子酸和恩诺沙星药物组合的优势所在。 

附图说明

图1.没食子酸对鲤鱼头肾巨噬细胞内ROS的影响。 

注：与空白对照组（0μg/mL）比较，*P<0.05，**P<0.01。 

具体实施方式

药物的制备 

（1）采用如下重量配比的原料配制而成：恩诺沙星1份，没食子酸10份 

（2）配制方法为将上述药物与适量的酸、碱混合均匀制成散剂，使其混合物溶解后的pH值为为6-8。 

实施例中，所涉及的部分材料来源如下： 

温和气单胞菌：中国工业微生物菌种保藏中心；LB培养基和Agar-LB培养基：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；恩诺沙星，没食子酸：中国药品生物制品检定所；鲤鱼：吉林省水产科学研究院 

实施例一：温和气单胞菌菌悬液的制备 

挑取适量菌种原液接种于LB液体培养基中，28℃培养18h，用接种环蘸取菌液在琼脂平板上划线培养24h，挑取单个菌落接种于LB培养基中培养18h。取出后用酶标仪测定A600nm确定菌液浓度，用LB培养基稀释到菌液终浓度为10⁶CFU/mL，置于4℃保存备用。另取适量菌悬液加入冻存液放入-80℃进行冻存，以备后续复苏后使用。 

实施例二：联合抑菌试验 

采用棋盘交叉法，根据中药单体和抗生素对温和气单胞菌的单用试验结果，考察没食子酸与恩诺沙星的联合抑菌效果，以2MIC开始进行二倍梯度稀释。联合抑菌试验中，96孔板每孔加入相应的受试药物各100μL，再加入10μL1×10⁶CFU/mL的新鲜菌液，混匀，小心将96孔板放入28℃恒温培养箱中培养24h，观察每孔中菌的生长情况。其中每次联合试验均设单药对照。 

联合抑菌试验结果显示，没食子酸和恩诺沙星联合作用时的MIC分别为15.6μg/mL和0.01μg/mL。 

实施例三：没食子酸和恩诺沙星药物组合体内治疗试验 

分组:选择健康无病的鲤鱼140条,随机分为7个大组。A组（空白组）；B组（阳性对照组）；C组（没食子酸组）；D组（恩诺沙星组）；E组（联合低剂量组）；F组（联合中剂量组）；G组（联合高剂量组）。A组不染菌，用一定量的生理盐水灌胃；B组注射感染后用等量的生理盐水灌胃；C组注射感染后用一定量的没食子酸灌胃；D组注射感染后用一定量的恩诺沙星灌胃；E组,F组,G组注射感染后分别用不同剂量的没食子酸和恩诺沙星灌胃。用10⁸CFU/mL的温和气单胞菌菌液分别进行腹腔注射染菌，每尾腹腔注射0.5mL相应菌液，攻毒组（温和气单胞菌组）感染10尾鲤鱼。每组按照相应剂量，在注射染菌后2小时灌胃给药，连续给药7天。从接种病菌时起,连续观察7天,记录各组鱼的发病死亡情况，统计存活率。 

治疗试验结果如表1: 

表1不同剂量药物治疗鲤鱼温和气单胞菌病试验 

实施例四：没食子酸和恩诺沙星药物组合对体内免疫系统的影响 

鲤鱼头肾巨噬细胞的分离：鲤鱼头肾巨噬细胞的分离采用Bayne方法。将鲤鱼麻醉后，放血，在超净台内，剖取鲤鱼头肾，剔除筋膜后研磨，将研磨液加入到34%/51%的Percoll 分离液的液面上，1500rpm离心30min，得液面交界处乳白色的巨噬细胞，离心洗涤2遍。用0.1%FBS-1640培养基调整细胞浓度为107个/mL，放入6孔板中，28℃过夜，弃除未贴壁的细胞，加入5%FBS-1640培养基培养备用。ROS测定：备用细胞中加入不同浓度的没食子酸培养，设置空白对照组。共同培养24h后，加入CM-H₂DCFDA5μM在28℃下培养30min后，用PBS洗两遍，于荧光倒置显微镜下观察，继而采用Quantity One software(Bio-Rad)对光密度进行定量分析。结果如图1，与空白组相比，没食子酸具有提高免疫力的作用。 

讨论与结论 

根据药物联合作用结果，我们研制出了治疗鱼类细菌性败血症的药物，治疗试验结果显示，没食子酸10mg/kg且恩诺沙星1mg/kg时，试验鱼的存活率较高，也就是治愈率较高，感染温和气单胞菌的鱼存活率能达到100%，结果表明，该联合药物针对细菌性败血症具有很好的治疗效果。同时，我们通过ROS测定考察了没食子酸的免疫活性，结果显示，随着没食子酸浓度的增大，免疫活性增强。因此，没食子酸不仅具有很好的抑菌效果，而且能够提高机体免疫力。 

Claims (3)

1.一种防治鱼类温和气单胞菌病的鱼药及其应用。

2.如权利要求1所述的药物组合，其特征在于：由如下重量配比的原料配制而成：恩诺沙星1份，没食子酸10份。

3.一种药物组合物的制备方法，包括如下步骤：

（1）包括如下重量配比的原料药配置而成：盐酸恩诺沙星1份，没食子酸10份；

（2）将上述药物与适量的酸、碱混合均匀制成散剂，使其混合物溶解后的pH值为6-8。

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