CN103865994A - 一种生物膜β-变形细菌的定量检测方法 - Google Patents

一种生物膜β-变形细菌的定量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生物膜β-变形细菌的定量检测方法，包括以下步骤：标准品β-变形细菌的预处理；待测生物膜β-变形细菌样品的预处理；对标准品β-变形细菌进行实时荧光定量PCR检测，制作标准曲线方程y＝-ax+b，其中，y为循环阈值，x为DNA浓度以10为底的对数；再对待测生物膜β-变形细菌进行实时荧光定量PCR检测得到循环阈值，根据循环阈值及标准曲线得到样品中β-变形细菌DNA的浓度。与现有技术相比，本发明有效克服了传统纯化培养方法分析速度慢、制约因素多、低估生物多样性、准确性低、主观因素强等问题，以更加科学地监测水处理工艺及管网生物膜中致病菌的信息，反映饮用水系统中的潜在危害，为给水管网的水质净化提供更加科学的依据。

Description

一种生物膜β-变形细菌的定量检测方法
技术领域
本发明涉及一种细菌检测方法，尤其是涉及一种生物膜β-变形细菌的定量检测方法。
背景技术
在水处理及管道输送领域，微生物指标是水质监测的重要组成部分。目前的微生物检测主要集中在水中的悬浮细菌，但实际上，在水处理各工艺及管网中都有生物膜的形成，成为水质稳定的隐患。给水系统中生物膜的形成，主要经由以下5个过程：(1)残留细菌附着；(2)形成微生物群落，产生胞外聚合物；(3)群落自由扩展，形成稳定结构；(4)生物膜成熟，新菌种进入生物膜生长，有机和无机物质被结合，形成溶液梯度，导致生物膜空间的异相结构；(5)成熟的生物膜脱落。以上循环交替重复进行。
变形菌门是细菌中最大的一门，包括很多病原菌，如大肠埃希氏菌、沙门氏菌、孤菌、螺杆菌等，变形细菌均为革兰氏阴性菌。根据rRNA的不同，变形菌通常分为5类用希腊字母α、β、γ、δ和ε命名。在给水系统中，变形细菌占有主导性。无论作为共生体还是病原体，变形细菌均与真核生物有着密切的交互作用。β-变形菌包括很多好氧或兼性细菌，通常其降解能力可变，但也有一些无机化能种类和光合种类，很多种类可以在废水或土壤的环境样品中发现。该纲的致病菌有奈氏球菌目(Neisseriales)和伯克氏菌属(Burkholderia)。
目前，国内对水处理工艺及管网生物膜生长和结构的研究较少，并且方法大多停留在细菌学指标阶段，较多采用传统纯培养技术来检测分析微生物，对于大多数微生物的样本，微生物形态学仅能提供极少的线索。再者，基于培养的微生物检测技术由于存在高度的选择性和费时、费力等缺点，不能满足分析微生物群落的结构与功能关系的需要。除此之外，许多有机体是不可培养的，生态系统中微生物多样性难以被确定；传统的分离计数技术也难以满足对微生物群落结构变化进行动态监测的要求。对于微生物的深入研究，迫切需要更为准确、全面、灵敏的分析技术。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种准备、灵敏的生物膜β-变形细菌的定量检测方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种生物膜β-变形细菌的定量检测方法，该方法包括以下步骤：
第一步、标准品β-变形细菌的预处理：
(1)将冷冻的β-变形细菌标样放入LB液体培养基中，37℃恒温培养，得到复苏的β-变形细菌标样；
(2)大肠埃希氏菌感受态细胞的制备；
(3)将复苏的β-变形细菌标样转化入大肠埃希氏菌感受态细胞中，并加入到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃恒温培养；
(4)通过质粒抽提试剂盒对步骤(3)所得物进行质粒提取，得到β-变形细菌质粒原液；
(5)利用超微量核酸蛋白测定仪测定步骤(4)所得的β-变形细菌质粒原液的DNA含量；
第二步、待测生物膜β-变形细菌样品的预处理：
(1)将从水处理工艺或管道内壁采集的生物膜样品加入灭菌生理盐水中，经超声预处理，利用提取DNA试剂盒进行DNA的提取；
(2)提取完毕后，直接采用0.7％的琼脂糖凝胶电泳或通过PCR扩增再电泳鉴定提取的DNA；
第三步、实时荧光定量PCR检测：
(1)标准品β-变形细菌的实时荧光定量PCR检测：
根据β-变形细菌质粒原液的DNA含量，将β-变形细菌质粒原液分别稀释成DNA含量为109、108、107、106、105、104、103copy/μl的β-变形细菌质粒稀释液，根据PCR反应体系测定对应的β-变形细菌质粒稀释液的循环阈值；
根据检测结果得到β-变形细菌的循环阈值与DNA含量的对应关系，制作标准曲线方程y＝-ax+b，其中，y为循环阈值，x为DNA浓度以10为底的对数；
(2)待测生物膜β-变形细菌的实时荧光定量PCR检测：
根据PCR反应体系测定预处理过的待测生物膜β-变形细菌样品的循环阈值，根据标准曲线得到样品中β-变形细菌DNA的浓度。
第一步中步骤(1)所述的β-变形细菌标样的复苏方法如下：
将-80℃低温保存的β-变形细菌标样取出，待β-变形细菌标样达到室温后，加入LB液体培养基中，37℃恒温培养24h后，得到复苏的β-变形细菌标样。
第一步中步骤(2)所述的大肠埃希氏菌感受态细胞的制备方法如下：
(a)从固体LB培养基上挑取大肠埃希氏菌的单菌落置于灭菌LB液体培养基中，37℃恒温培养后，获得新鲜大肠埃希氏菌菌液；
(b)将新鲜大肠埃希氏菌菌液在低温下高速离心，去除上清液，然后加入0℃的灭菌的氯化钙溶液，充分混匀，并于散冰中静置30min；于4℃下高速离心5min，去除上清液；在离心管中继续加入灭菌的氯化钙溶液，散冰上轻柔地摇匀，得到大肠埃希氏菌感受态细胞菌液。
第一步中步骤(3)所述的将复苏的β-变形细菌标样转化入大肠埃希氏菌感受态细胞中，并加入到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃恒温培养的具体方法如下：
(a)大肠埃希氏菌感受态细胞菌液中加入复苏的β-变形细菌标样，冰水浴30min后，40～45℃水浴热激80～90s，再冰水浴2min后加入到LB液体培养基中，混匀后37℃恒温复苏1h，得到复苏浑浊液；
(b)将复苏浑浊液离心，去除上清液，然后涂布到含氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃倒置LB固体培养基培养12～16h，得到β-变形细菌转化入大肠埃希氏菌后的新鲜β-变形细菌菌落产物；
(c)挑选新鲜β-变形细菌菌落产物中的单个菌落加入到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃恒温培养14～16h。
第三步中步骤(1)所述的PCR反应体系共25μl，包括12.5μl市售的SYBRGreen Realtime PCR Master Mix、0.5μl正向引物、0.5μl反向引物、10μl灭菌去离子水及1.5μl模板DNA，所述的模板DNA为β-变形细菌质粒稀释液或预处理过的待测生物膜β-变形细菌样品。
所述的正向引物序列为5′-CGCACAAGCGGTGGATGA-3’；所述的反向引物序列为5′-CGGTGTGTACAAGACCC-3’。
第三步中步骤(1)所述的PCR反应的条件为：预变性条件为95℃保持3min；变性扩增条件为95℃保持15s，延伸条件为60℃保持60s，该过程共循环40次；最后在72～99℃解离。
所述的含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，每100ml LB液体培养基含有200～250μl的氨苄青霉素，含氨苄青霉素的LB固体培养基中，每100ml LB固体培养基含有200～250μl的氨苄青霉素。
在进行PCR检测时，对结果进行扩增曲线、熔解曲线和标准曲线的分析，当R2＞0.99且扩增效率在0.9-1.1之间时，认为扩增有效且结果可信。
每次PCR试验均需进行标准曲线的同步测定，每个样品选取2个平行样，每次试验需采用1组空白对照考察反应体系是否被污染。
所有试验材料均需高温灭菌处理后密封烘干使用；配置体系时需在无菌超净台中进行操作，由于SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂的热感性，所有操作均需在冰上进行。
与现有技术相比，本发明选择β-变形细菌为研究对象进行定量分析研究，建立了基于SYBR Green I的实时荧光定量PCR技术检测管网管壁生物膜微生物结构组成的方法，可准确检测出β-变形细菌的数量，从微观角度定量了解生物膜的组成与结构。有效克服了传统纯化培养方法分析速度慢、制约因素多、低估生物多样性、准确性低、主观因素强等问题，以更加科学地监测水处理工艺及管网生物膜中致病菌的信息，反映饮用水系统中的潜在危害，从而为研究饮用水系统的微生物稳定性提供支撑，为给水管网的水质净化提供更加科学的依据。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
(1)β-变形细菌标样的复苏
将-80℃低温保存的β-变形细菌标样取出，溶解至室温，充分混合；取20μl液态β-变形细菌标样入2ml的LB液体培养基(培养基用前121℃高温灭菌25min)，置于37℃恒温摇床培养24h，转速控制在160rpm。24h后得到新鲜活化的各个标样菌液。
(2)大肠埃希氏菌感受态细胞的制备
A、选用大肠埃希氏菌菌株，从LB平板上挑取单菌落置于1ml的灭菌LB液体培养基，于37℃恒温摇床培养，转速控制在160rpm，24h后获得新鲜大肠埃希氏菌菌液。
B、将新鲜培养的大肠埃希氏菌菌液充分混匀，取400μl菌液放入40ml液体LB培养基，37℃培养100min；
C、取50ml菌液，预冷低温高速离心机至4℃，4℃下6000rpm高速离心5min，缓慢去除上清液；
D、加1ml预冷的灭菌CaCl2溶液(冰水混合物中预冷至0度)，充分混匀；在混合液体中，继续加入20ml左右CaCl2溶液；
E、将离心管于散冰中静置30min；于4℃下6000rpm高速离心5min，去除上清液；在离心管中继续加入800μlCaCl2溶液，散冰上轻柔地摇匀。
由于感受态受温度影响较大，故成功制备的感受态需完全置于散冰中低温保存，并于制备之日起5日内尽快使用。
(3)变形细菌标样转化入感受态细菌
为考察感受态效果，选用阳性质粒进行转化试验，具体操作如下：
A、分别从以上800μl菌液中取80μl入2个1.5ml离心管，其中一个为阴性对照，不加入任何其他试剂；另一个加入1μl拷贝数为10-9的阳性质粒，作为阳性对照。将离心管置于冰水混合物，冰水浴30min；
B、将离心管水浴42℃热激80～90s后，迅速置于冰水浴冷却2min；
C、加500μl的LB液体培养基，混匀后37℃恒温160rpm复苏1h  复苏浑浊液室温下13000rpm离心1min，去除500μl上清液，充分混匀后涂布到含氨苄青霉素(100ml固体培养基加入200-250μl氨苄AP50)的LB固体平板，37℃倒置平板培养12～16h；
D、培养后，观察两块平板，若阴性平板无菌落，阳性板菌落较多则证明感受态制作效果良好。则将β-变形细菌标样与其连接：从感受态菌液中取80μl入多个1.5ml离心管，其中一个为阴性对照，不加入任何其他试剂，标记为空白样；其它离心管中分别加入1μl的β-变形细菌复苏活化后的新鲜菌液，对应标记为β-变形细菌。将以上离心管置于冰水混合物，冰水浴30min；重复本节中的步骤B-C；
培养后的平板为β-变形细菌转化入大肠埃希氏菌后的新鲜变形细菌菌落产物。
(4)变形细菌标样的挑菌培养
在灭菌的液体LB培养基中加入氨苄(40ml液体LB培养基+80μl氨苄AP50)，在上述β-变形细菌平板中分别挑单个菌加入1ml液体LB培养基，置于1.5ml灭菌离心管中。将上述离心管置于37℃恒温摇床培养14～16h，转速控制在160rpm。
(5)变形细菌标样质粒的提取
采用质粒抽提试剂盒进行质粒提取。提取方法按试剂盒说明所述进行。
(6)β-变形细菌定量双链DNA含量的测定
利用超微量核酸蛋白测定仪测定β-变形细菌DNA含量。
(7)实时荧光定量PCR(RTFQ-PCR)检测
根据β-变形细菌的DNA含量测定结果，将变形细菌质粒原液分别稀释至109、108、107、106、105、104、103copy/μl。根据本发明所述RTFQ-PCR反应体系、条件测定对应的β-变形细菌标准曲线，取103copy/μl～107copy/μl的稀释浓度为已知浓度。
(8)根据检测结果得到标准曲线方程y＝-ax+b。其中，y为循环阈值(Ct值)，x为DNA浓度以10为底的对数。以a接近于3.33且b在38-40之间为最佳。
(9)样品预处理
向从水处理工艺或管道内壁采集的生物膜样品中加入40ml灭菌生理盐水，置于超声振荡仪处理，超声功率23w，超声时间2min。
(10)DNA提取
利用提取DNA试剂盒进行DNA的提取。操作方法按试剂盒说明所述进行。提取完毕后，直接采用0.7％的琼脂糖凝胶电泳或通过PCR扩增再电泳鉴定提取的DNA，在相应位置条带明亮且无杂带则可进行下一步操作。
(11)实时荧光定量PCR(RTFQ-PCR)检测
按照本发明所述RTFQ-PCR反应体系、条件测定DNA样品，根据标准曲线得到样品中β-变形细菌DNA的浓度。
实施例2
一种生物膜β-变形细菌的定量检测方法，该方法包括以下步骤：
第一步、标准品β-变形细菌的预处理：
(1)将-80℃低温保存的β-变形细菌标样取出，待β-变形细菌标样达到室温后，加入LB液体培养基中，37℃恒温培养24h后，得到复苏的β-变形细菌标样；
(2)大肠埃希氏菌感受态细胞的制备：
(a)从固体LB培养基上挑取大肠埃希氏菌的单菌落置于灭菌LB液体培养基中，37℃恒温培养后，获得新鲜大肠埃希氏菌菌液；
(b)将新鲜大肠埃希氏菌菌液在低温下高速离心，去除上清液，然后加入0℃的灭菌的氯化钙溶液，充分混匀，并于散冰中静置30min；于4℃下高速离心5min，去除上清液；在离心管中继续加入灭菌的氯化钙溶液，散冰上轻柔地摇匀，得到大肠埃希氏菌感受态细胞菌液；
(3)将复苏的β-变形细菌标样转化入大肠埃希氏菌感受态细胞中，并加入到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃恒温培养：
(a)大肠埃希氏菌感受态细胞菌液中加入复苏的β-变形细菌标样，冰水浴30min后，40～45℃水浴热激80～90s，再冰水浴2min后加入到LB液体培养基中，混匀后37℃恒温复苏1h，得到复苏浑浊液；
(b)将复苏浑浊液离心，去除上清液，然后涂布到含氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃倒置LB固体培养基培养12～16h，得到β-变形细菌转化入大肠埃希氏菌后的新鲜β-变形细菌菌落产物；
(c)挑选新鲜β-变形细菌菌落产物中的单个菌落加入到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃恒温培养14～16h；
其中，含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，每100ml LB液体培养基含有200～250μl的氨苄青霉素，含氨苄青霉素的LB固体培养基中，每100ml LB固体培养基含有200～250μl的氨苄青霉素。
(4)通过质粒抽提试剂盒对步骤(3)所得物进行质粒提取，得到β-变形细菌质粒原液；
(5)利用超微量核酸蛋白测定仪测定步骤(4)所得的β-变形细菌质粒原液的DNA含量；
第二步、待测生物膜β-变形细菌样品的预处理：
(1)将从水处理工艺或管道内壁采集的生物膜样品加入灭菌生理盐水中，经超声预处理，利用提取DNA试剂盒进行DNA的提取；
(2)提取完毕后，直接采用0.7％的琼脂糖凝胶电泳或通过PCR扩增再电泳鉴定提取的DNA；
第三步、实时荧光定量PCR检测：
(1)标准品β-变形细菌的实时荧光定量PCR检测：
根据β-变形细菌质粒原液的DNA含量，将β-变形细菌质粒原液分别稀释成DNA含量为109、108、107、106、105、104、103copy/μl的β-变形细菌质粒稀释液，根据PCR反应体系测定对应的β-变形细菌质粒稀释液的循环阈值；
PCR反应体系共25μl，包括12.5μl市售的SYBR Green Realtime PCR MasterMix、0.5μl正向引物、0.5μl反向引物、10μl灭菌去离子水及1.5μl模板DNA，模板DNA为β-变形细菌质粒原液或预处理过的待测生物膜β-变形细菌样品；正向引物序列为5′-CGCACAAGCGGTGGATGA-3’；反向引物序列为5′-CGGTGTGTACAAGACCC-3’。PCR反应的条件为：预变性条件为95℃保持3min；变性扩增条件为95℃保持15s，延伸条件为60℃保持60s，该过程共循环40次；最后在72～99℃解离。
根据检测结果得到β-变形细菌的循环阈值与DNA含量的对应关系，制作标准曲线方程y＝-ax+b，其中，y为循环阈值，x为DNA浓度以10为底的对数；
(2)待测生物膜β-变形细菌的实时荧光定量PCR检测：
根据PCR反应体系测定预处理过的待测生物膜β-变形细菌样品的循环阈值，根据标准曲线得到样品中β-变形细菌DNA的浓度。
在进行PCR检测时，对结果进行扩增曲线、熔解曲线和标准曲线的分析，当R2＞0.99且扩增效率在0.9-1.1之间时，认为扩增有效且结果可信。
每次PCR试验均需进行标准曲线的同步测定，每个样品选取2个平行样，每次试验需采用1组空白对照考察反应体系是否被污染。
所有试验材料均需高温灭菌处理后密封烘干使用；配置体系时需在无菌超净台中进行操作，由于SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂的热感性，所有操作均需在冰上进行。

Claims (8)

1.一种生物膜β-变形细菌的定量检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
第一步、标准品β-变形细菌的预处理：
(1)将冷冻的β-变形细菌标样放入LB液体培养基中，37℃恒温培养，得到复苏的β-变形细菌标样；
(2)大肠埃希氏菌感受态细胞的制备；
(3)将复苏的β-变形细菌标样转化入大肠埃希氏菌感受态细胞中，并加入到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃恒温培养；
(4)通过质粒抽提试剂盒对步骤(3)所得物进行质粒提取，得到β-变形细菌质粒原液；
(5)利用超微量核酸蛋白测定仪测定步骤(4)所得的β-变形细菌质粒原液的DNA含量；
第二步、待测生物膜β-变形细菌样品的预处理：
(1)将从水处理工艺或管道内壁采集的生物膜样品加入灭菌生理盐水中，经超声预处理，利用提取DNA试剂盒进行DNA的提取；
(2)提取完毕后，直接采用0.7％的琼脂糖凝胶电泳或通过PCR扩增再电泳鉴定提取的DNA；
第三步、实时荧光定量PCR检测：
(1)标准品β-变形细菌的实时荧光定量PCR检测：
根据β-变形细菌质粒原液的DNA含量，将β-变形细菌质粒原液分别稀释成DNA含量为109、108、107、106、105、104、103copy/μl的β-变形细菌质粒稀释液，根据PCR反应体系测定对应的β-变形细菌质粒稀释液的循环阈值；
根据检测结果得到β-变形细菌的循环阈值与DNA含量的对应关系，制作标准曲线方程y＝-ax+b，其中，y为循环阈值，x为DNA浓度以10为底的对数；
(2)待测生物膜β-变形细菌的实时荧光定量PCR检测：
根据PCR反应体系测定预处理过的待测生物膜β-变形细菌样品的循环阈值，根据标准曲线得到样品中β-变形细菌DNA的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种生物膜β-变形细菌的定量检测方法，其特征在于，第一步中步骤(1)所述的β-变形细菌标样的复苏方法如下：
将-80℃低温保存的β-变形细菌标样取出，待β-变形细菌标样达到室温后，加入LB液体培养基中，37℃恒温培养24h后，得到复苏的β-变形细菌标样。
3.根据权利要求1所述的一种生物膜β-变形细菌的定量检测方法，其特征在于，第一步中步骤(2)所述的大肠埃希氏菌感受态细胞的制备方法如下：
(a)从固体LB培养基上挑取大肠埃希氏菌的单菌落置于灭菌LB液体培养基中，37℃恒温培养后，获得新鲜大肠埃希氏菌菌液；
(b)将新鲜大肠埃希氏菌菌液在低温下高速离心，去除上清液，然后加入0℃的灭菌的氯化钙溶液，充分混匀，并于散冰中静置30min；于4℃下高速离心5min，去除上清液；在离心管中继续加入灭菌的氯化钙溶液，散冰上轻柔地摇匀，得到大肠埃希氏菌感受态细胞菌液。
4.根据权利要求1所述的一种生物膜β-变形细菌的定量检测方法，其特征在于，第一步中步骤(3)所述的将复苏的β-变形细菌标样转化入大肠埃希氏菌感受态细胞中，并加入到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃恒温培养的具体方法如下：
(a)大肠埃希氏菌感受态细胞菌液中加入复苏的β-变形细菌标样，冰水浴30min后，40～45℃水浴热激80～90s，再冰水浴2min后加入到LB液体培养基中，混匀后37℃恒温复苏1h，得到复苏浑浊液；
(b)将复苏浑浊液离心，去除上清液，然后涂布到含氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃倒置LB固体培养基培养12～16h，得到β-变形细菌转化入大肠埃希氏菌后的新鲜β-变形细菌菌落产物；
(c)挑选新鲜β-变形细菌菌落产物中的单个菌落加入到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃恒温培养14～16h。
5.根据权利要求1所述的一种生物膜β-变形细菌的定量检测方法，其特征在于，第三步中步骤(1)所述的PCR反应体系共25μl，包括12.5μl市售的SYBR Green Realtime PCR Master Mix、0.5μl正向引物、0.5μl反向引物、10μl灭菌去离子水及1.5μl模板DNA，所述的模板DNA为β-变形细菌质粒稀释液或预处理过的待测生物膜β-变形细菌样品。
6.根据权利要求5所述的一种生物膜β-变形细菌的定量检测方法，其特征在于，所述的正向引物序列为5′-CGCACAAGCGGTGGATGA-3’；所述的反向引物序列为5′-CGGTGTGTACAAGACCC-3’。
7.根据权利要求1所述的一种生物膜β-变形细菌的定量检测方法，其特征在于，第三步中步骤(1)所述的PCR反应的条件为：预变性条件为95℃保持3min；变性扩增条件为95℃保持15s，延伸条件为60℃保持60s，该过程共循环40次；最后在72～99℃解离。
8.根据权利要求4所述的一种生物膜β-变形细菌的定量检测方法，其特征在于，所述的含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，每100ml LB液体培养基含有200～250μl的氨苄青霉素；所述的含氨苄青霉素的LB固体培养基中，每100ml LB固体培养基含有200～250μl的氨苄青霉素。
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