CN103865917B - 一种原子转移自由基聚合修饰的金属丝固定化酶反应器的制备方法 - Google Patents

一种原子转移自由基聚合修饰的金属丝固定化酶反应器的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种固定化酶反应器的制备方法。该方法包括如下步骤:1)制备一端为巯基,另一端为原子转移自由基聚合引发基团的引发剂;2)利用巯基将引发剂固定在金属丝表面;3)利用甲基丙烯酸缩水甘油酯单体的原子转移自由基聚合反应,使金属丝表面固定上环氧基;4)利用乙二胺使环氧基开环并暴露氨基;5)利用氨基与戊二醛反应,使金属丝表面修饰上醛基;6)利用醛基与蛋白酶的氨基反应,将蛋白酶固定到金属丝表面;7)利用含有氨基的化合物对剩余醛基进行封闭,获得金属丝固定化酶反应器。本发明的固定化酶反应器使用简单方便,易于从溶液中分离,可重复使用;与传统溶液酶解法相比,该固定化酶反应器所需酶解时间显著减少。

Description

一种原子转移自由基聚合修饰的金属丝固定化酶反应器的制备方法
技术领域
本发明属于生物化学领域,涉及一种原子转移自由基聚合修饰的金属丝固定化酶反应器的制备方法。
背景技术
蛋白质组学研究中最主要的两种研究策略是“top-down”策略和“bottom-up”策略。由于“top-down”策略只能应用于单一的蛋白或简单的蛋白混合物,所以现在最常用的策略依然是“bottom-up”研究策略。鉴于“bottom-up”的两种主要的工作流程(肽质量指纹谱和肽序列标签)中都需要将蛋白质酶解后对其酶解产物进行质谱(MS)分析,并已经成为蛋白质的鉴定及其翻译后修饰的研究最常用的方法。因此,蛋白质的酶解在蛋白质组学的研究中发挥关键作用。但由于传统溶液酶解方式往往存在的酶解时间较长、酶自切物干扰以及蛋白酶不能重复使用等缺陷,为了解决溶液酶解过程中存在的问题,在蛋白质组研究中引进并发展了固定化酶技术。目前已经有了很多关于固定化酶反应器的报道,其材料也是多种多样,包括纳米金颗粒,包裹二氧化硅的磁性纳米颗粒,氧化石墨烯,芯片材料,棉纱,介孔材料,以及石英毛细管整体柱、杂化整体柱固定化酶反应器等,但操作仍然不够方便。
原子转移自由基聚合法(ATRP)是Matyjaszewki K.教授小组于1995年首次提出的一种可控自由基聚合方法,但由于传统的ATRP反应中的催化O2剂对H2O及较为敏感,不利于反应的控制,Matyjaszewki K.教授小组进一步发展了电子转移生成催化剂原子转移自由基聚合(AGET ATRP)的方法有效的克服了该问题。电子转移生成催化剂原子转移自由基聚合与传统活性聚合技术相比具有单体覆盖面广、聚合条件温和、易于实现工业化等显著优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种原子转移自由基聚合修饰的金属丝固定化酶反应器的制备方法。
本发明所提供的原子转移自由基聚合修饰的金属丝固定化酶反应器的制备方法,具体可包括如下步骤:
(1)制备一端为巯基,另一端为原子转移自由基聚合引发基团的引发剂;
(2)利用巯基与金属丝结合的特性,将所述引发剂固定在所述金属丝表面;
(3)在所述引发剂的作用下,利用甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)单体的原子转移自由基聚合反应,使所述金属丝表面固定上环氧基团;
(4)利用乙二胺使所述环氧基团发生开环反应并暴露氨基;
(5)利用所述氨基与戊二醛反应,使所述金属丝表面修饰上醛基;
(6)利用所述醛基与蛋白酶的氨基反应,进而将蛋白酶固定到所述金属丝表面;
(7)利用含有氨基的化合物对步骤(6)中剩余的醛基进行封闭,从而获得所述金属丝固定化酶反应器。
在上述方法中,所述金属丝从处理方式上讲,为表面去除了氧化膜的金属丝;所述金属丝具体可通过如下方法去除氧化膜:使用酸,如体积分数为25%的硝酸去除所述金属丝表面的氧化膜(浸泡3-10min),后使用易挥发溶剂,如乙醇清洗后干燥,得到待用金属丝。
从材质上讲,所述金属丝为能与巯基发生络合反应的金属丝,可如银、金、铜。在本发明的一个实施例中,所述金属丝具体为银。
所述金属丝长可为5-20cm(如8cm),直径可为0.2-0.5cm,呈弹簧状存在。
在本发明的一个实施例中,所述金属丝长具体为8cm,直径具体为0.3cm(所使用的载体为1.5ml的EP管)。
在本发明的一个实施例中,步骤(1)中所述引发剂具体由11-巯基-1-十一烷醇与2-溴异丁酰溴反应产生。
所述反应中,所述11-巯基-1-十一烷醇与所述2-溴异丁酰溴的配比为0.3g:164μL。
所述反应的催化剂为吡啶;所述反应的液体环境为四氢呋喃;所述反应在无氧(如通氮气除氧)条件下进行。
所述反应结束后,将反应后溶液过滤(滤纸过滤)后,以氮气吹干至略微粘稠,得到所述引发剂,充氮气后密闭4°C保存。
在上述方法中,步骤(3)中,所述甲基丙烯酸缩水甘油酯单体的原子转移自由基聚合反应,催化剂可为过渡金属卤化物(如氯化亚铜),配体可为1,1,4,7,7-五甲基二亚乙基三胺。
所述甲基丙烯酸缩水甘油酯单体的原子转移自由基聚合反应的体系中,所述甲基丙烯酸缩水甘油酯单体、所述氯化亚铜、所述1,1,4,7,7-五甲基二亚乙基三胺的浓度配比为(1-3M):(0.01-0.03M):(0.015-0.045M)。在本发明的一个实施例中,所述甲基丙烯酸缩水甘油酯单体、所述氯化亚铜、所述1,1,4,7,7-五甲基二亚乙基三胺的浓度配比具体为2M:0.02M:0.03M。
在本发明的一个实施例中,所述甲基丙烯酸缩水甘油酯单体的原子转移自由基聚合反应的体系中,所述甲基丙烯酸缩水甘油酯单体的终浓度具体为2M,所述氯化亚铜的终浓度具体为0.02M,所述1,1,4,7,7-五甲基二亚乙基三胺的终浓度具体为0.03M。此外,所述反应的体系中,还含有终浓度为0.001M的CuCl2,以及终浓度为0.03M葡萄糖。所述反应的液体环境为环己醇。所述反应的条件为常温(10-30℃)震摇反应24h。
在上述方法中,步骤(4)中,所述开环反应是在异丙醇的水溶液中进行的;所述开环反应中,所述乙二胺的体积分数为60%;为了加快反应速度,将所述开环反应的温度设为80℃(所述开环反应常温下会很缓慢),时间为4小时。
在上述方法中,步骤(5)中,所述反应中,所述戊二醛的体积分数为30%-50%(具体如40%);所述反应的时间为12h,温度为10-30℃。
在本发明的一个实施例中,步骤(6)中所述蛋白酶具体为胰蛋白酶。实现将所述蛋白酶固定到所述金属丝表面的反应体系中,用PBS溶液将胰蛋白酶配置成终浓度为2mg/ml的溶液(pH=8.0),并加入氰基硼氢化钠形成反应体系;所述氰基硼氢化钠在所述反应体系中的终浓度为2-6mg/ml(如5mg/ml);所述反应的温度为4℃,时间为24-48小时(如24h)。
在本发明的一个实施例中,步骤(7)中所述含有氨基的化合物具体为氨基乙醇。所述氨基乙醇在进行封闭的反应体系中的体积分数为1%;所述反应的温度为4℃,时间为4-12小时(如4h)。
在上述方法中,在步骤(6)和/或步骤(7)之后,还包括用50mM Tris-HCl缓冲液清洗所述金属丝的步骤。
利用上述本发明所提供的方法制备得到的固定化酶反应器也属于本发明的保护范围。
利用本发明所提供的固定化酶反应器(所述蛋白酶为胰蛋白酶)酶解蛋白的方法也属于本发明的保护范围。
上述利用固定化酶反应器酶解蛋白的方法,具体可包括如下步骤:
(a)将待酶解蛋白样品溶于50mM Tris-HCl缓冲液中,后加入所述固定化酶反应器,37℃水浴孵育20分钟,进行酶切;
(b)酶解完成后,直接将所述固定化酶反应器取出,酶解产物进行相应的色谱分离和质谱分析;所述固定化酶反应器取出后使用50mM Tris-HCl缓冲液清洗后4℃保存。
本发明具有以下优点:
1、由于金属丝表面通过AGET-ATRP反应生成的聚合物链上带有高密度环氧基,从而使其固定上大量的胰蛋白酶,而且非交联的聚合物链有利于酶与底物的接触。
2、与传统溶液酶解需要的时间相比,本发明所提供的金属丝固定化酶所需的酶解时间显著减少。
3、本发明所提供的金属丝固定化酶反应器使用简单方便,易于从溶液中分离。酶解完成后,使用镊子将金属丝固定化酶反应器取出即可。
4、本发明所提供的金属丝固定化酶反应器可多次重复使用,每次使用后50mM的Tris-HCl缓冲液清洗后4℃保存即可。
附图说明
图1为本发明金属丝固定化酶反应器的制备流程图。
图2为金属丝固定化酶反应器酶解BSA的MALDI-TOF质谱图。
图3为金属丝固定化酶反应器酶解BSA稳定性和重现性考察结果(8次酶解BSA蛋白的氨基酸序列覆盖率分析)。其中,R1-R8对应8次酶解。
图4为利用金属丝固定化酶反应器酶解腾冲嗜热厌氧杆菌全蛋白所得肽段的总离子流色谱图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
胰蛋白酶:购自于美国Promega公司;
牛血清白蛋白(BSA):购自于美国Sigma公司;
腾冲嗜热厌氧杆菌(T.tengcongensis):记载在“Wang J,XueY,Feng X,et al.Ananalysis of the proteomic profile for Thermoanaerobacter tengcongensis under optimalculture conditions.Proteomics,2004,4(1):136-150.”,公众可从中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所获得。
实施例1、基于原子转移自由基聚合修饰的金属丝固定化酶反应器的制备
本实施例将详细阐述基于原子转移自由基聚合修饰的金属丝固定化酶反应器的制备方法,其制备流程图如图1所示。
1、含巯基的原子转移自由基聚合引发剂的合成
使用11-巯基-1-十一烷醇与2-溴异丁酰溴反应合成一端为巯基,另一端为原子转移自由基聚合(ATRP)引发基团的引发剂。具体如下:将0.3g的11-巯基-1-十一烷醇溶于6mL的四氢呋喃(提供反应的液体环境)中,再加入108μL的吡啶(催化剂),混合后通入氮气除氧,同时冰浴30分钟,之后缓慢滴加164μL的2-溴异丁酰溴,并且持续搅拌4h(持续通氮气),最后将反应后溶液用滤纸过滤后,以氮气吹干至略微粘稠,得到所述引发剂,充氮气后密闭4°C保存。
2、金属丝的表面处理
截取约8cm长,直径0.3cm的金属丝(银),绕成弹簧状后置于1.5mL EP管中,向EP管中加入体积分数25%的硝酸进行处理(浸泡3-10min),去除表面的氧化膜。用水清洗3次后再用乙醇清洗3次,室温干燥后备用。
3、引发剂的固定
利用巯基与金属丝之间的配位键,将引发剂固定到金属丝表面。具体如下:将步骤1中合成的引发剂溶解在无水乙醇中,配制成引发剂终浓度为10mM的反应液。将步骤2处理后的金属丝置于上述反应液中,室温下反应24小时后取出金属丝,使用甲醇清洗去除金属丝上剩余的引发剂,用氮气吹干。
4、原子转移自由基聚合反应
ATRP反应液:终浓度为2M的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)单体,终浓度为0.02M的CuCl(ATRP反应的催化剂),终浓度为0.03M的1,1,4,7,7-五甲基二亚乙基三胺(ATRP反应的配体),终浓度为0.001M的CuCl2,溶于环己醇。
将金属丝加入ATRP反应液中,再加入0.03M葡萄糖,常温(10-30℃)下震摇反应24h。这一步反应使金属丝表面修饰上了高密度的环氧基团。
5、环氧基团的开环反应
配制体积分数为50%的异丙醇的水溶液,并以其为溶剂配制体积分数为60%的乙二胺溶液。将步骤4中获得的修饰上了高密度环氧基团的金属丝置于上述乙二胺溶液中80℃反应4小时,使氨基暴露(使金属丝表面修饰上氨基)。
6、修饰醛基官能团
首先称量67.84g的磷酸氢二钠和1.65g的磷酸二氢钠,溶于2L的去离子水中,配制成PBS溶液。再以PBS溶液为溶剂,配制体积分数为40%的戊二醛溶液。将步骤5中获得的暴露氨基的金属丝置于戊二醛溶液中常温(10-30℃)反应12h,使所述金属丝表面修饰上醛基。
7、在金属丝表面进行胰蛋白酶的固定
具体方法如下:用步骤6中所述的PBS溶液配制终浓度为2mg/ml的胰蛋白酶溶液(pH=8.0),并加入氰基硼氢化钠使其终浓度为5mg/ml,混合均匀后作为胰蛋白酶反应液。将步骤6中获得的表面修饰上醛基的金属丝置于上述胰蛋白酶反应液中,4℃反应24小时后使用50mM Tris-HCl缓冲液(50mM Tris溶液使用HCl调到pH=8)清洗。
8、聚合物侧链剩余醛基的封闭
向步骤6中所述的PBS溶液中加入氨基乙醇至其体积分数为1%,将步骤7中的金属丝放入其中,4℃下反应4-12小时。反应完成后用50mM Tris-HCl缓冲液(配方同步骤7中所述)反复清洗三次后4℃保存,即获得述基于原子转移自由基聚合修饰的金属丝固定化酶反应器。
实施例2、实施例1制备的固定化酶反应器酶解肽段覆盖率的测定
本实施例分别对采用实施例1制备的金属丝固定化酶反应器进行酶解与传统溶液酶解,这两方法酶解牛血清白蛋白(BSA)的酶解肽段覆盖率进行了测定,并对结果进行了比较分析。具体如下:
配制终浓度为2mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液(溶剂为50mM Tris-HCl缓冲液,配方同实施例1步骤7中所述),加入二硫苏糖醇(DTT),使DTT的终浓度为10mM,再置于沸水中加热变性10min,待冷却至室温后加入碘乙酰胺(IAA),使IAA的终浓度为50mM,暗处放置1h,补加DTT至其终浓度为10mM,取两份体积均为50μL的溶液。其中一份采用传统溶液酶解法进行酶解,即向该份溶液中加入2μg的胰蛋白酶(BSA与胰蛋白酶的质量比为50:1,即50微克蛋白加入1微克胰蛋白酶),置于37℃水浴酶解16h;另一份溶液中加入实施例1制备的金属丝固定化酶反应器(1个),于37℃水浴酶解20min后,将金属丝固定化酶反应器取出。
将以上两种方法的酶解液分别稀释后点靶进行MALDI-TOF MS质谱分析。具体如下:MALDI-TOF MS质谱鉴定的仪器控制软件为4000 Series Explorer TMsoftware。采用马心肌红蛋白的胰蛋白酶酶解肽段作为标准对仪器进行外标校正,要求相对标准偏差小于10×10-6,一级质谱数据采集使用MS-2kv反射模式,加速电压20kv,BSA的酶解产物扫描范围为m/z:650-4000。激光能量为4500,每张谱图由1600个亚谱累加获得。取以上两种方法的酶解液稀释到0.01μg/μL,取0.8μL点到MALDI-TOF靶上,待室温干燥后,点上0.8μL CHCA基质结晶后进行MALDI-TOFMS质谱分析。所得质谱数据提交给MASCOT进行肽质量指纹图谱分析。
质谱分析结果如图2所示。分析结果表明,在采用传统溶液酶解法进行酶解的产物中鉴定到的肽段覆盖了BSA氨基酸序列的79%,而在采用了实施例1制备的金属丝固定化酶反应器酶解产物中鉴定到的肽段覆盖了BSA氨基酸序列的93%。
实施例3、实施例1制备的固定化酶反应器酶解效率稳定性测定
本实施例以牛血清白蛋白(BSA)为待酶解蛋白样品,对实施例1制备的金属丝固定化酶反应器酶解效率的稳定性进行了测定。具体如下:
使用同一根实施例1制备的金属丝固定化酶反应器在一个月的时间内先后酶解8份BSA(每周的周一和周四各酶解一次),具体酶解方法和步骤如实施例2中所述。将8次BSA酶解后的产物均进行MALDI-TOF MS质谱分析。质谱条件如实施例2所述。将所得质谱数据提交给MASCOT进行肽质量指纹图谱分析。进行肽质量指纹图谱分析,所得的氨基酸序列覆盖率如图3所示。可以发现氨基酸序列覆盖率在89%到97%之间,平均覆盖率为94%,相对标准偏差(RSD)为3.13%。这一结果说明实施例1制备金属丝固定化酶能够多次重复使用,并且酶解效率具有较好的稳定性。
实施例4、实施例1制备的固定化酶反应器的实际应用
本实施例以腾冲嗜热厌氧杆菌全蛋白为待酶解蛋白样品,分别对采用实施例1制备的金属丝固定化酶反应器进行酶解与传统溶液酶解,这两方法的酶解效果进行了测定,并对结果进行了比较分析。具体如下:
1、腾冲嗜热厌氧杆菌全蛋白的提取
将腾冲嗜热厌氧杆菌溶于1mL裂解液(Tris终浓度为50mM,尿素终浓度为8M,pH=8),在冰浴下进行超声提取,超声仪设置为脉冲工作模式,超声功率为400W,即工作1s,间隔2s,工作60s后静置3min,重复以上循环8次。4℃,14000rpm离心1h,吸取上清液,即为腾冲嗜热厌氧杆菌全蛋白的提取液。使用NanoDrop 2000c微量分光光度计测量全蛋白浓度,分装后保存于-80℃冰箱备用。
2、实施例1制备的金属丝固定化酶反应器应用于腾冲嗜热厌氧杆菌全蛋白的酶解
取步骤1制备的腾冲嗜热厌氧杆菌全蛋白的提取液,使其腾冲嗜热厌氧杆菌全蛋白含量为100μg,加入DTT(终浓度为10mM)后,37℃水浴还原4h,冷却至室温,加入IAA(终浓度为50mM)后暗处放置1h进行烷基化。补加DTT至其终浓度为10mM后,使用50mM Tris-HCl缓冲液(配方同实施例1步骤7中所述)稀释至终体积为196μL。分为两份(98μL/份)后,其中一份采用传统溶液酶解法进行酶解,即向该份溶液中加入2μL浓度为0.5μg/μL的胰蛋白酶(终体积为100μL)(腾冲嗜热厌氧杆菌全蛋白与胰蛋白酶的质量比为50:1,即50微克蛋白加入1微克胰蛋白酶),置于37℃水浴酶解16h;另一份溶液中则加入到实施例1制备的金属丝固定化酶反应器(1个),于37℃水浴酶解20min后,将金属丝固定化酶反应器取出,取出后加水补充至终体积为100微升。
两种方法酶解完成后,各取适量酶解液(均含0.5μg酶解肽段),脱盐后用RPLC-ESI-LTQ-FT MS液质系统进行分离和鉴定。具体如下:
由自动进样器上样,上样体积为20μL(含0.5μg酶解肽段),在Agillent 1100系统上进行色谱分离,洗脱的馏分经过ESI离子源离子化后进入质谱。液相色谱条件为:流动相A:同时含有体积分数为0.1%的甲酸(FA),以及体积分数为2%的乙腈(ACN)水溶液;流动相B:同时含有体积分数为0.1%的甲酸(FA),以及体积分数为80%的乙腈(ACN)水溶液。洗脱条件为:0-1min,流动相B占流动相总体积含量从0%线性变化至6%;1-91min,流动相B占流动相总体积含量从6%线性变化至40%;91-101min,流动相B占流动相总体积含量从40%线性变化至100%;101-111min,采用体积含量100%的流动相B(即流动相中不含流动相A);111-112min,流动相B占流动相总体积含量从100%线性变化至0%;112-120min,采用体积含量100%的流动相A(即流动相中不含流动相B)平衡色谱柱。流速为300nL/min。
ESI-LTQ-FTMS质谱条件:正离子模式;扫描范围为:m/z 375.0-1500.0;质谱采集时间为110分钟;数据依赖模式:选取一级质谱全扫描的10个信号最高离子进行MS/MS分析;碰撞能量为35V,活化时间为10ms;排除1电荷和4电荷以上离子,重复采集谱图2次后,动态排除,时间为10ms。MS/MS谱图数据检索均应用pFind软件,具体设置包括:蛋白质水解酶为胰蛋白酶;允许漏切位点数2个;固定修饰选择半胱氨酸烷基化;可变修饰选择甲硫氨酸氧化;母离子质量偏差为20ppm;碎片离子质量偏差为0.8Da。最后使用pBuild软件依据1%假阳性率对搜库结果进行过滤。
利用实施例1制备的金属丝固定化酶反应器酶解腾冲嗜热厌氧杆菌全蛋白所得肽段的总离子流色谱图如图4所示。液-质联用分析所得的质谱原始数据使用pFind软件检索腾冲嗜热厌氧杆菌蛋白质数据库后的具体结果见表2。结果证明:利用实施例1制备的金属丝固定化酶反应器酶解腾冲嗜热厌氧杆菌全蛋白20min所鉴定到的序列覆盖率和鉴定的蛋白数量与同样条件下利用传统溶液酶解法酶解16小时的结果接近,而零漏切位点肽段的比例更高。
表2两种酶解方法的结果比较

Claims (3)

1.一种固定化酶反应器的制备方法,包括如下步骤:
(1)制备一端为巯基,另一端为原子转移自由基聚合引发基团的引发剂;
(2)利用巯基与金属丝结合的特性,将所述引发剂固定在所述金属丝表面;
(3)在所述引发剂的作用下,利用甲基丙烯酸缩水甘油酯单体的原子转移自由基聚合反应,使所述金属丝表面固定上环氧基团;
(4)利用乙二胺使所述环氧基团发生开环反应并暴露氨基;
(5)利用所述氨基与戊二醛反应,使所述金属丝表面修饰上醛基;
(6)利用所述醛基与蛋白酶的氨基反应,进而将蛋白酶固定到所述金属丝表面;
(7)利用含有氨基的化合物对步骤(6)中剩余的醛基进行封闭,从而获得所述金属丝固定化酶反应器;
所述金属丝为银;
步骤(1)中,所述引发剂由11-巯基-1-十一烷醇与2-溴异丁酰溴反应产生;
所述反应中,所述11-巯基-1-十一烷醇与所述2-溴异丁酰溴的配比为0.3g:164μL;
所述反应的催化剂为吡啶;
所述反应的液体环境为四氢呋喃;所述反应在无氧条件下进行;
步骤(3)中,所述甲基丙烯酸缩水甘油酯单体的原子转移自由基聚合反应,催化剂为CuCl,配体为1,1,4,7,7-五甲基二亚乙基三胺;所述甲基丙烯酸缩水甘油酯单体的原子转移自由基聚合反应的反应液组成如下:终浓度为2M的甲基丙烯酸缩水甘油酯单体,终浓度为0.02M的CuCl,终浓度为0.03M的1,1,4,7,7-五甲基二亚乙基三胺,终浓度为0.001M的CuCl2,溶于环己醇;
步骤(3)中,使所述金属丝表面固定上环氧基团是通过如下实现的:将所述金属丝加入所述甲基丙烯酸缩水甘油酯单体的原子转移自由基聚合反应的反应液中,再加入0.03M葡萄糖,10-30℃下震摇反应24h;
步骤(7)中,所述含有氨基的化合物为氨基乙醇。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(6)中,所述蛋白酶为胰蛋白酶。
3.利用权利要求1或2所述的方法制备得到的固定化酶反应器。
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