CN105542076A - 嗜硫多孔材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种嗜硫多孔材料及其制备方法和应用,其中,所述制备方法包括:在引发剂存在的条件下,将二乙烯砜、N,N-亚甲基双丙烯酰胺和第一有机溶剂混合,制得嗜硫多孔材料。上述设计通过将二乙烯砜和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺在自由基反应引发剂引发下发生共聚反应形成交联的骨架结构和相互贯穿的通透孔道,从而使得在一定浓度盐存在下,可与含有二硫醚基团的化合物和抗体发生特异性的相互作用,从而实现分离与纯化的作用。同时,通过上述技术方案,首次提出了用双键聚合的方法将砜基引入嗜硫多孔材料中,同时采用一锅法制备嗜硫多孔材料,实现了不仅制备过程简单便捷,且制备方法简单,重复性好的效果。
Description
技术领域
本发明涉及亲和嗜硫材料的制备方法,具体地,涉及一种嗜硫多孔材料的制备方法。
背景技术
由于免疫学、基因工程、分子生物学的快速发展,抗体在生物技术、疾病预防诊治、生物制药和医药保健等方面得到广泛的应用,其需求量逐年呈现出指数增长的趋势。临床疾病治疗和药理研究也对抗体的纯度、成本、活性等方面提出很高的要求(参见《Methods》2012年第56期第116–129页)。但是传统的分离抗体的方法,如离子交换法、疏水色谱等,分离效率低、操作复杂、分离周期较长、生产成本高、生物活性损失较大,难以实现大规模工业应用。
“嗜硫”一词是指一种对处于硫醚基团附近的砜基的亲和性,嗜硫色谱又称为亲硫色谱(参见《AnalyticaChimicaActa》2010年第658期第18–31页),嗜硫色谱介质上配基的砜-硫醚基团在一定浓度的盐存在下,可与含有二硫醚基团的化合物和抗体相互作用,从而达到分离与富集的作用。最早用于从人血清中分离免疫球蛋白,后来人们又成功地利用其从杂交瘤的细胞培养液中分离出多克隆抗体,从而在抗体的分离方面得到广泛的应用。傅蓉等(参见《NaturalScience》2000年第28(6)期第110-114页)利用商品化的T2gel分离纯化卵黄免疫球蛋白(IgY),活性回收率可高达70%。Yannick等(参见《J.Chromatogr.B》2004年第808期第51–56页)在空纤维膜聚乙烯二乙烯醇上修饰嗜硫试剂,实现对复杂体系中IgG的分离。Judith等(参见《J.ChromatographyB》2007年第845期第226页)先用二乙烯基砜对SepharoseCL-4B表面进行改性,再用2-巯基乙醇进行修饰之后,组装成色谱柱,在0.5mol/LNa2SO4和25mmol/LPBS(pH为7.4)条件下,对人血清中的IgG进行提纯。2010年,Lakhiar等(参见《Chromatogr.》2010年第72期第205-213页)在葡聚糖的表面键合上乙二胺,中和葡聚糖的电负性,然后再引入砜-硫醚基团,对老鼠腹水中的抗体进行了富集与分离。华侨大学的钱浩等(参见《Biotech.Progr.》2009年第25期第376-383页)从事嗜硫磁性微球的相关研究工作,他们通过在磁性微球的表面偶联嗜硫基团,该嗜硫磁性微球可用于人血清中抗体的纯化且效果优异。迄今为止,嗜硫色谱不仅被广泛的应用于分离纯化免疫球蛋白,还被用于分离了辣根过氧化物酶、过敏毒素、前胶原等这些含有二硫醚键的有机大分子,进一步拓宽嗜硫色谱的应用领域。
目前常用的以琼脂糖、凝胶等软基质为载体的亲和嗜硫材料,无法承受高压力;而磁性微球上的后修饰容易发生功能化基团的流失,同时,这类材料机械强度小,制备成本高,存储难,而且无法多次重复使用,满足不了高通量的抗体纯化。
因此,提供一种制备方法简单,制备过程安全,重复性好,且价格低廉,大大降低生产成本,稳定性高,并且可重复利用,大大降低使用成本,提高使用范围的嗜硫多孔材料及其制备方法是本发明亟需解决的问题。
发明内容
针对上述现有技术,本发明的目的在于克服现有技术中亲和嗜硫材料重复性差,无法承受高压,机械强度小,制备成本高,存储难,而且无法多次重复使用,满足不了高通量的抗体纯化的问题,从而提供一种制备方法简单,制备过程安全,重复性好,且价格低廉,大大降低生产成本,稳定性高,并且可重复利用,大大降低使用成本,提高使用范围的嗜硫多孔材料及其制备方法。
为了实现上述目的,本发明提供了一种嗜硫多孔材料的制备方法,其中,所述制备方法包括:在引发剂存在的条件下,将二乙烯砜、N,N-亚甲基双丙烯酰胺和第一有机溶剂混合,制得嗜硫多孔材料。
本发明还提供了一种根据上述所述的制备方法制得的嗜硫多孔材料。
本发明还提供了一种根据上述所述的制备方法制得的嗜硫多孔材料或根据上述所述的嗜硫多孔材料在富集和分离含有二硫醚基团的化合物中的应用。
通过上述技术方案,本发明通过将二乙烯砜和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺在自由基反应引发剂引发下发生共聚反应形成交联的骨架结构和相互贯穿的通透孔道,从而使得在一定浓度盐存在下,可与含有二硫醚基团的化合物和抗体发生特异性的相互作用,从而实现分离与纯化的作用。同时,通过上述技术方案,首次提出了用双键聚合的方法将砜基引入嗜硫多孔材料中,同时采用一锅法制备嗜硫多孔材料,实现了不仅制备过程简单便捷,且制备方法简单,重复性好的效果。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与下面的具体实施方式一起用于解释本发明,但并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1是本发明提供的一种嗜硫多孔材料的制备原理图;
图2(a)是实施例2中制得的嗜硫多孔材料放大1200倍的扫描电镜图;
图2(b)是实施例2中制得的嗜硫多孔材料放大6000倍的扫描电镜图;
图3是实施例2中制得的嗜硫多孔材料的傅里叶变换红外光谱图;
图4是应用例1中提供的嗜硫多孔材料对3,3-二硫二丙酸的富集与分离的电泳图;
图5是应用例2中提供的嗜硫多孔材料对卵黄免疫球蛋白(IgY)的富集与分离的电泳图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是,此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明,并不用于限制本发明。
本发明提供了一种嗜硫多孔材料的制备方法,其中,所述制备方法包括:在引发剂存在的条件下,将二乙烯砜、N,N-亚甲基双丙烯酰胺和第一有机溶剂混合,制得嗜硫多孔材料。其制备原理如图1所示。
上述设计通过将二乙烯砜和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺在自由基反应引发剂引发下发生共聚反应形成交联的骨架结构和相互贯穿的通透孔道,从而使得在一定浓度盐存在下,可与含有二硫醚基团的化合物和抗体发生特异性的相互作用,从而实现分离与纯化的作用。同时,通过上述技术方案,首次提出了用双键聚合的方法将砜基引入嗜硫多孔材料中,同时采用一锅法制备嗜硫多孔材料,实现了不仅制备过程简单便捷,且制备方法简单,重复性好的效果。
所述引发剂可以为本领域常规使用的引发剂类型,例如,可以为有机过氧化物引发剂、无机过氧化物引发剂、偶氮类引发剂或是氧化还原引发剂,当然,在本发明的一种优选的实施方式中,考虑到反应温度的温和性,所述引发剂可以进一步选择为偶氮类引发剂,这里的具体种类可以根据实际需要进行选择,例如,在本发明的一种更为优选的实施方式中,为了进一步提高引发效率,所述引发剂可以进一步选自偶氮二异丁腈、偶氮二异戊腈和偶氮二异丁酸二甲酯中的一种或多种。
当然,这里的第一有机溶剂可以为本领域常规使用的有机溶剂类型,本领域技术人员可以根据实际需要进行选择,例如,在本发明的一种优选的实施方式中,为了提高共聚反应的产率,所述第一有机溶剂可以进一步为选自二甲基亚砜、十二醇和丙酮中的一种或多种。
所述各原料的用量可以根据实际需要进行调节,例如,在本发明的一种优选的实施方式中,为了使得产率更高且更节约原料,降低生产成本,相对于1重量份的所述二乙烯砜,所述N,N-亚甲基双丙烯酰胺的用量为1-5重量份,所述引发剂的用量为0.03-0.13重量份。
当然,在本发明的一种更为优选的实施方式中,为了除去制得的嗜硫多孔材料上附着的未反应的小分子物质,进一步提高制得的嗜硫多孔材料的纯度,所述制备方法还可以包括在混合后采用清洗液进行萃取或淋洗。当然,这里的萃取和淋洗可以按照本领域常规采用的方式进行操作,例如,萃取可以通过索氏提取器进行操作,淋洗可以通过柱层析的方式进行,当然,本发明并不局限于此,本领域常规使用的此类方法在本发明中均可以使用,本发明在此不一一赘述。
所述清洗液可以为本领域常规使用的有机溶剂类型,但是,在本发明的一种优选的实施方式中,为了提高对未反应的小分子物质的去除效果,大大提高制得的嗜硫多孔材料的纯度,所述清洗液可以进一步选择为甲醇、乙腈和乙醇中的一种或多种。
所述混合过程可以按照本领域常规采用的方式进行操作,混合过程中所使用的反应容器可以不作限定,例如,可以为离心管、色谱柱和毛细管等,当然,在本发明的一种优选的实施方式中,所述混合过程为:1)将引发剂、二乙烯砜、N,N-亚甲基双丙烯酰胺和第一有机溶剂置于离心管或毛细管中;2)将离心管或毛细管密封后进行混合。通过将引发剂、二乙烯砜、N,N-亚甲基双丙烯酰胺和第一有机溶剂置于密封的离心管或毛细管中进行混合,从而使得置于离心管中制得的嗜硫多孔材料为块状,并使得其便于通过研磨形成粉状,更便于后期将其填充至色谱柱中,方便对含有二硫醚基团的化合物和抗体的富集和分离;而置于毛细管中制得的嗜硫多孔材料则固定于毛细管柱中,可以使得其在毛细管中进行重复多次使用。
所述混合过程的反应条件可以不作限定,在本发明的一种优选的实施方式中,为了使二乙烯砜能够尽可能多地与毛细管内壁上的双键基团以及与N,N-亚甲基双丙烯酰胺充分反应,以进一步提高产率,所述混合过程可以进一步选择为置于温度为65.0-90.0℃的条件下混合6.0-16.0h;
当然,毛细管的类型可以根据实际需要进行选择,例如,在本发明的一种优选的实施方式中,毛细管的直径可以选自25.0μm、75.0μm、100.0μm、150.0μm和250.0μm中的一种或多种。
为了使得于毛细管中制得的嗜硫多孔材料能够更好地富集和分离含有二硫醚基团的化合物和抗体,毛细管的直径可以进一步选择为75.0μm。
当然,为了使毛细管更为洁净,大大降低杂质对于制得的嗜硫多孔材料的影响,在本发明的一种优选的实施方式中,步骤1)中还可以包括在将引发剂、二乙烯砜、N,N-亚甲基双丙烯酰胺和第一有机溶剂置于毛细管前对毛细管进行清洗,这里的清洗可以按照本领域常规方式进行操作,例如,可以为依次经过碱洗、水洗、酸洗、水洗和有机溶剂的清洗等,本发明在此不多作赘述。当然,为了进一步提高制得的嗜硫多孔材料的纯度,所述制备方法还可以包括将清洗后的毛细管在第二有机溶剂存在的条件下置于3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷中进行接触反应。
当然,这里的第二有机溶剂可以为本领域常规采用的类型,例如,在本发明的一种优选的实施方式中,所述第二有机溶剂可以选自乙腈、丙酮、甲醇和乙醇中的一种或多种。
当然,这里的3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷和所述第二有机溶剂的用量可以根据实际情况进行选择,例如,在本发明的一种优选的实施方式中,相对于1重量份的所述3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷,所述第二有机溶剂的用量为0.5-10.0重量份;
这里的接触反应条件可以不作限定,为了进一步提高反应速率,在本发明的一种更为优选的实施方式中,所述接触反应可以为置于40.0-60.0℃的条件下放置8.0-12.0h。
本发明还提供了一种根据上述所述的制备方法制得的嗜硫多孔材料。
本发明还提供了一种根据上述所述的制备方法制得的嗜硫多孔材料或根据上述所述的嗜硫多孔材料在富集和分离含有二硫醚基团的化合物中的应用。当然,这里的富集和分离方式可以按照本领域常规采用的方式进行操作,用于富集的上样液和用于分离的洗脱液也可以为本领域常规使用的类型,在此不多作赘述。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中,红外图谱参数通过傅里叶-红外光谱仪(IR-21,日本岛津公司)测得,扫描电镜图谱参数和X射线能谱参数均通过场发射扫描电镜(S-4800,日本日立公司Hitachi)测得,电泳参数通过毛细管电泳仪(P/ACEtmMDQ,美国贝克曼公司)测得。其中,所述上样液、洗脱液和电泳分离缓冲溶液具体如下所述。
1.0mol/L的柠檬酸溶液:在25.0℃下,将2.10g柠檬酸溶于适量蒸馏水,并定容至10.0mL配置成1.0mol/L的柠檬酸水溶液。
上样液:在25.0℃下,将0.72g磷酸氢二钠和3.55g硫酸钠溶于45.0mL的蒸馏水中,接着用1.0mol/L的柠檬酸水溶液调节至pH为6.2,然后定容至50.0mL,得到上样液。
洗脱液:在25.0℃下,将0.72g磷酸氢二钠45.0mL的蒸馏水中,接着用11.0mol/L的柠檬酸水溶液调节至pH为6.2,然后定容至50.0mL得到洗脱液。
电泳分离缓冲溶液:将1.95g的磷酸氢二钠、0.73g氯化钠和7.21g十二烷基硫酸钠溶解在240.0mL蒸馏水中,用1.0mol/L氢氧化钠水溶液调节溶液至pH为6.5,定容至250.0.mL,制得电泳分离缓冲溶液。
实施例1
将12.5mg二乙烯砜与30.0mgN,N-亚甲基双丙烯酰胺溶于85.0μL二甲基亚砜中,并置于离心管中,再加入85.0μL的十二醇和1.0mg的偶氮二异丁腈,然后置于涡旋振荡器中进行充分溶解,而后进行超声脱气20.0min,得到混合均匀后的溶液,再用硅橡胶将离心管两端封口,将上述封口后的离心管置于温度为85.0℃的水浴锅中放置10.0h,制得混合物M1;将制得的混合物M1取出后切成小块,而后取3.0g混合物M1置于索氏提取器中加入甲醇,并置于110.0℃的条件下提取24.0h,得到混合物M2;将混合物M2置于温度为100.0℃的真空干燥箱中干燥12.0h,制得嗜硫多孔材料A1。
实施例2
1)用0.1mol/L的NaOH溶液冲洗直径为75.0μm的毛细管空柱30.0min,再用去离子水冲洗毛细管30.0min,接着用0.1mol/L的HCl溶液冲洗毛细管30.0.min,再用去离子水冲洗毛细管至流出液体pH值为7.0,然后用甲醇溶液冲洗毛细管30.0min,并用氮气吹干;而后往毛细管中注入甲醇与3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的混合物(其中,相对于1.3重量份的3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷,所述甲醇的用量为1重量份)后置于50.0℃的温度下反应12.0h;再用甲醇冲洗,最后将上述预处理后的毛细管用氮气吹干待用;
2)将12.5mg二乙烯砜与30.0mgN,N-亚甲基双丙烯酰胺溶于85.0μL的二甲基亚砜中,再加入85.0μL的十二醇和1.0mg的偶氮二异丁腈,然后置于涡旋振荡器中进行充分溶解,而后超声脱气20.0min,得到均匀混合的聚合液M1,将上述制得的聚合液M1用氮气压入上述预处理后的毛细管中,将毛细管两端用硅橡胶封口后置于温度80.0℃的条件下水浴反应10.0h,制得含有嗜硫多孔材料的粗制毛细管;
3)将步骤2)中制得的粗制毛细管接在高压液相色谱泵上,以甲醇为流动相冲去未反应完全的聚合单体和制孔剂等,制得嗜硫多孔材料A2。
应用例1
1)将1.0mL的上样液注入嗜硫多孔材料A2中平衡120.0min,接着注入50.0μL的1.0mg/mL的3,3-二硫二丙酸标准溶液固载60.0min;
2)用上样液对上述固载有3,3-二硫二丙酸的嗜硫多孔材料A2中冲洗30.0min,将未被固载的3,3-二硫二丙酸冲洗除去,得到富集有3,3-二硫二丙酸的嗜硫多孔材料A2;
3)将洗脱液注入步骤2)中制得的富集有3,3-二硫二丙酸的嗜硫多孔材料A2,将3,3-二硫二丙酸洗脱下来,制得3,3-二硫二丙酸洗脱液;
4)通过毛细管电泳仪对步骤3)中制得的3,3-二硫二丙酸洗脱液进行电泳检测,具体的检测条件为:在内径为75.0μm的熔融石英毛细管(总长度为56.5cm,有效长度为50.0cm)中进行;红外检测波长为214.0nm,进样量为8s×0.5psi,流动相为pH为6.0的0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液。电泳检测结果如图4所示,该图中a曲线为3,3-二硫二丙酸洗脱液的电泳图,b曲线为1.0mg/mL的3,3-二硫二丙酸标准溶液的电泳图,c曲线为空白对照组(pH为6.0浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液)的电泳图,d曲线为空白对照组(0.5mol/L的Na2SO4溶液),由该图可知,嗜硫多孔材料A2能够在高浓度盐的存在下对3,3-二硫二丙酸进行有效的富集,在低浓度盐的存在下对3,3-二硫二丙酸进行有效的洗脱。
应用例2
1)将1.0mL的上样液注入嗜硫多孔材料A2中平衡120.0min,接着注入50.0μL的1.0mg/mL的卵黄免疫球蛋白(IgY)标准溶液固载60.0min;
2)用上样液对上述固载有IgY的嗜硫多孔材料A2冲洗60.0min,将未被固载的IgY冲洗除去,得到富集有IgY的嗜硫多孔材料A2;
3)将洗脱液注入步骤2中制得的富集有IgY的嗜硫多孔材料A2,将IgY洗脱下来,制得IgY洗脱液;
4)通过毛细管电泳仪对步骤3)中制得的IgY洗脱液进行电泳检测,具体的检测条件为:在内径为75.0μm的熔融石英毛细管(总长度为56.5cm,有效长度为50.0cm)中进行;红外检测波长为214nm,进样量为5s×0.5psi。流动相为pH6.0的0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液。电泳检测结果见图5,该图中a曲线为IgY洗脱液的电泳图,b曲线为1.0mg/mL的3,3-二硫二丙酸标准溶液的电泳图,c曲线为空白对照组(pH6.0浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液)的电泳图,d曲线为空白对照组(0.5mol/L的Na2SO4溶液),由该图可知,嗜硫多孔材料A2能够在高浓度盐的存在下对IgY进行有效的富集,在低浓度盐的存在下对IgY进行有效的洗脱。
检测例
将实施例1中制得的嗜硫多孔材料A1通过傅里叶-红外光谱仪进行检测:先将嗜硫多孔材料A1研磨成颗粒,并与溴化钾晶体混合后一起研磨成粒径小于200目的粉末,压片后用傅立叶变换红外光谱法表征,可以观察到砜基(波数为1130cm-1、1242cm-1和1302cm-1)、和氨基(波数为1533cm-1和3300cm-1)等特征基团的吸收峰,具体红外光谱图如图3所示。通过图3可以看出,实施例1中制得的嗜硫多孔材料A1已成功修饰上了砜-硫醚基团。
将实施例2中制得的嗜硫多孔材料A2通过扫描电镜进行检测,观察其横截面形态图,具体扫描电镜图如图2(a)和图2(b)所示,可以看出其形成有多孔结构。
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节,在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外,本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合,只要其不违背本发明的思想,其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种嗜硫多孔材料的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括:在引发剂存在的条件下,将二乙烯砜、N,N-亚甲基双丙烯酰胺和第一有机溶剂混合,制得嗜硫多孔材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其中,所述引发剂选自偶氮二异丁腈、偶氮二异戊腈和偶氮二异丁酸二甲酯中的一种或多种;
优选地,所述第一有机溶剂选自二甲基亚砜、十二醇和丙酮中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法,其中,相对于1重量份的所述二乙烯砜,所述N,N-亚甲基双丙烯酰胺的用量为1-5重量份,所述引发剂的用量为0.03-0.13重量份。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法,其中,所述制备方法还包括在混合后采用清洗液进行萃取或淋洗;
优选地,所述清洗液选自甲醇、乙腈和乙醇中的一种或多种。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法,其中,所述混合过程为:
1)将引发剂、二乙烯砜、N,N-亚甲基双丙烯酰胺和第一有机溶剂置于离心管或毛细管中;
2)将离心管或毛细管密封后进行混合;
优选地,所述混合过程为置于温度为65.0-90.0℃的条件下混合6.0-16.0h。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其中,毛细管的直径选自25.0μm、75.0μm、100.0μm、150.0μm和250.0μm中的一种或多种;
优选地,毛细管的直径为75.0μm。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其中,步骤1)中还包括在将引发剂、二乙烯砜、N,N-亚甲基双丙烯酰胺和第一有机溶剂置于毛细管前对毛细管进行清洗,而后将清洗后的毛细管在第二有机溶剂存在的条件下置于3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷中进行接触反应;
优选地,所述第二有机溶剂选自乙腈、丙酮、甲醇和乙醇中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其中,相对于1重量份的所述3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷,所述第二有机溶剂的用量为0.5-10.0重量份;
优选地,所述接触反应为置于40.0-60.0℃的条件下放置8.0-12.0h。
9.一种根据权利要求1-8中任意一项所述的制备方法制得的嗜硫多孔材料。
10.一种根据权利要求1-8中任意一项所述的制备方法制得的嗜硫多孔材料或根据权利要求9所述的嗜硫多孔材料在富集和分离含有二硫醚基团的化合物中的应用。
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