CN103120932A

CN103120932A - 一种阳离子多糖涂覆型亲水色谱固定相的制备方法及应用

Info

Publication number: CN103120932A
Application number: CN201310066189XA
Authority: CN
Inventors: 梁鑫淼; 柯燕雄; 盛骞莹
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2013-03-01
Filing date: 2013-03-01
Publication date: 2013-05-29
Anticipated expiration: 2033-03-01
Also published as: CN103120932B

Abstract

本发明涉及一种阳离子多糖涂覆型色谱固定相的制备方法及应用，其中Silica Gel为硅胶，带负电荷，saccharide为季铵化的多糖，带正电荷。本发明提供了上述固定相材料的制备方法，利用离子相互作用，将表面磺化的硅胶与带正电荷的阳离子多糖在水溶液体系中结合，以制备附聚型的色谱固定相。该固定相得制备方法对比于传统的键合糖型固定相更为高效，方便，环保。同时具有很好的分离选择性，重复性和稳定性。对于分离其他类型的极性化合物有很大的应用潜在性，在糖生物学和糖蛋白组学都将有很广泛的应用。

Description

一种阳离子多糖涂覆型亲水色谱固定相的制备方法及应用

【技术领域】

本发明涉及亲水色谱固定相技术领域，具体地说，是一种阳离子多糖涂覆型亲水色谱固定相的制备方法及应用。

【背景技术】

亲水作用色谱最早是由Alpert提出[A.J.Alpert，J.Chromatogr.A，1990，499，177]，是近年来色谱领域研究的热点之一。因其对极性化合物有很强的保留及很好的分离选择性，并且与质谱检测良好的兼容性和灵敏度等优点，应用方面也越来越广泛，也越来越受关注。

随着对硅胶的表面修饰，将硅胶表面固载上糖作为一种新型的亲水色谱固定相也得到了很快的发展[P.Hemstrom，et al，J.Sep.Sci，2006，29，1784]。糖基修饰的硅胶固定相具有高柱效、高选择性和稳定性，适用于分离各种强极性化合物，如单糖、寡糖、糖醇、核苷和氨基酸等，具有很广泛的应用前景。目前常见的多糖色谱固定相有利用点击化学所制备的键合多糖亲水色谱材料，如键合β-环糊精[X.Liang，et al，Chem.commun，2007，2491]和键合麦芽糖[X.Liang，et al，Anal.Methods，2010，2，217]，对极性化合物及寡糖样品都有很好的保留及很强的分离选择性。虽然改制备方法非常高效，但也存在它的缺陷，如步骤繁琐影响产率，还有反应过程中使用了大量有机试剂。

基于以上的研究背景，发明人开发出了一种新型的亲水色谱固定相及其制备方法，利用离子相互作用原理，将带不同电荷硅胶与阳离子多糖结合，以制备附聚型的多糖色谱固定相。此方法优势在于反应简单易控，稳定性高，在水系中涂覆更为环保安全。同时在糖生物学和糖蛋白组学中都取得了很好的应用。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种阳离子多糖涂覆型亲水色谱固定相的制备方法及应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种阳离子多糖涂覆型亲水色谱固定相，其化学结构式如图8所示：

其中Silica Gel为硅胶，带负电荷，saccharide为季铵化的多糖，带正电荷。

一种阳离子多糖涂覆型亲水色谱固定相的制备方法，其具体步骤为：

(1)硅胶预处理

硅胶加入质量浓度为1～40％的盐酸或硝酸溶液中，加热回流搅拌1～48小时，过滤，水洗至中性，于100～160℃下干燥至恒重；

(2)硅胶表面修饰

将步骤(1)所得的活化硅胶置于玻璃或者聚四氟乙烯反应容器中，在氮气氛围下加入有机溶剂，搅拌均匀，滴加硅烷试剂，保持温度为20～200℃条件下搅拌2～48小时。待反应体系冷却至室温，减压过滤并用甲苯、丙酮、甲醇水、甲醇洗涤，固体产品在60～100℃条件下干燥12～36小时；

所述的有机溶剂为与水不互溶的有机溶剂，包括甲苯、乙苯、二甲苯、正己烷、正庚烷、正戊烷、正辛烷、环己烷等苯系物和烷烃；

所述的有机溶剂的使用量为每克活化硅胶使用2～100mL有机溶剂；硅烷试剂结构式为：

其中，X为-OCH₃，-OCH₂CH₃或-Cl，m＝1～12，A为SH；硅烷试剂的使用量为每克活化硅胶使用0.5～5mmol；

(3)磺化过程

将步骤(2)所得产品加入到含有质量分数为30％过氧化氢溶液和含浓硫酸的甲醇溶液的混合溶液中，搅拌均匀，保持温度为10～40℃条件下搅拌2～48小时；反应结束后减压过滤并用水、甲醇洗涤，固体产品在60～100℃条件下干燥12～36小时；

所述的混合溶液的使用量为每克硅胶使用2～100mL质量分数为30％过氧化氢溶液，1～10mL甲醇溶液及0.01～1mL浓硫酸溶液；

(4)涂覆过程

将步骤(3)所得产品与阳离子多糖水溶液混合，搅拌均匀，保持温度为10～40℃条件下搅拌1～60分钟；反应结束后减压过滤并用水、甲醇洗涤，固体产品在60～100℃条件下干燥12～36小时。

所述的阳离子多糖包括阳离子纤维素，阳离子淀粉等等，分子量范围在100～200万之间；

所述的阳离子多糖的使用量为每克硅胶使用0.01～1g，所配置的水溶液浓度为0.1％～10％。

一种阳离子多糖涂覆型亲水色谱固定相在糖生物学和糖蛋白组学中的应用。

与现有技术相比，本发明的积极效果是：

本发明具有以下有益效果：本发明制备的色谱固定相具有很强的亲水作用，是一种新型的糖固载亲水色谱固定相。利用离子相互作用制备附聚型的材料，设计思路新颖。涂覆过程在水溶液体系在完成，过程简单易控，反应条件温和，高选择性，高转化率。技术适用范围广，可换用其他带正电荷的多糖基质进行涂覆，为糖固载固定相提供了广泛的发展空间。该固定相在以乙腈/水作为流动相中对极性化合物或有着很好的保留和分离选择性，在糖生物学和糖蛋白组学都有很广泛的应用价值。

【附图说明】

图1为使用实施例1所制备的色谱柱在亲水色谱模式下对强极性化合物的保留和分离混合样品的色谱图；

图2为使用实施例1所制备的色谱柱在亲水色谱模式下分离糖和糖醇所获得的色谱图；

图3为使用实施例1所制备的色谱柱在亲水色谱模式下分离半乳寡糖样品所获得的色谱图；

图4为使用实施例1所制备的色谱柱在亲水色谱模式下分离果寡糖样品所获得的色谱图；

图5为使用实施例1所制备的色谱柱在亲水色谱模式下分离果聚糖样品所获得的色谱图；

图6为使用实施例1所制备的色谱柱在亲水色谱模式下分离三七皂苷样品所获得的色谱图；

图7为使用实施例1所制备的固定相材料富集糖蛋白酶解液所获得的质谱图。

图8阳离子多糖涂覆型亲水色谱固定相的化学结构式。

【具体实施方式】

以下提供本发明一种阳离子多糖涂覆型亲水色谱固定相的制备方法及应用的具体实施方式。

实施例1

在500ml三口烧瓶中加入350ml无水甲苯，23.8mLγ-三乙氧基丙基巯基硅烷，置于110℃油浴中加热搅拌，进行氮气回流保护。然后加入粒径为5μm，孔径为

比表面积为100m²g^-1的球形硅胶颗粒20g，110℃下反应24小时，反应结束用4^#砂芯漏斗进行抽滤，依次用甲苯、丙酮、水、甲醇清洗，抽干于80℃烘箱中干燥过夜。接着，在反应中间产物中加入200mL30％的双氧水溶液和含有1mL硫酸的甲醇溶液60mL，室温缓慢搅拌20小时，然后用水、甲醇进行清洗、干燥，得到磺化硅胶。元素分析结果：C1.47％，N0％，H0.78％。将磺化硅胶加到1％的阳离子纤维素溶液中，投料比为10∶1，室温搅拌30分钟后先进行离心操作除去悬浮物，然后用去离子水清洗，干燥得到最终材料。元素分析结果：C2.49％，N0.05％，H0.88％。这里所用的阳离子纤维素为购买的商品化JR-400阳离子纤维素，又称阳离子羟乙基纤维素，聚季铵-10，由羟乙基纤维素与阳离子迷化剂反应而成。的分子量范围为150-200万。元素分析结果：C37.87％，N2.06％，H6.43％。经计算的涂覆量为24.27mg/g。元素分析结果证实本实施例的固定相结构式为：

把所得的固定相填料填装于4.6mm*150mm，I.D.的不锈钢HPLC色谱柱中，制得的色谱柱用于测试其在亲水色谱模式下对强极性化合物的保留和分离混合样品。流动相为三相，分别为乙腈，水，200mM的甲酸铵溶液(pH为3)。流动相条件为90％乙腈/10mM的甲酸铵溶液(pH为3)，流速1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为270nm，色谱图如图1所示(1为尿嘧啶，2为腺嘌呤，3为胞嘧啶，4为肌苷，5为胞苷)。分离结果显示，反相色谱柱死时间流出的强极性化合物胞嘧啶得到了很好的保留，表现出典型的亲水作用模式。

实施例2

使用实施例1所制备的色谱柱分离在亲水作用色谱模式下分离糖和糖醇。以乙腈/水作为流动相，乙腈和水的体积比为80/20，糖和糖醇都得到了良好的分离，如图2所示(1为核糖，2为甘露糖醇，3为蔗糖，4为麦芽糖醇，5为棉籽糖，6为松三糖)。

实施例3

使用实施例1所制备的色谱柱分离在亲水作用色谱模式下分离半乳寡糖样品。以乙腈/水作为流动相，梯度洗脱(水体积含量：0-60分钟：20-40％)条件下，半乳寡糖样品得到了良好的保留与分离，如图3所示，(图中2到7分别代表聚合度不同的二到七糖)。

实施例4

使用实施例1所制备的色谱柱分离在亲水作用色谱模式下分离果寡糖样品。以乙腈/水作为流动相，梯度洗脱(水体积含量：0-60分钟：20-40％)条件下，果寡糖样品得到了良好的保留与分离，如图4所示，(图中4到20分别代表聚合度不同寡糖)。

实施例5

使用实施例1所制备的色谱柱分离在亲水作用色谱模式下分离果聚糖样品。以乙腈/水作为流动相，梯度洗脱(水体积含量：0-120分钟：20-40％)条件下，果聚糖样品得到了良好的保留与分离，如图5所示，(图中数字代表聚合度不同寡糖范围)。

实施例6

使用实施例1所制备的色谱柱分离在亲水作用色谱模式下分离三七皂苷样品。以乙腈/水作为流动相，梯度洗脱(水体积含量：0-60分钟：10-40％)条件下，三七皂苷样品得到了良好的保留与分离，同时得到了很高的回收率，如图6所示，(图中1为二糖，2、3为三糖，4为四糖)。

实施例7

使用实施例1所制备的色谱固定相富集人血清免疫球蛋白G，洗脱条件为乙腈/水/甲酸(50∶50∶0.1v/v，10mM甲酸铵溶液)，如图7所示，(图中(A)为蛋白酶解液未经富集的质谱图，(B)为蛋白酶解液经色谱固定相富集后的质谱图)。从图中可知，经过富集，糖肽的选择性和丰度有了很大的提高，表现出很好的富集选择性。

实施例9

与实施例1不同之处在于，采用粒径为5μm，孔径为比表面积为300m²g^-1的球形硅胶颗粒，按实施例1的合成步骤得到固定相和此固定相填充的色谱柱。磺化硅胶的元素分析结果：C3.13％，N0％，H1.33％。涂覆纤维素后的元素分析结果：C3.86％，N0.04％，H1.38％。经计算的涂覆量为19.42mg/g。将此固定相及填充的色谱柱应用于糖生物学及糖蛋白组学。

实施例10

与实施例1不同之处在于，采用粒径为5μm，孔径为比表面积为30m²g^-1的球形硅胶颗粒，按实施例1的合成步骤得到固定相和此固定相填充的色谱柱。磺化硅胶的元素分析结果：C0.42％，N0％，H0.4％。涂覆纤维素后的元素分析结果：C1.70％，N0.02％，H0.53％。经计算的涂覆量为9.71mg/g。将此固定相及填充的色谱柱应用于糖生物学及糖蛋白组学。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。

Claims

1.一种阳离子多糖涂覆型亲水色谱固定相，其特征在于，其化学结构式为：

2.一种阳离子多糖涂覆型亲水色谱固定相的制备方法，其特征在于，其具体步骤为：

(1)硅胶预处理

(2)硅胶表面修饰

(3)磺化过程

(4)涂覆过程

3.如权利要求2所述的一种阳离子多糖涂覆型亲水色谱固定相的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，所述的有机溶剂为与水不互溶的有机溶剂，包括甲苯、乙苯、二甲苯、正己烷、正庚烷、正戊烷、正辛烷、环己烷等苯系物和烷烃。

4.如权利要求2所述的一种阳离子多糖涂覆型亲水色谱固定相的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，所述的有机溶剂的使用量为每克活化硅胶使用2～100mL有机溶剂。

5.如权利要求2所述的一种阳离子多糖涂覆型亲水色谱固定相的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，硅烷试剂结构式为：

其中，X为-OCH₃，-OCH₂CH₃或-Cl，m＝1～12，A为SH；硅烷试剂的使用量为每克活化硅胶使用0.5～5mmol。

6.如权利要求2所述的一种阳离子多糖涂覆型亲水色谱固定相的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(3)中，所述的混合溶液的使用量为每克硅胶使用2～100mL质量分数为30％过氧化氢溶液，1～10mL甲醇溶液及0.01～1mL浓硫酸溶液。

7.如权利要求2所述的一种阳离子多糖涂覆型亲水色谱固定相的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(4)中，所述的阳离子多糖包括阳离子纤维素，阳离子淀粉等等，分子量范围在100～200万之间。

8.如权利要求2所述的一种阳离子多糖涂覆型亲水色谱固定相的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(4)中，所述的阳离子多糖的使用量为每克硅胶使用0.01～1g，所配置的水溶液浓度为0.1％～10％。

9.一种阳离子多糖涂覆型亲水色谱固定相在糖生物学和糖蛋白组学中的应用。