CN103483223B

CN103483223B - α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯、制备方法及应用

Info

Publication number: CN103483223B
Application number: CN201310414668.6A
Authority: CN
Inventors: 国新华; 肖朝辉; 刘超; 王晟
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2013-09-12
Filing date: 2013-09-12
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2033-09-12
Also published as: CN103483223A

Abstract

α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯、制备方法及应用，属于基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI）技术领域。是在室温搅拌下，向反应溶剂中加入哌啶，再加入氰基乙酸丙酯和4-羟基苯甲醛，待药品溶解后再加入甲苯，升温回流除水后停止反应，然后冷却至室温后，旋蒸得含α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯的浓缩液；产物纯化：将所得浓缩液倒入大量去离子水中，立即有固体析出，抽滤得滤饼；再将滤饼用乙醇重结晶1～5次，得微黄色产物，即α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯。采用本发明的质谱分析方法检测各类样品，灵敏度与检测限与传统基质（α-氰基-4-羟基肉桂酸）相比，具有更好的测试效果。

Description

α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯、制备方法及应用

技术领域

本发明属于基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI）技术领域，具体涉及α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯、制备方法及在作为MALDI的基质方面的应用。

背景技术

基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱技术自1988年Tanaka等人报道以来，就备受各国研究者的青睐。基质在MALDI分析中充当十分重要的角色，它们不仅能吸收和传递激光能量，同时也能将待测物分子分离开防止它们聚集成簇免遭强烈激光照射使待测物分子发生碎裂。一个“好的”基质需要满足几个条件，包括其要在所用激光波长处有较强的吸收能力，并且能够与待测物互溶从而能够很好的共同均匀结晶。事实上，一种基质可能不同时具备满足一个样品中各种各样的待测物的要求，因此经常使用混合基质即在基质的溶液中加入适当的辅助基质。然而因为缺乏严格的指导性规则，在MALDI中找到一种适合作为基质或是辅助基质的化合物是一个需要大量的劳动和时间的工作。幸运的是，近年来在生物样品MALDI分析中基质添加物或是新基质的研究取得很大进展。

因为每种基质都有其特定的“能力阀值”，而电离不同类型的样品需要不同的能量。同时，在检测过程中要保持样品的稳定性，太“热”（能量传递太高、太快）的基质会导致样品不可预测的解离，因此在MALDI的使用中，不同类型的样品要用不同的基质。在选用好适用于待测样品的基质后便可以使用MALDIMS进行样品制备分析，其流程主要包括：（1）选择适合样品类型的基质后，将样品与基质按照适当的比例均匀的混合，一般为混合溶液。（2）用微量移液枪取约0.5ul上述的混合溶液使其自由滴落在靶板上。（3）使液滴自然结晶。（4）打开质谱仪取下靶板，将样品靶放进质谱仪，此时质谱仪处于高真空工作状态。（5）待质谱仪显示准备好后，点击样品点的不同位置，用激光照射样品，产生离子。MALDI产生的离子基本上均带一个电荷，为准分子离子。

MALDI质谱技术常用的基质，如α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）、2,5-二羟基苯甲醛（DHB）和芥子酸（SA）等测试样品时往往遇到以下问题：（1）质量范围与样品类型不广：CHCA一般只适用于分子量500～10000Da，DHB一般适用于分子量小于5000的多肽，多糖和糖肽；而SA一般适用于分子量大于10000的蛋白。（2）待分析的样品，尤其是生物样品如蛋白组学研究的实际样品，往往存在大量的杂质和其他非蛋白成分，这使得质谱检测灵敏度大大降低，且严重抑制样品信号，因此需要加入额外的除盐步骤和除杂质操作，导致样品大量损失，而低的样品含量给后续质谱分析和检测带来困难。（3）CHCA在合成制备上不易得到纯品，商业化产品价格高。因此，开发一些同时具有CHCA、DHB和SA三种传统基质优良性能，且相对灵敏度更高，应用范围更广，易获取的基质材料是对当前基于MALDI的质谱分析的重要和有力补充，具有良好的实用价值和应用前景。

发明内容

本发明的一个目的是提供α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯、制备方法及在作为MALDI的基质方面的应用。

本发明所述的α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯的结构式如式（1）所示：

式（1）

本发明所述的α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯的制备方法，其步骤如下：

1）室温搅拌下，向反应溶剂中加入哌啶，再加入氰基乙酸丙酯（式3）和4-羟基苯甲醛（式2），待药品溶解后再加入甲苯，升温回流除水后停止反应，然后冷却至室温后，旋蒸得含式（1）产物的浓缩液；

2）产物纯化：将所得浓缩液倒入大量去离子水中，立即有固体析出，抽滤得滤饼；再将滤饼用乙醇重结晶1～5次，得微黄色产物，即α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯。

式（2）

式（3）

其中，步骤1）中，

哌啶的加入量为4-羟基苯甲醛摩尔数的1%～10%；

氰基乙酸丙酯与4-羟基苯甲醛的摩尔比为1：0.5～5；

反应溶剂为乙醇，氰基乙酸丙酯与乙醇的摩尔比为1：1～1000；乙醇与甲苯的摩尔比为1：0.5～10；

反应温度为40～150摄氏度，反应时间为0.5～24小时。

步骤2）中，

浓缩液与去离子水的体积比为1：10～1000，滤饼与乙醇质量比为1：10～1000。

本发明的另一个目的是提供α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯在作为辅助激光解吸电离（MALDI）质谱的基质方面的应用。该方法适用于对有机物以及各类生物样品进行质谱分析，尤其是多肽、蛋白的质谱分析。

当以α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯为MALDI基质时，对基质溶液的浓度没有特别限定，通常可配制成1mmol/L至饱和溶液的浓度。溶剂原则上与质谱后续分析兼容即可，通常可以是水，甲醇，乙醇，乙酸乙酯，乙腈，四氢呋喃，丙酮等，包括它们的互溶体系。

采用本发明的质谱分析方法检测各类样品，灵敏度与检测限与传统基质（α-氰基-4-羟基肉桂酸）相比，具有更好的测试效果。

本发明的质谱分析方法可在有机与生物质谱，质谱成像，蛋白质组学，代谢组学，生物标记物发现，环境和药物分析等领域得到有效的应用。

适合分析的样品除纯品或简单混合物外，还涵盖复杂混合体系。包括但不限于各种生物组织细胞样本，微生物样本，体液，透析液，化学合成体系，以及环境监测样本，如水，大气，土壤样本等。

本发明以α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯作为MALDI的基质的质谱分析法，通常是用时间飞行质谱（TOFMS）作为质量分析手段，但与其他质谱质量分析器也兼容。

本发明的方法不仅可以用于均质体系的MALDI质谱分析，还可以用于如质谱成像等非均质体系的应用。

具体使用时，基质溶液一般配成1mmol/L至饱和溶液的浓度，与待测物的摩尔量配比并无特殊要求，因为需要基质吸收激光传递能量给待测物，尽可能使所有待测物被离子化，一般情况下基质的摩尔量比待测物大即可。

采用本发明的方法进行MALDI质谱分析时，所述待测化合物与基质的摩尔比可为1：1～100000，具体可为1：1000；将所述化合物的样品和所述基质溶液中的基质以摩尔比1：1～100000混合均匀后，吸取0.5～1μL混合液点样。待混合液中的溶剂在空气中挥发完全后，根据样品类型，可采用正离子或者负离子扫描模式的MALDI质谱对所述化合物进行分析。

本方法中待测样品为复杂混合体系时，通常无需特殊处理，吸取混合体系的上清液（也可以是浑浊液）以一定比例和基质溶液混合（样品与基质的摩尔比可为1：1～100000），点于MALDI靶板后即可用于质谱分析。当作为质谱成像应用，样品为组织切片时，可将基质溶液（1mmol/L至饱和浓度）喷洒在样品表面，然后进行标准的质谱成像分析。

本发明采用的基质，无需加入离子化试剂，减少了对样本处理的要求。

附图说明

图1：α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯的核磁谱图；

图2：MALDI-MS检测BSA质谱图：从上至下依次为α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质，α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯作为基质；

图3：MALDI-MS检测Myoglobin质谱图：从上至下依次为α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质，α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯作为基质；

图4：MALDI-MS检测Insulin质谱图：从上至下依次为α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质，α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯作为基质；

图5：MALDI-MS检测[Gly¹⁴]-HumaninGhuman质谱图：从上至下依次为α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质，α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯作为基质；

图6：MALDI-MS检测有机小分子样品质谱分析图：从上至下依次为α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质，α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯作为基质；

图7：MALDI-MS检测谷胱甘肽质谱分析图：从上至下依次为α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质，α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯作为基质。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法：所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例所用的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪的型号为AutoflexspeedTOF/TOF（BrukerDaltonics，Germany），激光波长为355nm的Nd：YAG激光器。质谱测试参数为：加速电压：20.000kv；延迟引出电压：18.000kv；反射器电压：20.000kv；透镜电压：6.000kv；频率：1.000Hz；激光器能量：75～80%；累加次数：500次；正离子模式。

实施例1：合成α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯

向乙醇（30mL)中加0.2mL哌啶，再加入氰基乙酸丙酯（0.6357g，5mmol）和4-羟基苯甲醛（0.6717g，5.5mmol）。待固体药品溶解后再加入甲苯（30mL），升温至130℃下搅拌回流除水3小时，停止反应。冷却至室温后，旋蒸浓缩至10mL。所得浓缩液倒入300mL一次水中有固体析出，抽滤得微黄色粉末滤饼。将滤饼用乙醇（50mL）重结晶一次，得微黄色产物α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯（0.7958g,0.34mmol），产率68.82%。

α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯结构鉴定数据如下：

¹HNMR(300MHz,CDCl₃)δ(ppm):8.19(s,1H),7.98(d,J=8.2Hz,2H),6.97(d,J=8.2Hz,2H),4.29(t,J=6.5Hz,1H),1.80(dd,J=14.1,7.1Hz,1H),1.04(t,J=7.3Hz,2H).

电喷雾质谱（ESI-MS）:m/z232.09,[M+H]⁺;254.14,[M+Na]⁺.元素分析（Elementalanalysis）:C₂₂H₁₀N₂O₄计算值：C67.52，H,5.67，N,6.06%；实验值：C67.51，H,5.68，N,6.08%.

实施例2：以α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯作为基质对蛋白标准品进行质谱分析。

取各种配制好的样品溶液（分别为牛血清白蛋白（BSA），马肌红蛋白（Myoglobin）和牛胰岛素（Insulin）的标准品，均购自sigma公司，浓度均为1μM）和基质溶液（浓度为5mM）以1：1体积比混合均匀，然后向MALDI靶板加入1μL混合样品，置于空气中挥发掉溶剂，而后进行质谱分析。

与传统基质α-氰基-4-羟基肉桂酸测样对比，α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯作为基质对于BSA（图2b，m/z66342,[M+H]⁺;33153,[2M+H]⁺），Myoglobin（图3b，m/z16960.817,[M+H]⁺;8479.374,[2M+H]⁺,5650.476,[3M+H]⁺），Insulin（图4b，m/z5734.439）均获得了相对高的信号强度，因而具有更好的基质性能。图中待测物的量均为0.5pmol，可以看出该基质分析灵敏度较高。

实施例3：对多肽标准品的质谱分析。

取[Gly¹⁴]-HumaninGhuman（氨基酸序列为Met-Ala-Pro-Arg-Gly-Phe-Ser-Cys-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Ala，浓度为1μM，购自sigma公司）标准品溶液和基质溶液（浓度为5mM）以1：1体积比混合均匀，然后向MALDI靶板加入1μL混合样品，置于空气中挥发掉溶剂，而后进行质谱分析。

与传统基质α-氰基-4-羟基肉桂酸测样对比，α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯作为基质对于[Gly¹⁴]-HumaninGhuman（图5b，m/z2685.761,[M+H]⁺;1343.516,[2M+H]⁺）均获得了相对高的信号强度，因而具有更好的基质性能。图中待测物的量为0.5pmol，可以看出该基质分析灵敏度较高。

实施例2和3可知，α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯作为基质对蛋白样品和多肽样品测样均具有比传统基质α-氰基-4-羟基肉桂酸更好的效果。

实施例4：对有机小分子样品的分析。

取N-叔丁氧羰基-N(咪唑)-(4-甲基苯磺酰基)-L-组氨酸（BOC-His(Tos)-OH，浓度为100μM，购自sigma公司，CAS号35899-43-5）样品溶液1μL与1μL基质溶液（浓度为5mM）混合，最后取出1μL混合液加入到MALDI靶板上，空气中干燥后进入质谱分析。

从图6中可以看出，使用α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯作为基质能使样品分子被离子化，产生质谱信号（图6b，m/z410.407,[M+H]⁺;432.448,[M+Na]⁺;448.470,[M+K]⁺），而使用α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质检测样品获得的离子信号强度非常弱。因此，α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯基质可以用于有机小分子的分析。

实施例5：对谷胱甘肽的质谱分析

取1μL谷胱甘肽（G-SH，浓度为10μM，购自sigma公司，CAS号为70-18-8）样品溶液，与1μL基质溶液（5mM）混合，最后取出1μL混合液加入到MALDI靶板上，空气中干燥后进入质谱分析。

从图7中可以看出，相对传统基质α-氰基-4-羟基肉桂酸而言，α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯作为基质检测样品时产生更强的质谱信号（图7b，m/z308.158,[M+H]⁺;330.235,[M+Na]⁺;346.441,[M+K]⁺）。此例说明，这个新基质可以应用于短肽的分析。结果还表明，α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯作为基质，检测出的样品信号强度比较高，说明α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯比α-氰基-4-羟基肉桂酸具有更好的基质性能。因此，α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯基质可以用于多肽样品的分析。

Claims

1.一种可以单独作为MALDI分析基质的α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯，其结构式如式(1)所示：

2.权利要求1所述的一种可以单独作为MALDI分析基质的α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯的制备方法，其步骤如下：

1)室温搅拌下，向反应溶剂中加入哌啶，再加入氰基乙酸丙酯和4-羟基苯甲醛，待药品溶解后再加入甲苯，升温回流除水后停止反应，冷却至室温后，旋蒸得含α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯的浓缩液；

2)产物纯化：将上面步骤所得浓缩液倒入到大量去离子水中，抽滤得滤饼；再将滤饼用乙醇重结晶1～5次，得微黄色产物，即α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯。

3.如权利要求2所述的一种可以单独作为MALDI分析基质的α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯的制备方法，其特征在于：步骤1)中哌啶的加入量为4-羟基苯甲醛摩尔数的1％～10％。

4.如权利要求2所述的一种可以单独作为MALDI分析基质的α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯的制备方法，其特征在于：步骤1)中氰基乙酸丙酯与4-羟基苯甲醛的摩尔比为1：0.5～5。

5.如权利要求2所述的一种可以单独作为MALDI分析基质的α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯的制备方法，其特征在于：步骤1)中反应溶剂为乙醇，氰基乙酸丙酯与乙醇的摩尔比为1：1～1000；乙醇与甲苯的摩尔比为1：0.5～10。

6.如权利要求2所述的一种可以单独作为MALDI分析基质的α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯的制备方法，其特征在于：步骤1)中反应温度为40～150摄氏度，反应时间为0.5～24小时。

7.如权利要求2所述的一种可以单独作为MALDI分析基质的α-氰基-4-羟基肉桂酸正丙酯的制备方法，其特征在于：步骤2)中浓缩液与去离子水的体积比为1：10～1000，滤饼与乙醇质量比为1：10～1000。