CN111796041B - 一种水产品中兽药分布的成像检测试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测水产品中兽药分布的方法和试剂盒，其中，该方法包括：对所述水产品进行切片处理，以便选取待测切片；将所述待测切片进行敞开式质谱成像检测，以便得到质谱检测信息；以及基于所述质谱检测信息，以便获得所述水产品的兽药分布信息。该方法通过对待测水产品进行切片，通过对切片的观测自由选择待测切片进行检测，并利用敞开式质谱进行成像检测，操作简单、分析时间短、无须或仅很少的样品需预处理、样品用量少，实现了水产品中兽药及其代谢物的可视化，分析时间短，检测速度快。

Description

一种水产品中兽药分布的成像检测试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及分析化学领域，具体地，涉及检测水产品中兽药分布的方法和检测水产品中兽药分布的试剂盒。
背景技术
我国水产品质量安全水平呈稳定提升，但硝基呋喃类药物、孔雀石绿和磺胺类兽药残留超标事件仍时有发生。因此，需研究兽药在水产养殖动物中的分布与代谢规律，从而保证鲜活水产品的质量安全。孔雀石绿(malachite green，MG)是水产养殖中禁用的一种三苯基甲烷类工业染料，能有效地的防治鱼类外部真菌、原虫感染等疾病。孔雀石绿多用于水产动物的繁殖、消毒和运输等环节。另一方面，孔雀石绿和其主要代谢产物隐色孔雀石绿(leucomalachite green，LMG)对人体具有致畸、致癌、致突变的“三致”作用，因此，MG禁止用于所有动物食品中。但是，由于孔雀石绿抗菌效果好、价格低廉，在水产养殖中仍有违规使用的情况。人类食用抗生素残留超标的食物，可能会造成体内菌群失衡，耐药菌株产生，中枢神经系统毒性，更有甚者引发变态反应。因此实现食品中痕量兽药残留的快速检测，挖掘残留兽药在生物体内的分布规律，对保障食品安全、协助食品安全监管具有重要意义。
传统的兽药分析方法，如酶联免疫吸附法(ELISA)，气相色谱-质谱(GC-MS)，高效液相色谱-紫外检测器(HPLC-UV)和液相色谱-质谱或串联质谱(LC-MS，LC-MS/MS)可用于(半)定量分析残留含量。然而，这些方法都需要复杂的样品制备，耗时费力，占用大量实验资源。例如，LC-MS必须经过复杂的样品提取和纯化过程，防止干扰物质对分析的影响，同时防止杂质污染仪器。通常这些方法是首先进行组织匀浆，导致样品中分析物的空间分布信息难以精确获得。
由此，检测水产品中兽药分布的方法有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种检测水产品中药物分布的方法，该方法实现了水产品中兽药及其代谢物的可视化，分析时间短，检测速度快。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种检测水产品中兽药分布的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：对所述水产品进行切片处理，以便选取待测切片；将所述待测切片进行敞开式质谱成像检测，以便得到质谱检测信息；以及基于所述质谱检测信息，以便获得所述水产品的兽药分布信息。
根据本发明实施例的检测水产品中兽药分布的方法，通过对待测水产品进行切片，通过对切片的观测自由选择待测切片进行检测，并利用敞开式质谱进行成像检测，操作简单、分析时间短、无须或仅很少的样品需预处理、样品用量少，实现了水产品中兽药及其代谢物的可视化，分析时间短，检测速度快。
另外，根据本发明上述实施例的检测水产品中兽药分布的方法，还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，所述切片处理包括：将所述水产品进行冷冻，以便得到冷冻水产品；；将所述冷冻水产品进行冷冻切片，以便得到切片样本；以及将所述切片样本进行显微观察，以便选取所述待测切片。
根据本发明的实施例，所述切片样本的厚度为25-35μm。
根据本发明的实施例，所述敞开式质谱成像检测为基质辅助激光解吸飞行时间质谱成像(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight MassSpectrometry Imaging，MALDI-TOF MSI)检测。
根据本发明的实施例，所述敞开式质谱成像检测包括：将所述待测切片进行多次基质喷涂处理，以便得到喷涂后切片；利用成像显微镜对所述喷涂后切片进行质谱成像检测，以便得到所述质谱检测信息。
根据本发明的实施例，所述基质喷涂处理的喷雾基质为含有α-氰-4-羟基肉桂酸的基质溶液。
根据本发明的实施例，所述基质溶液的α-氰-4-羟基肉桂酸的浓度为15-25mg/mL。
根据本发明的实施例，所述多次基质喷涂处理为10-15次。
根据本发明的实施例，所述成像显微镜为iMScope TRIO显微镜。
根据本发明的实施例，所述成像显微镜的工作参数为：离子源：300-400nm脉冲激光光源；所述聚焦激光的工作参数为：频率0-1000Hz，激光强度0-25.0，激光步距10-100μm；最小激光斑点直径：不大于5μm。
根据本发明的实施例，所述敞开式质谱成像检测的质谱条件：离子极性：正离子；质量范围：m/z 100-2000Da；样品电压：3.5kV；检测器电压：1.90kV。
根据本发明的实施例，所述食品为肉类和水产品。
根据本发明的实施例，所述兽药为硝基呋喃类兽药、孔雀石绿和磺胺类兽药。
进一步地，根据本发明的又一方面，本发明提供了一种检测水产品中兽药分布的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前述的检测水产品中兽药分布的方法中所使用的试剂、标准品、辅助材料或其中至少一项的组合。由此，该试剂盒通过对待测水产品进行切片，通过对切片的观测自由选择待测切片进行检测，并利用敞开式质谱进行成像检测，操作简单、分析时间短、无须或仅很少的样品需预处理、样品用量少，实现了水产品中兽药及其代谢物的可视化，分析时间短，检测速度快。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的检测水产品中兽药分布的方法的流程示意图；
图2显示了根据本发明一个实施例的不同基质对于孔雀石绿质谱信号的影响的结果示意图；
图3显示了根据本发明一个实施例的孔雀石绿以及隐色孔雀绿MALDI质谱图以及二级质谱图结果示意图，其中，a为孔雀石绿的质谱图，b为孔雀石绿的二级质谱图，c为隐色孔雀石绿的质谱图，d为隐色孔雀石绿的二级质谱图；
图4显示了根据本发明一个实施例的鲫鱼样品及冷冻切片示意图，其中，a为鲫鱼样品，b为冷冻切片；
图5显示了根据本发明一个实施例的不同组织中孔雀石绿及其代谢产物的空间分布的结果示意图，其中，a为图4b中1区域显微镜光学成像图；b为图4b中2区域显微镜光学成像图；c为图5a对应区域孔雀石绿质谱成像图及分布(m/z＝329.20)；d为图5b对应区域孔雀石绿质谱成像图及分布；e为图5a对应区域隐色孔雀绿质谱成像图及分布(m/z＝331.20)；f为图5b对应区域隐色孔雀绿质谱成像图及分布。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种检测水产品中兽药分布的方法。
根据本发明实施例的检测水产品中兽药分布的方法，通过对待测水产品进行切片，通过对切片的观测自由选择待测切片进行检测，并利用敞开式质谱进行成像检测，操作简单、分析时间短、无须或仅很少的样品需预处理、样品用量少，实现了水产品中兽药及其代谢物的可视化，分析时间短，检测速度快。
根据本发明实施例的检测水产品中兽药分布的方法，适用于水产品，例如水产品和肉类的生物组织中残留兽药的快速检测，用于明确水产品中兽药，尤其是兽药分布规律与可食用部分，分析时间短，检测快速，为水产品安全提供指导。
为了便于理解该检测水产品中兽药分布的方法，参考图1，根据本发明的实施例，对该方法进行解释说明：
S100切片处理
根据本发明的实施例，对水产品进行切片处理，选取待测切片。由此，通过显微观察切片的情况，灵活自由选择待测切片，提高检测的准确性和自由度。
在此需要说明的是，切片处理的方法可以根据待测样品、实验条件和待测兽药的种类等自行选择。根据本发明的一些实施例，该切片处理包括：将水产品进行冷冻，得到冷冻水产品；；将冷冻水产品进行冷冻切片，得到切片样本；将切片样本进行显微观察，选取所述待测切片。其中，需要说明的是，在冷冻之后，切片之前，可以将冷冻水产品进行固定包埋，得到包埋后水产品；包埋用包埋剂将组织包裹起来以提供性能支撑或化学保护的过程，水产品的肉质较软，部分组织可能比较松散，通过包埋，使水产品质地变硬或变紧实，便于后续处理。根据本发明的一些实施例，该冷冻为液氮冷冻。
根据本发明的实施例，该切片样本的厚度为25-35μm。由此，该厚度适于制片，防止组织破损。
S200质谱成像检测
根据本发明的实施例，将待测切片进行敞开式质谱成像检测，得到质谱检测信息。由于敞开式质谱具有操作简单、分析时间短、无须或仅很少的样品需预处理、样品用量少，适于切片的兽药分布检测。
S300兽药分布分析
根据本发明的实施例，基于该质谱检测信息，获得水产品的兽药分布信息。由此，基于该质谱检测信息，对质谱信息进行分析，例如采用了Imaging MS Solution Version1.30版本的软件(岛津公司，日本)进行可视化数据采集与分析，判断兽药在切片上的分布，进而确定兽药在水产品中的组织分布。
根据本发明的实施例，该敞开式质谱成像检测为MALDI-TOF MSI质谱检测。分子成像技术，可以同时检测和表征多种化合物的空间分布和相对丰度。该质谱检测适于提供同一组织切片中各种化合物的空间信息，无需额外标记、抗体反应、染色或其他复杂的样品前处理步骤。并且，该质谱检测方式可以直接分析样品，无需均质化和萃取，从而减少了分析物的损失。
根据本发明的实施例，该敞开式质谱成像检测包括：将待测切片进行多次基质喷涂处理，得到喷涂后切片；利用成像显微镜对喷涂后切片进行质谱成像检测，得到质谱检测信息。由此，
根据本发明的实施例，该基质喷涂处理的喷雾基质为含有α-氰-4-羟基肉桂酸的基质溶液。针对水产品的特性，发明人发现采用该基质目标化合物信号强度较高，干扰信号较少。
根据本发明的实施例，所述基质溶液的α-氰-4-羟基肉桂酸的浓度为15-25mg/mL。由此，在激光波长处的高吸收、基质峰及其簇峰的背景信号低、能与分析物形成共结晶及有效的电离目标物。该浓度的优点是基质涂布均匀，目标信号较强。
根据本发明的实施例，该多次基质喷涂处理为10-15次。由此，质谱成像效果好，检测的准确度更高。
根据本发明的实施例，该成像显微镜为iMScope TRIO显微镜。由此，显微成像效果好。
根据本发明的实施例，该成像显微镜的工作参数为离子源：300-400nm脉冲激光光源；所述聚焦激光的工作参数为：频率0-1000Hz，激光强度0-25.0，激光步距10-100μm；最小激光斑点直径：不大于5μm，优选地，离子源：355nm脉冲激光光源；该聚焦激光的工作参数为：频率1000Hz，激光强度15.0，激光步距50μm；最小激光斑点直径：不大于5μm。由此，参数目标信号较强，干扰碎片较少。
根据本发明的实施例，该成像显微镜每像素照射样品表面50次。
根据本发明的实施例，该敞开式质谱成像检测的质谱条件：离子极性：正离子；质量范围：m/z 100-2000Da；样品电压：3.5kV；检测器电压：1.90kV。由此，检测的准确性和精确度高。
由于动物和水产品养殖中，常出现禁用兽药的使用或用药量超标等情况，进而，对肉类和水产品的兽药，尤其是兽药的检测很有必要。根据本发明的实施例，该水产品为肉类和水产品。
在此需要说明的是本文所用术语“兽药”是指用于预防、治疗、诊断动物疾病或者有目的地调节动物生理机能的物质(含药物饲料添加剂)，例如，水产品养殖、生产过程中常用的兽药或鱼药。根据本发明的实施例，该兽药可以为硝基呋喃类兽药、孔雀石绿和磺胺类兽药。
进一步地，根据本发明的又一方面，本发明提供了一种检测水产品中兽药分布的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前述的检测水产品中兽药分布的方法中所使用的试剂、标准品、辅助材料或其中至少一项的组合。由此，该试剂盒通过对待测水产品进行切片，通过对切片的观测自由选择待测切片进行检测，并利用敞开式质谱进行成像检测，操作简单、分析时间短、无须或仅很少的样品需预处理、样品用量少，实现了水产品中兽药及其代谢物的可视化，分析时间短，检测速度快。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。
本说明书中实施例所用设备和材料如下：
1、所述设备：
质谱显微镜(iMScope TRIO)仪器(岛津公司，日本)；
冷冻切片机(Leica CM 1950，德国)；
基质升华仪器(SVC-700TMSG iMLayer，东京，日本)；
喷枪(MR.Linear Compressor L7/PS270Airbrush，东京，日本)；
AG-204电子分析天平(Mettler Toledo公司，瑞士)。
/2、所述材料：
MALDI级的基质2，5-二羟基苯甲酸(DHB)、α-氰-4羟基肉桂酸(CHCA)、芥子酸(SA)、2，4，6-三羟基苯乙酮(2，4，6-THAP)(纯度均＞97％)购自美国Sigma-Aldrich公司；
三氟乙酸(TFA)购自美国Sigma-Aldrich公司；孔雀石绿与隐色孔雀绿标准品购自美国Sigma-Aldrich公司；高效液相色谱乙腈和甲醇由美国Fisher Chemical公司提供；去离子超纯水(＜18.2MΩem电阻率)在Milli-Q水系统(Millipore，布鲁塞尔，比利时)上净化；
氧化铟锡(ITO)涂层载玻片(尺寸75mm×25mm，表面电阻率8-12Ω/平方米)购自美国Sigma-Aldrich公司。
实施例1
MALDI-MSI对于药物的分析效果极大的依赖于基质的选择，一种潜在的基质化合物应满足特定的条件，包括在激光波长处的高吸收、基质峰及其簇峰的最低背景信号、能与分析物形成共结晶及有效的电离目标物。本实施例比较孔雀石绿在DHB、CHCA、2，4，6-THAP和SA这些基质中的信号强度，筛选出适宜的基质。
1、基质溶液的制备
(1)称取适量的CHCA基质，用含0.1％TFA的70％乙腈溶液溶配置成浓度为20mg/mL的基质溶液。
(2)分别称取适量的DHB、2，4，6-THAP和SA基质，用含0.1％TFA的70％甲醇溶液配置成浓度为20mg/mL的基质溶液。
2、质谱检测
利用液滴干燥法将上述基质溶液(0.5μL)滴在不锈钢MALDI靶板上。在正电离模式下检测，质谱结果分别如图2所示，结果表明，CHCA基质对兽药具有较高的选择性。
实施例2
本实施例中，利用MALDI离子源TOF质谱分析鱼类水产品中孔雀石绿空间分布分析，具体如下：
1、切片制备
鱼类阳性样品采用孔雀石绿添加入培养环境中方式培养，一段时间后处死。冷冻切片机(Leica CM 1950，德国)将速冻的样品在-18℃下切成30μm的薄片，然后利用融裱法将薄片贴在ITO导电载玻片上进行光学成像和后续的基质沉积及质谱成像研究。如图4所示，图中标示区域为图5的两个检测区域，样品切片于-80℃冰箱中保存。
2、基质喷雾
称取适量的CHCA基质，用含0.1％TFA的70％乙腈溶液溶解至浓度为20mg/mL的基质溶液。制备1mL CHCA基质溶液(20mg/mL)，然后用移液枪吸取500μL基质溶液添加到手动喷枪的空腔中(MR.Linear Compressor L7/PS270 Airbrush，东京，日本)。喷枪尖端与样品切片表面之间的距离约为8em。在前3个循环中，每隔60s对基质进行喷吹10s，在随后的7个循环中，每隔30s对基质进行连续喷吹10s。喷涂完成后，样品切片表面覆盖一层均匀的白色结晶层。最后，将载玻片置于通风橱中5分钟，使溶剂蒸发。
3、质谱检测
质谱数据是在成像显微镜(iMScope TRIO)仪器(岛津公司，日本)上获得的，该仪器配备有光学显微镜、大气压MALDI源(AP-MALDI)和混合四极离子阱飞行时间(QIT-TOF)质谱分析仪。使用5ns脉冲宽度的聚焦激光(355nmNd：YAG激光)扫描样品切片。在iMScope系统中，激光的工作参数为：频率1000Hz，激光强度15.0，激光步距50μm，所有试验均在最小激光斑点直径(5μm)下进行，在优化的参数下，每像素照射样品表面80次。离子极性，正离子；质量范围，m/z200-800Da；样品电压，3.5kV；检测器电压，1.90kV。Imaging MS SolutionVersion1.30版本的软件(岛津公司，日本)用于控制仪器和数据采集。提取m/z＝329.2(孔雀石绿)与m/z＝331.2(隐色孔雀绿)获得(对应质谱图和二级质谱图如图3所示)可视化分布，所得质谱成像结果如图5所示，结果表明，孔雀石绿代谢具有空间分布特征。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种检测水产品中兽药分布的方法，其特征在于，包括：
对所述水产品进行切片处理，以便选取待测切片；
将所述待测切片进行敞开式质谱成像检测，以便得到质谱检测信息，其中，所述敞开式质谱成像检测为基质辅助激光解吸飞行时间质谱成像检测；以及
基于所述质谱检测信息，以便获得所述水产品的兽药分布信息，
其中，所述敞开式质谱成像检测包括：
将所述待测切片进行多次基质喷涂处理，以便得到喷涂后切片，其中，所述基质喷涂处理的喷雾基质为含有浓度为15-25mg/mL的 α-氰-4-羟基肉桂酸的基质溶液；以及
利用成像显微镜对所述喷涂后切片进行质谱成像检测，以便得到所述质谱检测信息，
其中，所述兽药为孔雀石绿，
其中，所述成像显微镜的工作参数为：
离子源：300-400 nm 脉冲激光光源；
聚焦激光的工作参数为：频率0-1000 Hz，激光强度0-25.0，激光步距10-100 μm；
最小激光斑点直径：不大于5 μm；
其中，所述敞开式质谱成像检测的质谱条件：
离子极性：正离子；
质量范围：m/z 100-2000 Da；
样品电压：3.0-5.0 kV；
检测器电压：1.90 kV。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述切片处理包括：
将所述水产品进行冷冻，以便得到冷冻水产品；
将所述冷冻水产品进行冷冻切片，以便得到切片样本；以及
将所述切片样本进行显微观察，以便选取所述待测切片。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述切片样本的厚度为10-100 μm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于， 所述多次基质喷涂处理为10-15次。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述成像显微镜为iMScope TRIO显微镜。
6.一种α-氰-4-羟基肉桂酸在制备检测水产品中孔雀石绿分布的试剂盒的用途，其特征在于，所述试剂盒的检测方法包括：
将所述待测切片进行多次基质喷涂处理，以便得到喷涂后切片，其中，所述基质喷涂处理的喷雾基质为含有浓度为15-25mg/mL的 α-氰-4-羟基肉桂酸的基质溶液；以及
利用成像显微镜对所述喷涂后切片进行质谱成像检测，以便得到所述质谱检测信息。
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