CN113861074A - 一种新型离子液体maldi基质的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型离子液体MALDI基质的制备方法及应用，其中，该离子液体基质包括α‑氰基‑4‑羟基肉桂酸‑对苯二胺复合物。该离子液体基质适用于小分子的检测，检测的灵敏度高，背景噪音小，在生物、医药、食品等领域具有重要应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学领域，具体的，涉及一种新型离子液体MALDI基质的制备方法及应用，更具体地，涉及离子液体基质、试剂盒、检测待测物中抗生素的方法，以及检测待测物中抗生素的试剂盒。
背景技术
基质辅助激光解析电离技术是出现于20世纪80年代的一种软电离质谱技术，能够快速分析高分子量的物质，质谱检测时无碎片或只有少量碎片，具有较高的检测精密度和灵敏度,在生物，食品，医药等多个领域都展示出广泛的应用前景。而基于MALDI的质谱成像技术能够同时满足空间成像需求和未知物的检测，具有很大的应用潜力。它的工作原理是：使用一定强度的激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜,基质从激光中吸收能量,导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。根据质荷比(m/z)的不同来进行检测并得到样品的分子量。基质是使用MALDI进行检测的关键，基质的研发与应用是这项技术得到更广泛应用的发展重点。目前常见的MALDI基质主要是有机小分子类基质，比如α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)，2,5-二羟基苯甲酸(DHB)，9-氨基吖啶(9-AA)和芥子酸(SA)，除此之外，无机基质比如石墨烯，碳纳米管等由于其优越的比表面积和干净的质谱背景等优点，其应用在MALDI中也屡见不鲜。然而，有机小分子类基质在低分子量区域内碎片多，使用时均一性差，无机基质价格昂贵且合成复杂等缺点制约着这两类基质的进一步发展，因此引入了离子液体基质的概念，在增加离子化效率的同时借助液体的优势提高均一性，减少“热点效应”的出现。现有的离子液体虽然在大分子检测中表现出了卓越的优势，但是在小分子中的应用却比较罕见。
由此，用于小分子的离子液体基质有待研究。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于制备一种适于小分子检测的离子液体基质。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：
发明人发现，如果离子液体是基于有机酸和有机碱的酸碱结合反应而合成的，合成操作经济简便，没有副产物，产品易纯化。进而，发明人先进行了适合合成离子液体的有机酸筛选，包括α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、DHB、9-AA和2,4,6-三羟基苯乙酮(THAP)，从中选择出灵敏度高，背景噪音相对较小的CHCA作为离子液体中的有机酸。然后，16种可能有效果的有机碱进行离子液体的合成与筛选，这16种基质对喹诺酮和磺胺的检测灵敏度，均一性进行了比较，发现对苯二胺是其中最适合制作离子液体的有机碱。因此，合成以CHCA为基础的离子液体用于MALDI(基质辅助激光解吸电离)分析。本发明实施例制备的离子液体，不仅能作为MALDI中的基质应用于样品中小分子兽药，尤其是喹诺酮类和磺胺类药物残留的净化与富集，还在生物、医药、食品等领域具有重要应用价值。
因而，根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种离子液体基质。根据本发明的实施例，该离子液体基质包括α-氰基-4-羟基肉桂酸-对苯二胺复合物(CHCA-对苯二胺复合物)。
发明人惊奇地发现本发明实施例的离子液体基质适用于小分子的检测，电离效率高，均一性好，检测的灵敏度高，背景噪音小，在生物、医药、食品等领域具有重要应用价值。
根据本发明的实施例，所述CHCA-对苯二胺复合物中，CHCA与对苯二胺的摩尔比为1:0.5-3。
进一步地，根据本发明的第二个方面，本发明提供了离子液体基质的用途，离子液体基质在基质辅助激光解吸电离中用于反应基质。由此，以该离子液体基质为检测基质，检测的灵敏度高，背景噪音小。
根据本发明的第三个方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前述的离子液体基质。由此，该试剂盒适用于小分子的检测，检测的灵敏度高，背景噪音小，在生物、医药、食品等领域具有重要应用价值。其中，需要说明的是，该试剂盒具有前述离子液体基质全部技术特征和技术效果，在此不再一一赘述。
根据本发明的第四个方面，本发明提供了一种检测待测物中抗生素的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将所述待测物进行提取处理，以便得到提取物；将所述提取物与前述的离子液体基质混合，以便得到混合物；对所述混合物进行质谱成像检测，以便对抗生素进行定性和/或定量检测。由此，该方法适用于抗生素的检测，检测的灵敏度高，背景噪音小。其中，需要说明的是，该方法具有前述离子液体基质全部技术特征和技术效果，在此不再一一赘述。
根据本发明的实施例，所述混合物置于不锈钢板上进行所述质谱成像检测。
根据本发明的实施例，所述质谱成像检测为MALDI-MSI质谱成像检测。
根据本发明的实施例，所述质谱成像检测的检测条件为：质谱检测器：IT-TOF MS质谱检测器；检测模式：阳离子模式。
根据本发明的实施例，所述质谱成像检测的成像范围为50×50微米。
根据本发明的实施例，所述质谱成像检测的成像条件：样品电压：3.5千伏；检测器电压：1.7千伏；激光强度为20。
根据本发明的实施例，所述抗生素为喹诺酮类抗生素和磺胺类抗生素。
根据本发明的实施例，所述CHCA对苯二胺复合物中，CHCA与对苯二胺的摩尔比为1:0.5-3。
根据本发明的第五个方面，本发明提供了一种检测待测物中抗生素的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前述的检测待测物中抗生素的方法中所使用的试剂、标准品、辅助材料或其中至少一项的组合。由此，该试剂盒适用于抗生素的检测，检测的灵敏度高，背景噪音小。其中，需要说明的是，该方法具有前述检测待测物中抗生素的试剂盒全部技术特征和技术效果，在此不再一一赘述。
根据本发明的实施例，所述抗生素为喹诺酮类抗生素和磺胺类抗生素。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的CHCA、CHCA/Na和CHCA-对苯二胺新型离子液体在1750-1200cm-1范围的红外光谱示意图，其中，A为CHCA，B为CHCA/Na，C为CHCA-对苯二胺；
图2显示了根据本发明一个实施例的CHCA-对苯二胺新型离子液体以检测恩诺沙星为基础进行的摩尔比优化图和使用CHCA基质与CHCA-对苯二胺新型离子液体基质的检测效果示意图，其中，A为CHCA(左)，B为CHCA-对苯二胺；
图3显示了根据本发明一个实施例的CHCA-对苯二胺新型离子液体与CHCA检测5种喹诺酮和两种磺胺类药物的灵敏度比较示意图；
图4显示了根据本发明一个实施例的CHCA-对苯二胺新型离子液体与CHCA检测4种喹诺酮和两种磺胺类药物的均一性比较示意图；
图5显示了根据本发明一个实施例的CHCA-对苯二胺新型离子液体对恩诺沙星进行检测的线性曲线示意图，其中，A为不锈钢靶板，B为鱼肉切片。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
(一)离子液体基质及其制备方法
根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种离子液体基质。根据本发明的实施例，该离子液体基质包括CHCA-对苯二胺复合物。
发明人惊奇地发现本发明实施例的离子液体基质适用于小分子的检测，电离效率高，均一性好，检测的灵敏度高，背景噪音小，在生物、医药、食品等领域具有重要应用价值。
根据本发明的实施例，所述CHCA-对苯二胺复合物中，CHCA与对苯二胺的摩尔比为1:0.5-3。根据本发明的一些优选实施例，所述CHCA-对苯二胺复合物中，CHCA与对苯二胺的摩尔比为1:1。由此，摩尔比1:1时响应强度更高，且在成像模式下均一性好。
为了便于理解前述的离子液体基质，在此提供了一种制备离子液体基质的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：CHCA通过超声助溶溶解于甲醇中，再将对苯二胺加入到CHCA甲醇溶液中，涡旋10分钟，制得该离子液体基质。这个方法不需要复杂的仪器和合成过程，经济实惠，操作简单，不仅能实现抗生素，尤其是喹诺酮和磺胺类药物的MALDI分析，还为生物、医药、食品等领域提供新的检测思路。
根据本发明的实施例，所述涡旋为Vortex-Genie2漩涡混合器，旋转频率2000rpm，温度25℃。
根据本发明的实施例，CHCA与对苯二胺的摩尔比为1:0.5-3，优选地，摩尔比为1:1。由此，摩尔比时响应强度更高，且在成像模式下均一性好。
(二)离子液体基质的应用
进一步地，根据本发明的第二个方面，本发明提供了离子液体基质的用途，离子液体基质在基质辅助激光解吸电离中用于反应基质。由此，以该离子液体基质为检测基质，检测的灵敏度高，背景噪音小。
根据本发明的第三个方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前述的离子液体基质。由此，该试剂盒适用于小分子的检测，检测的灵敏度高，背景噪音小，在生物、医药、食品等领域具有重要应用价值。其中，需要说明的是，该试剂盒具有前述离子液体基质全部技术特征和技术效果，在此不再一一赘述。
根据本发明的第四个方面，本发明提供了一种检测待测物中抗生素的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将所述待测物进行提取处理，以便得到提取物；将所述提取物与前述的离子液体基质混合，以便得到混合物；对所述混合物进行质谱成像检测，以便对抗生素进行定性和/或定量检测。由此，该方法适用于抗生素的检测，检测的灵敏度高，背景噪音小。其中，需要说明的是，该方法具有前述离子液体基质全部技术特征和技术效果，在此不再一一赘述。
根据本发明的实施例，所述混合物置于不锈钢板上进行所述质谱成像检测。由此，以不锈钢板为离子液体基质的支持物，有效避免外界基质的干扰。
根据本发明的实施例，所述质谱成像检测为MALDI-MSI质谱成像检测。由此，MALDI-MSI质谱成像能同时对特定的区域进行成像和质谱检测，有效解决小分子兽药喹诺酮和磺胺的空间分布检测的难题。
根据本发明的实施例，所述质谱成像检测的检测条件为：质谱检测器：IT-TOF MS质谱检测器；检测模式；阳离子模式。发明人发现，喹诺酮和磺胺易于得质子，在上述正离子模式下，响应强度高，电离背景干净。
根据本发明的实施例，所述质谱成像检测的成像范围为50×50微米。该成像范围恰好是可覆盖不锈钢钢板中每一个点样圈的面积，在保证点样液滴被充分检测的前提下，节省了检测的时间和试剂。
根据本发明的实施例，所述质谱成像检测的成像条件：样品电压：3.5千伏；检测器电压：1.7千伏；激光强度为20。由此，在该检测条件下，检测的分析物以分子离子的形式下出现，背景干净，噪音小。
根据本发明的实施例，所述抗生素为喹诺酮类抗生素和磺胺类抗生素，这两类抗生素是兽药中的首选，具有广谱治疗作用，在肉类中易于残留，对上述两类抗生素的检测，有利于保证食品的安全性
根据本发明的实施例，所述CHCA-对苯二胺复合物中，CHCA与对苯二胺的摩尔比为1:0.5-3。
根据本发明的第五个方面，本发明提供了一种检测待测物中抗生素的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括前述的检测待测物中抗生素的方法中所使用的试剂、标准品、辅助材料或其中至少一项的组合。由此，该试剂盒适用于抗生素的检测，检测的灵敏度高，背景噪音小。其中，需要说明的是，该方法具有前述检测待测物中抗生素的试剂盒全部技术特征和技术效果，在此不再一一赘述。
根据本发明的实施例，所述抗生素为喹诺酮类抗生素和磺胺类抗生素。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。
仪器与材料
Shimadzu Scope/iMScope TRIO仪器进行检测，(日本Shimadzu公司)；
KQ5200V型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；
Milli-Q Reference超纯水机(德国默克密理博公司)；
LEICA CM 1950(德国LEICA公司)；
Vortex-Genie2漩涡混合器(美国Scientific Industries公司)；
SP12Z023红外检测仪器(Thermo Scientific)
甲醇HPLC级别(FISHER)
恩诺沙星、洛美沙星、培氟沙星、加替沙星、左氧氟沙星(Sigma-aldrich)；CHCAmatrix substance for MALDI-MS,≥99.0％(HPLC)(Sigma-aldrich)、对苯二胺(化学纯)，均购自国药集团)；
磺胺二甲唑，磺胺甲噻二唑(Sigma-aldrich)和氢氧化钠溶液，均购自Sigma-aldrich。
实施例1
根据本发明实施例的方法，使用CHCA与对苯二胺合成新型离子液体，并对该离子液体作为MALDI基质应用的可行性和可电离性进行了检测，具体如下：
1、新型离子液体的制备
(1)从CHCA、DHB、DAN和THAP中筛选出检测效果最好的CHCA；
(2)称取10毫克CHCA固体基质，加入到1毫升甲醇中，超声溶解为CHCA甲醇溶液；
(3)称取等摩尔量的对苯二胺，加入到上述CHCA甲醇溶液中；
(4)涡旋10分钟，得到离子液体。
2、离子液体的可电离性检测
对离子液体进行红外检测，结果如图1所示，CHCA-对苯二胺离子液体红外光谱图在1750-1200cm-1处出现宽的双峰，推测具有氢键，羧基峰的消失(1669cm-1)和羧酸盐峰(1580cm-1)的出现说明了CHCA与对苯二胺发生了反应，但是其峰值仍高于CHCA/Na，说明其仍具有电离能力，符合离子液体的特征。
实施例2
利用实施例1制备的CHCA-对苯二胺离子液体对恩诺沙星进行检测，具体如下：
1、恩诺沙星的标品分析
(1)取100毫克的恩诺沙星标品溶于甲醇中，制备得100μg/mL的恩诺沙星甲醇溶液。
(2)取20微升100μg/mL的恩诺沙星甲醇溶液，加入20微升的CHCA-对苯二胺离子液体，涡旋30秒混匀。
(3)取1微升上述混合溶液点在不锈钢靶板上，放置进入质谱成像仪器。
结果如图2所示，说明该基质检测恩诺沙星表现出较高的灵敏度和均一性，以及更好的点对点的重复性，是值得推崇的MALDI基质。
2、探讨恩诺沙星的定量检测能力：
(1)配制20微升不同浓度(5-500μg/mL)的恩诺沙星甲醇溶液,分别与20微升的CHCA-对苯二胺离子液体混合涡旋30秒，然后取其中1微升点于不锈钢靶板上进行检测。
(2)配制20微升不同浓度(10-1000μg/mL)的恩诺沙星甲醇溶液,分别与20微升的CHCA-对苯二胺离子液体混合涡旋30秒，然后取其中0.5微升点于草鱼切片上进行检测。结果如图5所示，该基质用于检测恩诺沙星时线性系数均大于0.99，说明该离子液体基质用于恩诺沙星的定量检测是可行的。
实施例3
利用实施例1制备的CHCA-对苯二胺离子液体对5种喹诺酮类和2种磺胺类兽药的检测通用性进行评价，具体如下:
分别配制100μg/mL的恩诺沙星、左氧氟沙星、加替沙星、培氟沙星、洛美沙星、磺胺二甲唑和磺胺甲噻二唑甲醇溶液，取20微升以上溶液，分别与20微升的CHCA-对苯二胺离子液体和CHCA甲醇溶液混合涡旋30秒，然后取其中1微升点于不锈钢靶板上进行检测以及结果对比。
实验结果如图3和图4所示，使用CHCA-对苯二胺离子液体基质进行检测的恩诺沙星、左氧氟沙星、加替沙星、培氟沙星、洛美沙星、磺胺二甲唑和磺胺甲噻二唑甲醇与使用CHCA基质相比，表现出了更高的灵敏度和均一性。
综上所述，本发明实施例的离子液体基质适用于小分子的检测，检测的灵敏度高，背景噪音小，在生物、医药、食品等领域具有重要应用价值。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种离子液体基质，其特征在于，包括α-氰基-4-羟基肉桂酸-对苯二胺复合物。
2.根据权利要求1所述的离子液体基质，其特征在于，所述α-氰基-4-羟基肉桂酸-对苯二胺复合物中，α-氰基-4-羟基肉桂酸与对苯二胺的摩尔比为1:0.5-3。
3.权利要求1或2所述的离子液体基质在基质辅助激光解吸电离中用于反应基质。
4.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的离子液体基质。
5.一种检测待测物中抗生素的方法，其特征在于，包括：
将所述待测物进行提取处理，以便得到提取物；
将所述提取物与权利要求1或2所述的离子液体基质混合，以便得到混合物；以及
对所述混合物进行质谱成像检测，以便对抗生素进行定性和/或定量检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述混合物置于不锈钢板上进行所述质谱成像检测。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述质谱成像检测为MALDI-MSI质谱成像检测。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述质谱成像检测的检测条件为：
质谱检测器：IT-TOF MS质谱检测器；
检测模式：阳离子模式；
任选地，所述质谱成像检测的成像范围为50×50微米；
任选地，所述质谱成像检测的成像条件：
样品电压：3.5千伏；
检测器电压：1.7千伏；
激光强度为20。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述抗生素为喹诺酮类抗生素和磺胺类抗生素，
任选地，所述α-氰基-4-羟基肉桂酸-对苯二胺复合物中，α-氰基-4-羟基肉桂酸与对苯二胺的摩尔比为1:0.5-3。
10.一种检测待测物中抗生素的试剂盒，其特征在于，包括权利要求5-9所述的检测待测物中抗生素的方法中所使用的试剂、标准品、辅助材料或其中至少一项的组合，
任选地，所述抗生素为喹诺酮类抗生素和磺胺类抗生素。
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