CN103857792A - 组合物及其制造方法 - Google Patents

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宫尾悠
安岛让
冈彻
廖能忠
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Sunstar Giken KK
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates

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Abstract

提供新颖的稳定的蛋白质的组合物、及蛋白质组合物的稳定化方法。组合物：其包含：含有最频粒径是500nm以下的超微细气泡的水和蛋白质；及蛋白质组合物的稳定化方法，其包括将含有最频粒径是500nm以下的超微细气泡的水与蛋白质混合。

Description

组合物及其制造方法
技术领域
本发明涉及组合物，其包含：含有最频粒径是500nm以下的超微细气泡（纳米气泡、也称为NB）的水和蛋白质，及蛋白质组合物的稳定化方法，其包括混合含有最频粒径是500nm以下的超微细气泡的水和蛋白质。
背景技术
酶、抗体、肽等的蛋白质在洗涤剂、工业、化妆品、食品加工、药品、诊断－检查、生物传感器中被广泛利用。由于与粉末相比，蛋白质的水溶性制剂/形态操作性优良等而广被大量地利用酶的业界使用。但是，一般而言，与粉体相比，水溶液中的酶存在明显不稳定而保存性差，无法长期间维持生理活性的问题。以往的不使蛋白质的生理活性降低而提供蛋白质的方法，已知有利用冷冻干燥法等不经热纯化蛋白质提供稳定化的制剂的方法。另外，已知使蛋白质在水溶液中稳定化的方法有：使之含有甘油等的多元醇作为尿酸酶、过氧化酶的稳定剂的方法（专利文献1：特开平6-70798）、向含胆甾醇氧化酶的水溶液添加牛血清白蛋白或葡萄糖等的糖类或赖氨酸等的氨基酸的技术（专利文献2：特开平8-187095）、不限定蛋白质而向水溶液中添加胍盐酸盐、尿素、吡啶等的有机化合物作为稳定剂的技术（专利文献3：特开2011-67202）等。
但是，这些的公知技术存在下述几个问题。例如，因为冷冻干燥法的脱水而变性的蛋白质无法使用，和干燥步骤中因为发生吸湿或氧化导致变质等问题，此外，由于有必要重新调节酶的水溶液而导致烦琐。使蛋白质在水溶液中稳定的技术有：为了使尿酸酶、过氧化酶稳定而使用多元醇的方法、和为了使胆甾醇氧化酶水溶液稳定而使用牛血清白蛋白或糖类或氨基酸的方法，任何一个方法都是稳定特定的蛋白质的方法，其存在缺乏广泛使用性的问题。另外，为稳定蛋白质水溶液而使用胍盐酸盐等有机化合物的方法虽有广泛使用性，但当该酶与其他物质制成混合制剂时，有一旦含与有机化合物反应的物质就不能使用的问题，另外，由于添加浓度也不得不调节为适当的浓度而导致烦琐。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:特开平6-70798
专利文献2:特开平8-187095
专利文献3:特开2011-67202
发明内容
发明要解决的技术问题
本发明以提供无上述的问题的、新颖的稳定的蛋白质的组合物、及蛋白质的稳定化方法作为目的。
解决问题的技术方案
为解决上述问题，反复锐意研究的结果，通过混合含有超微细气泡的水和蛋白质，发现得到稳定的蛋白质组合物，从而完成本发明。
本发明提供组合物，其包含：含有最频粒径是500nm以下的超微细气泡的水和蛋白质。另外本发明提供包含上述的含有超微细气泡的水和蛋白质的上述的组合物，其中超微细气泡的最频粒子浓度是100万个/ml以上。还有，本发明提供包含含有超微细气泡的水和蛋白质的上述的组合物，其中粒径1000nm以下的气泡的粒子浓度是5000万个/ml以上。
此外，本发明提供了包括将含有最频粒径500nm以下的超微细气泡的水与蛋白质混合步骤的蛋白质组合物的稳定化方法。另外本发明提供了包括将最频粒径是500nm以下的、超微细气泡的最频粒子浓度是100万个/ml以上的含有超微细气泡的水与蛋白质混合的步骤的蛋白质组合物的稳定化方法。还有，本发明提供包括将最频粒径是500nm以下的、粒径1000nm以下的气泡的粒子浓度是5000万个/ml以上，任意地超微细气泡的最频粒子浓度可为100万个/ml以上的含有超微细气泡的水与蛋白质混合步骤的蛋白质组合物的稳定化方法。
在本发明中，上述超微细气泡内部虽不限于这些，但可为选自空气、氧、氢、氮、二氧化碳气体、氩、氖、氙、氟化气体及惰性气体的1种或2种以上的气体。
作为可在本发明的蛋白质组合物中使用的蛋白质，虽不特别限定，但可举出酶、动物来源蛋白质、鱼来源蛋白质、植物来源蛋白质、重组蛋白质、酶、抗体、肽等，如可使用例如以下的蛋白质：
酶类：作为酶类，可使用氧化还原酶（胆甾醇氧化酶、葡萄糖氧化酶、抗坏血酸氧化酶、多酚氧化酶、过氧化物酶等）；转移酶（酰基转移酶、磺基转移酶、转葡萄糖苷酶等）；水解酶（蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、等）；添加脱离酶（果胶裂合酶等）；异构化酶（葡萄糖异构酶等）；合成酶（脂肪酸合酶、磷酸合酶、柠檬酸合酶、透明质酸裂合酶、碳酸脱水酶等）。
重组蛋白质：作为重组蛋白质，可使用蛋白制剂（干扰素α、生长激素、胰岛素、血清白蛋白）、疫苗等。
抗体：作为抗体，可使用单克隆抗体及多克隆抗体。
肽：作为肽，不特别限定氨基酸，可使用二肽、三肽、多肽等。
在优选的实施方式中，蛋白质可为水溶性蛋白质，更优选为，蛋白质可为酶，再优选为，蛋白质可为水溶性的酶，最优选为，选自过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、及脂肪酶中的至少1种。
所使用的蛋白质的量随蛋白质的种类、用途等而变化。优选的量可通过实验适宜确定，一般而言可使用1ng/ml～300mg/ml、优选为10ng/ml～100mg/ml、再优选为30ng/ml～50mg/ml的范围。
本发明中使用的水不限于这些，但可选自：自来水、纯化水、离子交换水、纯水、超纯水、去离子水、蒸馏水、缓冲液、清洁水、天然水、过滤水、高纯水、饮用水及电解水。
另外，也可加水溶性溶剂、例如醇、二醇、甘油、醚、酮、酯等。
发明效果
包含本发明的蛋白质的组合物的稳定性优良，特别是具有对pH的变化稳定的pH稳定性、降低温度影响的温度稳定性、及降低光影响的光稳定性优良的效果。
附图说明
图1:是显示含有超微细气泡的水中的气泡的粒径分布的测定结果的图。
图2:是显示日本药局方纯化水中的气泡的粒径分布的测定结果的图。
图3:是显示过氧化氢酶稳定性测定试验的结果的图。
图4:是显示脂肪酶稳定性测定试验的结果的图。
实施方式
本发明中使用的超微细气泡的最频粒径是500nm以下，优选为，最频粒径是300nm以下，再优选为最频粒径是150nm以下，最优选为最频粒径是100nm以下，最频粒径的气泡的粒子浓度优选为100万个/ml以上、再优选为300万个/ml以上、再优选为500万个/ml以上、再优选为700万个/ml以上、再优选为1000万个/ml以上、再优选为5000万个/ml以上、再优选为9000万个/ml以上、再优选为1亿个/ml以上、再优选为5亿个/ml以上、最优选是9亿个/ml以上。
在本发明中，总粒子浓度优选为5000万个/ml以上、再优选为7000万个/ml以上、再优选为8000万个/ml以上、再优选为1亿个/ml以上、再优选为6亿个/ml以上、再优选为10亿个/ml以上、再优选为30亿个/ml以上、再优选为50亿个/ml以上、再优选为70亿个/ml以上、再优选为100亿个/ml以上、再优选为200亿个/ml以上、再优选为500亿个/ml以上、最优选可为700亿个/ml以上。在再优选的实施方式中，几乎不存在1000nm以上的气泡。
本发明中使用的超微细气泡的粒径由于非常小，无法用通常的粒度分布测定装置正确地测定。因此，本说明书中利用由纳米粒子解析系统NanoSight系列（NanoSight公司制）测定的数值。纳米粒子解析系统NanoSight系列（NanoSight公司制）测量纳米粒子的布朗运动的速度，从其速度算出粒径。最频粒径可由存在的粒子的粒径分布确认，是指个数变成极大值之时的粒径。
再有，本发明中的超微细气泡的粒径及个数是指在组合物配合后24小时的时间点测定的数值。
再有，本申请发明的组合物不限于这些，还可含防腐剂及稳定剂等添加剂。作为防腐剂，虽不限于这些，但可使用例如聚六亚甲基双胍及对羟基苯甲酸酯等。另外作为稳定剂，虽不限于这些，但可使用例如糖类、抗生素物质、氨基糖苷、有机酸、辅酶、及氨基酸等。另外，本申请发明的组合物可含表面活性剂。表面活性剂不仅包括含水不溶性物质或水难溶性物质的添加剂的情况，在使用水溶性的添加物时，也可根据使用条件等适宜添加。
超微细气泡表面的ζ电位影响气泡的稳定性。本发明中使用的超微细气泡表面带电，其ζ电位的绝对值为5mV以上、优选为7mV以上、更优选为10mV以上、再优选为20mV以上、再优选为25mV以上、最优选是30mV以上。另外，ζ电位的绝对值由于与溶液的粘度系数/溶液的介电常数成比例，因此认为越在低温条件下将含有超微细气泡的水与蛋白质混合，稳定性越高。
本发明中使用的超微细气泡可由任意的公知的手段、例如静态混合器式、文丘里式、空化式、蒸气凝集式、超声波方式、旋涡流方式、加压溶解方式、微细孔方式发生。优选的气泡的发生方法是气液混合剪切方式。
作为对于由气液混合剪切方式发生超微细气泡的有用的装置，可举出例如专利第4118939号中公开的装置。在此装置中，导入到流体旋涡室内的气液混合流体的多数与如在前述的以往装置中单纯地流向吐出口不同，而是先向与吐出口的方向反对方向作为旋涡流前进。然后，该旋涡流由第1端壁部件反转，从该第1端壁部件向第2端壁部件前进，但此时的旋涡旋转半径相比向第1端壁部件之时变小，所以其流速变快，从而，向该液体内含的气体的剪切力变大，促进其微细化。
通过将蛋白质的水溶液由超微细气泡发生装置处理，在水溶液中发生超微细气泡，可制造蛋白质溶解在水中的本发明的组合物。另外，通过向含有超微细气泡的水溶解蛋白质也可制造本发明的组合物。上述的含有超微细气泡的水可具有如前述的最频粒径及个数。
本说明书中的本发明的说明及实施例的记述仅用于本发明的各种各样的例示的实施方式的详细的说明，本领域技术人员在不脱离本发明的范围的情况下，可对本说明书中公开的实施方式进行各种各样的改良及变更。从而，本说明书的记载不以任何方式限制本发明的范围，本发明的范围由专利权利要求的记载确定。
实施例
实施例1
含有大气的超微细气泡的水的调节
由作为由气液混合剪切方式的超微细气泡发生装置的株式会社协和机械设备制造的“BUVITAS”，使用日本药局方纯化水，产生超微细气泡。将生成的超微细气泡的粒径由纳米粒子解析系统NanoSight系列（NanoSight公司制）测定。测定结果示于图1。图的横轴示nm单位的粒径，纵轴示每1ml的NB粒子数（纳米气泡粒子数）（106个/ml）。另外，图2示对日本药局方纯化水的微细气泡的测定结果。
生成的含有超微细气泡的水的最频粒径是86nm、在最频粒径的粒子浓度是7.57×106个/ml、总粒子浓度是6.86×108个/ml。
对于日本药局方纯化水而言，粒子浓度非常地少，未见到正态分布，由此判断测定结果是噪声。
在以下的实施例中，含有大气的超微细气泡的水与上述同样地调节，作为空白的比较例，代替含有大气的超微细气泡的水，采用了使用日本药局方纯化水的水。
1.过氧化物酶在20℃、50℃的10天的稳定性
向含有大气的超微细气泡的水加链霉亲和素过氧化物酶至成50ng/ml，向管中各分别注入1.0ml，在20、50℃的条件下密闭保存1、3和10天。接下来，向保存的链霉亲和素过氧化物酶水溶液100μl加100μl如下调节的底物液而显色。
底物液的调节方法
将由下述成分组成的试剂混合而得到底物液。
o-苯二胺片（SIGMA-ALDRICH公司制）：1个
70mM柠檬酸缓冲液（柠檬酸-磷酸钠；pH5.0）：12.5ml
过氧化氢液：5μl
（酶浓度及酶活性残留率的算出方法）
向样品加50μl4NH2SO4溶液，停止显色反应之后，用酶标仪（ThermoFisherScientific株式会社制）测定在492nm处的吸光度（A492）。酶浓度由使用链霉亲和素过氧化物酶制成的标准曲线求出。另外，以样品的初期酶活性作为A、以保存后的酶活性作为B，由下式算出“酶活性残留率”。
酶活性残留率（%）=（1-（A-B）/A）×100
再有，在最频粒径的浓度计算为在最频粒径的浓度测定值（106个/ml）×测定时的稀释倍率。另外，总粒子浓度计算为在总粒子浓度的浓度测定值（108个/ml）×测定时的稀释倍率。
结果示于下述的表1和表2。
表1
Figure BDA0000487859340000081
表2
Figure BDA0000487859340000082
实施例1～3显示于20℃保存1天、3天和10天时的结果，实施例4～6显示于50℃保存1天、3天和10天时的结果。在20℃的比较显示，酶残留率显著地升高。另外，在50℃的结果也非常地优良。
2.酶对热（80℃）的稳定性
（酶液的制备）
向含有大气的超微细气泡的水加链霉亲和素过氧化物酶至成50ng/ml，向管内各分别注入1.0ml，在80℃的条件下密闭保存30分钟。此时，将含有超微细气泡的水的最频粒子浓度各自调节成106个/ml（实施例7和8）、107个/ml（实施例9和10）、108个/ml（实施例11和12）。
接下来，向保存的链霉亲和素过氧化物酶水溶液100μl加100μl调节的下述试剂（底物液）而显色。
（底物液的制备）
将由下述成分组成的试剂混合而得到底物液。
o-苯二胺片（SIGMA-ALDRICH公司制）：1个
70mM柠檬酸缓冲液（柠檬酸-磷酸钠pH5.0）：12.5ml
过氧化氢液：5μl
酶浓度和酶活性残留率的计算方法
向样品加50μl的4N H2SO4溶液而停止显色反应之后，用酶标仪（ThermoFisherScientific株式会社制）测定在492nm处的吸光度。酶浓度由使用链霉亲和素过氧化物酶制成的标准曲线求出。另外，以样品的初期酶活性作为A、以保存后的酶活性作为B，由下式算出“酶活性残留率”。
酶活性残留率（%）=（1-（A-B）/A）×100
结果示于下表3。
显示总粒子浓度的增大提供更优良的结果。
再有，在实施例8中，酶残留率是0.0%，在实施例10中，酶残留率成15.2%。尽管与比较例相比，结果升高，但在80℃经80分钟的条件下，如在实施例12中，认为数亿个的最频粒径浓度和数百亿个的总粒子浓度是优选的。
表3
Figure BDA0000487859340000091
3.酶对pH的稳定性
使用含有大气的超微细气泡的水调节柠檬酸缓冲液（pH4.6）、醋酸缓冲液（pH5.7）、磷酸缓冲液（pH7.0）、硼酸缓冲液（pH8.9），向其中各自加链霉亲和素过氧化物酶使之为50ng/ml。将其向管内各自分别注入1.0ml，在80℃的条件下密闭保存20分钟。向链霉亲和素过氧化物酶水溶液100μl加100μl调制的下述试剂（底物液）而显色。
（底物液的调制）
将由下述成分组成的试剂混合而得到底物液。
o-苯二胺片（SIGMA-ALDRICH公司制）：1个
70mM柠檬酸缓冲液（柠檬酸-磷酸钠pH5.0）：12.5ml
过氧化氢液：5μl
（酶浓度和酶活性残留率的计算）
向样品加50μl的4N H2SO4溶液而停止显色反应之后，用酶标仪（ThermoFisherScientific株式会社制）测定在492nm处的吸光度。酶浓度由使用链霉亲和素过氧化物酶制成的标准曲线求出。另外，以样品的初期酶活性作为A、以保存后的酶活性作为B，由下式算出“酶活性残留率”。
酶活性残留率（%）=（1-（A-B）/A）×100
结果示于下表4。
本发明显示在广范的pH范围提供优良的稳定性。
表4
Figure BDA0000487859340000101
4.蛋白酶的热（80℃）稳定性
【酶液的调制】
向含有大气的超微细气泡的水中加蛋白酶使之为10mg/ml，于80℃放置30分钟之后，向管各分注990μl。加10μl偶氮酪蛋白Tris-Cl（AzocaseinTris-Cl）（1.3M）、CaCl2（20mM）溶液至成0.05（w/v）%，用设定为60℃的加热器（大和科学株式会社制）密闭保存30分钟。
接下来，添加1.1ml的10%（w/v）三氯醋酸，于25～27℃的室温下等待30分钟，停止反应。为了分离沉淀的蛋白质，以13000×g离心10分钟，将上清1ml在别的已放入1ml的1M NaOH的管中显色。
（酶活性及酶活性残留率的计算方法）
使用调节的酶液，用酶标仪（ThermoFisherScientific株式会社制）测定在450nm处的吸光度（A450）。另外，对于空白，也与上述同样地测定在450nm处的吸光度（A450b），使用下式算出“酶活性”。
酶活性（U/ml）=（A450-A450b）/（0.001×30）
＊1单位（U）的蛋白酶活性被定义为“在450nm处的吸光度每1分钟增加0.001”。
接下来，以样品的初期酶活性作为A、以保存30分钟的样品的酶活性作为B，由下式算出“酶活性残留率”。
酶活性残留率（%）=（1-（A-B）/A）×100
结果示于下表5。
本发明显示，对于蛋白酶也得到优良的热稳定性。
表5
Figure BDA0000487859340000111
5.过氧化氢酶的稳定性
（试验方法）
（1）将过氧化氢酶用纯化水或含有超微细气泡的水（最频粒径；100nm、最频粒子浓度；8.77×106/ml、粒径1000nm以下的总粒子浓度；6.18×108/ml）调节为1mg/ml（3809Unit/ml）水溶液。
（2）将分注于微管的过氧化氢酶水溶液1ml用热振荡器（500rpm）在62.5℃温育指定时间（20、30、40、50分钟）。其后，用离心分离器（14000rpm×5分钟）进行沉淀处理。
（3）在管中取处理的过氧化氢酶水溶液的上清100μL、3%过氧化氢水200μL、磷酸缓冲液（500Mm·pH5.8）200μL和纯化水100μL而于室温反应15分钟。
（4）反应之后，为了使酶完全失活而于100℃热处理5分钟。
（5）分取100μL反应液，测定在290nm处的吸光度。由测定的吸光度，使用标准曲线算出过氧化氢分解率。
结果示于图3。
6.脂肪酶的稳定性
（试验方法）
（1）将脂肪酶用纯化水或含有超微细气泡的水（最频粒径；113nm、最频粒子浓度；36.4×106/ml、粒径1000nm以下的总粒子浓度；20.9×108/ml）调节为0.02mg/ml（23.52Unit/ml）水溶液。
（2）将调节的脂肪酶水溶液于70℃温育5分钟。
（3）将处理的脂肪酶水溶液50μL、用下记方法调节的底物液100μL、Tris盐酸缓冲液（pH8.2）50μL于室温反应指定时间。
分离反应液，测定在410nm处的吸光度。
结果示于图4。
（底物液的调制）
向纯化水100ml混合0.0135g的p-硝基苯基月桂酸酯、0.017g的十二烷基硫酸钠、1.0g的Triton X-100，于65℃水溶之后冷却。

Claims (12)

1.组合物，其包含蛋白质和含有最频粒径在500nm以下的超微细气泡的水。
2.权利要求1所述的包含蛋白质和含有超微细气泡的水的组合物，其中超微细气泡的最频粒子浓度是100万个/ml以上。
3.权利要求1～2中任一项所述的包含蛋白质和含有超微细气泡的水的组合物，其中粒径1000nm以下的气泡的粒子浓度是5000万个/ml以上。
4.权利要求1～3中任一项所述的组合物，其中上述超微细气泡由选自空气、氧、氢、氮、二氧化碳气体、氩、氖、氙、氟化气体及惰性气体的1种或2种以上的气体形成。
5.权利要求1～4中任一项所述的组合物，其中上述蛋白质是酶。
6.权利要求5所述的组合物，其中上述酶是过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、或者脂肪酶。
7.蛋白质组合物的稳定化方法，其包括将含有最频粒径是500nm以下的超微细气泡的水与蛋白质混合。
8.蛋白质组合物的稳定化方法，其包括将含有最频粒径是500nm以下，最频粒子浓度是100万个/ml以上的超微细气泡的水与蛋白质混合。
9.蛋白质组合物的稳定化方法，其是权利要求7或8所述的蛋白质组合物的稳定化方法，其中含有超微细气泡的水的粒径1000nm以下的气泡的粒子浓度是5000万个/ml以上。
10.权利要求7～9中任一项所述的蛋白质组合物的稳定化方法，其中上述超微细气泡内包选自空气、氧、氢、氮、二氧化碳气体、氩、氖、氙、氟化气体及惰性气体的1种或2种以上的气体。
11.权利要求7～10中任一项所述的蛋白质组合物的稳定化方法，其中上述蛋白质是酶。
12.权利要求11所述的蛋白质组合物的稳定化方法，其中上述酶是过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、或者脂肪酶。
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