CN103857384B - 用于合成卟啉‑磷脂结合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种包括卟啉‑磷脂结合物双层的纳米囊泡。每个卟啉‑磷脂结合物包括共价连接到脂质侧链的一个卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物，该脂质侧链位于一个磷脂的sn‑1或sn‑2位中的一个。另外，该纳米囊泡具有限定的sn‑1∶sn‑2卟啉‑磷脂结合物的结构异构体比率。

Description

用于合成卟啉-磷脂结合物的方法
技术领域
本发明的领域涉及用于合成和提纯卟啉-磷脂结合物(porphyrin-phospholipidconjugate)的方法，且更具体地涉及具有限定的异构体纯度的卟啉-磷脂结合物组合物的合成和提纯。该卟啉-磷脂结合物组合物特别适合用来形成纳米囊泡。
背景技术
近来，在WO11/044671中描述了卟啉体(Porphysome)；是由卟啉-磷脂结合物形成的纳米囊泡，其是具有固有多模态的用于生物光子成像和治疗的生物相容的纳米颗粒。1修饰的磷脂已被证实可用于不同的生物技术应用，包括核酸递送(阳离子脂质)、诊断成像(放射性同位素-螯合脂质)、生物现象研究(荧光脂质)、以及药代动力学调制(PEG化脂质)和结构(可聚合脂质)。2-4磷脂可在其首基(head group)或侧链上的各个位置被标记。5使用磷脂酰乙醇胺的伯氨基团可以容易地实现首基修饰。侧链修饰不太容易，但在保持磷脂两性分子特性的同时，适合用于结合更疏水的配体。近年来，用胆固醇、视黄酸和卟啉侧链修饰的磷脂已被研发，其具有用于给药、免疫学和生物光子应用的有用性能。1，6-9
单侧链修饰的磷脂的合成通常受酰基转移的影响。所得的结构异构体(参见图1A)有相似的结构，这使得使用如HPLC、NMR和质谱技术使它们无法分离且使它们的检测很难或不可能。10结构选择性磷脂侧链修饰已使用多种技术实现。修饰的磷脂的合成已使用修饰的甘油基骨架以多步反应进行，有时需要保护基。6，9，11根据方法和催化剂，溶血磷脂与脂肪酸酰氯、咪唑、酸酐和硫代吡啶酯的酰化作用已经实现了不同的异构体纯度(70％至99％)和产率(40％至90％)。12，13然而，这些反应中间体的产生可引起降解反应且可能无法产生满意的产率和异构体纯度。羧酸用标准的偶联剂对溶血磷脂的直接酰化是方便的合成路线，且已报道了旨在减少酰基转移如用玻璃珠声波处理(sonication)的实验方案。14
发明内容
一方面，提供了包括卟啉-磷脂结合物双层的纳米囊泡，其中，每个卟啉-磷脂结合物包括共价连接到脂质侧链的一个卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物，该脂质侧链位于一个磷脂的sn-1或sn-2位中的一个，该纳米囊泡具有限定的sn-1∶sn-2卟啉-磷脂结合物的结构异构体比率(regioisomeric ratio)。
另一方面，提供了卟啉-磷脂结合物的组合物，其中，卟啉-磷脂结合物包括共价连接到脂质侧链的一个卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物，该脂质侧链位于一个磷脂的sn-1或sn-2位中的一个，其中该组合物有限定的sn-1∶sn-2卟啉-磷脂结合物的结构异构体比率。
另一方面，提供了由卟啉-磷脂结合物的sn-1和sn-2结构异构体的混合物生产卟啉-磷脂结合物的组合物的方法，每个所述结构异构体包括共价连接到脂质侧链的一个卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物，该脂质侧链位于一个磷脂的sn-1或sn-2位中的一个，其中该组合物具有限定的sn-1∶sn-2卟啉-磷脂结合物的结构异构体比率，该方法包括用酶温育结构异构体的混合物直到达到所限定的结构异构体比率，该酶选择性裂解sn-1或sn-2结构异构体中的一个。
根据另一方面，提供了用于从包含卟啉-磷脂结合物sn-1和sn-2结构异构体混合物的组合物中除去卟啉-磷脂结合物sn-1和sn-2结构异构体中的一个的方法，该方法包括酶催化裂解卟啉-磷脂结合物的sn-1和sn-2结构异构体中的一个。
另一方面，提供了用于由卟啉-磷脂结合物的sn-1和sn-2结构异构体的混合物生产卟啉-磷脂结合物的组合物的方法，每个所述结构异构体包括共价连接到脂质侧链的一个卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物，该脂质侧链位于一个磷脂的sn-1或sn-2位中的一个，其中该组合物具有限定的sn-1∶sn-2卟啉-磷脂结合物的结构异构体比率，该方法包括改变卟啉和磷脂结合反应的原料比。
另一方面，提供了用于由卟啉-磷脂结合物的sn-1和sn-2结构异构体的混合物生产卟啉-磷脂结合物的组合物的方法，每个所述结构异构体包括共价连接到脂质侧链的一个卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物，该脂质侧链位于一个磷脂的sn-1或sn-2位中的一个，其中该组合物具有限定的sn-1∶sn-2卟啉-磷脂结合物的结构异构体比率，该方法包括用有机萃取提纯该混合物并接着使用硅胶层析法提纯。
另一方面，提供了用于由卟啉-磷脂结合物的sn-1和sn-2结构异构体的混合物生产卟啉-磷脂结合物的组合物的方法，每个所述结构异构体包括共价连接到脂质侧链的一个卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物，该脂质侧链位于一个磷脂的sn-1或sn-2位中的一个，其中该组合物具有限定的sn-1∶sn-2卟啉-磷脂结合物的结构异构体比率，该方法包括用有机萃取提纯该混合物并接着使用二醇基硅胶提纯。
附图说明
本发明优选实施方式的这些和其他特征将在参考附图的以下具体实施方式中变得更明显，其中：
图1示出了A)酰基转移的焦脱镁叶绿酸-脂质(pyro-lipid)结构异构体的合成；B)使用HPLC检测异构体；以及C)对应于原料比的结构异构体产物的比率。
图2示出了选择性裂解各个焦脱镁叶绿酸-脂质结构异构体的两种酶的鉴别。A)用不同酶温育sn-1和sn-2焦脱镁叶绿酸-脂质溶液(未处理的)后的异构体含量。使用的缩写为：PL：磷脂酶；H.B.V：蜜蜂毒液；T.L：疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)；R.M：米黑根毛酶(Rhizomucor miehei)；P.C.：洋葱假单胞菌；C.R.：皱褶念珠菌(Candidarugosa)；LPL，P：脂蛋白脂肪酶，假单胞菌；PLD，P：磷脂酶D，花生；B.S.：嗜热脂肪芽孢杆菌。sn-2和sn-1异构体的量的差别分别用蓝色和红色示出。B)在可以分解各个结构异构体的酶筛选中鉴别出的两个目标的动力学分析。
图3示出了两种焦脱镁叶绿酸-脂质结构异构体形式的卟啉体。卟啉体用指定比率的sn-2或sn-1焦脱镁叶绿酸-脂质形成且经受TEM(左)。所示比例尺为100nm。相应卟啉体的荧光光谱在右侧示出，完好卟啉体的光谱用虚线示出以及洗涤剂破坏后的光谱用实线示出。
图4示出了几百毫克级的sn-2焦脱镁叶绿酸-脂质的制备。星号表示酰基转移的结构异构体。
图5示出了sn-2焦脱镁叶绿酸-脂质卟啉体用于光热治疗的用途。带有KB异种移植(xenograft)的裸鼠静脉注射40mg/kg的sn-2焦脱镁叶绿酸-脂质卟啉体或盐水，24小时后，用700mW激光(0.8cm2光点大小)使癌症经受激光治疗60秒。当肿瘤直径达到1cm时裸鼠死亡。每组N＝5。
图6是卟啉-磷脂结合物异构体构成的卟啉体的示意图。
图7示出了两种焦脱镁叶绿酸-脂质异构体的质谱和吸收光谱。
图8示出了焦脱镁叶绿酸-脂质异构体(在d-DMSO中)的NMR特征。具有断裂的酰基链的sn-1(A)和sn-2(B)焦脱镁叶绿酸-脂质的HPLC踪迹、结构和1H NMR光谱。光谱上标记了被标示的甘油的氢的化学位移。(C)标示的酰基链断裂的焦脱镁叶绿酸-脂质异构体的COSY光谱。(Di)示出了具有指定质子的sn-1焦脱镁叶绿酸-脂质异构体的NOSEY光谱。(Dii)示出了具有指定质子的sn-2焦脱镁叶绿酸-脂质异构体的NOSEY光谱。
图9示出了卟啉体的动态光散射粒度分布。
图10示出了光热治疗过程中肿瘤的温度。带有KB肿瘤的裸鼠静脉注射卟啉体(黑色)或盐水(灰色)。24小时后，裸鼠被麻醉并暴露到671nm的激光。数据表示对于每组n＝5的最大肿瘤温度的+/-S.D.平均值。
具体实施方式
具有卟啉侧链的磷脂可自组装形成卟啉体，一类新的光学活性的纳米囊泡。溶血磷脂的sn-2羟基的酰化对此类侧链修饰的磷脂是有吸引力的路线，但会产生酰基转移的结构异构体且感兴趣的配体连接到sn-1位。这里，我们报告了通过酰基转移的结构异构体的酶催化选择制备异构的纯卟啉-脂质结合物。酶筛选从蜜蜂毒液鉴别磷脂酶A2来选择性裂解sn-1卟啉-结合脂质以及从疏绵状嗜热丝孢菌鉴别脂肪酶来选择性裂解sn-2卟啉-结合脂质。两种纯化的结构异构体产生卟啉体纳米囊泡。Sn-2结合卟啉体易于制备且在体内作为有效的光热剂对抗异种移植肿瘤。
存在这里描述的“卟啉体”；由磷脂-卟啉结合物亚单元自组装的有机纳米颗粒，其呈现出脂质体样结构和载荷能力、结构相关的纳米级光传导性能、优异的生物相容性，并具有多样化的生物光子应用的前景。已经描述了其他卟啉囊泡和二嵌段共聚物，其包含卟啉亚单元，但低卟啉密度导致较低的消光系数和特征明显的荧光自猝灭的缺乏，其产生卟啉体的新型特征。
在一些实施方式中，卟啉体包括卟啉-脂质结合双层，该卟啉-脂质结合双层每个卟啉体包括约100,000个卟啉分子。由于它们通过卟啉亚单元形成和稳定，卟啉体可使用一系列细胞靶向部分靶标细胞。卟啉体是高度有用的，具有形成不同类型卟啉的能力，具有螯合不同类型金属的能力，以及具有形成不同大小的能力。另外，卟啉体显示了纳米级特性，且在活化前具有高猝灭和光热传导效率。
本文中描述的纳米囊泡是小的，通常小于200nm，囊泡(即泡或囊)由包括磷脂或其衍生物的双层的膜形成。然而，本领域技术人员使用标准脂质技术也能够产生更大的双层如大单层囊泡或平面脂质双层。
一方面，提供了包括卟啉-磷脂结合物双层的纳米囊泡，其中，每个卟啉-磷脂结合物包括共价连接到脂质侧链的一个卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物，该脂质侧链位于一个磷脂的sn-1或sn-2位中的一个，该纳米囊泡具有限定的sn-1∶sn-2卟啉-磷脂结合物的结构异构体比率。
优选地，纳米囊泡基本上是结构异构体纯的(regioisomerically pure)。更优选地，纳米囊泡中卟啉-磷脂结合物结构异构体的纯度>97％。
在优选的实施方式中，以增加的优选度，该纳米囊泡包括至少15mol％、25mol％、34mol％、45mol％、55mol％、65mol％、75mol％、85mol％和95mol％的卟啉-磷脂结合物。
构造本发明纳米囊泡的卟啉-磷脂结合物包括卟啉、卟啉衍生物和卟啉类似物。示例性卟啉包括血卟啉、原卟啉和四苯基卟啉。示例性卟啉衍生物包括焦脱镁叶绿酸、细菌叶绿素、叶绿素a、苯并卟啉衍生物、四羟基苯基二氢卟酚、红紫素、苯并二氢卟酚、萘并二氢卟酚(napthochlorins)、维尔丁(verdin)、玫红素(rhodin)、酮二氢卟酚(keto chlorin)、氮杂二氢卟酚、菌绿素、甲苯基卟啉(tolyporphyrin)、和苯并菌绿素(benzobacteriochlorin)。卟啉类似物包括扩展的卟啉族成员(如泰萨卟啉(texaphyrin)、萨普卟啉(sapphyrin)、六元卟啉(hexaphyrin))，和卟啉异构体(如卟啉烯(porphycene)、反转卟啉(inverted porphyrin)、酞菁、和萘酞菁)。
优选地，扩展卟啉为泰萨卟啉、萨普卟啉或六元卟啉，且卟啉异构体为卟啉烯、反转卟啉、酞菁、或萘酞菁。
如文中所使用的，“磷脂”是具有带有磷酸基的亲水首基和疏水脂质尾端的脂质。
在一些实施方式中，卟啉-磷脂结合物中的磷脂包括卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇。
优选地，磷脂包括12至22个碳的酰基侧链。
在一些实施方式中，卟啉-磷脂结合物中的卟啉是焦脱镁叶绿酸-a酸。在另一个实施方式中，卟啉-磷脂结合物中的卟啉是细菌叶绿素衍生物。
在一些实施方式中，卟啉-磷脂结合物中的磷脂是1-十六酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱。
在一些实施方式中，卟啉-磷脂结合物是焦脱镁叶绿酸-脂质。
在其他实施方式中，卟啉-磷脂结合物为氧基细菌叶绿素-脂质。
在一些实施方式中，卟啉通过0至20个碳的碳链连接基团结合到磷脂上的甘油基基团。
在一些实施方式中，纳米囊泡进一步包括PEG，优选PEG-脂质，且进一步优选PEG-DSPE。优选地，PEG或PEG-脂质以约5mol％的量存在。
在一些实施方式中，纳米囊泡基本为球形且直径为约30nm至约200nm之间，优选地，直径为约100nm或直径为约30nm。
在一些实施方式中，卟啉-磷脂结合物包括螯合在其中的金属，可选地为金属的放射性同位素，优选Zn、Cu、Pd或Pt。
多种生物活性或治疗剂、药剂物质、或药物可包封在卟啉体内部中。
在一些实施方式中，纳米囊泡进一步包括包封在其中的活性剂，优选治疗剂或诊断剂，优选化疗剂如多柔比星(doxorubicin)。
术语“治疗剂”是本领域公认的且是指生物学上、生理学上或药理学上的活性物质的任何化学部分。在熟知的参考文献中描述了治疗剂(还称为“药物”)的实例，如the MerckIndex、the Physicians Desk Reference、和The Pharmacological Basis ofTherapeutics，并且它们包括但不限于药物；维生素；矿物质补充剂；用于治疗、预防、诊断、治愈或缓解病或疾病的物质；影响身体结构或功能的物质；或在它们已经置于生理环境后变为生物活性的或活性更强的前体药物。可使用各种形式的治疗剂，其能够在给予受试者时从受试者组合物释放到邻近组织或液体。
“诊断的”或“诊断剂”是可用于诊断的任何化学部分。例如，诊断剂包括成像剂，例如，包含放射性同位素的那些如铟或锝；包含碘或钆的对比剂；酶如辣根过氧化物酶、GFP、碱性磷酸酶、或β-半乳糖苷酶；荧光物质如铕衍生物；发光物质如N-甲基吖啶鎓(N-methylacrydium)衍生物等。
在一些实施方式中，纳米囊泡进一步包括靶向分子，优选抗体、肽、适体或叶酸。
“靶向分子”是可引导纳米囊泡到特定目标的任何分子，例如，通过结合至靶细胞表面上的受体或其他分子。靶向分子可为蛋白质、肽、核酸分子、糖类或多糖、受体配体或其他小分子。特异性程度可通过靶向分子的选择调整。例如，抗体通常表现高特异性。这些可以是多克隆的、单克隆的、片段、重组体、或单链，其中许多是市售的或使用标准技术易于获得。
在一些实施方式中，纳米囊泡的双层进一步包括胆固醇，优选在30-50mol％之间的胆固醇。
另一方面，提供了卟啉-磷脂结合物的组合物，其中，卟啉-磷脂结合物包括共价连接到脂质侧链的一个卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物，该脂质侧链位于一个磷脂的sn-1或sn-2位中的一个，其中该组合物具有限定的sn-1∶sn-2卟啉-磷脂结合物的结构异构体比率。
优选地，该组合物基本上是结构异构体纯的。进一步优选地，该组合物中卟啉-磷脂结合物的结构异构体的纯度>97％。
另一方面，提供了用于由卟啉-磷脂结合物的sn-1和sn-2结构异构体混合物生产卟啉-磷脂结合物的组合物的方法，每个所述结构异构体包括共价连接到脂质侧链的一个卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物，该脂质侧链位于一个磷脂的sn-1或sn-2位中的一个，其中该组合物具有限定的sn-1∶sn-2卟啉-磷脂结合物的结构异构体比率，该方法包括用酶温育结构异构体混合物直到达到所限定的结构异构体比率，该酶选择性裂解sn-1或sn-2结构异构体中的一个。
优选地，该组合物基本上是结构异构体纯的。
根据另一方面，提供了用于从包括卟啉-磷脂结合物sn-1和sn-2结构异构体混合物的组合物中除去卟啉-磷脂结合物sn-1和sn-2结构异构体中的一个的方法，该方法包括酶催化裂解卟啉-磷脂结合物的sn-1和sn-2结构异构体中的一个。
在一些实施方式中，所得的组合物基本上是异构体纯的sn-1卟啉-磷脂结合物组合物(因此除去sn-2卟啉-磷脂结合物)且酶优选来自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶(LTL)。
在一些实施方式中，所得的组合物基本上是异构体纯的sn-1卟啉-磷脂结合物组合物(因此除去sn-1卟啉-磷脂结合物)且酶优选来自蜜蜂毒液的磷脂酶A2(PLA2HBV)。
另一方面，提供了用于由卟啉-磷脂结合物的sn-1和sn-2结构异构体的混合物生产卟啉-磷脂结合物的组合物的方法，每个所述结构异构体包括共价连接到脂质侧链的一个卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物，该脂质侧链位于一个磷脂的sn-1或sn-2位中的一个，其中该组合物具有限定的sn-1∶sn-2卟啉-磷脂结合物的结构异构体比率，该方法包括改变卟啉和磷脂结合反应的原料比。
另一方面，提供了用于由卟啉-磷脂结合物的sn-1和sn-2结构异构体的混合物生产卟啉-磷脂结合物的组合物的方法，每个所述结构异构体包括共价连接到脂质侧链的一个卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物，该脂质侧链位于一个磷脂的sn-1或sn-2位中的一个，其中该组合物具有限定的sn-1∶sn-2卟啉-磷脂结合物的结构异构体比率，该方法包括用有机萃取提纯该混合物并接着使用硅胶层析法提纯。
另一方面，提供了用于由卟啉-磷脂结合物的sn-1和sn-2结构异构体的混合物生产卟啉-磷脂结合物的组合物的方法，每个所述结构异构体包括共价连接到脂质侧链的一个卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物，该脂质侧链位于一个磷脂的sn-1或sn-2位中的一个，其中该组合物具有限定的sn-1∶sn-2卟啉-磷脂结合物的结构异构体比率，该方法包括用有机萃取提纯该混合物并接着使用二醇基硅胶提纯。
本发明的优点进一步通过以下实施例说明。本文中阐述的实施例和其它具体细节仅是为了说明呈现且不应解释为对本发明权利要求的限制。
实施例
材料和方法
焦脱镁叶绿酸-脂质的合成
如前所述(Zheng等人，Bioconjugate Chemistry，13-392，2002)，焦脱镁叶绿酸(pyro)衍生自pacifica螺旋藻(spirulina pacifica algae)(Cyanotech)。在标准反应中，107mg的焦脱镁叶绿酸(200umol)在5mL戊烯稳定的氯仿中与98.7mg的16∶0溶血磷脂酰胆碱(1-十六酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，Avanti Polar Lipids#855675)、76.3mgEDC(Sigma)和48.7mgDMAP(Sigma)混合。反应混合物在室温氩气下搅拌24小时。使用2695HPLC/MS Micromass ZQ2000系统(Waters)反向HPLC和质谱法分析所得的焦脱镁叶绿酸-脂质结构异构体产物。使用4.6mm×75mm、3.5μm的Sunfire C8HPLC色谱柱(Waters)，色谱柱以从处于0.1％TFA中的15％乙腈到处于0.1％TFA中的95％的乙腈的梯度以0.5mL/min流速在60℃加热15分钟。焦脱镁叶绿酸-脂质结构异构体经受进一步分析，或可替代地，在加热到40℃使用旋转蒸发器在减压下除去氯仿并进行进一步的酶催化的结构选择。
酶催化的结构选择及随后的焦脱镁叶绿酸-脂质纯化
为了酶筛选，使用来自Sigma的以下酶：来自落花生(花生)的磷脂酶D-II型(PO515)；来自伯克氏菌属(Burkholderia)的脂蛋白脂肪酶(L9656)；来自褶皱念珠菌的脂肪酶，II型(L1754)；来自产气荚膜梭菌的磷脂酶C，I型(P7633)；来自猪肝的酯酶(E3019)；来自猪胰腺的磷脂酶A2(P6534)；来自猪胰腺的脂肪酶(L3126)；来自疏绵状嗜热丝孢菌的磷脂酶A1(L3295)；嗜热脂肪芽孢杆菌酯酶，重组体(69509)；来自洋葱假单胞菌的脂肪酶(62309)；来自米黑根毛酶的脂肪酶(L4277)；来自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶(L0777)；来自蜜蜂毒液的磷脂酶A2(P9279)。为了酶筛选，每次反应酶添加2nmol焦脱镁叶绿酸-脂质，且在50uL的0.025％Triton X100和5mM Tris pH8和10ug的干酶(磷脂酶D、磷脂酶C、脂蛋白脂肪酶、来自褶皱念珠菌的脂肪酶、来自猪肝的酯酶、磷脂酶A2、猪肝脂肪酶)或以液体或悬浮液形式获得的酶(全部其它酶)中在37℃温育3小时。温育后，样品与50uL的DMSO混合，离心以除去任何沉淀的蛋白质并经受如上述的HPLC/MS。在确定来自蜜蜂毒液的磷脂酶A2和来自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶分别为用于裂解sn-1和sn-2结合的焦脱镁叶绿酸-脂质异构体的最佳酶后，每次反应使用2nmol焦脱镁叶绿酸-脂质重新评估这两种酶并在指示的时间点温育。对于具有连接在sn-2位的焦脱镁叶绿酸的焦脱镁叶绿酸-脂质的标准纯化，混合物的干燥的焦脱镁叶绿酸-脂质直接悬浮在5mg/mL的在1mM CaCl2，50mM Tris pH8，0.5％TritonX-100和10％MeOH中的焦脱镁叶绿酸-脂质中。接着以0.1mg/mL浓度加入来自蜜蜂毒液的PLA2，且将溶液在37℃温育24小时。对于具有连接在sn-1位的焦脱镁叶绿酸的焦脱镁叶绿酸-脂质的制备，先纯化sn-1和sn-2焦脱镁叶绿酸-脂质的结构异构体混合物，接着在2.5mg/mL的在0.5％Triton X-100和1mM CaCl2中的焦脱镁叶绿酸-脂质中温育，并通过加入制备的每10mL焦脱镁叶绿酸-脂质含200uL来自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶溶液消化。反应状态用HPLC/MS探测并进行多天，且每天加入另外100uL的脂肪酶。在使用HPLC/MS通过确认不需要的结构异构体消失证实反应完成。加入另外2体积的氯仿和1.25体积的甲醇并从有机层萃取焦脱镁叶绿酸-脂质并在减压40℃下使用旋转蒸发器，除去溶剂。接着焦脱镁叶绿酸-脂质再悬浮在DCM中，并装载到装载有二醇基硅胶(Sorbtech，#52570)的快速层析柱中，每100mg焦脱镁叶绿酸-脂质大约10g干二氧化硅粉末。对焦脱镁叶绿酸-脂质使用Solera快速层析系统(Biotage)，使用处于DCM中的0至10％甲醇梯度。合并被洗脱的部分并在减压下用旋转蒸发器除去溶剂。最后，将焦脱镁叶绿酸-脂质溶解在10mL的20％水和80％的叔丁醇中，在液氮中冷冻，并冻干2-3天。对于Sn-1焦脱镁叶绿酸-脂质，NMR特征如下：
1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ9.22(s，1H)，9.06(s，1H)，8.49(s，1H)，7.89(dd，J＝18.0，11.6Hz，1H)，6.21(dd，J＝18.0，1.2Hz，1H)，6.11(dd，J＝11.6，1.2Hz，1H)，5.21(m，1H)，5.19(d，J＝19.6Hz，1H)，4.99(d，J＝19.6Hz，1H)，4.45(d，J＝17.2Hz，1H)，4.39(q，J＝7.2Hz，1H)，4.29(m，2H)，4.19-4.11(m，2H)，3.94(m，2H)，3.73(m，2H)，3.45(q，J＝9.6，2H)，3.35(s，3H)，3.30(s，3H)，3.26(s，9H)，3.12(s，3H)，2.66-2.55(m，3H)，2.35-2.27(m，1H)2.14(t，J＝7.6Hz，3H)，1.77(d，J＝7.6Hz，3H)，1.55(t，J＝7.6，3H)，1.33(m，2H)，1.33-0.93(m，31H)，0.85(t，J＝6.8Hz，3H)，0.23(br，1H)，-1.84(br，1H)；
13C NMR(CDCl3，100MHz)：δ196.1，173.1，172.9，171.3，160.2，155.1，150.6，148.8，144.8，141.4，137.5，136.1，135.9，135.7，131.5，130.1，129.1，127.8，122.4，105.8，103.7，97.0，93.0，70.4，70.3，68.3，66.5，63.5，63.3，59.2，54.5，51.6，49.9，48.0，34.2，32.9，30.9，29.7，29.6，29.6，29.6，29.6，29.5，29.4，29.3，29.1，28.9，24.7，23.1，22.6，19.2，19.0，17.3，14.1，12.0；
对于Sn-2焦脱镁叶绿酸-脂质，NMR特征如下：
1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ9.08(s，1H)，8.89(s，1H)，8.45(s，1H)，7.78(dd，J＝18.0，11.6Hz，1H)，6.14(d，J＝18.0Hz，1H)，6.04(dd，J＝11.6Hz，1H)，5.31(m，1H)，5.13(d，J＝19.6Hz，1H)，4.97(d，J＝19.6Hz，1H)，4.41(m，3H)，4.24(m，2H)，4.18(m，2H)，4.00(t，J＝6.4Hz，2H)，3.66(m，2H)，3.34(q，J＝7.5Hz，2H)，3.29(s，3H)，3.21(s，12H)，3.03(s，3H)，2.81(s，1H)，2.64(q，J＝6.8Hz，2H)，2.41(m，1H)，2.16(t，J＝7.1Hz，2H)，2.05(m，1H)，1.75(d，J＝7.2Hz，3H)，1.49(t，J＝7.6Hz，3H)，1.41(p，J＝6.9Hz，2H)，1.29-0.89(m，31H)，0.85(t，J＝6.8Hz，3H)，-0.07(br，1H)，-1.97(br，1H)；
13C NMR(CDCl3，100MHz)：δ196.4，173.5，172.6，171.4，160.3，154.9，150.4，148.7，141.4，137.4，136.0，135.8，135.6，131.4，122.3，105.7，103.6，96.9，93.0，72.9，41.2，41.2，66.3，66.2，63.9，63.6，63.5，62.8，59.3，51.5，49.9，48.0，43.0，39.1，31.9，31.1，29.8，29.6，29.6，29.6，29.5，29.4，29.3，29.3，29.1，29.0，24.7，23.1，22.6，19.2，17.3；
为了确认异构体的身份，在0.5％Triton-X100和1mM CaCl2中，sn-1焦脱镁叶绿酸-脂质用来自蜜蜂毒液的磷脂酶A2消化且sn-2焦脱镁叶绿酸-脂质用来自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶消化。在37℃温育过夜后，使用2体积氯仿和1.25体积甲醇萃取裂解产物。有机溶剂通过旋转蒸发器除去，并将裂解部分再悬浮在处于DCM中的1％的MeOH中，并用小二醇基二氧化硅柱纯化，裂解部分在比焦脱镁叶绿酸-脂质更高浓度的MeOH中(约8％)洗脱。干燥溶剂并经受d-DMSO400MHz NMR。NMR光谱在支持图2中示出。
卟啉体的形成和表征
将异构体纯的焦脱镁叶绿酸-脂质、胆固醇(Avanti Polar Lipids)以及二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-甲氧基(聚乙二醇)(PEG-2000-PE，Avanti Polar Lipids)溶解在氯仿中。为了表征研究，在硅酸硼试管中分散形成0.5mg的95％焦脱镁叶绿酸-脂质(标示的结构异构体组合物的)和5％PEG-2000-PE的薄膜，在氮气流下干燥，接着在真空下除去剩余的氯仿。将脂质薄膜用磷酸盐缓冲溶液(150mM NaCl，10mM磷酸盐PH7.4)再水化，并使用液氮冷冻接着在65℃水浴中融解经受5个冻融循环。然后卟啉体用微型挤出机(Mini-Extruder)(Avanti Polar Lipids)通过100nm的聚碳酸酯膜挤出15次。在纳米粒度仪(Nanosizer)(Malvem)上进行尺寸测量。使用Fluoroxmax荧光计(Horiba Jobin Yvon)记录荧光的自猝灭。将卟啉体溶液在PBS中稀释到2.5ug/mL，并在2nm狭缝宽度在420nm下激发。测量发射并在1nm狭缝宽度从600nm整合至800nm。用相同浓度的100nm卵磷脂(eggphosphatidyl choline)：胆固醇(3∶2摩尔比)脂质体进行背景消除。使用由1％的醋酸铀负染色的卟啉体使用H-7000透射式电子显微镜(Hitachi)进行透射式电子显微。对于体内的光热研究，通过混合65mol％卟啉-磷脂和30mol％胆固醇及5mol％溶解在氯仿中的PEG-2000-PE制备5mg脂质薄膜，且在氮气流下渐渐干燥，并进一步在真空下干燥1小时。然后将脂质薄膜在1mL PBS中再水化并经受5个冻融循环以获得卟啉体悬浮液。使用10mLLIPEXTM热筒挤出机(Thermobarrel Extruder)(Catalogue#T.005，Northen Lipids公司，CA)将悬浮液通过100nm孔径聚碳酸酯膜(Avanti Polar Lipids)在700psi(4826kPa)氮气下挤出10次。用循环水浴将温度精确控制在70℃。光热治疗
对于光热治疗，通过注射2x106个细胞(cell)到鼠右翼，KB肿瘤在雌性裸鼠内生长。当肿瘤直径达到4～5mm时，通过鼠尾静脉注射42mg kg-1的含30mol％胆固醇和5mol％PEG-2000DSPE的卟啉体。注射后24h，用2％(v/v)异氟烷(isofluorane)麻醉鼠，且用在671nm下具有700mW输出的光点直径为8mm的激光(671nm2W DPSS激光器，LaserGlowTechnologies)照射肿瘤，用红外摄像机(Mikeospec)记录肿瘤温度。每天测量肿瘤体积，一旦肿瘤直径达到10mm，对鼠实行安乐死。
结果与讨论
在酰化反应中使用1∶1∶2∶2摩尔比的焦脱镁叶绿酸∶脂质∶DMAP∶EDC将焦脱镁叶绿酸-a(pyro)结合到溶血磷脂1-十六酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱。虽然该反应进行完全要过夜，但它产生两种结构异构体，一个是在sn-2位的焦脱镁叶绿酸，一个是在sn-1位的焦脱镁叶绿酸，分别称作sn-2焦脱镁叶绿酸-脂质和sn-1焦脱镁叶绿酸-脂质(图1)。使用具有在60℃加热的柱的HPLC-MS，异构体的存在被显示为两个紧密洗脱的两个峰(图1B)。这些峰均表现出同样预期的焦脱镁叶绿酸-结合的脂质的分子量吸收光谱(图7)。通过检测酶裂解结合物中甘油基骨架中心碳上的氢的1H的化学位移确认了异构体的身份，其连接到酯或伯醇(酶催化裂解在下文描述且裂解产物的NMR光谱和未消化的结构异构体在图8中示出)。焦脱镁叶绿酸与磷脂的原料比的调整导致所得的结构异构体产物比的改变。当使用1∶1的比率时，超过80％的产物为sn-2焦脱镁叶绿酸-脂质异构体(即焦脱镁叶绿酸结合到sn-2羟基)。当该比率增加到1∶7时，sn-2焦脱镁叶绿酸异构体产物减少到35％且sn-1焦脱镁叶绿酸异构体增加到65％。这个观察的一个解释是小部分的溶血磷脂在与焦脱镁叶绿酸反应前经历了酰基转移。由于酰基转移的溶血磷脂包含反应性更强的伯醇，其在反应中被迅速消耗，以使得溶血磷脂更大的原料比导致更多sn-1焦脱镁叶绿酸-脂质的产生。因此，可通过改变反应条件实现一些结构异构体的选择度，但需要替代的方法来实现改善的异构体纯度。
酶已经用于制备或确认磷脂的身份。例如，磷脂酶A2可用来裂解磷脂sn-2位的取代基用于制备溶血磷脂或用于分析裂解产物和侧链性能。然而，据我们所知，酶还未综合地用来消除不需要的结构异构体。我们假设焦脱镁叶绿酸的疏水的、平面特性以异构体特异性方式干扰磷脂结合物的酶识别。为了验证该假设，集合了15种市售的脂肪酶和酯酶组并用几乎等摩尔的sn-1和sn-2焦脱镁叶绿酸-脂质溶液温育。各种酶的异构裂解在图2A中示出，sn-1焦脱镁叶绿酸-脂质的具体增加用红色示出且sn-2焦脱镁叶绿酸-脂质的具体的增加用蓝色示出。在试验条件下，大多数酶在裂解焦脱镁叶绿酸-脂质结构异构体上是效率低的。考虑到由焦脱镁叶绿酸引入的庞大的空间干扰，这并不奇怪。然而，识别了在筛选条件下作用于焦脱镁叶绿酸-脂质的一些酶。来自嗜热脂肪芽孢杆菌的酯酶将两种焦脱镁叶绿酸-脂质结构异构体有效裂解为质荷比为848的产物，其对应于磷脂胆碱首基裂解的焦脱镁叶绿酸-脂质。然而，没有检测到任何结构异构体的优先裂解。一些酶确实选择性裂解sn-1或sn-2焦脱镁叶绿酸-脂质结构异构体。虽然这些酶裂解大量的两种异构体，但来自米黑根毛酶和洋葱假单胞菌的脂肪酶优选裂解sn-2焦脱镁叶绿酸-脂质异构体。来自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶(LTL)选择性裂解sn-2焦脱镁叶绿酸-脂质异构体，且极少改变sn-1异构体。反之，来自蜜蜂毒液的磷脂酶A2(PLA2HBV)选择性裂解sn-1结构异构体。再次检查这两种酶证实了它们对消除各单独焦脱镁叶绿酸-脂质结构异构体的特异性(图2B)。因此，该筛选方法识别了可选择性裂解各结构异构体的两种酶。
接着PLA2HBV和LTL被用来制备异构体纯的卟啉-磷脂来组装入卟啉体。基于HPLC，sn-1和sn-2结构异构体均为超过97％的异构体纯的。在薄膜中制备各种纯化的焦脱镁叶绿酸-脂质结构异构体和二者的组合，连同5mol％的PEG-2000-磷脂酰乙醇胺，在磷酸盐缓冲溶液中再水化，并用100nm聚碳酸酯膜挤出以形成卟啉体。动态光散射显示生成物的尺寸是约120nm单分散的(图9)。透射电子显微镜确认了用于各种结构异构体的组装体的纳米囊泡结构，其包括包封水性内部的球形卟啉双层(图3，左列)。卟啉体的另一个特性来自卟啉双层内焦脱镁叶绿酸-脂质亚单元的相互作用，其产生结构驱动的自猝灭。所有卟啉体均高度猝灭，且超过99％的焦脱镁叶绿酸卟啉的正常荧光发射在完好的卟啉体中猝灭(图3，右列)。这些结果表明两种焦脱镁叶绿酸-脂质结构异构体和二者的组合在形成高度猝灭的卟啉双层的纳米囊泡上的行为相似。
虽然焦脱镁叶绿酸-脂质结构异构体可互换且极少影响产生的卟啉体的物理特性，但是大部分应用更加需要异构体纯的材料。如果批与批的比例改变且对体内环境不同异构体有望显示不同代谢降解产物，多种异构体的组合将增加重复能力的问题。Sn-2焦脱镁叶绿酸-脂质合成路线更有效，不仅由于该路线避免了酰基转移(即结合如预期地发生在溶血磷脂sn-2醇上)，还由于最优反应不需要过量溶血磷脂(不像sn-1焦脱镁叶绿酸-脂质-参见图1C)，其还使下游溶血磷脂污染风险最小化。sn-2焦脱镁叶绿酸-脂质的合成可简单地增加到100mg级(图4)且由3个步骤组成：将焦脱镁叶绿酸结合到脂质，用酶消化以及在二醇基二氧化硅柱上纯化。该简单的实验方案是有效的并产生高纯度的异构体纯的焦脱镁叶绿酸-脂质。接着sn-2焦脱镁叶绿酸-脂质形成为卟啉体并用于光热切除肿瘤。由于它们是荧光猝灭的，将吸收光能转化为热且已经证明卟啉体是用于光热治疗的有效对比剂。1带有KB肿瘤的裸鼠静脉注射卟啉体且24小时后用671nm激光治疗。在激光治疗进程中，肿瘤温度迅速达到60℃而单激光组仍低于40℃(图10)。接收卟啉体和激光治疗的肿瘤形成两周后消失的表面焦痂。如图5所示，仅接受激光治疗或仅接受卟啉体治疗的鼠由于肿瘤继续生长不得不被处死。相比之下，在卟啉体和激光组中，所有鼠存活超过150天且永久消灭所有肿瘤。
综上所述，在筛选(PLA2HBV和LTL)中确认了用于产生异构体纯的sn-1和sn-2卟啉-磷脂结合物的酶。两种结构异构体均组装为卟啉体。Ssn-2焦脱镁叶绿酸-脂质被有效合成并可用来使用卟啉体光热治疗切除肿瘤。该酶筛选方法和可能识别的两种酶可用来产生其它类型的异构体纯的磷脂结合物。
虽然本文已经描述了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员应当理解，在不背离本发明精神或附加权利要求范围的情况下可对其做修改。本文中公开的所有参考，包括以下清单中的那些，通过援引并入本文。
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(14)Rosseto,R.;Hajdu,J.Tetrahedron Letters2005，46，2941-2944.

Claims (11)

1.一种用于由卟啉-磷脂结合物的sn-1和sn-2结构异构体的混合物生产卟啉-磷脂结合物的组合物的方法，每个所述结构异构体包括共价连接到脂质侧链的一个卟啉，所述脂质侧链位于一个磷脂的sn-1或sn-2位中的一个，其中，所述组合物具有限定的sn-1:sn-2卟啉-磷脂结合物的结构异构体比率，所述方法包括用酶温育所述结构异构体的混合物直到达到所限定的结构异构体比率，所述酶选择性裂解所述sn-1或所述sn-2结构异构体中的一个；
其中，在所述卟啉-磷脂结合物中，所述卟啉为焦脱镁叶绿酸，所述磷脂是1-十六酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱；并且
所述酶选自来自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶和来自蜜蜂毒液的磷脂酶A2。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物是结构异构体纯的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述卟啉-磷脂结合物的结构异构体纯度＞97％。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述组合物是sn-1卟啉-磷脂结合物的结构异构体纯的组合物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述酶是来自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述组合物是所述sn-2卟啉-磷脂结合物的结构异构体纯的组合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述酶是来自蜜蜂毒液的磷脂酶A2。
8.一种用于从包含卟啉-磷脂结合物的sn-1和sn-2结构异构体的混合物的组合物中除去所述卟啉-磷脂结合物的sn-1和sn-2结构异构体之一的方法，每个所述结构异构体包括共价连接到脂质侧链的一个卟啉，所述脂质侧链位于一个磷脂的sn-1或sn-2位中的一个，所述方法包括分别用来自蜜蜂毒液的磷脂酶A2和来自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶中的一个酶催化裂解所述卟啉-磷脂结合物的所述sn-1和sn-2结构异构体之一；
其中，在所述卟啉-磷脂结合物中，所述卟啉为焦脱镁叶绿酸，所述磷脂是1-十六酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所得到的组合物的结构异构体纯度＞97％。
10.根据权利要求8-9中任一项所述的方法，其中，sn-2卟啉-磷脂结合物被除去。
11.根据权利要求8-9中任一项所述的方法，其中，sn-1卟啉-磷脂结合物被除去。
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