CN103849678B - 一种快速微藻种属鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速微藻种属鉴定的方法。主要步骤为：将单藻落挑取至事先加入10~20μL水的PCR管中，或者含藻水体离心收集藻细胞104~106个后加入10~20μL水的PCR管中，将藻细胞吹打散开后，直接将PCR管置于PCR仪中，于99℃加热20~30min，再次吹打使DNA释放作为模板，以真核细胞通用18s？rDNA或ITS引物进行PCR反应。通过对产物测序和序列分析，可获得待测藻株的种属信息。该方法利用直接热裂解后释放出DNA进行PCR反应，无需微藻的扩培及提取DNA，大大地节约时间和节省成本，达到快速、准确鉴定的目的。

Description

一种快速微藻种属鉴定方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种快速微藻种属鉴定方法。
背景技术
藻类资源极为丰富，无论是引起环境问题的藻类水华，还是利用藻类资源解决资源短缺和能源危机，在藻类的研究过程中，藻株的分离及鉴定是非常重要的一个环节。藻类鉴定技术已从最初的形态学分类和生物化学分类为主的传统表型分类进入到各种分子水平的分类。其中，18SrRNA基因大小在1600-1800bp，在藻类研究中得到了广泛、有效的应用，因此，18SrRNA基因序列分析已经成为藻株种属鉴定和分类的标准方法（参考文献1：郑俊斌，张凤英等.米氏凯伦藻18SrDNA和转录间隔区序列分析.上海海洋大学学报，2009,18（6）.）。ITS序列为转录间隔区序列，大小在600-800bp左右，是现在常用的种间鉴定的可靠依据（参考文献2：NinoskaS.Hurtado,etal.GeneticandcytologicalevidenceofhybridizationbetweennativeRuditapesdecussatusandintroducedRuditapesphilippinarum(Mollusca,Bivalvia,Veneridae)inNWSpain.Aquaculture,(2011)311,123-128.）。PCR技术具有简便、快速、高效、准确等特点，在这个过程中发挥着重要作用。但是在未知藻的鉴定中，由于数据库信息的可靠性，有时不能完全准确鉴定出具体的种属，只能初步判断出与哪些藻的同源性关系更接近。
目前，在藻的分离鉴定中，利用PCR技术扩增基因序列时，通常需要将分离的藻株培养至一定量后，采用CTAB法、超声波法、反复冻融法、煮沸法、微波法等提取基因组DNA，最后采用PCR对基因序列进行扩增，通过序列分析来鉴定藻株（参考文献3：石彦红，张凤英等.三种赤潮微藻基因组DNA快速制备方法的研究.海洋渔业,2009,31（4）:438-443.）。该方法需要提取基因组DNA，因此使用的样品量大、培养周期长、步骤繁多、耗时较长，且使用化学试剂对人员与环境危害大，不能满足快速鉴定藻株的需要。
本发明基于PCR扩增技术，无需培养大量藻、也不必提取基因组DNA，直接以藻热裂解后释放出的DNA为模板进行PCR扩增，通过18SrDNA或ITS序列分析达到鉴定藻种的目的，是一种快速鉴定藻株的高效、节约的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题为针对常规鉴定藻类PCR的培养周期长、所需试剂多等缺陷，提供了一种快速微藻种属鉴定方法，本发明所述方法简单、快速，且准确性高。
本发明提供的快速微藻种属鉴定方法，包括以下步骤：
1）从固体培养基上挑取0.1-3mm大的藻落或在含藻水体离心收集藻细胞104-106个，至已加入10-20μL水的PCR管中。
2）预处理：将藻反复吹打散开后，将PCR管置于PCR仪上，99℃加热20-30min后放凉至4℃，然后再次反复吹打，至藻细胞彻底散开。
3）以上述预处理得到的DNA为模板，按下述要求进行扩增检测。
真核细胞通用18srDNA引物，序列为：
18s-F5'-CCGAATTCGTCGACAACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3'，
18s-R5'-CCCGGGATCCAAGCTTGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3'。
ITS引物序列为：
ITS-F5’-GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG-3’，
ITS-R5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。
所述扩增检测中采用的18s-PCR反应体系组成包括上述预处理得到的基因组DNA5-10μL，10-20μM18s-F，10-20μM18s-R，200-500μMdNTPs，5μL10×PCR缓冲液（Mg2+），0.5μLLATaq，然后用无菌ddH2O补足到50μL。
所述扩增检测中采用的ITS-PCR反应体系组成包括上述预处理得到的基因组DNA5-10μL，10-20μMITS-F，10-20μMITS-R，200-500μMdNTPs，5μL10×PCR缓冲液（Mg2+），0.5μLLATaq，然后用无菌ddH2O补足到50μL。
所述18s-PCR扩增检测中PCR扩增条件为：93-95℃3-5min；93-95℃30-60s，50-60℃30-60s，68-72℃1-2min，共28-35个循环；68-72℃延伸6-10min。
所述ITS-PCR扩增检测中PCR扩增条件为：93-95℃3-5min；93-95℃30-60s，50-60℃30-60s，68-72℃30-60s，共30-40个循环；68-72℃延伸6-10min。
4）将第3步18s-PCR得到的产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，得到大小在1800bp的基因片段产物，可将产物直接测序；ITS-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，得到大小在750bp的基因片段产物，可将产物直接测序。
5）序列结果分析：测序结果通过GenBank数据库进行比对，同源性大于97％可初步认定是同一种，小于97％的不能确定是否是同一种，只能确定与哪一种的亲缘关系更近。
6）本发明所述快速微藻种属鉴定方法适用于绿藻、金藻和硅藻。
该方法利用直接热裂解后释放出DNA进行PCR反应，无需微藻的扩培及提取DNA，大大地节约时间和节省成本，达到快速、准确鉴定的目的。
附图说明
图1藻Ch-124电泳图（右边条带为Marker，左边条带为藻Ch-124ITS序列）；
图2藻Is-001电泳图（左边条带为Marker，右边条带为藻Is-00118srDNA序列）；
图3藻Bc-001电泳图（左边条带为Marker，右边条带为藻Bc-00118srDNA序列）。
具体实施方式
本发明公开了一种快速微藻种属鉴定方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进技术参数实现，技术参数包括藻的种类、藻落大小、加入热裂解反应溶液量及热裂解时间。特别需要指出的是，以上技术参数的改动对结果的影响不大，都被视为包括在本发明。本发明方法及应用已经通过实例进行详细描述，相关人员能够轻松的对本文所述方法进行应用。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：方法简便、易行，能够快速鉴定藻株种属。
实施例1：
ITS-PCR快速鉴定绿藻Ch-124
用无菌牙签挑取平板上新长出第3天的单克隆，藻落直径约0.1-0.2mm，至已提前加入10μL无菌水的PCR管中，再用10μL枪头反复吹打含有藻落的无菌水，至藻落散开，可见无菌水略有藻的颜色，看不到大块藻落、溶液均匀即可。将PCR管置于PCR仪中，99℃加热20min后放凉再反复吹打。再加入0μMITS-F，20μMITS-R，500μMdNTPs，5μL10×PCR缓冲液（Mg2+），0.5μLLATaq，然后用无菌ddH2O补足到50μL。设定PCR扩增条件为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃延伸10min。扩增后电泳检测750bp附近的条带，测序工作由大连宝生物公司协助完成。、
序列结果分析：通过在GenBank数据库中进行序列比对，与莱因衣藻序列同源性为99％，确认鉴定的藻Ch-124可能为Chlamydomonasreinhardtii。
图1藻Ch-124电泳图（右边条带为Marker，左边条带为藻Ch-124ITS序列）
藻Ch-124序列信息如下：
ACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTGAATCTATCACAATCCACACCGCGAACTAACACTGTTGGCCTCCGTCTGTGTAAAAGCAAACGGGCCAGGTCTGGGCGCAATGTAAAAGTTACGCCTGGCCTGGGTTGCCGCAAGGCATCGGTCTCTTATACTAACCAACCAACGCCAAACCAAAACTAAATTAAAACCGAGTATCTAGCTTAGAGCTAGTGCTCACTAACCAAGACAACTCTCAACAACGGATATCTTGGCTCTCGGATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAGTGTGAATTGCAGAAATACGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCATATTGCGCTCGAGGCTTCGGCCAAGAGCATGTCTGCCTCAGCGTCGGGTTAATACTCGCCCTACTCCAACATGTTTGGAGCAAGAGCGGACCTGGCTGTCTCGGTGTTTGATTTTCGGATCAGACGCCGGGTCAGCTGAAGTACAGAGGTTGATGCATGGACCCGCTTATGGGCCTCTACTGGGTAGGCAACTCGTTGCTAATGCTTTAGTAGATGGCTTGGAGCTGTGCTTGTCGACCCAAACCAGGAACTTTGGCCCTGTGCCGAAGCAAACCCCTATTTTCTCGACCTGAGCTCAGGCAAGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCA
实施例2：
18s-PCR快速鉴定金藻Is-001
用无菌牙签挑取平板上新长出第10天的单克隆，藻落直径约1.0-1.2mm，至已提前加入10μL无菌水的PCR管中，再用10μL枪头反复吹打含有藻落的无菌水，至藻落散开，可见无菌水略有藻的颜色，看不到大块藻落、溶液均匀即可。将PCR管置于PCR仪中，99℃加热20min后放凉。再加入20μM18s-F，20μM18s-R，500μMdNTPs，5μL10×PCR缓冲液（Mg2+），0.5μLLATaq，然后用无菌ddH2O补足到50μL。设定PCR扩增条件为：95℃3min；94℃30s，58℃30s，70℃2min，共30个循环；72℃延伸6min。扩增后电泳检测1800bp附近的条带，测序工作由大连宝生物公司协助完成。
序列结果分析：通过在GenBank数据库中进行序列比对，与湛江等鞭金藻序列同源性为99％，确认鉴定的金藻Is-001可能为湛江等鞭金藻。
图2藻Is-001电泳图（左边条带为Marker，右边条带为藻Is-00118srDNA序列）
藻Is-001序列信息如下：
CATATGCTTGTCTCAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCGAGTATACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATGGTTTATTTGATGGTACCTTGCTACTTGGATAACCGTAGTAATTCTAGAGCTAATACATGCAGGAGTTCCCGACTTCGGAAGGGATGTATTTATTAGATAAGAAACCAAACCGGTCTCCGGTTGCGTGCTGAGTCATACTAACTGCTCGAATCGCACGGCTTTACGCTGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAGCTTTCGATGGTAGGATAGAGGCCTACCATGGCGTTAACGGGTAACGGAGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAATGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGTAAATTGCCCGAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAGGGCTCTTCGAGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATTTACATCTCTTCACGAGGATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAACGCTCGTAGTCGGATTTCGGGGCGGGCCCGCCGGTCTGCCGATGGGTACGCACTGGCGGGCGCGTCCTTCCTCCCGGAGACGGCCGCTACTCTTAACTGAGCGGTGGTCGGAGACGGGATGTTTACTTTGAAAAAATCAGAGTGTTTCAAGCAGGCAGTCGCTCTTGCATGGATTAGCATGGGATAATGAAATAGGACTCTGGTGCTATTTTGTTGGTTTCGAGCACCGGAGTAATGGTTAACAGGGACAGTCAGGGGCACTCGTATTCCGCCGAGAGAGGTGAAATTCTCAGACCAGCGGAAGACGAACGACTGCGAAAGCATTTGCCAGGGATGTTTTCACTGATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACCATGCCGACTAGGGATTGGAGGATGTTCCGTTTGTGACTCCTTCAGCACCTTTCGGGAAACTAAAGTCTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTTACCAGGTCCAGACATTGTGAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTCGATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCGCAGCCTGCTAAATAGTGTCCCCAACCCYCTGTTGGGGCTCGCTTCTTAGAGGGACAACTTGTCTTCAACAAGTGGAAGTTCGCGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGATGCATTCAGCGAGTCGTCTCCCTTGACCGAGAGGTCCGGGTAATCTTGTGAACTTGCATCGTGATGGGGATAGATTATTGCAACTATTAATCTTCAACGAGGAATTCCTAGTAAGCGTGTGTCATCAGCGCACGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTCCTACCGATTGAATGATCCGGTGAGGCCCCCGGACTGCGGCGCCGCCGCTGGTTCTCCAGCGCTGGCGTCGCGGGAAGCTGTCCGAACCTTATCATTTAGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGT
实施例3：
18s-PCR快速鉴定硅藻Bc-001
用无菌牙签挑取平板上新长出第15天的单克隆，藻落直径约2.8-3mm，至已提前加入10μL无菌水的PCR管中，再用10μL枪头反复吹打含有藻落的无菌水，至藻落散开，可见无菌水略有藻的颜色，看不到大块藻落、溶液均匀即可。将PCR管置于PCR仪中，99℃加热20min后放凉。再加入10μM18s-F，10μM18s-R，400μMdNTPs，5μL10×PCR缓冲液（Mg2+），0.5μLLATaq，然后用无菌ddH2O补足到50μL。设定PCR扩增条件为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃2min，共30个循环；72℃延伸7min。扩增后电泳检测1800bp附近的条带，测序工作由大连宝生物公司协助完成。
序列结果分析：通过在GenBank数据库中进行序列比对，与三角褐指藻序列同源性为100％，确认鉴定的硅藻Bc-001为三角褐指藻。
图3藻Bc-001电泳图（左边条带为Marker，右边条带为藻Bc-00118srDNA序列）；
藻Bc-001序列信息如下：
TACGCTCGTCTCAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAATCTTTTACTTTGAAACTGCGAATGGCTCATTATATCAGTTATAGTTTATTTGATAGTCCCTTCACTATTTGGATAACCGTAGTAATTCTAGAGCTAATACATGCGTCAATACCCTTCTGGGGTAGTATTTATTAGATTGAAACCAACCCCTTCGGGGTGATGTGGTGATTCATAATAAGCTTGCGGATCGCATGGCTTTTGCCGGCGATGGATCATTCAAGTTTCTGCCCTATCAGCTTTGGATGGTAGGGTATTGGCCTACCATGGCTTTAACGGGTAACGGGAAATCAGGGTTTGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAGACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGTAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATGCCGGGCCTTTCTAGGTCTGGCTTTTGGAATGAGAACAATTTAAACCCCTTATCGAGGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAATGTTGCTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTGTGGTGGGCCCGGTGGCTCGGCCTTAGTTGGCCGTTGCTGTTTTGGGTCCGCCATCCTTGGGTGGAATCAGTGTGGCATTAAGTTGTCGCGCTGGGGATGCCCATCGTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCTTACGCCGTTGAATATATTAGCATGGAATAATGAGATAGGACCTTGGTACTATTTTGTTGGTTTGCGCACCGAGGTAATGATTAATAGGGACAGTTGGGGGTATTCGTATTCCATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTCTGGAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTACCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGATGATTAGATACCATCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACAAGGGATTGGCGGGGTTTCGTTACGTCTCCGTCAGCACCTTATGAGAAATCACAAGTCTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCTTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGTCCAGACATAGTGAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTCTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCCCTGCCTGCTAAATAGCCCAGTGAGTGAATTTCACTGACCAGGGCTTCTTAGAGGGACGTGCGTTCTATTAGACGCAGGAAGATAGGGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGATGCATTCAACGAGTGTTTTTCCTTGGCCGAGAGGCCTGGGCAATCTTTTGAACGTGCATCGTGATAGGGATAGATTATTGCAATTATTAATCTTGAACGAGGAATTCCTAGTAAACGCAGATCATCAATCTGCATTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCACCTACCGATTGGATGGTCCGGTGAAGCCTCGGGATTGTGACCAGTGCCTTTATTGGTGTTGGTTGCGAGAACTTGTCTAAACCTTATCATCTAGAGGAAGGTGAAGTCGTAACAAGTT
实施例4：
18s-PCR快速鉴定未知硅藻Bc-002
取微藻Bc-002培养液1mL，经4000rpm离心5min，收集藻细胞1.5-2.0×105个，将其加入已提前加入10μL无菌水的PCR管中，再用10μL枪头反复吹打含有藻落的无菌水，至藻落散开，可见无菌水略有藻的颜色，看不到大块藻落、溶液均匀即可。将PCR管置于PCR仪中，99℃加热20min后放凉。再加入15μM18s-F，15μM18s-R，200μMdNTPs，5μL10×PCR缓冲液（Mg2+），0.5μLLATaq，然后用无菌ddH2O补足到50μL。设定PCR扩增条件为：93℃5min；93℃30s，56℃30s，72℃2min，共30个循环；72℃延伸6min。

Claims (2)

1.一种快速微藻种属鉴定方法，其步骤如下：
1)从固体培养基上挑取0.1～3mm大的待测藻落或在含藻水体中离心收集待测藻细胞104～106个，至已加入10～20μL水的PCR管中；
2)预处理：将藻反复吹打散开后，将PCR管置于PCR仪上，99℃加热20～30min后放凉至4℃，然后再次反复吹打，使加热裂解的藻细胞DNA释放到溶液中，将其作为模板；
3)以上述预处理得到的DNA为模板，按下述要求进行扩增检测；扩增过程采用下述两者均分别操作或选择其一操作过程；
真核细胞通用18srDNA引物，序列为：
18s-F5'-CCGAATTCGTCGACAACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3'，
18s-R5'-CCCGGGATCCAAGCTTGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3'；
所述扩增检测中采用的18s-PCR反应体系组成包括上述预处理得到的基因组DNA5～10μL，10～20μM18s-F，10～20μM18s-R，200～500μMdNTPs，5μL10×PCR缓冲液，0.5μLLATaq，然后用无菌ddH2O补足到50μL；
所述18s-PCR扩增检测中PCR扩增条件为：93～95℃3～5min；93～95℃30～60s，50～60℃30～60s，68～72℃1～2min，共28～35个循环；68～72℃延伸6～10min；
ITS引物序列为：
ITS-F5’-GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG-3’，
ITS-R5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；
所述扩增检测中采用的ITS-PCR反应体系组成包括上述预处理得到的基因组DNA5～10μL，10～20μMITS-F，10～20μMITS-R，200～500μMdNTPs，5μL10×PCR缓冲液，0.5μLLATaq，然后用无菌ddH2O补足到50μL；
所述ITS-PCR扩增检测中PCR扩增条件为：93～95℃3～5min；93～95℃30～60s，50～60℃30～60s，68～72℃30～60s，共30～40个循环；68～72℃延伸6～10min；
4)将第步骤3)中18s-PCR得到的产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，得到大小在
1600～1800bp的基因片段产物，可将此产物经亚克隆测序；
ITS-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，得到大小在600～800bp的基因片段产物，可将此产物经亚克隆测序；
5)序列结果分析：测序结果通过GenBank数据库进行比对，找出与待测藻落或待测藻细胞同源性最接近的藻种，若找出的藻种与待测藻落或待测藻细胞的同源性大于等于97％可初步认定是同一种，同源性小于97％的不能确定是否是同一种，只能确定待测藻落或待测藻细胞与找出的藻种的亲缘关系比GenBank数据库中其它藻种的亲缘关系更近；
6)本发明所述快速微藻种属鉴定方法适用于绿藻、金藻和硅藻。
2.按照权利要求1所述鉴定方法，其特征在于：
如果第步骤4)中没有获得所需条带，则步骤1)-3)或步骤3)中实验失败，需要重新做步骤1)-3)中实验或步骤3)中实验。
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一种快速制备甲藻细胞PCR扩增DNA模板的方法;张炎 等;《海洋科学》;20051231;第29卷(第11期);第1-3页 *
米氏凯伦藻18S rDNA和转录间隔区序列分析;郑俊斌 等;《上海海洋大学学报》;20091130;第18卷(第6期);第680-685页 *

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