CN103848748B - 一种采用禽蛋壳类为钙源制备谷氨酸螯合钙及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种采用禽蛋壳类为钙源制备谷氨酸螯合钙及其制备方法。通过以禽蛋壳为钙源原料，采用直接反应制取氨基酸螯合钙法，在单因素试验的基础上，对摩尔比、pH、螯合温度、螯合时间关键几个技术参数进行响应面优化设计，确定的最佳制备工艺条件为：溶液pH值6-8，蛋壳粉与谷氨酸摩尔比1:2至1:3，螯合温度60-80℃，螯合时间50-70min，制备的谷氨酸螯合钙制剂经验证具有突显的钙吸收效果，谷氨酸螯合率高达为63.88%，获得高吸收型的活性补钙制剂，溶解度33%—33.4%，10%水溶液呈中性PH6.0—7.5，稳定性好，含钙量10.9%—13.5%，具有广泛的应用价值。

Description

一种采用禽蛋壳类为钙源制备谷氨酸螯合钙及其制备方法

技术领域

本发明涉及谷氨酸螯合钙制备技术领域，具体的，本发明涉及一种采用禽蛋壳为钙源直接制备的谷氨酸螯合钙的技术领域。

背景技术

钙是人体内必需的元素之一，它是构成人体骨骼、牙齿、器官、血液、肌肉组织的重要成分，当人体中缺乏钙可能发生生理功能障碍。氨基酸螯合钙是一个或者多个基酸基团与金属钙发生配合反应形成的具有环状结构的化合物。其具有良好的化学和生化稳定性，易于被人体吸收、副作用小、生物利用率高，能达到既补充氨基酸又补充钙的双重功效，是一种较理想的钙营养强化剂。

禽蛋壳中含有丰富的钙，是一种完全高度结合的生物钙源，天然、安全[1]。H.Z.Walton对没经过水洗处理的禽蛋壳中所含化学元素进行测定，发现其中钙含量高达36.4%[2]，我国每年扔掉的仅禽蛋壳多达400×10⁴t[3,4]，对环境造成污染以及资源的极大浪费。这迫切需要新技术手段来对蛋壳进行资源化利用，既可以变废为宝，增加社会财富，又可以解决蛋壳对环境所造成的污染。因此研究以禽蛋壳为钙源制备谷氨酸螯合钙的技术具有较高的实际意义和开发价值。

目前，对蛋壳钙源的利用主要用酸解提取可溶性钙、高温煅烧法，方法普遍存在造成酸污染以及环境污染，有机溶剂残留等缺陷[5,6]，直接利用禽蛋壳类为钙源与氨基酸直接反应制取氨基酸螯合钙未见报道，利用壳类钙源采用环保工艺简单制备的高吸收率的氨基酸螯合钙的技术方案未见报道。现有报道的采用贝壳类等原料制备的氨基酸螯合钙普遍存在：一是溶解度差,100mL水中只溶解0.02g碳酸钙,需胃酸中和分解后,钙离子才能被吸收；二是原料取之于近海的牡蛎、贝壳类,这些海洋生物类有很强的吸附作用,不但能吸附很多浮游生物作为食物,而且能将海洋中污染的重金属吸附到贝壳中。因此这种贝壳生物碳酸钙含重金属,影响服用者的健康。

发明内容

针对现有技术中未见有关采用禽蛋壳与氨基酸直接反应制取氨基酸螯合钙的技术现状，基于具有绿色环保，工艺简便易行的原则，本发明目的旨在于提供一种采用禽蛋壳为钙源制备的谷氨酸螯合钙及其制备方法。制备的谷氨酸螯合钙的钙吸收率好，可作为一种高吸收型的活性补钙制剂。

本发明的技术方案：通过以禽蛋壳为钙源原料，采用直接反应制取氨基酸螯合钙法，在单因素试验的基础上，对摩尔比、pH、螯合温度、螯合时间关键几个技术参数进行响应面优化设计。最终确定的最佳制备工艺条件为：溶液pH值6-8，蛋壳粉与谷氨酸摩尔比1:2至1:3，螯合温度60-80℃，螯合时间50-70min。获得采用禽蛋壳为钙源制备的谷氨酸螯合钙最佳工艺参数，确定的制备工艺完整有机组成不可分割，制备的谷氨酸螯合钙制剂通过科学实验反复验证具有突显的钙吸收效果，谷氨酸螯合率高达为63.88%，获得高吸收型的活性补钙制剂。

具体的，本发明提供了一种采用禽蛋壳为钙源直接制备谷氨酸螯合钙的方法，具体制备方法步骤如下。

（1）原料预处理：收集禽蛋壳后用清水清洗表面杂物，经沸水煮沸5-10min，40-60kHz，超声20-30min初次壳膜分离，置隧道式鼓风干燥箱中利用风力再次分离壳膜，粉碎过100目筛，得到纯度较高蛋壳粉，再4℃储存备用。

（2）将蛋壳钙粉和谷氨酸按照1:2至1:3摩尔比例混合，蒸馏水按固液质量比1:15至1:20添加，用NaOH调节pH值至6-8，加热至60-80℃以20-30r/min速度搅拌保温螯合50-70min。

（3）将上述步骤获得螯合反应的粗品，抽滤5-10min，滤渣回收重新投料使用；滤液减压浓缩置膏状，90%-95%无水乙醇沉淀，搅拌30min，静置过夜，4000r/min-6000r/min离心15-20min，回收上清液无水乙醇混合物，过滤收集沉淀物。

（4）将上述步骤（3）纯化后的谷氨酸螯合钙经110℃干燥，粉碎过120目筛，制得白色粉末状谷氨酸螯合钙。

本发明中，选择禽蛋壳为钙源制备谷氨酸螯合钙制剂，首先是基于禽蛋壳的结构优势，通过电镜结构观察，蛋壳成多孔的不规则结构，这是禽蛋壳粉比碳酸钙更易被人体和动物吸收的主要原因，这样为制备谷氨酸螯合钙，有利于人体吸收奠定了基础。其次是安全性，比其他贝壳类，骨头类安全。众所周知，贝壳因海洋污染重金属超标，受地域限制只有沿海地区较多因素限制，骨头中因激素、药品等污染的现状，禽蛋壳是禽类的生物组织。通过利用钙源原料骨粉、鸡蛋壳粉、牡蛎壳制备的生物碳酸钙或常见活性钙粉按照上述提供的制备工艺，将钙源原料和蒸馏水一定比例混合，调节pH值，加热，搅拌，保温螯合，抽滤，减压浓缩置膏状，乙醇沉淀，离心，收集沉淀物，干燥、粉碎获得谷氨酸螯合钙成品，通过将制备的谷氨酸螯合钙成品进行性能参数比对获悉，采用鸡蛋壳粉为钙源制备谷氨酸螯合钙性能比较好，进一步通过利用鸭蛋壳、鹅蛋壳等其他禽类蛋壳粉为钙源直接制备的谷氨酸螯合钙，普遍共同获得以下优良性能的谷氨酸螯合钙：白色粉末，易吸潮。溶解度高到33%-33.4%，水溶液无色具有特有的鲜味，呈中性pH(10%水溶液)6.0-7.5，稳定性较好，含钙量（以钙计算）10.9%-13.5%。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下技术效果。

1.通过以禽蛋壳为钙源原料，采用直接反应制取氨基酸螯合钙法，在单因素试验的基础上，对摩尔比、pH、螯合温度、螯合时间几个关键技术参数进行响应面优化设计，最终确定的最佳制备工艺条件为：溶液pH值6-8，蛋壳粉与谷氨酸摩尔比1:2至1:3，螯合温度60-80℃，螯合时间50-70min，获得采用禽蛋壳为钙源制备的谷氨酸螯合钙最佳工艺参数，确定的制备工艺完整有机组成不可分割，制备的谷氨酸螯合钙制剂通过科学实验反复验证具有突显的钙吸收效果，谷氨酸螯合率高达为63.88%，获得高吸收型的活性补钙制剂。谷氨酸螯合钙制剂具有的特征或者属性：白色粉末，易吸潮。溶解度高到33%-33.4%，水溶液无色具有特有的鲜味，呈中性批pH(10%水溶液)6.0-7.5，稳定性较好，含钙量（以钙计算）10.9%-13.5%。

2.本发明采用禽蛋壳为钙源直接制备谷氨酸螯合钙制剂的工艺中，确定了摩尔比、pH、螯合温度、螯合时间都显著影响氨基酸螯合钙的螯合率关键技术要素，提供确定的制备工艺中各技术步骤之间有机组成，上下相互衔接，互不可替换，共同完整有机组成不可分割。同时在选用壳膜分离技术步骤中，采用煮沸消毒浸泡之后超声波壳膜分离，与贝壳类比用弱酸弱碱泡，节约了资源，减少了酸碱的污染。并在工艺过程中加蒸馏水量较少，节约了水资源，减少了浓缩时间，提高了效率。

3.采用制备的谷氨酸螯合钙制剂，通过应用试验，证实了采用相同含钙元素剂量条件下，本发明提供的谷氨酸螯合钙制剂对改善大鼠股骨的营养状况效果比葡萄糖酸钙组好，高剂量组大鼠骨密度与葡萄糖酸钙组比较增加，差异有显著性(P<0.01)意义。实验得出本发明提供的谷氨酸螯合钙与低钙组以及葡萄糖酸钙比显著（P<0.05）提高了大鼠L股骨上端最大载荷，高达106.60±16.87N可以较好地改善大鼠股骨近端的力学性能。本发明提供的谷氨酸螯合钙的钙吸收率较好，高剂量组大鼠表观消化率为96.27±1.55％，与对照组比较增高，差异显著（P<0.01）。表明通过本发明以禽蛋壳为钙源原料，采用直接反应制备的谷氨酸螯合钙制剂钙吸收率显著突出，是一种高吸收型的活性补钙制剂，具有广泛的实用性和开发价值。

附图说明

图1显示为采用禽蛋壳为钙源直接制备谷氨酸螯合钙的的工艺流程图。

图2显示为蛋壳粉与谷氨基酸不同摩尔比对螯合率的影响图。

图3显示为不同pH值对谷氨酸螯合钙螯合率的影响图。

图4显示为不同温度对谷氨酸螯合钙螯合率的影响图。

图5显示为螯合时间对谷氨酸螯合钙螯合率的影响图。

图6显示为摩尔比和pH交互影响螯合率响应面图。

图7显示为摩尔比与温度交互影响螯合率响应面图。

图8显示为pH与时间交互影响螯合率响应面图。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

采用原料及试剂：采用原料为各类禽蛋壳，采用的试剂为L-谷氨酸、无水乙醇、EDTA二钠盐、铬黑T、三乙醇胺、盐酸、氨水均为分析纯，本领域可通过现有技术获得或制备获得。

采用的主要的仪器设备：FW-100高速万能粉碎机（北京市永光明医疗仪器厂）、EYELASB2000旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）、DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱（上海恒科技有限公司）、100目国家标准筛（上海东星建材实验设备有限公司）、AL204-IC电子分析天平（上海市梅特勒-托利多有限公司）、数显恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）、pHS-3c酸度计（上海仪电科学仪器股份有限公司）、FOODALYT-TS10滴定仪（北京天翔飞域仪器设备有限公司）。

本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器、设备都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：采用禽蛋壳为钙源制备谷氨酸螯合钙

采用禽蛋壳为钙源直接制备谷氨酸螯合钙的具体方法步骤如下。

（1）原料预处理：收集禽蛋壳后用清水清洗表面杂物，经沸水煮沸5-10min后，40-60kHz，超声20-30min初次壳膜分离，置隧道式鼓风干燥箱中利用风力再次分离壳膜，粉碎过100目筛，得到纯度较高蛋壳粉，再4℃储存备用。

（2）将蛋壳钙粉和谷氨酸按照1:2至1:3摩尔比例混合，蒸馏水按固液质量比1:15至1:20添加，用NaOH调节pH值至6-8，加热至60-80℃以20-30r/min速度搅拌保温螯合50-70min。

（3）将上述步骤获得螯合反应的粗品，抽滤5-10min，滤渣回收重新投料使用；滤液减压浓缩置膏状，90%-95%无水乙醇沉淀，搅拌30min，静置过夜，4000r/min-6000r/min离心15-20min，回收上清液无水乙醇混合物，过滤收集沉淀物。

（4）将上述步骤（3）纯化后的谷氨酸螯合钙经110℃干燥，粉碎过120目筛，制得白色粉末状谷氨酸螯合钙。

通过上述采用禽蛋壳为钙源直接制备谷氨酸螯合钙，具有制备的谷氨酸螯合钙制剂通过科学实验反复验证具有突显的钙吸收效果，谷氨酸螯合率高达为63.88%左右，获得高吸收型的活性补钙制剂：白色粉末，易吸潮。溶解度高到33%-33.4%，水溶液无色具有特有的鲜味，呈中性pH(10%水溶液)6.0-7.5，稳定性较好，含钙量（以钙计算）10.9%-13.5%。

实施例二：采用禽蛋壳为钙源制备谷氨酸螯合钙

采用禽蛋壳为钙源直接制备谷氨酸螯合钙的具体方法步骤如下。

（1）原料预处理：收集禽蛋壳后用清水清洗表面杂物，经沸水煮沸5min，40kHz，超声20min初次壳膜分离，置隧道式鼓风干燥箱中利用风力再次分离壳膜，粉碎过100目筛，得到纯度较高蛋壳粉，再4℃储存备用。

（2）将蛋壳钙粉和谷氨酸按照1:2摩尔比例混合，蒸馏水按固液质量比1:15添加，用NaOH调节pH值至6，加热至60℃以20r/min速度搅拌保温螯合50min。

（3）将上述步骤获得螯合反应的粗品，抽滤5min，滤渣回收重新投料使用；滤液减压浓缩置膏状，90%%无水乙醇沉淀，搅拌30min，静置过夜，4000r/min离心15min，回收上清液无水乙醇混合物，过滤收集沉淀物。

（4）将上述步骤（3）纯化后的谷氨酸螯合钙经110℃干燥，粉碎过120目筛，制得白色粉末状谷氨酸螯合钙。

通过上述采用禽蛋壳为钙源直接制备谷氨酸螯合钙，具有制备的谷氨酸螯合钙制剂通过科学实验反复验证具有突显的钙吸收效果，谷氨酸螯合率高达为63.88%左右，获得高吸收型的活性补钙制剂：白色粉末，易吸潮。溶解度高到33%-33.4%，水溶液无色具有特有的鲜味，10%水溶液呈中性pH6.0，稳定性较好，含钙量（以钙计算）10.9%。

实施例三：采用禽蛋壳为钙源制备谷氨酸螯合钙

采用禽蛋壳为钙源直接制备谷氨酸螯合钙的具体方法步骤如下。

（1）原料预处理：收集禽蛋壳后用清水清洗表面杂物，经沸水煮沸10min，60kHz，超声30min初次壳膜分离，置隧道式鼓风干燥箱中利用风力再次分离壳膜，粉碎过100目筛，得到纯度较高蛋壳粉，再4℃储存备用。

（2）将蛋壳钙粉和谷氨酸按照1:3摩尔比例混合，蒸馏水按固液质量比1:20添加，用NaOH调节pH值至8，加热至80℃以30r/min速度搅拌保温螯合70min。

（3）将上述步骤获得螯合反应的粗品，抽滤10min，滤渣回收重新投料使用；滤液减压浓缩置膏状，95%无水乙醇沉淀，搅拌30min，静置过夜，6000r/min离心20min，回收上清液无水乙醇混合物，过滤收集沉淀物。

（4）将上述步骤（3）纯化后的谷氨酸螯合钙经110℃干燥，粉碎过120目筛，制得白色粉末状谷氨酸螯合钙。

通过上述采用禽蛋壳为钙源直接制备谷氨酸螯合钙，具有制备的谷氨酸螯合钙制剂通过科学实验反复验证具有突显的钙吸收效果，谷氨酸螯合率高达为63.88%左右，获得高吸收型的活性补钙制剂：白色粉末，易吸潮。溶解度高到33%-33.4%，水溶液无色具有特有的鲜味，10%水溶液呈中性pH7.5，稳定性较好，含钙量（以钙计算）13.5%。

实施例四：采用禽蛋壳为钙源制备谷氨酸螯合钙

将收集禽蛋壳后用清水清洗表面杂物，经沸水煮沸8min，50kHz，超声25min初次壳膜分离，置隧道式鼓风干燥箱中利用风力再次分离壳膜，粉碎过100目筛，得到纯度较高蛋壳粉，将蛋壳钙粉和谷氨酸按照1:2.5摩尔比混合，蒸馏水按固液质量比1:18添加，用NaOH调节pH值至7，加热至70℃以25r/min速度搅拌保温螯合60min获得螯合反应的粗品，抽滤7min，滤渣回收重新投料使用；滤液减压浓缩置膏状，90%无水乙醇沉淀，搅拌30min，静置过夜，5000r/min离心17min，回收上清液无水乙醇混合物，过滤收集沉淀物，经110℃干燥，粉碎过120目筛，制得白色粉末状谷氨酸螯合钙：白色粉末，易吸潮。溶解度高到33.3%，水溶液无色具有特有的鲜味，呈中性pH(10%水溶液)7.0，稳定性较好，含钙量（以钙计算）13%。

实施例五：制备谷氨酸螯合钙的钙源选择

本实施例旨在通过将常见的制备的谷氨酸螯合钙的钙源材料，采用骨粉、鸡蛋壳粉、牡蛎壳制备的生物碳酸钙或常见活性钙粉作为钙源，通过试验进一步验证采用禽蛋壳为钙源制备谷氨酸螯合钙的技术优势。

(1)骨粉为原料：用动物骨骼制成的钙制剂,是一种很好的补钙剂,但现有技术普遍认为有以下缺陷:一是钙的含量太低；二是有的地方用来提取和加工的化学制剂有毒,有多例报告发生肝中毒。三是猪、牛、羊的骨骼可能会吸附重金属[7,8,9]。

(2)禽蛋壳粉为原料：将鸡蛋为代表的禽蛋壳清洗、粉碎后高温消毒制成禽蛋壳钙粉,其主要化学成分是碳酸钙。采用常见的蛋壳CaCO₃高于93%,Ca元素含量大于36%,远高于动物骨常见的12%含钙量[7,8,9]。蛋壳有机物含量很低,因此制备钙剂时产率较高。蛋壳钙表面存在大量微孔,消化液也易于作用。

(3)生物碳酸钙为原料：以牡蛎壳为原料,经清洗、粉碎、高温锻烧精制而成,主要化学成分为碳酸钙,呈白色微细粉末,无臭无味。可溶于乙酸、稀盐酸,并产生二氧化碳。这类钙制剂突出优点是价廉、取料方便、含钙量高。其缺点一是溶解度差,100mL水中只溶解0.02g碳酸钙,需胃酸中和分解后,钙离子才能被吸收[9]。二是原料取之于近海的牡蛎、贝壳类,这些海洋生物类有很强的吸附作用,不但能吸附很多浮游生物作为食物,而且能将海洋中污染的重金属吸附到贝壳中,因此生物碳酸钙含重金属,影响服用者的健康。

(4)活性钙为原料：别名活性离子钙,前几年曾风行一时。以牡砺壳为原料,经清洗、粉碎、高温锻烧、水解精制而成。其主要化学成分为氢氧化钙,另含微量氧化镁,氧化钾,氧化铁等,含钙量为5.41%。呈白色粉末的活性钙、无臭、有涩味,溶于酸性溶液,几乎不溶于水,呈强碱性(pH=12.4),对皮肤、织物有腐蚀作用。有文献报道本品在体内吸收好,利用率高,但由于碱性太强,服用后易产生灼烧感,恶心和不适,因此很多地区已淘汰了这个产品[8,9]。

通过利用上述提供的钙源原料骨粉、鸡蛋壳粉、牡蛎壳制备的生物碳酸钙或常见活性钙粉按照实施例提供的制备工艺，将钙源原料和蒸馏水一定比例混合，调节pH值，加热，搅拌，保温螯合，抽滤，减压浓缩置膏状，乙醇沉淀，离心，收集沉淀物，干燥、粉碎获得谷氨酸螯合钙成品，通过将制备的谷氨酸螯合钙成品进行性能参数比对获悉，采用鸡蛋壳粉为钙源制备谷氨酸螯合钙性能比较好，进一步通过利用鸭蛋壳、鹅蛋壳等其他禽类蛋壳粉为钙源直接制备的谷氨酸螯合钙，普遍共同获得以下优良性能的谷氨酸螯合钙：白色粉末，易吸潮。溶解度高到33%-33.4%，水溶液无色具有特有的鲜味，呈中性pH(10%水溶液)6.0-7.5，稳定性较好，含钙量（以钙计算）10.9%-13.5%。

由此可见，对于钙源的选择，经过采用不同钙源原料试验得知，基于禽蛋壳的生物组织结构优势，蛋壳成多孔的不规则结构，禽蛋壳也是禽类重要的的生物组织的构成部分，同时，禽蛋壳的钙含量比贝壳类、骨类高的现实情况，综合涉及各方面的考量，决定了禽蛋壳粉比碳酸钙更易被人体和动物吸收的主要原因，也是奠定了本发明采用禽蛋壳为钙源直接制备谷氨酸螯合钙的主要技术支持和优势决定。

实施例六：谷氨酸螯合钙螯合率的测定

称取1.00g氨基酸螯合钙样品，溶于蒸馏水定容500mL，取100mL置300mL锥形瓶中，加入5滴1%铬黑T指示剂和NH₃·H₂O-NH₄Cl缓冲溶液5mL摇匀。0.01mol/LEDTA溶液滴定，平行进行3次滴定，记下消耗的EDTA溶液平均体积V₀。另取相同量氨基酸螯合钙样品，加50mL无水乙醇，充分搅拌离心、分离、烘干，用蒸馏水定容至500mL，方法同上，记下消耗的EDTA溶液平均体积V₁。

采用EDTA络合滴定法其原理:EDTA-M络合物的稳定常数(lgK=18.8)远大于氨基酸螯合物的稳定常数，氨基酸螯合钙在无水乙醇中的溶解度较小，而钙离子可以溶于无水乙醇，可以洗脱除去未螯合的钙离子[10]。由此计算出螯合率和金属元素的总含量。

螯合率（%）==

钙元素的总量(%)=

式中：C标定EDTA溶液的浓度mol/L；V₁滴定螯合态钙元素消耗的EDTA溶液体积ml；V₀滴定钙元素总量消耗的EDTA溶液体积ml；M为钙元素的相对分子量g/mol；m为称取的样品量g。

实施例七：以禽蛋壳为钙源直接制备谷氨酸螯合钙的单因素试验

1.禽蛋壳粉与谷氨基酸不同摩尔比对螯合率的影响：分别以4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5摩尔比，在pH7、温度70℃的水浴中保温螯合60min，考察不同摩尔比对螯合率的影响。结果参见附图2可知，在禽蛋壳粉与谷氨酸摩尔比从4:1增加到1:3的过程中，螯合率显著增加，在摩尔比为1:3时达到最高值；但随着摩尔比继续增大，螯合率降低。这是因为碳酸钙与谷氨酸反应合成谷氨酸螯合钙，反应物的摩尔比理论值为1:2，反应体系中谷氨酸与钙源蛋壳粉中的CaCO₃的摩尔比高，将有利于钙离子的螯合完全，但是氨基酸利于率低，造成能源浪费，产品中钙浓度低。

2.不同pH值对谷氨酸螯合钙螯合率的影响：调节混合液pH值分别为3、4、5、6、7、8、9、10，在摩尔比为1:3、温度70℃的水浴中保温螯合60min，考察不同摩尔比对螯合率的影响。结果参见附图3可知，pH值对螯合率有明显影响，在pH由3上升到5过程中螯合率迅速减小，这是因为谷氨酸是酸性氨基酸其酸性条件下CaCO₃直接发生反应有利于反应的进行。pH由5再上升到7时螯合率迅速增大，在pH8～10之间螯合率逐渐减低，pH为7时达到最大值，分析原因可能是当溶液中H⁺大量存在时，H⁺将会与Ca²⁺争夺电子基团，不利于螯合物的形成，在pH为7时，氨基酸受H⁺和OH^-影响较小，提供了充分的供电子基团，从而有利于钙通过配位键形成螯合物[11,12]。

3.不同温度对谷氨酸螯合钙螯合率的影响：在pH值为7，蛋壳粉与谷氨酸摩尔比为1:3，螯合时间60min选取螯合温度30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃。结果参见附图4可知，随着温度的提高，螯合钙的螯合率增大，70℃时螯合率最高，但温度进一步升高时，螯合率呈下降趋势，其原因可能是温度过高而引起其他复杂反应导致产品质量减少。

4.螯合时间对谷氨酸螯合钙螯合率的影响：在pH7、70℃、蛋壳粉与谷氨酸摩尔比为1:3条件下，选取不同时间进行保温螯合。实验结果参见附图5可知，随着螯合时间的延长螯合率先增高后减，当螯合时间为60min时，螯合率达到最大值，若时间进一步延长，螯合率有明显的降低，可能是由于搅拌作用引起螯合率的降解，导致螯合率的降低。

结论：通过单因素试验和响应面设计，得出影响螯合率的工艺因素按主次顺序为摩尔比＞pH值＞温度＞时间，制备最佳条件为：谷氨酸与禽蛋壳粉摩尔比为3:1，pH等于7，螯合温度为70℃，螯合时间60min。在最优条件下，螯合率为63.88±0.15%。

实施例八：以禽蛋壳为钙源直接制备谷氨酸螯合钙的响应面优化实验

1.1响应面实验设计：选取摩尔配比、pH、温度、反应时间4个因素，进行Box-Behnken优化试验。试验因素水平设计见表1，响应面设计数据及结果见表2。

表1谷氨酸螯合钙响应面试验因素与水平

表2Box-BehnkenDesign试验设计与结果

实验号	A	B	C	D	螯合率(%)
						1	0	-1	0	-1	53.15
2	0	0	1	1	52.66
						3	-1	0	1	0	39.95
4	0	1	-1	0	52.5
						5	0	1	0	1	48.41
6	1	-1	0	0	53.66
						7	0	0	0	0	64.26
8	1	0	-1	0	58.04
						9	0	0	-1	-1	58.91
10	0	0	0	0	63.39
						11	0	0	0	0	64.85
12	-1	0	0	-1	46.15
						13	-1	0	0	1	43.89
14	0	0	0	0	63.61
						15	0	0	1	-1	55.37
16	0	-1	0	1	58.05
						17	-1	0	-1	0	47.98
18	0	1	0	-1	54.06
						19	0	0	-1	1	57.8
20	1	0	0	1	58.15
						21	0	0	0	0	63.65
22	1	0	0	-1	57.43
						23	0	-1	1	0	51.8
24	0	1	1	0	50.3
						25	1	0	1	0	57.44
26	1	1	0	0	55.48
						27	-1	1	0	0	37.03
28	0	-1	-1	0	58.27
						29	-1	-1	0	0	46.65

1.2模型方差分析：表2是29个试验点结果，29个试验点分为两类：一是析因点，自变量取值在A、B、C、D所构成的三维顶点，共有24个析因点；二是零点，为区域中心点，零点试验重复5次，用来估计试验误差，以得率为响应值(Y)。利用Design-Expert8.0软件进行二次多元回归拟合，分别得到表3回归方程模型方差分析及表4回归方程系数显著性分析。

表3回归方程模型方差分析

方差来源	平方和	自由度	均方	F值	概率Pr＞F
						模型	1419.74	14	101.41	373.71	< 0.0001* *
残差	3.8	14	0.27
						失拟项	2.37	10	0.26	0.67	0.7261
纯误差	1.43	4	0.36
						总离差	1423.54	28

注：*.差异显著，P＜0.05；**.差异极显著，P＜0.01，下同。

由表3方差分析结果可看出，模型P＜0.0001，方程模型达到极显著，失拟P＝0.7261＞0.05，不显著。因此二次模型成立，应用此方程可以预测谷氨酸螯合钙的螯合率及优化工艺。对表3中数据进行回归拟合，得到自变量与螯合率率(Y)的二次多项回归方程：

Y=63.95+6.55A-1.98B-2.17C-0.51D+2.86AB+1.86AC+0.74AD+1.07BC-2.64BD-0.40CD-8.96A²-6.77B²-4.06C²-3.69D²

表4回归方程系数显著性分析

方差来源	平方和	自由度	均方	F值	概率Pr＞F
						模型	1419.74	14	101.41	373.71	< 0.0001 * *
A	514.18	1	514.18	1894.8	< 0.0001 * *
						B	47.2	1	47.2	173.95	< 0.0001 * *
C	56.25	1	56.25	207.28	< 0.0009 * *
						D	3.11	1	3.11	11.46	0.0044
A-B	32.72	1	32.72	120.57	< 0.0001 * *
						A-C	13.8	1	13.8	50.86	< 0.0001 * *
A-D	2.22	1	2.22	8.18	0.0126
						B-C	4.56	1	4.56	16.8	0.0011
B-D	27.83	1	27.83	102.54	< 0.0001 * *
						C-D	0.64	1	0.64	2.36	0.1469
A2	520.57	1	520.57	1918.37	< 0.0001 * *
						B2	297.27	1	297.27	1095.49	< 0.0001 * *
C2	107.04	1	107.04	394.45	< 0.0001 * *
						D2	88.13	1	88.13	324.77	< 0.0001 * *

由表5可知，影响氨基酸螯合钙螯合率的因素主次为：摩尔比＞pH＞温度＞时间。其中摩尔比、温度及pH值达到极显著程度，螯合时间为显著，且摩尔比与pH、摩尔比与温度，pH与时间有交互作用，达到显著水平。

1.3响应面分析：谷氨酸螯合钙制备工艺中摩尔比、温度、pH值、时间4个因素之间交互作用对螯合率的影响。

为了考察各个交互项对螯合率的影响，在其他因素固定不变的情况下，利用Design-Expert8.0软件对回归方程进行运算，作出交互项的三维响应面图，能比较直观的解释各个变量和变量之间对响应值的影响。

由附图6可知摩尔比与pH对螯合钙的螯合率的影响均呈抛物线形，即随摩尔比和pH的同增大，螯合率呈先增大后降低的趋势，因此在制备工艺中适当增大摩尔比和pH可以提高螯合率。从附图7可以看出，随着温度和摩尔比值提高，螯合率也表现为先增大后缓慢降低。由此可见，适当的提高摩尔比及螯合温度，可以一定程度提高螯合率。在附图8中，随着时间和pH的增大，螯合率达到最大值；当时间和pH继续增大时，螯合率缓慢降低。因此在实际生产中应控制pH值和反应温度在最佳范围。

为检验响应面法优化以禽蛋壳为钙源谷氨酸螯合钙工艺的可靠性，采用优化后的工艺条件进行验证试验。通过Design-Expert8.0软件，根据所建立的数学模型进行参数的最优化分析，可得以禽蛋壳为钙源直接制备谷氨酸螯合钙的最佳工艺参数为：参考实际操作，将优化后工艺参数调整为氨基酸与蛋壳粉摩尔比为3:1，pH等于7，螯合温度为70℃，螯合时间60min。经过多次重复实验，螯合率为(63.88±0.15)%与模型预测值的误差为1.5%，接近预测值，与理论预测值接近，说明该方程与实际情况拟合良好，响应面分析所得到的优化模型是可靠的，标明试验具有实际应用价值。

结论：本实验采用废弃禽蛋壳这种生物组织为材料与氨基酸直接反应制取氨基酸螯合钙技术不仅螯合率较高，而且制备过程相对于高温煅烧、酸溶解法具有节能环保，可有效提高生产效率，生产成本低，市场竞争强等优势。优化的制备工艺，可用于禽蛋壳资源利用及产业化生产，带动禽蛋壳综合利用以及钙制剂市场的发展。

实施例九：以禽蛋壳为钙源直接制备谷氨酸螯合钙的功能性能试验

【目的】为将上述实施例制备的谷氨酸螯合钙对SD大鼠骨密度增加的影响。

【方法】实验设高、中、低剂量组，另设一个生理盐水低钙对照组和一个葡萄糖酸钙对照组，以50mg/kg·bw、200mg/kg·bw、400mg/kg·bw，剂量的氨基酸螯合钙给大鼠灌胃10wk，饮用去离子水和摄食低钙饲料，测量大鼠骨股长度、质量、荷载、骨密度、股钙含量及钙表观消化率等相关指标。

1.1实验材料：谷氨酸螯合钙选用由上述各实施例本发明提供的以禽蛋壳为钙源直接制备谷氨酸螯合钙；葡萄糖酸钙，三九集团昆明白马制药有限公司产品。

1.2实验动物与饲料：清洁级SD大鼠60只，4周龄，体重75-90g，由新疆医科大学动物实验中心提供。低钙饲料参考AOAC推荐的标准饲料配制，饲料组成及营养成分见表5。表5基础饲料组成及营养水平（风干基础）

原料 Ingredient	含量 Content %
		酪蛋白 Casein	10.0
黄豆粉 Soybean meal	15.0
		小麦面粉 Wheat flour	55.0
玉米油Corn oil	4.0
		纤维素Cellulose	2.0
混合盐Mixture of inorganic salt	2.0
		混合维生素Mixture of vitamin	1.0
淀粉Corn starch	11.0

1.3实验方法：大鼠适应性喂养3d后，按体重随机分为6组，每组10只，实验前处死一组。分别设高、中、低剂量组，另设一个生理盐水低钙对照组和一个相应高剂量葡萄糖酸钙对照组，以50mg/kg·bw，200mg/kg·bw，400mg/kg·bw，剂量的氨基酸螯合钙给大鼠灌胃10wk，饮用去离子水和摄食低钙饲料早晚各1次，每周称体重和量身高。实验结束前3d单笼饲料进行代谢实验，实验结束时对大鼠骨密度及股钙含量，股骨重量、股骨力学的检测。

1.4指标测定与方法。

1.4.1钙的表观消化率的测定：记录3d进食量，收集72h粪便，测定饲料及粪便中钙含量。饲料及粪便中钙用火焰原子吸收分光光度法测定。测定液、标准溶液和空白均用氧化镧溶液稀释。

摄入钙(d)=饲料钙含量(mg/g)×饲料消耗量(g/d)＋受试物钙含量

粪钙(d)=粪便钙含量(mg/g)×粪便排出量(d)

钙的表观消化率(％)=(摄入钙－粪钙)/摄入钙×100％

1.4.2骨密度测定：喂养10wk后的大鼠直接断颈处死，采用LEXXOS型双能X线骨密度仪检测大鼠左股骨中段密度。

1.4.3股骨重量、长度及股骨力学检测：对检测完骨密度的大鼠进行解剖，取出股骨剔除肌肉后，用游标卡尺测量股骨长度。并将其放置在正己烷溶剂中进行脱脂48h，55℃烘干至恒重称取骨重。按规定方位放置股骨干，支点跨距20mm，加压点为中点，选取标定载荷15kg，加载速2mm/min，加载至骨折，记录载荷-位移曲线。

1.4.4骨钙含量测定：取烘干至恒重的右侧股骨称重、经过干燥、电炉炭化、高温灰化之后，以0.5％的氧化镧溶液定容，采用火焰原子吸收分光光度计测定其含钙量。

1.5数据处理：数据采用SPSS17.0进行方差分析，以“平均值±标准差”表示，各组间的平均值采用Dunnett进行检验，成组资料采用t值检验，以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著作为判断标准。

2结果与分析

2.1谷氨酸螯合钙对大鼠股骨长度和质量的影响

从表6可知，低钙组的大鼠股骨长度与葡萄酸钙组及谷氨酸钙低剂量组的大鼠股骨长度相比，差异不显著无统计学意义；在谷氨酸螯合钙中、高剂量组中，大鼠的股骨长度与低钙组大鼠股骨长度相比，差异有统计学意义(P<0.05)。高钙剂量组股骨长度显著高于葡萄糖酸钙组(P<0.05)。

从表6可知，3种剂量水平的谷氨酸钙给药组、葡萄糖酸钙组的大鼠股骨质量与低钙组大鼠股骨质量相比存在差异；剂量组大鼠股骨质量与低钙组大鼠股骨质量相比差异显著(P<0.05)；而相同含钙元素剂量条件下，谷氨酸钙对大鼠股骨质量增加的效果比葡萄糖酸钙组好，两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。

表6谷氨酸螯合钙对大鼠股骨长度和质量的影响

组别	N	股骨长度/cm	股骨质量/mg（右侧）
				低钙对照组	10	3.04±0.21	468.31±68.44
葡萄糖酸钙组	10	3.05±0.25	474.94±65.05
				低剂量组	10	3.05±0.15	488.76±60.47#*
中剂量组	10	3.09±0.17△△	490.21±57.97#**
				高剂量组	10	3.11±0.18△△*	491.33±66.42#**

注：剂量组与低钙对照组比较下△△表示P<0.05；#表示P<0.01；*、**分别表示剂量组与葡萄糖酸钙对照组比较P<0.05、P<0.01；下表同。

2.2谷氨酸螯合钙对大鼠骨密度及骨钙的影响

从表7可知，高剂量水平的氨基酸螯合钙组大鼠股骨钙质量分数与低钙组相比，差异明显(P<0.01)；在相同含钙元素剂量下，高剂量谷氨酸螯合钙组的大鼠股骨钙质量分数比葡萄糖酸钙阳性组的大鼠股骨钙质量分数有增高趋势，差异显著(P<0.01)。

葡萄糖酸钙阳性组的大鼠骨密度与低钙组大鼠骨密度相比较高；剂量组大鼠骨密度与低钙对照组，差异极显著(P<0.01)；高剂量组大鼠骨密度与葡萄糖酸钙组比较增加，差异有显著性意义，表明受试物可作为补钙剂。

表7谷氨酸螯合钙对大鼠骨密度及骨钙的影响

组别	N	骨钙质量分数/（mg/g）	股骨密度/（g/cm2）左侧
				低钙对照组	10	7.56±1.59	0.13±0.01
葡萄糖酸钙组	10	8.77±2.13	0.17±0.08
				低剂量组	10	8.40±2.64	0.16±0.04#
中剂量组	10	8.56±2.10	0.19±0.02#*
				高剂量组	10	9.36±2.26#**	0.20±0.02#**

2.3谷氨酸螯合钙对大鼠股骨荷载的影响

实验得出，剂量组和葡萄糖酸钙组最大载荷高于低钙对照组，说明剂量组和葡萄糖酸钙组能有效改善股骨的力学强度。而高剂量组股骨最大载荷显著高于葡萄糖酸钙组，说明在本实验中，氨基酸螯合钙的应用可较好地改善大鼠股骨近端的力学性能。

表8谷氨酸螯合钙对大鼠股骨荷载的影响

组别	N	L 股骨上端最大载荷/N
			低钙对照组	10	89.31±19.37
葡萄糖酸钙组	10	92.81±14.12
			低剂量组	10	93.77±16.51△△
中剂量组	10	101.52±18.9#*
			高剂量组	10	106.60±16.87#*

2.4谷氨酸螯合钙对大鼠钙表观消化率的影响

由表9可见，氨基酸钙中、高剂量组大鼠的钙表观吸收率显著高于葡萄糖酸钙阳性对照组，经统计学检验，差异有显著性意义(P<0.01)，剂量组间高剂量组高于中剂量组，表明该受试样品有较好的生物利用率。

表9谷氨酸螯合钙对钙表观消化率的影响

组别	N	钙的表观消化率/%
			低钙对照组	10	-12.05±1.18
葡萄糖酸钙组	10	92.38±1.38
			低剂量组	10	90.88±3.36
中剂量组	10	95.91±2.17**
			高剂量组	10	96.27±1.55**

3以禽蛋壳为钙源制备谷氨酸螯合钙钙吸收的良好机理分析

3.1谷氨酸螯合钙对大鼠股骨状况的影响

补钙能否显著性地增加股骨长度，文献报道的研究结果不一[13,14]。实验研究表明，在谷氨酸螯合钙中、高剂量组中，大鼠的股骨长度高于低钙组小鼠股骨长度，剂量组间高剂量组大于中剂量组，说明谷氨酸钙能促进骨骼生长，且大鼠股骨增长与补钙剂量的高低相关。此结果与孙晓红、邹全明等的研究结果[15,16]一致，高钙摄取量能提高大鼠的股骨长度，氨基酸钙对大鼠股骨增长有显著性影响。白剑[17]等通过对小鼠饲料中钙的营养吸收实验发现股骨重量随饲料中钙含量升高而增重，高钙饲料对骨质沉积有一定效果。本实验结果显示，本发明提供的谷氨酸钙给药组高于低钙组大鼠股骨质量；而相同含钙元素剂量条件下，谷氨酸钙对大鼠股骨质量增加的效果比葡萄糖酸钙组好，表明受试物对大鼠骨质沉积有增加的作用。

钙是骨骼的主要构成成分，骨密度和骨钙含量是目前公认的评价骨质的较好的方法[18]。从骨密度结果可以看出，与低钙对照组相比，本发明提供的谷氨酸螯合钙能增加大鼠股骨密度，与相同剂量的葡萄糖酸钙相比，本发明提供的谷氨酸螯合钙增加骨密度的效果更好。表明本发明提供的谷氨酸螯合钙能被有效吸收和利用。骨的构成除矿物质因素外，还与胶原蛋白基质构成有关。因而，在低钙水平上添加氨基酸螯合钙对骨的生长效果可佳。一是补充了矿物质；二是补充了骨质生长必需的胶原蛋白成分；三是氨基酸有协同功用，有利于钙的吸收利用。骨中除含丰富的矿物质外，还含有丰富的胶原蛋白，氨基酸尤其是羟脯氨酸十分丰富了，羟脯氨酸是骨基质形成的重要成分，它的合成受一些条件的限制，如维生素C缺乏会使之合成障碍。此外，还有各类乳糖、磷脂等，能促进钙的吸收[17,19]。本试验选择的葡萄糖酸钙制剂中添加有乳糖，因此对葡萄糖酸钙组的骨密度提高有贡献。另外实验进行了对大鼠骨钙质量分数的测定，进一步支撑了谷氨酸螯合钙有利于骨营养状况的提高。

3.2谷氨酸螯合钙对大鼠钙表观消化率的影响

本试验以本发明提供的禽蛋壳为钙源制备的谷氨酸活性钙作为受试物，实验得出，剂量组的钙表观消化率高于葡萄糖酸钙组，这与文献[20]报道，蛋壳超微用来补钙，其吸收率大于普通钙源，从显微结构看，蛋壳呈不规则的多孔结构，更易被人和动物吸收的重要原因有关。与何丽等人[21]研究的海洋生物牡蛎贝壳为原料的钙源生物利用度差比较有优势。另外，从氨基酸钙结构特点分析，每两个氨基酸分子与一个钙离子螯合在一起，位于五元环螯合物中心的钙元素可以通过小肠绒毛刷状缘，以氨基酸或肽的整体形式直接从肠黏膜吸收，从而免遭一些理化因子，如pH值、脂类、纤维、草酸、氧化物、植酸、磷酸盐等的影响，其生物学利用率高，从而有效解决了传统钙源溶解性差、吸收率低、副作用大、产生结石等问题[22]。低剂量组钙的表观吸收率为90.88±3.36％，高剂量组为96.27±1.55％，说明大鼠钙吸收率与摄入量相关；这与文献报道一致[18]。

4结论

（1）本研究结果表明,高钙摄取组在股骨长度，骨重量、骨矿物质、含量指标均相应增加，剂量组大鼠骨密度与低钙对照组，差异极显著(P<0.01)；高剂量组大鼠骨密度与葡萄糖酸钙组比较增加，差异有显著性(P<0.01)意义，这说明本发明提供的氨基酸钙有利于增加骨密度。而相同含钙元素剂量条件下，谷氨酸钙对对改善大鼠股骨的营养状况效果比葡萄糖酸钙组好。

（2）实验得出本发明提供的谷氨酸螯合钙与低钙组以及葡萄糖酸钙比显著（P<0.05）提高了大鼠L股骨上端最大载荷，高达106.60±16.87N可以较好地改善大鼠股骨近端的力学性能。

（3）本发明提供的谷氨酸螯合钙的钙吸收率较好，高剂量组大鼠表观消化率为96.27±1.55％，与对照组比较增高，差异显著（P<0.01），可作为一种高吸收型的活性补钙制剂。

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Claims (1)

1.一种采用禽蛋壳为钙源直接制备谷氨酸螯合钙的方法，其特征在于，具体制备方法步骤如下：

(1)原料预处理：收集禽蛋壳后用清水清洗表面杂物，经沸水煮沸5-10min，40-60kHz，超声20-30min初次壳膜分离，置隧道式鼓风干燥箱中利用风力再次分离壳膜，粉碎过100目筛，得到纯度较高蛋壳粉，再4℃储存备用；

(2)将蛋壳钙粉和谷氨酸按照1:2-1:3的摩尔比混合，蒸馏水按固液质量比1:15至1:20添加，用NaOH调节pH值至6-8，加热至60-80℃以20-30r/min速度搅拌保温螯合50-70min；

(3)将上述步骤获得螯合反应的粗品，抽滤5-10min，滤渣回收重新投料使用；滤液减压浓缩置膏状，加入90％-95％无水乙醇沉淀，搅拌30min，静置过夜，4000r/min-6000r/min离心15-20min，回收上清液无水乙醇混合物，过滤收集沉淀物；

(4)将上述步骤(3)纯化后的谷氨酸螯合钙经110℃干燥，粉碎过120目筛，制得白色粉末状谷氨酸螯合钙。